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BRUNO CHACON DE FIGUEIR
EDO
FORMAÇÃO E INIBIÇÃO DE COMPOSTOS
PROVENIENTES DE REAÇÕES OXIDATIVAS EM
PESCADO
CAMPINAS 2015
iii
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS FACULDADE DE ENGENHARIA DE ALIMENTOS
BRUNO CHACON DE FIGUEIREDO
FORMAÇÃO E INIBIÇÃO DE COMPOSTOS PROVENIENTES DE REAÇÕES OXIDATIVAS EM PESCADO
Tese apresentada à Faculdade de Engenharia de Alimentos da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para obtenção do título de Doutor em Ciência de Alimentos
Orientadora: Prof (a) Dr (a). NEURA BRAGAGNOLO
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À
VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA PELO ALUNO BRUNO CHACON DE FIGUEIREDO, E ORIENTADO PELA PROF (A). DR (A). NEURA BRAGAGNOLO
______________________________________ ASSINATURA DO ORIENTADOR
Campinas 2015
Ficha catalográfica
Universidade Estadual de Campinas
Biblioteca da Faculdade de Engenharia de Alimentos Claudia Aparecida Romano - CRB 8/5816
Figueiredo, Bruno Chacon de,
1982-F469f FigFormação e inibição de compostos provenientes de reações oxidativas em pescado / Bruno Chacon de Figueiredo. – Campinas, SP : [s.n.], 2015.
FigOrientador: Neura Bragagnolo.
FigTese (doutorado) – Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos.
Fig1. Oxidação lipídica. 2. Alta pressão. 3. Tratamento térmico. 4. Urucum. 5. Pescado. I. Bragagnolo, Neura. II. Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Engenharia de Alimentos. III. Título.
Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: Formation and inhibition of oxidative reaction compounds in fish Palavras-chave em inglês: Lipid oxidation High pressure Thermal treatment Annatto Fish
Área de concentração: Ciência de Alimentos Titulação: Doutor em Ciência de Alimentos Banca examinadora:
Neura Bragagnolo [Orientador] Daniel Barrera Arellano
Hugo Antônio Lima de Souza Mônica Roberta Mazalli
Adriana Pavesi Arisseto Bragotto
Data de defesa: 15-06-2015
Programa de Pós-Graduação: Ciência de Alimentos
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BANCA EXAMINADORA
____________________________________________ Professora Dra. Neura Bragagnolo (FEA/UNICAMP)
(Orientadora)
_____________________________________________ Professor Dr. Daniel Barrera Arellano (FEA/UNICAMP)
(Membro titular)
____________________________________________ Professor Dr. Hugo Antônio Lima de Souza (IFSP)
(Membro titular)
____________________________________________
Professora Dra. Mônica Roberta Mazalli (USP/FZEA/PIRASSUNUNGA) (Membro titular)
____________________________________________
Professora Dra. Adriana Pavesi Arisseto Bragotto (ITAL-CAMPINAS) (Membro titular)
____________________________________________ Professor Dr. Sérgio Bertelli Pflanzer Júnior (DTA-FEA)
(Membro Suplente)
____________________________________________ Dra. Lilian Regina Barros Mariutti (DCA-FEA)
(Membro Suplente)
____________________________________________ Professora Dra. Inar Alves de Castro (FCF–USP)
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RESUMO GERAL
Pescados são considerados como alimentos saudáveis da dieta humana devido à alta proporção de ácidos graxos poli-insaturados em relação aos ácidos graxos saturados em comparação com outros alimentos de origem animal. Os ácidos graxos poli-insaturados são conhecidos por seus efeitos benéficos à saúde humana, entretanto, também são altamente suscetíveis à oxidação. A intensidade da oxidação lipídica em pescados depende de diversos fatores como concentração e perfil dos ácidos graxos, presença de antioxidantes, tipo de processamento e condições de armazenamento. Baseado nestes fatos, os objetivos do presente estudo foram verificar o efeito antioxidante do urucum e da bixina na oxidação lipídica em pescado submetido ao tratamento de alta pressão hidrostática e tratamento térmico.
O tratamento de alta pressão hidrostática foi realizado em amostras de filé de cavala (Scomber scombrus) e de arenque (Clupea harengus) frescos a 600 MPa por 10 min. Aproximadamente 6 kg de cavala e de arenque foram adquiridos no mercado local de Copenhague, Dinamarca. Após a filetagem e a homogeneização, cada peixe foi dividido em três porções: 1) amostra controle, 2) com adição de 500 mg de urucum/kg de peixe e 3) com adição de 1 mg de bixina/kg peixe. Hambúrgueres (80 g ± 1 g) foram moldados e embalados a vácuo em sacos de polietileno de baixa densidade. Metade dos hambúrgueres foi pressurizado e mantido a 5°C por 14 dias. A outra metade das amostras foi armazenada a 5°C por 14 dias. Os parâmetros de cor (L*, a* e b*), os teores de umidade, lipídios totais, colesterol, óxidos de colesterol e a composição de ácidos graxos foram determinados. A identificação e a quantificação de óxidos de colesterol foram realizadas por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) com detectores de UV e índice de refração e a confirmação da identidade dos óxidos de coleterol foi realizada por HPLC acoplado a um detector de espectrometria de massas (MS/MS). A composição de ácidos graxos foi realizada por cromatografia gasosa (GC) com detector de ionização em chama. O efeito mais acentuado da alta pressão em relação aos parâmetros de cor foi um aumento na luminosidade (L*) em todas as amostras. A bixina e o urucum apresentaram efeitos diferentes na oxidação do colesterol e dos ácidos graxos insaturados após o tratamento com a alta pressão hidrostática e posterior armazenamento. A adição de urucum ou bixina nas amostras de cavala ou arenque foi suficiente para conter a formação de óxidos colesterol decorrente do tratamento de alta
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pressão, mas apenas o urucum reduziu a degradação do ácido docosahexaenoico (DHA), possivelmente, devido à ação sinergística com os compostos fenólicos, tocoferóis e tocotrienóis presentes na semente.
O tratamento térmico foi realizado em filés de tilápia vermelha (Oreochromus spp) adquiridos no mercado de Campinas, São Paulo. Os filés foram homogeneizados e divididos em 2 porções, sendo uma adicionada de 500 mg/kg de bixina e a outra sem adição do carotenoide. Hambúrgueres de 80 ± 2 g foram moldados, embalados em filme plástico e acondicionados a -18ºC. Os hambúrgueres foram submetidos a quatro tratamentos térmicos: cozimento em água a 95 ± 1°C por 30 min; em forno de micro-ondas na potência 10 (máxima) por 5 min; em forno elétrico a 180°C durante 10 min e em grelha a 165°C por 8 min. Os teores de bixina, umidade, lipídios totais, colesterol, óxidos de colesterol, compostos voláteis e a composição de ácidos graxos foram determinados. Os ácidos graxos foram analisados por GC com detector de ionização em chama e os óxidos de colesterol por GC com detector de espectrometria de massas (GC-MS). Os compostos voláteis foram extraídos utilizando a fibra divinilbenzeno/carboxen/polidimetilsiloxano (DVB/CAR/PDMS) acoplada a um cromatógrafo gasoso com detector de espectrometria de massas. A quantificação do colesterol foi feita por HPLC.
O tratamento térmico levou a uma diminuição de até 11,1% no teor de colesterol e ao aumento da formação de 7-cetocolesterol (composto majoritário) e 7β-hidroxicolesterol, sendo as amostras grelhadas as que apresentaram os maiores valores de óxidos de colesterol totais. Todos os métodos de cocção resultaram em perdas de ácidos graxos monoinsaturados e poli-insaturados. As maiores perdas também foram observadas nas amostras grelhadas. O tratamento térmico aumentou os teores de compostos voláteis e promoveu a formação de novos compostos como o pentanal, o heptanal, o decanal, o octanol e o 1-octenol. Houve uma forte correlação linear entre a degradação dos ácidos graxos insaturados das famílias n-3, n-6 e n-9 e os produtos voláteis oriundos da oxidação destes ácidos graxos. A adição de bixina foi capaz de reduzir a formação de óxidos de colesterol em todos os tratamentos térmicos, entretanto, não foi eficiente em inibir a oxidação dos ácidos graxos insaturados. O cozimento em grelha a 165°C por 8 min foi o que resultou em maiores perdas de ácidos graxos insaturados e na maior formação de óxidos de colesterol.
