JULIANA SILVEIRA RUAS
METABOLISMO ENERGÉTICO MITOCONDRIAL NA
PROLIFERAÇÃO DE CÉLULAS DE GLIOBLASTOMA
U-87MG E T98G EM CULTURA
CAMPINAS
2015
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS
JULIANA SILVEIRA RUAS
“METABOLISMO ENERGÉTICO MITOCONDRIAL NA
PROLIFERAÇÃO DE CÉLULAS DE GLIOMA U-87MG E T98G EM
CULTURA”
Orientador/Supervisor: Prof. Dr. Roger Frigerio Castilho
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Fisiopatologia Médica, da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas, para a obtenção do título de Mestre em Ciências.
Este exemplar corresponde à versão final da tese defendida pela aluna Juliana Silveira Ruas e orientada pelo Prof. Dr. Roger Frigerio Castilho.
Assinatura do Orientador
CAMPINAS
2015
RESUMO
A maioria das células tumorais depende da glicólise para a ressíntese de ATP durante um processo de rápida proliferação, mesmo que haja disponibilidade de oxigênio para a transdução de energia mitocondrial (Efeito Warburg). O objetivo do presente estudo foi avaliar o papel do metabolismo oxidativo mitocondrial na proliferação de células de glioblastoma humano U-87MG e T98G. Quando as células foram cultivadas na presença de oligomicina (um inibidor da ATP sintase) ou antimicina A (um inibidor do complexo III da cadeia transportadora de elétrons), observou-se apenas uma inibição parcial da proliferação das células. Notadamente, a incubação dessas células com ambos os inibidores causou uma inibição quase completa na proliferação celular. Resultados semelhantes foram observados em cultura primária de astrócitos, havendo uma queda na proliferação celular somente quando ambos os inibidores mitocondriais estavam presentes. Medidas de consumo de oxigênio indicaram que células de glioblastoma utilizam parcialmente a fosforilação oxidativa para a ressíntese de ATP e apresentam uma respiração bem acoplada. Quando se inibiu, nestas células, a fosforilação oxidativa do ADP com oligomicina ou antimicina A, houve um pequeno aumento no consumo de glicose e na produção de lactato. No entanto, o tratamento com ambos os inibidores mitocondriais promoveu um menor consumo de glicose e produção de lactato, em comparação com os efeitos que a antimicina A promoveu. Isso indica que a cadeia transportadora de elétrons quando inibida pela presença de antimicina A, promove um funcionamento inverso da ATP sintase, promovendo a hidrólise de ATP para que haja um bombeamento de prótons para o espaço intermembranar mitocodrial. De acordo com os resultados acima descritos, uma queda quase completa do potencial de membrana mitocondrial foi observada apenas quando as células de glioblastoma foram incubadas na presença de ambos os inibidores mitocondriais, oligomicina e antimicina A. Quando a análise do ciclo celular foi realizada, observou-se uma diminuição da percentagem das células em G0-G1 e um aumento nas fases S e G2-M quando tratadas com oligomicina. Quando as células foram tratadas com antimicina A e oligomicina mais antimicina A foi constatado uma diminuição
viii
significativa nas fases G0-G1 e G2-M, e um aumento na fase S. Em conclusão, estes resultados indicam que a rápida proliferação de células de glioblastoma depende da existência do potencial de membrana mitocondrial, mas não da fosforilação oxidativa ou do transporte de elétrons na cadeia respiratória.
Palavras-Chave: efeito Warburg, fosforilação oxidativa, glicólise, glioblastoma, inibidores mitocondriais, potencial de membrana mitocondrial.
ABSTRACT
Most tumor cells rely on glycolysis for ATP resynthesis during rapid proliferation, despite the availability saturating levels of oxygen for mitochondrial energy transduction (Warburg effect). The aim of the present study was to evaluate the role of mitochondrial oxidative metabolism on proliferation of human glioblastoma cells U-87MG and T98G. When cells were cultured in the presence of oligomycin (ATP synthase inhibitor) or antimycin A (inhibitor of complex III of the electron transport chain), we observed only a partial inhibition of cell proliferation. Remarkably, incubation of cells with both inhibitors caused an almost complete inhibition of cell proliferation. Similar results were observed in primary culture of astrocytes, with a decrease in cell proliferation only when both mitochondrial inhibitors were present. Oxygen consumption measurements indicated that glioma cells partially rely on oxidative phosphorylation for ATP turnover and exhibit a well-coupled respiration. In fact, shutting down mitochondrial ADP phosphorylation in these glioma cells with either oligomycin or antimycin inhibitors slightly increased glucose consumption and lactate release. However, the treatment with both mitochondrial inhibitors promoted lower glucose consumption and lactate release as compared with the effects of antimycin alone, which indicates that ATP synthase is operating reversely and thus hydrolyzing ATP and pumping H+ out when the respiratory chain is inhibited by antimycin. In agreement, an almost complete collapse of mitochondrial membrane potential was only observed when the glioma cells were incubated in the presence of both antimycin and oligomycin, but not of only antimycin. When cell cycle analyses were performed in oligomycin-treated cells, a decrease in the percentage of cells in G0-G1 phase and an increase in S and G2-M phases were observed. When cells were treated with antimycin A or oligomycin plus antimycin A, it was observed a significant decrease in G0-G1 and G2-M cell phases and an increase in S phase. Overall, our results suggest that the rapid proliferation of glioblastoma cells is dependent on the mitochondrial membrane potential, but not on oxidative phosphorylation or electron transport in the respiratory chain.
x
Key words: Warburg effect, oxidative phosphorylation, glycolysis, glioblastoma, mitochondrial inhibitors, mitochondrial membrane potential.
SUMÁRIO RESUMO...
vii
ABSTRACT ...ix
1. INTRODUÇÃO ... . 1 1.1 Metabolismo Energético ... . 11.2 Células Tumorais e o efeito Warburg ... . 7
1.3 Efeito Warburg e Síntese de Biomassa ... 10
1.4 Gliomas Humanos ... 12
2. OBJETIVOS. ... 15
2.1 Objetivo Geral ... 15
2.2 Objetivos específicos ... 15
3. MATERIAIS E MÉTODOS ... 16
3.1 Linhagens de células e reagentes químicos ... 16
3.2 Cultura de Células ... 17
3.3 Cultura Primária de Astrócitos... 17
3.4 Microfotografias ... 18
3.5 Medida de Viabilidade Celular por MTT ... 19
3.6 Medida de Viabilidade Celular por Azul de Tripan ... 20
3.7 Medida do consumo de O2 em células U-87MG e T98G intactas ... 20
3.8 Medida do Consumo de Glicose e Produção de Lactato ... 21
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3.10 Análise do Ciclo Celular em células U-87MG e T98G ... 23
3.11 Análise Estatística ... 25
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 26
4.1 Efeito da inibição da ATP sintase e/ou da cadeia transportadora de elétrons na proliferação de células de glioblastoma humano... ... .... 26
4.2 Efeitos da oligomicina e antimicina A no metabolismo energético das células de glioma ... 32
4.3 Estimativa do potencial de membrana mitocondrial em células de glioblastoma humano: Efeito de oligomicina e/ou antimicina A ... 38
4.4 Análise do ciclo celular em células de glioblastoma humano, U-87MG e T98G .. 45
4.5 Efeito da inibição da ATP sintase e/ou da cadeia transportadora de elétrons na proliferação de astrócitos primários em cultura ... 50
5. CONCLUSÕES ... 52
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 54
AGRADECIMENTOS
À Deus, por sempre direcionar meus passos e atender às minhas preces, me dar forças e me reerguer quando precisei.
Ao meu orientador e amigo, Professor Dr. Roger Frigério Castilho, por toda dedicação e paciência que teve para me ensinar e orientar ao longo de toda esta jornada. Agradeço pela oportunidade de trabalhar sob sua orientação e pela confiança depositada em mim. Ao Professor Dr. Anibal Eugênio Vercesi e sua esposa, Drª Helena, que me indicou para trabalhar neste laboratório.