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SUMMARY
Fish is considered a health food in human diet due to the high proportion of polyunsaturated fatty acids in relation to saturated fatty acids when compared to other foods of animal origin. The polyunsaturated fatty acids are known because of their benefic effects to human health; however, they are also highly susceptible to oxidation. The intensity of lipid oxidation in fish depends on several factors such as concentration and profile of fatty acids, presence of antioxidants, type of processing and storage conditions. Based on these facts, the aims of the present study were to verify the antioxidant effect of annatto and bixin on lipid oxidation of fish submitted to high hydrostatic pressure and thermal treatment.
High hydrostatic pressure treatment was carried out in fresh mackerel (Scomber
scombrus) and herring (Clupea harengus) filet samples at 600 MPa for 10 min. About 6 kg
of mackerel and herring were acquired at the local market in Copenhagen, Denmark. After filleting and homogenization, each fish sample was divided into 3 portions: 1) control sample, 2) with addition of 500 mg of annatto powder/kg of fish and 3) with addition of 1 mg of bixin/kg of fish. Hamburgers (80 g ± 1 g) were molded and vacuum packed in low density polyethylene bags. Half of the hamburgers was pressurized and stored at 5°C for 14 days. The other half was stored at 5°C for 14 days. Color parameters (L*, a* and b*), moisture, total lipids, cholesterol, cholesterol oxides contents and fatty acid composition were determined. The identification and quantification of cholesterol oxides was carried out by high pressure liquid chromatography (HPLC) coupled to UV and refractive index detectors and the identity confirmation of the cholesterol oxides by HPLC coupled to a mass spectrometer (MS/MS) detector. Fatty acid composition was carried out by gas chromatography (GC) with flame ionization detector. The most pronounced effect of high pressure concerning the color parameters was an increase on luminosity (L*) of all samples. Bixin and annatto showed different effects on cholesterol and unsaturated fatty acids oxidation after high hydrostatic pressure treatment and subsequent storage. Addition of annatto or bixin in mackerel or herring samples was sufficient to counteract the formation of cholesterol oxides due to high pressure treatment, but only annatto reduced docosahexaenoic acid (DHA) degradation, possibly because of the synergistic action with phenolic compounds, tocopherols and tocotrienols present in the seed.
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Thermal treatment was carried out in red tilapia (Oreochromus spp) fillets acquired at the local marked in Campinas, São Paulo. The filets were homogenized and divided in two portions, to one 500 mg/kg of bixin was added and no carotenoid was added to the other portion. Hamburgers of 80 ± 2 g were molded, packed in plastic film and stored at -18ºC. The hamburgers were submitted to four thermal treatments: boiling in water at 95 ± 1°C for 30 min, cooked in microwave oven at potency 10 (maximum) for 10 min, baked in electric oven at 180°C for 10 min and grilled at 165°C for 8 min. Contents of bixin, moisture, total lipids, cholesterol, cholesterol oxides, volatile compounds and fatty acid composition were determined. Fatty acids were analyzed by GC with flame ionization detector and cholesterol oxides by GC with mass spectrometer detector (GC-MS). The volatile compounds were extracted using a divinylbenzene/carboxen/polydimethylsiloxane (DVB/CAR/PDMS) fiber coupled to a GC-MS. Cholesterol quantification was carried out by HPLC.
Thermal treatment resulted in a decrease of up to 11.1% of cholesterol content and an increase of 7-ketocholesterol (major compound) and 7β-hydroxicholesterol content, being the grilled samples the ones presenting the highest total cholesterol oxide values. All cooking methods resulted in loss of monounsaturated and polyunsaturated fatty acids. The greatest losses were also observed in grilled samples. Thermal treatment increased the content of volatile compounds and promoted the formation of new compounds such as pentanal, heptanal, decanal, octanol and 1-octenol. A strong linear correlation was found between n-3, n-6 and n-9 unsaturated fatty acids degradation and the volatile products of fatty acid oxidation. The addition of bixin was able to reduce the formation of cholesterol oxides in all thermal treatments; however, it was not efficient in the inhibition of unsaturated fatty acid oxidation. Grilling at 165°C for 8 min resulted in the highest loss of unsaturated fatty acids and highest formation of cholesterol oxides.
xi ÍNDICE
INTRODUÇÃO GERAL 1
Capítulo 1: SÍNTESE BIBLIOGRÁFICA 6
1. Síntese bibliográfica 7
1.1 Aspectos gerais da Tilápia (Oreochromis spp.) 7
1.2 Ácidos graxos em peixes e sua relação com a saúde humana 9
1.3 Oxidação lipídica 12
1.4 Oxidação do colesterol 16
1.5 Urucum (Bixa orellana) 20
1.6 Tratamentos de alta pressão hidrostática na conservação de alimentos 22
1.7 Tratamento térmico 25
Capítulo 2: INHIBITION OF CHOLESTEROL AND POLYUNSATURATED FATTY ACIDS OXIDATION BY ANNATTO AND BIXIN IN HIGH-PRESSURE PROCESSED FISH
41
Abstract 42
Introduction 42
Materials and methods 42
Sample preparation 44
Color measurement 45
Total lipids, moisture and iron contents 45
Fatty acid composition 46
Cholesterol and cholesterol oxides 46
Saponification and extraction 46
Separation and quantification of cholesterol by HPLC-DAD 46 Separation and quantification of cholesterol oxides by GC-MS 47
Statistical Analysis 50
Results and discussion 50
Conclusions 63
xii
Capítulo III: FORMAÇÃO DE COMPOSTOS VOLÁTEIS PROVENIENTES DA OXIDAÇÃO LIPÍDICA EM TILÁPIA VERMELHA (OREOCHROMIS SPP) SUBMETIDA A DIFERENTES MÉTODOS DE COCÇÃO
70
RESUMO 71
1. INTRODUÇÃO 71
2. MATERIAIS E MÉTODOS 73
2.1. Preparo das amostras 73
2.2. Determinação do teor de lipídios totais e umidade 74
2.3. Determinação de compostos voláteis 74
2.4. Determinação de compostos voláteis provenientes da bixina 75
2.5. Determinação da composição de ácidos graxos 76
2.6. Índices da qualidade nutricional dos lipídios 77
2.7. Quantificação de colesterol e óxidos de colesterol 78
2.8. Quantificação de bixina em tilápia 78
3. RESULTADOS 78
3.1. Caracterização das amostras 79
3.2. Teores de bixina nos hambúrgueres de tilápia vermelha 80
3.3. Degradação de ácidos graxos por tratamento térmico 83
3.4. Compostos voláteis oriundos da oxidação lipídica 87
3.5. Produtos oriundos da oxidação do colesterol 92
4. CONCLUSÃO 95
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AGRADECIMENTOS
A Deus pela presença em minha vida.
À minha mãe pelas orações dedicadas a mim, por seu amor e incentivo. E ao meu pai, por todo bom exemplo de honestidade, amor e perseverança.
Aos meus irmãos Ythallo e Victor, pelo apoio e solidariedade.
À Faculdade de Engenharia de Alimentos da UNICAMP e especialmente ao laboratório de Química de Alimentos, onde desenvolvi a maior parte deste trabalho.
À minha orientadora Profa. Dra. Neura Bragagnolo pela orientação, paciência, amizade e por todo incentivo, e motivação ao longo desses anos.
Aos professores Leif H. Skibsted e Vibeke Orlien pela orientação e apoio durante o tempo que estive na Dinamarca para o desenvolvimento deste trabalho.
À Lilian Regina Barros Mariutti pelo apoio, paciência, amizade e contribuição para o meu desenvolvimento cientifico.
Aos queridos amigos de laboratório Poliana, Fernanda, Marcella, Fabiola, Sarah, Eliseu, Naira, Debora, Galega, Renan, Adones, Adria, Aline, Cristina, Daniele, Gilsandro, Hugo, Janina, Kleidson, Regiane, Rosemar e a todos que passaram pelas bancadas desta ‘vida de laboratório’ e deixaram sua marca.
Aos professores (as) Daniel, Sérgio, Lilian, Adriana, Mônica, Hugo e Inar, membros titulares e suplentes da banca examinadora, pelas correções e sugestões que muito contribuíram para a melhoria da qualidade científica da tese.
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), ao CNPq e a CAPES, pelo suporte financeiro ao desenvolvimento deste trabalho.
A todos que contribuíram direta ou indiretamente para realização deste trabalho.