Aos funcionários Edilene de Souza Siqueira Santos, Roberto C. Stahl, Drª. Márcia M. Fagian Pansani, pelos ensinamentos, companheirismo, amizade e pela ajuda. Aos alunos do Laboratório de Bioenergética e do Laboratório de Neurodegeneração Experimental, Fábio Rogério, Cláudia Navarro, Erika Rodrigues da Silva, Kézia Moura, Evellyne Figueiroa, Genoefa Amalia Dal'bó, Ana Carolina Marques, Hanan Chweih, Tiago Figueira, Juliana Ronchi, Raffaela Ignarro, Gustavo Facchini e Estela Busanello. Aos ex-alunos do laboratório, Guilherme Michelini, Daniela Melo, Ivan Cappelli, Vinícius Vercesi, Audrey de Moraes, Mary Aranda, Luciana Luz, Rute Costa, Carina Malagutti, Felipe Gustavo Ravagnini, Silvia Elaine Ferreira Melo, Sônia Ap. Gurgueira, Franco Rossato, e aos demais colegas, pelo companheirismo, pelas discussões científicas e aos momentos de descontração.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pela concessão de bolsa para o desenvolvimento dessa dissertação.
Aos meus pais, Aparecida P. Da Silveira Ruas e Luiz Roberto Ruas, por terem me dado suporte emocional, me motivado e apoiado em todos os momentos. Sou eternamente grata a vocês. Meu amor por vocês é incondicional.
Ao meu querido namorado Thomas Samara, obrigada por todo o incentivo, por cada sabádo e domingo que esteve ao meu lado fazendo companhia no
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laboratório, por todo amor e dedicação que tem por mim. À minha querida sogra, Sônia Samara, pelas conversas, pelos sorrisos, por toda sabedoria que me acrescentou na vida. Aos meus cunhados amados Cammys, Carol, Tatá, Teté e Patrick. Ao Luiz Arthur, Rodrigo, Victor Hugo e Dani.
À minha amada irmã, Roberta Silveira Ruas, e a meu cunhado, Kaue Dias de Souza, pelas risadas e conversas que me proporcionaram. Por sempre me defenderem e me apoiarem emocionalmente.
À minha avó Lais. Aos meus tios, Maria Auxiliadora, Teresa Cristina, Sueli, Sílvia, Emílo, Bernardo, Álvaro. Aos meus primos, Vivian, Kika, Carol, Samira, Emilinho, Jorginho, Léo, Lucas, Mateus. Aos agregados Mateus Dias, Marcelo, Ricardo, Juscelino, Julia, Grazi. Ao pessoal de São Paulo, tia Eneida, tio Fábio, Mané, Zé, Adriana, Rafa e Léo. A toda minha família.
Aos meus amigos, Fabio Zatta, Thais Alves, Giovani Felizardo, Augusto Sancesário, Juliana Camargo, Marindia Freitas, Ana Carolina Arruda, Carol Magalhães, Fer Pereira, Alex Oliveira, Fernanda Bonato, Alexandre Calix, Marcelo Castro Lígia Carneiro, Lucia Devito, Romualdo, Rafaela Mendonça, Mateus Vidigal, pelos momentos de descontração, pela amizade sincera, pela disposição em ouvir e por todo apoio e confiança.
Aos meus queridos avós Teresinha, Miguel e Fernando. À minha madrinha Cibele e ao tio Geraldo. Sinto muita falta de vocês. E ao colega Paolo La Guardia (In Memoriam).
E àqueles que me ajudaram e torceram por mim ao longo desses anos. Muito obrigada!
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Lista de Figuras LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Esquema das fases da glicólise e os possíveis destinos para
o piruvato Pág 03
Figura 2 Esquema ilustrando o transporte de elétrons e a fosforilação
oxidativa mitocondrial Pág 04
Figura 3 Esquema exemplificando o complexo III da cadeia
transportadora de elétrons Pág 06
Figura 4 Esquema exemplificando a ATP sintase mitocondrial Pág 07 Figura 5 Efeito inibitório de oligomicina e antimicina A na proliferação
de células de glioblastoma humano U-87MG e T98G Pág 27 Figura 6 Efeito de oligomicina e antimicina A na proliferação de
células de glioblastoma humano U-87MG e T98G Pág 28 Figura 7 Microfotografias de células U-87MG e T98G mantidas em
cultura durante 5 dias: efeito de oligomicina e/ou antimicina A Pág 30 Figura 8 Efeito inibitório de oligomicina e antimicina A no consumo de
oxigênio de células de glioblastoma humano U-87MG e T98G Pág 34
Figura 9
Avaliação do consumo de glicose e produção de lactato por células de glioblastoma humano U-87MG e T98G: Efeito de oligomicina e antimicina A
Pág 36
Figura 10
Efeito da adição de oligomicina e/ou antimicina A no potencial de membrana mitocondrial estimado em suspensões de células intactas de glioblastoma humano U-87MG e T98G
Pág 39
Figura 11
Efeito da incubação por 24 horas com oligomicina e/ou antimicina A no potencial de membrana mitocondrial de células intactas de glioblastoma humano U-87MG e T98G
Pág 42
Figura 12
Imagem ilustrativa dos histogramas obtidos em análises por um citômetro de fluxo quando se quer avaliar a intérfase do ciclo celular.
Pág 48
Figura 13 Efeito de oligomicina e/ou antimicina A no ciclo celular das
células de glioblastomas U-87MG e T98G Pág 49 Figura 14 Efeito de oligomicina e antimicina A na proliferação de
LISTA DE TABELAS
Tabela I Compostos que interferem na fosforilação oxidativa Pág 06 Tabela II Variação dos locis analisados pelo método de repetição de
arranjos curtos (STR) Pág 14
Tabela III
Porcentagens obtidas por citometria de fluxo para cada tratamento em células de glioblastoma humano U-87MG relativas a cada fase da intérfase no ciclo celular
Pág 47
Tabela IV
Porcentagens obtidas por citometria de fluxo para cada tratamento em células de glioblastoma humano T98G relativas a cada fase da intérfase no ciclo celular
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LISTA DE ABREVIATURAS
AA Antimicina A
ADP Adenosina difosfato ANOVA
atm
Análise de variância simples Atmosfera, unidade de pressão ATP Adenosina trifosfato
A.U. Unidades arbitrárias (Arbitrary units) Acetil-CoA Acetil coenzima A
BSA Ca2+
Albumina soro bovino Íon cálcio
CDKN2A Cyclin-dependent kinase inhibitor 2A
CDKN2C Cyclin-dependent kinase inhibitor 2C
C6H12O6 Molécula de glicose
CO2 Dióxido de carbono
Cyt c Citocromo c
DMEM Meio de Eagle modificado por Dulbecco (Dulbecco’s modified Eagle’s médium) DMSO Dimetilsulfóxido
DNA Ácido desoxirribonucleico DNAse Deoxiribonuclease I DPI Cloreto difenileneiodonio
EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético
EGFR Receptor de fator de crescimento epidérmico FADH2 Flavina adenina dinucleotídeo reduzido
FCCP Carbonil cianeto de p-trifluorometoxifenil-hidrazona FH Fumarato hidrase
GOD Glicose oxidase
H+ Cátion hidrogênio (próton) H2O Molécula de água
xx H2O2 Peróxido de hidrogênio
HCl Ácido clorídrico
HEPES Ácido N-2-hidroxietilpiperazina-N’-2’-etanosulfônico HIF1 Hypoxia-Inducible Factor 1
HIF1 α Hypoxia-Inducible Factor 1, subunit α
HIF1 β Hypoxia-Inducible Factor 1, subunit β
HKI Hexoquinase 1 HKII IDH2 Hexoquinase 2 Isocitrato desidrogenase 2 KCl Cloreto de potássio
LDH-A Lactato desidrogenase