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1. INTRODUÇÃO GERAL
O Brasil apresenta uma extensa área geográfica litorânea e continental, possuindo cerca de 12% da água doce superficial do planeta e uma linha costeira contínua de 8.000 km de extensão (IBGE, 2011), recursos naturais estes, fundamentais para o cultivo ou captura de animais de vida aquática. Entre as criações de peixes ao redor do mundo se destaca o cultivo da tilápia. Segundo a FAO (Food and Agriculture Organization of the United Nations), a produção de tilápias ocorre em 135 países, estando presente em todos os continentes (FAO, 2014). No Brasil, o crescimento da aquicultura teve forte contribuição na produção de tilápias devido a sua adaptabilidade ao clima tropical do país. Em 2011, a produção de tilápia e tambaqui representavam 67% da aquicultura continental (MPA, 2013).
A ingestão regular de pescado fornece ferro, vitamina B12, cálcio e aminoácidos essenciais. Além de ser fonte de proteína, o peixe apresenta uma série de vantagens à saúde humana (Olley et al., 2002; FAO, 2014). O consumo de peixe possui grande participação na prevenção de doenças, principalmente os de águas frias como a cavala (Scomber scombrus) e arenque (Clupea harengus), que são fonte de ácidos graxos poli-insaturados ômega-3 (AGPI n-3) que tem a capacidade de diminuir o colesterol total e a LDL (Low Density
Lipoprotein) e de aumentar o HDL (High Density Lipoprotein). Aumentando assim, o fator
de proteção a doenças cardiovasculares, principalmente infarto e derrame. A tilápia apresenta requisitos típicos dos peixes preferidos pelo consumidor, tais como carne branca de textura firme, sabor delicado, fácil filetagem, uma ótima fonte de AGPI e baixo teor de colesterol.
O colesterol é um lipídio-esteróide que apresenta inúmeras funções no organismo, servindo de matéria prima para hormônios, sais biliares e vitamina D3. Ele também é o constituinte estrutural das membranas celulares, sendo necessário para o crescimento e viabilidade celular, e é o principal esterol dos animais. No entanto, o colesterol, assim como os ácidos graxos poli-insaturados, são compostos instáveis devido a presença de ligações duplas nas suas estruturas que se tornam suscetíveis à auto-oxidação. Dependendo da composição dos fosfolipídios, quantidade de ácidos graxos poli-insaturados, das concentrações de íons metálicos, oxigênio, sal e outros pró-oxidantes o processo de auto-oxidação pode ser acelerado (Calkins e Hodgen, 2007).
Em geral, os peixes são consumidos após cozimento sendo o tratamento térmico um importante método utilizado para destruir os microrganismos nocivos à saúde e melhorar a
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qualidade sensorial do pescado. O tratamento térmico, no entanto, também pode catalisar a oxidação do colesterol e dos AGPI provocando alterações na qualidade lipídica do peixe durante os processos de cozimento (Yagiz et al., 2009; Karlsdottir et al., 2014, Derewiaka e Molinska, 2015).
Entre as tecnologias emergentes utilizadas para a conservação de alimentos, o tratamento por alta pressão hidrostática (APH) vem se destacando devido a sua capacidade de preservar a qualidade sensorial e nutricional dos alimentos enquanto inativa enzimas pro-oxidantes e potenciais microrganismos indesejáveis, aumentando assim, a vida de prateleira e qualidade do alimento (Bermúdez-Aguirre et al., 2011, Norton e Sun, 2008). Por outro lado, a APH também pode ocasionar a oxidação lipídica.
A oxidação lipídica é uma sequência de reações tradicionalmente apresentada em três estágios: iniciação, propagação e terminação. Na iniciação um pequeno número de radicais livres são formados, estes posssuem vida muito curta e são altamente reativos. Na reação de propagação, o oxigênio atmosférico reage com os radicais livres gerando hidroperóxidos. Por exemplo, os ácidos graxos linoleico e araquidônico por autoxidação produzem o 9-hidroperóxido e 12-9-hidroperóxido, respectivamente, os quais podem se decompor formando compostos voláteis tais como o hexanal, decadienal, 2-nonenal, 1-octen-3-ona, 2,4-nonadienal, e 2-octenal. Hexanal e 2,4-decadienal contribuem positivamente para o sabor da carne, mas podem produzir sabores indesejáveis quando em altas concentrações (Kolanowski et al., 2007). Eventualmente, a concentração de radicais livres atinge um ponto em que eles começam a reagir entre si, formando produtos finais estáveis. Estas são as reações de terminação.
A oxidação do colesterol ocorre similarmente à oxidação dos ácidos graxos poli-insaturados, levando a formação de compostos denominados de óxidos de colesterol. Os produtos da oxidação do colesterol estão associados a doenças inflamatórias (Poirot e Silvente-Poirot, 2012) e são considerados citotóxicos, mutagênicos, carcinogênicos e aterogênicos (Alemany et al., 2012; Lordan et al., 2009; Otaegui-Arrazola et al., 2010).
Existem vários biomecanismos de defesa envolvendo enzimas e compostos antioxidantes que protegem a célula contra os danos oxidativos. Embora as defesas antioxidantes endógenas sejam efetivas, nem sempre são suficientes para conter o avanço da oxidação lipídica e a utilização de antioxidantes tem sido cada vez mais comum no auxílio
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ao controle oxidativo. O uso de ervas aromáticas ou plantas como antioxidantes vem em encontro com a tendência atual dos consumidores pela procura de produtos naturais, causada pela crescente preocupação com a saúde.
Diante do exposto, os objetivos deste estudo foram: (1) avaliar o efeito do tratamento térmico na oxidação lipídica na tilápia vermelha (Oreochromis spp); (2) avaliar o efeito do tratamento por APH na oxidação lipídica em cavala do atlântico (Scomber scombrus) e arenque (Clupea harengus); (3) avaliar o efeito da adição de urucum ou bixina na degradação de ácidos graxos insaturadoes e formação de óxidos de colesterol em pescados submetidos a tratamento por APH e diferentes métodos de cocção (cozimento em água, cozimento em forno micro onda, forno elétrico, grelha) e; (4) verificar a correlação entre a formação de compostos voláteis provenientes da oxidação lipídica e a degradação dos ácidos graxos insaturados em tilápia vermelha submetida a diferentes tratamentos térmicos.
Referências bibliográficas
Alemany, L., Laparra, J, M., Barberá, R., Alegría, A. Evaluation of the cytotoxic effect of 7keto-stigmasterol and 7keto-cholesterol in human intestinal (Caco-2) cells. Food and
Chemical Toxicology, 50, 3106-3113, 2012.
Bermudez-Aguirre, D., Barbosa-Cánovas, G, V. An update on high hydrostatic pressure, from the laboratory to industrial applications. Food Engineering Reviews, 3, 4–61, 2011.
Calkins, C. R., Hodgen, J, M. A fresh look at meat flavor. Meat Science, 77, 63–80, 2007. Derewiaka, D., Molinska, E. Cholesterol transformations during heat treatment. Food
Chemistry, 171, 233–240, 2015. doi: 10.1016/j.foodchem.2014.08.117.
Food and Agriculture organization of the United Nations -FAO. The State of World
Fisheries and Aquaculture (SOFIA). Food and Agriculture organization of the United
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Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística - IBGE. Atlas geográfico das zonas costeiras
e oceânicas do Brasil, IBGE, Diretoria de Geociências, Rio de Janeiro: IBGE, 176p,
2011.
Karlsdottir, M. G., Sveinsdottir, K., Kristinsson, H. G., Villot, D., Craft, D. B., Arason, S. Effect of thermal treatment and frozen storage on lipid decomposition of light and dark muscles of saithe (Pollachius virens). Food Chemistry, 164, 476–484, 2014.
Kolanowski, W., Jaworska, D., Weissbrodt, J., Importance of instrumental and sensory analysis in the assessment of oxidative deterioration of omega-3-long-chain polyunsaturated fatty acid-rich foods. Journal of Science and Food Agriculture, 87, 181–191, 2007.
Lordan, S., Mackrill, J. J., O’Brien, N. M. Oxysterols and mechanism of apoptotic signaling: implications in the pathology of degenerative diseases. Journal of Nutrition and
Biochemistry, 20, 321-336, 2009.
Ministerio de Pesca e Aquicultura - MPA: Boletim estatístico da pesca aquicultura, 2011. Publicado em 13 de Setembro de 2013.