MCU Canal uniporter mitocondrial (Mitochondrial uniporter channel) MTT Brometo de azul tiazoil tetrazólio
NAD+ Nicotinamida adenina dinucleotídeo, forma oxidada NADH
NADP NADP+
Nicotinamida adenina dinucleotídeo, forma reduzida Nicotinamida adenina dinucleotídeo monofosfato
Nicotinamida adenina dinucleotídeo monofosfato, forma oxidada NADPH
NNT
Nicotinamida adenina dinucleotídeo monofosfato, forma reduzida Transidrogenase de nucleotídeos de nicotinamida
O2 Oxigênio molecular
O2.- Radical ânion superóxido
Oligo Oligomicina
OXPHOS Fosforilação oxidativa PBS Tampão fosfato salina PDH Piruvato desidrogenase Pi Fosfato inorgânico
PI Iodeto de propídeo
PKM2 Piruvato quinase, isoforma M2 PTEN Phosphatase and tensin homolog
xxi RNA
RNAse
Ácido ribonucleico Ribonuclease
rpm Rotações por minuto SDH Succinato desidrogenase SDS
SNC SNP
Dodecil sulfato de sódio Sistema nervoso central Sistema nervoso periférico
SRC Coativador do receptor esteroide (Steroid receptor coactivator) STR
TIM
Repetição de arranjos curtos (short tandem repeat) Translocase de membrana mitocondrial interna TMRM
TOM
Tetrametilrodamina metil éster
Translocase de membrana mitocondrial interna TPB- Tetrafenilborato de sódio
UQ Coenzima Q
Introdução 1
1. INTRODUÇÃO
A homeostase bioquímica celular depende de processos que requerem alta demanda energética, suprida pela disponibilidade de ATP. A contínua ressíntese de ATP pode ser provida tanto pela glicólise como pela fosforilação oxidativa (OXPHOS), processo dependente da cadeia transportadora de elétrons mitocondrial (NELSON, COX, 2012). Quando a célula está em hipóxia, a geração de ATP é dependente da glicólise (NELSON, COX, 2012).Nesta Introdução serão descritos os mecanismos de obtenção de ATP por células normais e as alterações metabólicas mais comumente observadas em células tumorais. As implicações destas alterações para processos de proliferação celular e tumorigênese também serão apresentadas.
1.1 Metabolismo Energético
O metabolismo energético de uma célula depende de processos capazes de promover a ressíntese de ATP. A forma como uma célula em normóxia obtém este ATP, envolve os processos da glicólise, ciclo do ácido cítrico e fosforilação oxidativa. A glicólise é uma via central quase universal de catabolismo da glicose, sendo a via com o maior fluxo de carbono na maioria das células. Na glicólise uma molécula de glicose, contendo seis carbonos, é degradada por uma série de reações catalisadas por enzimas formando duas moléculas de piruvato, contendo três carbonos cada. Durante as reações sequenciais da glicólise, parte da energia livre liberada a partir da glicose é conservada na forma de ATP e NADH. A glicólise ocorre em dez reações, sendo as cinco primeiras consideradas a fase preparatória e as outras cinco reações a fase de pagamento (LODISH et al., 2005; NELSON, COX, 2012).
A fase preparatória da glicólise é caracterizada pela fosforilação da glicose a glicose-6-fosfato pela enzima hexoquinase e a conversão deste intermediário através
Introdução 2
de mais quatro reações à gliceraldeído-3-fosfato (aldose) mais dihidroxicetona (cetose). Nas reações desta fase, duas fosforilações são realizadas com gasto de ATP. Já na fase de pagamento, a célula recupera o gasto de ATP que ocorreu na fase preparatória. A fase de pagamento consiste em uma sequência de cinco reações com a conversão do gliceraldeído-3-fosfato em piruvato, produto final da glicólise. Nestas reações ocorre a formação de ATP e NADH. Para cada molécula de glicose metabolizada são consumidas duas de ATP na fase preparatória e quatro moléculas de ATP são produzidas na fase de pagamento, tendo um resultado líquido de duas moléculas de ATP para cada molécula de glicose convertida a piruvato (NELSON, COX, 2012).
O piruvato formado pela glicólise pode ter dois destinos (Fig. 1). Na presença de oxigênio, este piruvato é majoritariamente utilizado pelo ciclo do ácido cítrico, que provê substratos para a cadeia transportadora de elétrons mitocondrial. Quando em situação de hipóxia, o piruvato é reduzido a lactato pela lactato desidrogenase com a oxidação de uma molécula de NADH à NAD+. O NAD+ é essencial para a continuação da fase de pagamento da glicólise. Em hipóxia, o NADH não pode ser reoxidado a NAD+ pelas mitocôndrias (NELSON, COX, 2012).
Quando na presença de oxigênio, o complexo da piruvato desidrogenase (PDH), localizado na matriz mitocondrial, promove a reação de descarboxilação oxidativa do piruvato, com a redução de uma molécula de NAD+. Essa reação consiste na remoção do grupo carboxila do piruvato na forma de uma molécula de CO2. Os dois carbonos remanescentes tornam-se o grupo acetil do acetil-CoA. O
acetil-CoA entra no ciclo do ácido cítrico a medida que a enzima citrato sintase catalisa sua condensação com o oxaloacetato para a formação de citrato. Em sete reações em sequência, incluindo duas descarboxilações, o ciclo do ácido cítrico converte o citrato em oxaloacetato e libera duas moléculas de CO2. A maior parte da
energia de oxidação é temporariamente retida nas coenzimas presentes na matriz mitocondrial NADH e FADH2, formadas em quatro reações no ciclo do ácido cítrico.
O NADH e FADH2 são oxidados, respectivamente, nos complexos I e II da cadeia
Introdução 3
O2. O transporte de elétrons está acoplado ao transporte de prótons para o espaço
intermembranas nos complexos I, III e IV, gerando o gradiente eletroquímico de H+ (NICHOLLS, BUDD, 2000; NASSEH et al., 2001; NELSON, COX, 2012).
Glicose 2 Piruvato 2 ATP 2 ADP 4 ADP 2 NAD+ 4 ATP 2 NADH Fase Preparatória Fase Pagamento 2 Lactato 2 NAD+ 2 FADH2 6 NADH 4 CO2 O2 Hipóxia
Glicólise
2 gliceraldeído 3-fosfato 2 Acetil-CoA 2 CO2 2 NADHCiclo do
ácido cítrico
Fig. 1 – Esquema das fases da glicólise e os possíveis destinos para o piruvato.
Na membrana mitocondrial interna estão presentes os complexos respiratórios multienzimáticos (I, II, III e IV); além da ATP sintase (também conhecida como complexo V) e dos transportadores de elétrons, coenzima Q (UQ) e citocromo c
Introdução 4
conforme apresentados na figura 2 (NICHOLLS, BUDD, 2000; FERREIRA et al., 2008; NELSON, COX, 2012).
Fig. 2 – Esquema ilustrando o transporte de elétrons e a fosforilação oxidativa mitocondrial
(adaptado NELSON, COX, 2012).
Na cadeia transportadora de elétrons, o NADH transfere seus elétrons para a coenzima Q através do complexo I e o complexo II promove a transferência de elétrons a partir do FADH2 e succinato para a coenzima Q. Na sequência, o
complexo III transfere elétrons da coenzima Q reduzida (UQH2) para o citocromo c e
então, no complexo IV, os elétrons do citocromo c são transferidos para o oxigênio molecular, formando água (H2O). É importante ressaltar que à medida que ocorre a
passagem dos elétrons pelos complexos I, III e IV, há o movimento unidirecional de prótons da matriz para o espaço intermembranar mitocondrial. Portanto um gradiente eletroquímico de prótons é criado através da membrana mitocondrial interna (carregada negativamente) (NICHOLLS, BUDD, 2000; NELSON, COX, 2012).
Por existir um potencial eletroquímico mais positivo no espaço intermembranar quando comparado com a matriz mitocondrial, esta acaba por atrair prótons. Os
Introdução 5
prótons passam pela ATP sintase (Fig. 2) e quando isso ocorre esta muda sua conformação unindo um ADP à um fosfato (Pi), produzindo ATP (NICHOLLS, BUDD,
2000).