Norton, T., Sun, D. W. Recent advances in the use of high pressure as an effective processing technique in the food industry. Food and Bioprocess technology, 1, 2-34, 2008. Olley, J., Dunstan, G, A., Kolakowska, A. Chemical and Functional Properties of Food
Lipids: In Fish lipids cap 12. Edited by Zdzislaw E. Sikorski and Anna Kolakowska. CRC Press 2002. DOI: 10.1201/9781420031997.ch12.
Otaegui-Arrazola, A., Menéndez-Carreño, M., Ansorena, D., Astiasarán, I. Oxysterols: A world to explore. Food and Chemical Toxicology, 48, 3289–3303, 2010.
Poirot, M., Silvente-Poirot, S. Cholesterol-5, 6-epoxides: Chemistry, biochemistry, metabolic fate and cancer. Biochimie, 95, 622-631, 2012. Doi: 10,1016/j,biochi,2012,05,006.
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Yagiz, Y., Kristinsson, H. G., Balaban, M. O., Welt, B. A., Ralat, M., Marshall, M, R. Effect of high pressure processing and cooking treatment on the quality of Atlantic salmon.
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CAPÍTULO I
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1. SÍNTESE BIBLIOGRÁFICA
1.1. Aspectos gerais
O pescado é de extrema importância na dieta alimentar por sua riqueza de nutrientes, alto teor proteico, lipídios de excelente qualidade e baixo teor de colesterol. O Brasil produz na atualidade 2 milhões de toneladas de pescado, sendo 40% cultivados. Em 2012, a produção aquícola nacional foi de 611 343 toneladas, representando um incremento de 21,6% em relação à produção de 2010 (FAO, 2014). Entre o período de 2003 e 2013, o consumo nacional de pescado aumentou mais de 100%, sendo o consumo médio por habitante/ano em 2013 de 14,5 kg o que já atende a recomendação da FAO. Seguindo o padrão observado nos anos anteriores, a maior parcela da produção aquícola é oriunda da aquicultura continental, na qual se destaca a piscicultura continental que representou 82,3% da produção total nacional (MPA, 2014).
Entre as espécies de peixes cultivadas, o grupo das tilápias é o segundo em volume de produção no mundo (Naylor et al., 2000) e o terceiro em geração de renda (Borghetti et al., 2003). Existem cerca de 100 espécies de tilápia, distribuídas em três generos, Oreochromis, Sarotherodon e Tilápia. No Brasil foram introduzidas três espécies:
Oreochromis niloticus (Tilápia do nilo) que pode alcançar cerca de 5 kg; Tilápia rendali
(Tilápia rendali) com cerca de 1 kg; Sarotherodon hornorum (Tilápia zanzibar) de coloração escura e maxilas protráteis. As tilápias possuem características desejáveis por terem boa aceitação e elevado valor comercial, excelente conversão alimentar e consequentemente custos de produção relativamente baixos. A tilápia do Nilo ou tilápia nilótica recebe esse nome por ser originária da bacia do Nilo e é um dos principais peixes na piscicultura em todo o mundo. Além disso, a produção de tilápias pode ser aumentada com a reversão, que consiste em introduzir na ração hormônio feminino ou masculino, sendo este último o mais habitual, com a finalidade de gerar tilápias de sexo, tamanho e peso uniforme e com rápido crescimento (Cordeiro, 1994). A tilápia vermelha (Oreochromis spp) possui o corpo inteiro dominado por pigmentos vermelhos isenta de pontos pretos, além de possuir alta tolerância à salinidade, podendo ser produzida em água salobra e mesmo água do mar (Watanabe et al., 1990). A vantagem da produção em água salina (>10 partes por trilhão) é que reduz os
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problemas relacionados com off-flavors causado por cianobactérias comumente encontradas em águas doces. Além disso, a tilápia vermelha produzida em água salina poderia, devido à sua semelhança com algumas espécies marinhas, também alcançar preços mais elevados do que outros tipos de tilápia (Smith et al., 2008). A tilápia vermelha não é uma espécie verdadeira, mas um grupo de tilápias coloridas (cor de rosa ou vermelho) geralmente formada pelo cruzamento da tilápia de Moçambique (Oreochromis mossambicus) com outras espécies de tilápia para obter características adicionais desejáveis. Geralmente, a tilápia moçambicana tem uma alta tolerância à salinidade, mas cresce consideravelmente mais lentamente comparada com o crescimento da Tilápia do Nilo em água doce (Kamal e Mair, 2005).
O arenque do atlântico (Clupea harengus) é uma espécie migratória encontrada em cardumes, que habita o nordeste e noroeste do atlântico norte. Em 2012, o arenque ocupava o 5º lugar na lista de peixes mais capturados no mundo (FAO, 2014). É considerada uma das espécies mais importantes no atlântico norte, devido ao papel que desempenha no ecossistema e sua importância comercial. Eles se alimentam inteiramente de plâncton e normalmente alcançam a maturideade em 3 anos, medindo cerca de 25 cm comprimento. Devido a sua natureza migratória, o arenque pode ser encontrado em várias zonas costeiras, ao longo do atlântico norte, e por isso, sua pesca é regulada através de cotas anuais (Atlantic
States Marine Fisheries Commission, 2015). Embora o arenque ainda seja comercializado
inteiro ou em filés, a maior parte do arenque capturado no mundo é processado de alguma forma, pelo fato de ser um peixe bastante perecível que exige muito cuidado na captura e resfriamento imediato para que seja destinado ao mercado. Os principais tratamentos empregados envolvem a defumação, salga, além de produtos marinados e enlatados (FAO, 2001a).
A cavala (Scomber scombrus) é uma pequena espécie de peixe pelágico capturado em grandes quantidades no atlântico norte durante períodos de demanda relativamente baixa e, portanto, uma grande parte dos peixes capturados é subutilizada sendo transformada em ração animal (Auborg et al., 2013). Esta espécie se diferencia de outras espécies de cavala encontradas em águas quentes como a Scomber japonicus. Uma cavala do atlântico adulta mede de 30-35 cm de comprimento e pesa 300-500 g antes de evisceração. Enquanto que uma cavala jovem mede de 20-25 cm de comprimento e, provavelmente, em seu segundo ano de vida pesa 100-200 g (FAO, 2001b). A cavala é considerada um peixe com alto teor
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de gordura, variando entre 6 a 23 g/100g, e quando capturada entre outubro e dezembro apresenta os maiores valores de gordura. Devido a presença de uma grande quantidade de ácidos graxos poli-insaturados ocorre o processo de rancificação enzimática e não enzimática mesmo durante o armazenamento a temperaturas negativas (Richards e Hultin, 2002). A indústria de pescado utiliza a cavala de forma semelhante ao arenque em processos que envolvam a defumação, salga, produtos marinados e enlatados (FAO, 2001b)
1.2 Ácidos graxos em peixes e sua relação com a saúde humana
O consumo de gordura nos dias modernos tem sido relacionado como uma das maiores causas de morte na sociedade ocidental, através de doenças cardiovasculares degenerativas e câncer. Isto levou à recomendação de que a ingestão de ácidos graxos insaturados deve ser aumentada em relação à de ácidos graxos saturados, em conjunto com a redução da ingestão de gordura total (Krogmann et al., 2011). Uma das principais características dos lipídios de peixes é o seu alto teor de ácidos graxos poli-insaturados (AGPI) de cadeia longa, os quais são conhecidos por seus efeitos benéficos à saúde humana. Peixes de água doce e de água salgada são comumente relacionados como bons componentes de uma dieta saudável, devido aos altos índices de ácidos graxos poli-insaturados em relação aos ácidos graxos saturados (AGPI/AGS) quando comparados a outras fontes de alimento de origem animal (Health Canada, 2011). Orientações nutricionais de várias agências de saúde em todo o mundo, apresentam recomendações para a ingestão diária de EPA + DHA (ácido eicopentaenoico, 20:5n-3 e ácido docosaexaenoico, 22:6n-3, respectivamente) e/ou ácidos graxos n-3 (ômega 3) (U.K. Scientific Advisory Committee on Nutrition, 2004; Koletzko et al., 2008; European Food Safety Authority, 2012). Além disso, dietas com proporções de n-3/n-6 próximos a 1 (Simopoulos, 2008) e AGPI/AGS >0,4 (Food and Agriculture Organization of the United Nations & World Health Organization, 1994) também são recomendados para uma boa saúde. Health Canada (2011) recomenda o consumo de no mínimo 150 g de peixe cozido por semana como parte de uma dieta saudável.
Os peixes marinhos, principalmente de regiões frias, são caracterizados por possuírem baixos níveis de ácido linoleico (18:2n-6) e ácido α-linolênico (18:3n-3) e altos níveis de AGPI n-3 de cadeia longa. Por outro lado, os peixes de água doce possuem altos níveis de
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AGPI com 18 carbonos, e teores razoáveis de EPA e DHA. Além disso, apresentam altos níveis de AGPI n-6, principalmente ácido araquidônico e ácido linoleico (Celik et al., 2005). A presença de maiores quantidades de AGPI n-3 do que de AGPI n-6 em peixes de água fria está relacionada com a estrutura dos ácidos graxos da família n-3, que possuem um maior grau de insaturação, o que confere maior flexibilidade e permeabilidade à membrana fosfolipídica necessárias à sobrevivência dos peixes em baixas temperaturas (Skagemo, 2010). Os peixes se alimentam de algas presentes no ecossistema aquático e posteriormente sintetizam os EPA e DHA. Portanto, os seres humanos devem consumir carne de peixe de origem marinha, principalmente de regiões frias. A síntese dos ácidos graxos poli-insaturados de cadeia longa como o ácido araquidônico (20:4n-6, ARA), EPA e DHA acontece no compartimento extramitocondrial, por um sistema enzimático complexo, cujo ponto de partida é a acetil-CoA. A partir dos ácidos graxos saturados formam-se os monoinsaturados, no fígado, por meio da reação catalisada por dessaturases microssomais. Dos monoinsaturados originam-se os poliinsaturados, por ação de dessaturases específicas para a posição da dupla ligação na cadeia (Tocher et al., 2002) Em geral, peixes de água doce possuem maior capacidade de converter ácidos graxos com 20 e 22 átomos de carbono comparados com os peixes de água salgada, apesar de existirem algumas exceções. Essa capacidade de conversão varia consideravelmente entre diferentes espécies e também para a mesma espécie devido às mudanças de temperatura, de salinidade e da profundidade da água (Tanakol et al., 1999). No entanto, as tilápias são conhecidas pela habilidade de transformar ácido α-linolênico em DHA e EPA (Tocher et al., 2002; Al-Souti et al., 2012).
Vários estudos têm demonstrado o grande benefício da ingestão dos ácidos graxos poli-insaturados n-3 (Lee et al., 2008; Sagara et al., 2011). Os AGPI n-3 demonstraram ser eficazes no tratamento e em alguns casos na prevenção de arteriosclerose (Angerer et al., 2002), de pressão arterial (Mori, 2010: Sagara et al., 2011), da degeneração macular relacionada com a idade e na diminuição do risco de acidente vascular cerebral isquêmico (Simopoulos, 2008; Chan e Cho, 2009). A ação principal pertencente aos AGPI n-3 está relacionada com a sua proteção cardiovascular, reduzindo o colesterol total e a LDL (Low
Density Lipoprotein). Além disso, as propriedades anti-inflamatórias, antioxidante, e
antiplaquetárias dos AGPI n-3 desempenham papéis fundamentais na prevenção da progressão da doença cardiovascular (Schwellenbach et al., 2006). Os AGPI n-3 também têm
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sido recomendados nos casos de depressão (Freeman et al., 2008), epilepsia (Cysneiro et al., 2009) déficit de atenção e hiperatividade (Richardson, 2006) e doenças crônicas e degenerativas relacionadas com a idade (Schaefer et al., 2006). No entanto, existem incertezas quanto aos mecanismos de ação de EPA e DHA com relação à saúde mental e se estes ácidos são ou não responsáveis por este efeito (Kris-Etherton e Hill, 2008). Além disso, os ácidos graxos das séries n-3 e n-6 são precursores da biossíntese de eicosanóides (prostaglandinas, prostaciclinas, tromboxanas e leucotrienos) os quais exercem importantes funções no orgamismo humano (Moreira et al., 2001).
No entanto, as composições de ácidos graxos nos peixes não são constantes, pois dependem de uma série de fatores tais como tamanho, idade e estado reprodutivo dos peixes, sistema de alimentação, localização geográfica, habitat e período do ano que são cultivados (Kalyoncu et al., 2009; Huynh e Kitts, 2009; Alasavar et al., 2002). A tabela 1 mostra os teores de ácidos oleico, linoleico, linolênico, EPA + DHA e colesterol (mg/100g, base úmida) em três espécies de pescado: tilápia vermelha (Oreochromis spp) tailandesa, arenque (Clupea
harengus) e cavala do atlântico (Scomber scombrus).
Tabela 1. Teores de ácidos oleico, linoleico, linolênico, EPA + DHA e colesterol (mg/100g, base úmida) em pescado cru.
*Fonte: Ng et al. (2013)
**Fonte: The Danish National Food Institute's Food Composition Databank (2009).
De acordo com a Resolução RDC Nº 54, de 12 de novembro de 2012, da Diretoria Colegiada da Agência Nacional de Vigilância Sanitária, estabelece que um alimento é considerado fonte de acidos graxos n-3 quando apresentar no mínimo de 300 mg de ácido alfa-linolênico ou 40 mg da soma de EPA e DHA por 100g de alimento.Apesar da grande
Ácido graxo Tilápia* Arenque** Cavala**
18:1n-9 534 1680 3370
18:2n-6 189 492 803
18:3n-3 7 290 298
EPA + DHA 83 5320 4500
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diferença entre os teores de EPA + DHA encontrados em peixes de águas frias como a cavala e o arenque, a tilápia vermelha também pode ser considerada como fonte de ácidos graxos n-3.
1.3 Oxidação lipídica
A oxidação lipídica consiste em uma série de reações químicas e bioquímicas que provocam alterações nas espécies moleculares presentes no alimento, sendo que estas espécies moleculares, na maior parte das vezes, são nutrientes importantes para o desenvolvimento e saúde humana (Akoh e Min, 2008). Estas reações alteram também o sabor do alimento e consequentemente há uma diminuição da aceitação de alimentos pelos consumidores (Shahidi e Zhong, 2010).
Os procedimentos de processamento de produtos cárneos podem levar à oxidação dos lipídios presentes na carne por várias maneiras. O tratamento térmico, por exemplo, tem efeito negativo na estrutura celular, pois provoca a desnaturação das proteínas e a liberação do íon ferro +2, além de acelerar as reações de decomposição dos hidroperoxidos. Fragmentando, picando e misturando a carne, desfaz-se a estrutura muscular da mesma, aumentando a superfície de exposição ao oxigênio e a catalisadores da oxidação, o que pode dar origem a radicais livres desencadeando as reações de oxidação do colesterol e ácidos graxos insaturados (Saldanha e Bragagnolo, 2008).
As reações de auto-oxidação apresentam normalmente um período de indução, n o qual pouca mudança ocorre nos lipídios, este período caracterizado pelo baixo consumo de oxigênio e formação dos radicais livres (R•). Após o término do período de indução, a oxidação dos lipídios ocorre mais rapidamente, aumentando o consumo de oxigênio e a formação de radicais peroxila (ROO•). Em seguida, a reação se propaga quando o radical peroxila formado abstrai um átomo de hidrogênio de uma nova molécula de lipídio insaturado (RH) formando então um hidroperóxido (ROOH) e um novo radical (R•) que irá dar continuidade a sequência de reações. Assim, os produtos primários da oxidação lipídica são os peróxidos e os hidroperóxidos, mas estes compostos são frequentemente instáveis e sofrem cisão para formar produtos secundários de baixo peso molecular tais como aldeídos, cetonas e epóxidos (Porter, 2013; Pratt et al., 2011), compostos que contribuem para o sabor
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de ranço. Em ácidos graxos contendo três ou mais ligações duplas, o radical peroxila pode reagir com uma das ligações duplas para formar o malonaldeído e endoperóxido (Porter, 2013). O malonaldeído (MDA) é um dialdeído formado durante a oxidação de ácidos graxos poli-insaturados, principalmente do ácido araquidônico, é um dos biomarcadores mais utilizados por ser um dos produtos secundários da oxidação lipídica mais conhecido (Grottol et al., 2008).
O maior responsável pela decomposição de hidroperoxidos lipídicos em alimentos e em sistemas biológicos é o ferro (heme e não-heme) via reação de Fenton:
Fe+2 + ROOH Fe+3 + RO• + •OH (reação de Fenton)
O radical •OH pode atuar como um eletrófilo ou como um nucleófilo, atacando moléculas orgânicas pela abstração de hidrogênio ou acoplando-se em ligações duplas. A decomposição dos hidroperoxidos é uma reação de baixo valor energético (cerca de 44 kcal/mol) e os compostos de off-flavous formados esta diretamente ligada com a composição dos ácidos graxos envolvidos na reação. A figura 1 mostra, como exemplo, a oxidação do ácido linoleico. A oxidação tem início com a abstração do hidrogênio da molécula do ácido graxo por intermédio de um radical livre. A menor enegia necessária para retirarada do hidrogênio da ligação C-H é encontrada na posição 11, entre as insaturações (hidrogênio bis-alílico, 75 kcal/mol), seguido pelo hidrogêncio alílico (88 kcal/mol) e o hidrogênio do grupo metileno (100 kcal/mol) (Erickson, 2008). Em pressões atmosféricas normais a reação do radical alquila com o oxigênio ocorre de maneira muito rápida e os radicais peróxila estão presentes em concentrações muito superiores aos dos radicais alquila. O radical peroxila formado irá abstrair um átomo de hidrogênio de uma nova molécula de ácido graxo resultando na formação dos hidroperóxidos 13-OOH e 9-OOH que poderão se decompor gerando novos radicais alcoxila (RO•) e hidroxila (•OH). Atravás da cisão dos radicais alcoxila podem ser formados compostos de baixo peso molecular como o hexanal, 2,4-decadienal, pentanol, 3-nonenal (Frankel, 2005).
Na fase de terminação da oxidação, os radicais reagem entre si dando origem a produtos não radicalares. Em ambientes com pouco oxigênio, podem ocorrer reações de terminação entre radicais alquila (R•), formando-se dímeros de ácidos graxos. Na presença
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de oxigênio podem ocorrer reações de terminação entre os radicais peroxila (ROO•) e alcoxila (RO•), que são predominantes nestas condições.
Iglesias e Medina (2008) avaliaram a oxidação lipídica em termos de formação de compostos voláteis durante o armazenamento de cavala do Atlântico a 4 ◦C. Propanal, 1-penten-3-ol, 2,3-pentanodiona, hexanal e 1-octen-3-ol foram os principais compostos voláteis formados durante o armazenamento. Outros produtos voláteis formados em concentrações significativas e estreitamente relacionados com oxidação lipídica foram 2-metilfurano, Z-4-heptenal e 3,5-octadien-2-ona. Durante os 3 primeiros dias de armazenamento, houve um aumento nos teores de 1-penteno-3-ol (200%), 2,3-pentanodiona (144%) e 1-octeno-3 (6,6%). Estes autores sugerem a utilização do 1-penteno-3-ol, 2,3-pentanodiona e 1-octeno-3 como marcadores da oxidação lipídica em músculo de cavala do Atlântico, devido aos altos níveis encontrados e sua excelente correlação com o índice peróxido e o TBARS.
Souza e Bragagnolo (2014) identificaram 123 compostos voláteis em camarão seco e salgado, destes, 1-penten-3-ol é produzido pela oxidação de ácidos graxos n-3; pentanal, hexanal, 1-pentanol, 2-pentilfurano, 1-hexanol, 1-octen-3-ol e 2-octen-3-ol são formados pela degradação de ácidos graxos n-6; octanal, nonanal, decanal, heptenol, octanol e 1-octennol provenientes da degradação dos ácidos graxos n-9; heptanal que pode ser formado por clivagem dos ácidos graxos n-6 ou n-9.
16 H isomerização OH O2 O2 OH COOH C H 13 12 10 9 COOH C 13 12 10 9 COOH C 12 11 9 10 13 12 C COOH 11 10 COOH C OO 12 10 9 11 C COOH OO 10 11 12 13 COOH C OOH 12 11 9 10 C COOH OOH 13 12 11 10 + OH + + OU C COOH O 13 12 C COOH O 12 13 C O H C COOH C COOH H OH C C COOH O H OH + C O H 3-nonenal 2,4-decadienal + hexanal +OH clivagem + C OH + OU COOH C O 9 10 C O H COOH C COOH C O H COOH C O 10 9 C OH COOH C O H pentanol isomerização clivagem clivagem clivagem 9-OOH 13-OOH RH R RH R
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1.4 Oxidação do colesterol
O colesterol (C27H46O) é largamente distribuído nos alimentos de origem animal, está
presente em todas as membranas celulares, participa do metabolismo de hormônios esteroides, da síntese de sais biliares e de vitaminas lipossolúveis no organismo animal, assim como no metabolismo humano. O colesterol apresenta um núcleo formado pela união de quatro anéis (A, B, C, D) com uma ligação dupla entre os carbonos 5 e 6, no anel B (figura 2), tornando a molécula suscetível à oxidação pela ação de agentes físicos e químicos, tais como, o oxigênio, a luz, o calor, a presença de metais, de fotossensibilizadores e radicais livres (Smith,1987; Wasowicz, 2003; Lengyel et al., 2012). O carbono 3 do anel A possui uma hidroxila que pode reagir com ácidos graxos insaturados e saturados tanto de cadeia curta como longa formando os ésteres de colesterol.
A oxidação do colesterol é muito similar à oxidação de ácidos graxos insaturados e ocorre preferencialmente no carbono 7 alílico à ligação dupla do anel B, pois esta reação é favorecida devido à menor energia de ativação para a abstração do hidrogênio (Wasowicz, 2003; Lengyel et al., 2012). HO 27 26 25 24 23 22 21 20 19 18 17 16 15 14 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 A B C D
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Os óxidos de colesterol formados são muito similares à estrutura do próprio colesterol com adição de grupos hidroxila, cetona ou epóxido no núcleo do esterol, e/ou grupos hidroxila na cadeia lateral. Mais de 80 produtos da oxidação do colesterol já foram identificados (Lengyel et al., 2012). Os principais óxidos de colesterol formados em produtos marinhos após tratamento térmico são os provenientes da oxidação do anel B do colesterol, 7-cetocolesterol, 7α-hidroxicolesterol, 7β-hidroxicolesterol, 5,6α-epoxicolesterol e 5,6β-epoxicolesterol (Al-Saghir et al., 2004; Ohshima, 2002). Porém, outros autores já encontraram em produtos marinhos óxidos gerados a partir da cadeia lateral do colesterol, como 20α-hidroxicolesterol, 22S-hidroxicolesterol, 24S-hidroxicolesterol, 22R-hidroxicolesterol, 25-hidroxicolesterol e 26-hidroxicolesterol (Saldanha e Bragagnolo, 2007; 2008; Saldanha et al., 2008). A figura 2 mostra os principais produtos da oxidação do colesterol encontrados em alimentos.
Embora não estejam estabelecidos os níveis seguros de ingestão de óxidos de colesterol, estes compostos podem ser absorvidos a partir da dieta numa proporção de 6 a 90%, e a exposição crônica pode constituir um risco a saúde humana, dados aos efeitos potencialmente aterogênicos (Garcia-Cruset et al., 2002), citotóxicos, mutagênicos e possivelmente carcinogênicos (Larsson et al., 2006; Roussi et al., 2007; Otaegui-Arrazola et al., 2010; Alemany et al., 2012). Vários pesquisadores têm relatado que alguns métodos de cocção podem aumentar significativamente a oxidação do colesterol, elevando o conteúdo total dos óxidos de colesterol, e modificar o valor nutricional dos alimentos em relação ao produto original (Echarte et al., 2001).
O 25-hidroxicolesterol e o colestanotriol são os óxidos de colesterol considerados mais citotóxicos, pois podem inibir completamente o crescimento e desenvolvimento celular. Este efeito foi observado em vários experimentos realizados in vitro com culturas de células musculares aórticas de coelhos, células embrionárias de hamsters, células musculares de artérias e fibroblastos de ratos, macrófagos e células vasculares de porcos. Alguns estudos in
vivo com coelhos sugeriram um possível mecanismo relacionado com a alteração do sistema
imune induzido pelos óxidos de colesterol, observando uma inibição sobre os primeiros estágios da divisão dos linfócitos, como também da proliferação e transformação dos mesmos, podendo ocorrer também à inibição da atividade de enzimas celulares específicas (Alemany et al., 2012)
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Geralmente a análise de colesterol e óxidos de colesterol envolve as seguintes etapas: extração dos lipídios totais com solventes orgânicos ou mistura de solventes; remoção do solvente; saponificação alcalina dos lipídios totais; extração da matéria insaponificável com solventes orgânicos; remoção do solvente e separação cromatográfica. Os métodos de saponificação a frio estão entre os mais utilizados para iniciar o procedimento de purificação da amostra já que alguns pesquisadores reportaram em seus trabalhos que a saponificação sob aquecimento proporciona a degradação do 7-cetocolesterol (Ahn et al, 1999; Baggio e Bragagnolo, 2004; Guardiola et al, 2004)
A análise por cromatografia gasosa requer uma etapa de derivatização química gerando trimetilsilil (TMS) derivados com intuito de aumentar a volatilidade dos óxidos, evitar picos com cauda e aumentar a estabilidade térmica dos hidroxicolesterol. A reprodutibilidade da reação de derivação depende do reagente de silanização, das condições de reação e da proporção entre a quantidade de reagente e grupos hidroxilas (Guardiola et al, 2004). Caso a derivatização seja incompleta, vários picos cromatográficos podem ser formados a partir de um único composto. A silanização pode ocorrer com ou sem a adição de solventes, entre os solventes mais utilizados estão piridina, dimetilformamida e acetonitrila. O solvente utilizado deve ser anidro uma vez que a água compete com os grupos hidroxila dos compostos a serem derivatizados (Ahn et al, 1999). No mercado existem vários reagentes cujo poder de derivatização varia de acordo com a mistura, sendo o Sylon BFT (BSTFA + TMCS, 99:1): N,O-Bis(trimetilsilil)trifluoroacetamida (BSTFA), trimetilclorosilano (TMCS) e o Sylon BTZ (BSA + TMCS + TMSI, 3:2:3): N,O-bis(trimetilsilil acetamida) (BSA), N-trimetilsililimidazola (TMSI)) as misturas mais utilizadas. As colunas mais utilizadas são a HP-5 (5% difenil, 95% polimetilsiloxano) e a DB-17 HT (50% difenil, 50% polimetilsiloxano) devido a sua polaridade.
20 OH HO HO OH HO O HO O HO O OH OH HO hidroxicolesterol hidroxicolesterol 7-cetocolesterol epoxicolesterol epoxicolesterol colestanotriol HO OH 25-hidroxicolesterol
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Uma das questões mais importantes na análise e detecção de produtos da oxidação do colesterol é a geração de artefatos durante a análise. Artefatos são óxidos de colesterol não necessariamente presentes na amostra antes do início da análise, ou inicialmente presentes na amostra cujas quantidades podem ser aumentadas ou diminuídas durante a análise (Baggio e Bragagnolo, 2004). A oxidação do colesterol pode ser iniciada através da exposição à luz, oxigênio, radiação, metais de transição, açidos graxos poli-insaturados (Smith, 1987), diante disso, alguns procedimentos podem ser utilizados para prevenir a formação de artefados e superestimação dos teores de óxidos durante a análise. O processo de saponificação direta a frio previne a formação de óxidos catalisada pela temperatura, além disso, todo procedimento deve ser executado em atmosfera de nitrogênio e ausência de luz evitando assim a oxidação do colesterol.
A identificação de produtos da oxidação de colesterol se torna mais fácil com o auxilio da espectrometria de massas. No caso de cromatografia gasosa a identificação é feita pela comparação dos espectros de massas dos TMS da amostra com os de padrões autênticos, tempos de retenção e dados publicados na literatura (Apprich e Ulberth, 2004). As perdas mais comuns são: perda do grupo trimetil silanol [M – 90]+, perda de água acompanhada do grupo trimetil silanol [M – 18 – 90]+ e no caso do colestanotriol, a perda de água acompanhada de grupos trimetil silanol [M – 18 – 90 - 90]+.
A quantificação dos óxidos de colesterol é conduzida através do método do padrão interno. Os compostos mais utilizados como padrão interno que possuem polaridade similar aos óxidos são o 19-hidroxicolesterol e 6-cetocolestrol, embora outros compostos como a 7-cetopregnenolona e 22-hidroxicolesterol são também usados (Guardiola et al., 2004).
Com o intuito de inibir ou retardar a oxidação lipídica, centenas de compostos com propriedades antioxidantes têm sido propostos na literatura. Dentre estes, destacam-se os antioxidantes naturais tais como condimentos contendo pigmentos, óleos essenciais e outras substâncias com capacidade de retardar as reações oxidativas por serem menos nocivos à saúde humana.
1.5 Urucum (Bixa orellana)
O urucum é um pigmento natural extraído da superfície externa das sementes da árvore Bixa orellana (figura 3), que cresce abundantemente nas regiões tropicais. É um
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condimento utilizado na culinária do México e da América do Sul, adicionado às preparações a base de carne de peixe, porco, frango, milho e arroz, realçando a sua cor e o seu sabor. O urucum apresenta em suas sementes mais de 107 compostos voláteis que lhe conferem aroma, entre eles, o p-xileno, tolueno, α-pineno, β-pineno e γ-elemeno (Galindo-Cuspiner et al., 2002). Os principais carotenoides do urucum são a bixina e a norbixina. A bixina que apresenta na sua estrutura 25 carbonos, 9 ligações duplas conjugadas e dois grupos carboxila, sendo um deles esterificado, é o pigmento majoritário presente no extrato de urucum perfazendo 80% dos carotenoides encontrados no urucum. Além disso, é um dos poucos carotenoides que se apresenta naturalmente na forma de isômero cis, e assim como os carotenoides em geral, apresenta eficiente capacidade em desativar oxigênio singlete (Montenegro et al., 2002). A legislação brasileira autoriza a adição de até 0,002 g de urucum/100 g de carnes ou produtos cárneos, como aromatizante ou corante, somente em sua superfície (D.O.U., 1999). Se por um lado a legislação estabelece a normatização do emprego do urucum como corante, o mesmo não ocorre para a sua utilização como antioxidante.
Figura 3. Os frutos do urucuzeiro (Bixa orellana) e suas sementes.
Segundo Castro et al. (2010), a adição de 0,4% de colorífico (condimento composto de urucum e farinha de milho) em peito de frango foi suficiente para reduzir a formação de TBARS nas amostras grelhadas (165º C por 4 min de cada lado). Sancho et al. (2011) ao adicionar urucum em pó (0,1%) e coentro (0,5%) em pescada branca observaram a inibição da oxidação lipídica após 90 dias de aramazenamento a -18°C por 120 dias. Figueirêdo et al. (2014), ao adicionar urucum (0,05%) em hambúrgueres feitos de lombo suíno, observaram o
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retardo na degradação de ácidos graxos insaturados e na oxidação do colesterol durante o armazenamento a -18°C por 120 dias.
De acordo com Martínez-Tome et al. (2001), extratos aquosos de urucum apresentaram boa capacidade em desativar diversas formas reativas de oxigênio, sendo maior que o extrato de alecrim, porém menor que orégano e cominho. Cardarelli et al. (2008) realizaram a caracterização do extrato de urucum em solventes de diferentes polaridades e avaliaram a quantidade de bixina e de compostos fenólicos totais, bem como a sua capacidade em desativar radicais livres. Os autores conseguiram extrair mais bixina com acetato de etila (4,26 mg de bixina por grama de semente na base seca), enquanto que o conteúdo de fenólicos totais foi maior com metanol/água (1:1, v/v) (1,84 mg de ácido gálico equivalente por grama de semente seca). A capacidade antioxidante de desativar radicais livres (capacidade antioxidante equivalente ao Trolox - TEAC) foi maior no solvente mais polar contendo metanol/água (1:1) (9,55 mM de equivalente de trolox por grama na base seca) e menor em acetato de etila (4,14 mM de equivalente de trolox por grama na base seca), de acordo com a premissa de que os compostos fenólicos são mais eficientes em sequestrar radicais livres. Mariutti et al. (2008) também obtiveram um baixo valor de TEAC em colorífico em extrato etanólico (2,64 mM de equivalente de trolox por grama na base seca). Além disso, segundo Chisté et al. (2011) extratos de ururum extraídos com solventes de diferentes polaridades (etanol:água: 1:1, v/v; etanol:acetato de etila: 1:1 v/v; acetato de etila e água) foram capazes de sequestrar várias espécies reativas de oxigênio e nitrogênio (O•2‾, H2O2, HOCl, 1O2, •NO,
ONOO‾).
1.6 Tratamentos de alta pressão hidrostática na conservação de alimentos
O processamento de alta pressão hidrostática (APH) é uma tecnologia industrial que oferece uma alternativa mais natural e ecológica para a pasteurização e extensão da vida útil de uma vasta gama de produtos alimentares (Welti-Chanes et al., 2005). Os equipamentos de APH requerem pressões muito elevadas (normalmente entre 100 e 800 MPa), utilizam ciclos rápidos e de alta capacidade, sendo bastante eficientes na eliminação de micro-organismos patogênicos (Medina-Meza et al., 2014). O efeito do tratamento de alta pressão em micro-organismos e proteínas/enzimas é semelhante ao efeito de tratamentos que empregam altas temperaturas.
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No tratamento de APH aplicada em alimentos, o produto é acomodado em um recipiente, geralmente feito de aço inoxidável, capaz de suportar a alta pressão, em seguida é submergido dentro de um líquido que atua como meio de transmissão da pressão. Água pode ser utilizada como meio de transmissão, mas meios contendo óleo de silicone, benzoato de sódio, etanol ou glicerol também podem ser utilizados (Hendrickx e Knorr, 2002).
Existem dois princípios ligados ao uso da APH em alimentos: o princípio de Le Chatelier, o qual se aplica a todos os processos físicos, “quando um sistema que estava em equilíbrio é perturbado por uma alteração na concentração, temperatura ou pressão de um dos componentes, o sistema deslocará a sua posição de equilíbrio de forma a contrabalancear o efeito da perturbação”. Isso significa que qualquer fenômeno que está acompanhado por uma diminuição do volume será reforçado com um aumento de pressão. O segundo princípio segue a regra socrática: “a pressão é transmitida de forma instantânea e uniforme ao longo de uma amostra, se esta estiver em contato direto com o meio de pressão, hermeticamente fechado em um recipiente flexível” (Medina-Meza et al., 2014).
A utilização da APH no processamento de alimentos resulta em uma efetiva redução nas contagens microbianas e mantém a qualidade nutricional e sensorial quase inalterada, consequentemente, a APH torna-se muito útil como uma tecnologia de preservação para pós-embalados, importante para alimentos prontos para o consumo (ready to eat), produtos inteiros ou carnes frias, marisco, frutas recém-colhidas e sucos, bem como saladas, condimentos, sopas e molhos (Bolumar et al., 2012). Outros fatores importantes a respeito do tratamento de alimentos por APH são que o tempo de processamento e consumo de energia são relativamente baixos, comparados ao tratamento térmico convencional (Hendrickx e Knorr, 2002). No entanto, danos induzidos na membrana pela APH pode promover a oxidação lipídica (Andres et al., 2004) e do colesterol (Smith, 1987; Bolumar et al., 2012).
O tratamento por APH possui pouco efeito sobre compostos de baixo peso molecular tais como os compostoe de aroma, as vitaminas e os pigmentos como a clorofila e os carotenoides (Butz et al., 2002). Entretanto, dependendo do binômio pressão-tempo de exposição, a APH pode resultar em certo grau de desnaturação proteica. Isto pode resultar em mudanças na cor de matrizes proteicas, que podem adquirir aparência de carne cozida e desenvolver a consistência de borracha (Hugas et al., 2002).
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A APH tem pouco efeito sobre a oxidação lipídica a pressões abaixo de 300 Mpa, mas aumenta de forma linear para valores de pressão acima de 300 Mpa, sendo 400 Mpa o valor critco para indução da oxidação em produtos cárneos. É possível que ions metálicos (Fe+2/+3, Cu+2/+3) sejam liberados, tornando-se disponíveis para geração de radicais livres via reação de Fenton. Em produtos cárneos, a presença das hemeproteinas como a mioglobina pode ser responsável pela geração de radicais livres e descoloração do músculo (oximioglobina para metmioglobina) (Medina-Meza et al., 2014).
Clariana e Garcia-Ribeiro (2011) ao estudarem o efeito da alta pressão em presunto curado (600 MPa por 10 minutos e 900 MPa por 5 minutos) observaram que a pressurização a 900 MPa produziu um aumento nos teores de 7α-hidroxicolesterol, 7hidroxicolesterol, β-epoxicolesterol, α-β-epoxicolesterol, 25-hidroxicolesterol e 7-ketocolesterol. Em contraste, o tratamento a 600 MPa não ocasionou qualquer alteração no conteúdo de óxidos de colesterol. Os mesmos pesquisadores sugerem a utilização do 7-cetocolesterol como indicador da oxidação do colesterol. De acordo com Kato e Hayashi (1999), o aumento do conteúdo óxidos medido a 900 MPa poderia estar relacionada com a ruptura celular promovido por APH.
Tuboly et al. (2003) avaliaram a oxidação lipídica em carne de peru refrigerada ou congelada após o tratamento por APH a 200 e 400 MPa durante 20 minutos, seguido pelo armazenamento por 4 e 8 meses a 20 ºC. A oxidação lipídica foi avaliada através dos valores de TBARS e conteúdo óxidos de colesterol. Os teores de 7α-hidroxicolesterol, 7β-hidroxicolesterol e cetocolesterol aumentaram pelo efeito da alta pressão, sendo o 7-cetocolesterol o óxido mais encontrado, representando 23-37% do total de óxidos formados. Durante o armazenamento, foi observado um aumento na quantidade de óxidos de colesterol, mostrando que o processo de oxidação continua após o tratamento, provavelmente, via radicais livre provenientes da APH.
Em músculo de peixe e produtos de peixe, a auto-oxidação lipídica parece ocorrer em menor pressão, uma vez que foi observado um ligeiro aumento no valor de TBARS a pressões de 200 MPa em filetes de linguado (Chavalier et al., 2001) e de 300 MPa em sardinhas defumadas (Gómez-Estaca et al., 2007). Em salmão do Atlântico tratado em pressões variando de 150 a 300 MPa por 15 min, os valores de malonaldeído aumentaram de 3,8 a 116 μmol MDA/kg, após 6 dias de estocagem a 4º C (Yagiz et al, 2009). Vázquez et al. (2012)
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ao aplicarem APH (150, 300, 450 MPa por 2,5 e 5,0 min) em cavala e posterior congelamento, encontraram uma significativa redução na formação de ácidos graxos livres. No entanto, os autores verificaram um aumento nos produtos secundários de oxidação lipídica, em comparação com as amostras controle. Pode-se supor que a inativação das enzimas lipilíticas induzida pela pressão poderia ser a causa da diminuição dos teores de ácidos graxos livres.
1.7 Tratamento térmico
O tratamento térmico em peixe pode inibir o crescimento microbiano e inativar as enzimas lipolíticas. Entretanto, pode ter um efeito pró-oxidante ao romper a integridade celular, inativar enzimas com atividade antioxidante, liberar o ferro presente nas proteínas heme além de decompor peróxidos pré-existentes na carne, diminuir a vida de prateleira e o valor nutricional, com perda de vitaminas, alterações no perfil de ácidos graxos e formação de óxidos de colesterol (Hur et al., 2007; Yagiz et al., 2009). Além disso, o aquecimento leva à diminuição da umidade e consequente aumento do teor de gordura total (Echarte et al., 2001; Saldanha et al., 2008;).
Os resultados obtidos de estudos a respeito do efeito da cocção no teor de ácidos graxos presentes em peixes são bastante variáveis, e sugerem que tanto o método de cocção como a espécie de peixe são fatores importantes que devem ser observados. Vários autores relataram perdas significativas nos teores de EPA e DHA após a cocção (Fogerty et al., 1990; Bakar et al., 2008; Türkkan et al., 2008; Stephen et al., 2010; Saldanha e Bragagnolo 2008, Guzmán-Guillén et al., 2011; Sancho et al., 2011; Karlsdottir et al., 2014). Ácidos graxos de cadeia longa são conhecidos por sua alta suscetibilidade à auto-oxidação, devido ao seu alto grau de insaturação degradando de forma mais rápida do que os ácidos graxos mono-insaturados (AGMI) e AGS. Quando o perfil de ácidos graxos de sardinhas grelhadas a 175°C por 4 min foram comparados com o perfil de ácidos graxos de sardinhas cruas, verificou-se reduções de 32% e 23% de EPA e DHA, respectivamente (Saldanha et al., 2008). De forma semelhante, reduções de 20% de EPA e de 17% de DHA foram encontradas em filés de pescada grelhados a 165°C por 4 min (Saldanha, Bragagnolo, 2007). Por outro lado, Neff et al. (2014) demonstraram que grelhar, cozer ou fritar peixe provavelmente não tem qualquer efeito sobre o conteúdo de EPA e DHA em salmão, carpa comum, truta ou badejo (exceto