Portanto, a fosforilação oxidativa é o processo final do metabolismo envolvendo a produção de energia na forma de ATP, ocorrendo apenas na presença de oxigênio molecular. Estudos recentes mostram uma produção de 30 a 32 moléculas de ATP a partir de uma de glicose, como apresentado abaixo na reação final de obtenção de ATP pela fosforilação oxidativa a partir de uma molécula de glicose. Qualquer disfunção da glicólise ou da cadeia transportadora de elétrons mitocondrial influencia diretamente este processo (FERREIRA et al., 2008; MOTTA, 2011; NELSON, COX, 2012).
Inibidores mitocondriais são comumente utilizados para estudar a função mitocondrial e o papel no metabolismo energético de cada complexo multienzimático da cadeia transportadora de elétrons (NICHOLLS, BUDD, 2000). Na tabela 1 estão representados alguns destes inibidores e o modo como atuam nestes complexos. Dentre estes compostos, ressaltamos a antimicina A, oligomicina e o FCCP, que foram utilizados para o presente trabalho.
A antimicina é um inibidor do complexo III da cadeia transportadora de elétrons, este complexo é um dímero com dois monômeros idênticos, como apresentado na figura 3. Seus componentes citocromo c1 e a proteína ferro enxofre
de Rieske podem interagir com o citocromo c. Este complexo possui dois sítios de ligação para a coenzima Q, QN e QP. A antimicina A liga-se ao sítio QN, impedindo o
fluxo de elétrons do heme bH para a coenzima Q (NELSON, COX, 2012).
Introdução 6
Fig. 3 – Esquema ilustrativo do complexo III da cadeia transportadora de elétrons (NELSON,
COX, 2012).
Tipo de
Interferência Composto Alvo / Modo de ação
Inibição da transferência de
elétrons
Rotenona Impedem a transferência de elétrons do centro Fe-S (complexo I) para a coenzima Q Piericidina A
Mixotiazol Impede o fluxo de elétrons de QH2 para a proteína ferro enxofre de Rieske Antimicina A Bloqueia a transferência de elétrons do
citocromo b (complexo III) para o citocromo c Cianeto Inibe a citocromo c oxidase (complexo IV)
Inibição da ATP sintase
Aurovertina B Inibe a subunidade F1
Oligomicina Inibem as subunidades Fo e CFo Venturicidina Desacoplamento da transferência de elétrons com a fosforilação FCCP
Carreadores hidrofóbicos de prótons 2,4-Dinitrofenol
Inibição da troca
ATP-ADP Carboxiatractilosídeo
Inibe a translocador de nucleotídeos de adenina
Tabela I – Compostos que interferem na fosforilação oxidativa (NICHOLLS, BUDD, 2000;
Introdução 7
A ATP sintase (Fig. 4) possui um domínio periférico F1 e uma parte integral Fo,
acoplada a membrana interna mitocondrial. À medida que os prótons fluem do espaço intermembranas para a matriz mitocondrial através de Fo, o cilindro e a haste
giram, e as subunidades β de F1 mudam de conformação à medida que as
subunidades
ɤ
se associam com cada uma delas (KAGAWA, RACKER, 1996). Com isso, uma molécula de ADP é unida com uma de Pi, formando o ATP. Estima-se quepara cada três prótons transportados para a matriz mitocondrial pela ATP sintase, uma molécula de ATP é formada. Notadamente, a ATP sintase também pode funcionar de forma inversa, hidrolisando ATP e promovendo o transporte de prótons da matriz mitocondrial para o espaço intermembranas (NICHOLLS, BUDD, 2000).
Fig. 4 – Esquema exemplificando a ATP sintase mitocondrial (NELSON, COX, 2012).
1.2 Células Tumorais e o Efeito Warburg
Células tumorais apresentam uma organização bioenergética distinta quando comparadas a células normais. Diferentemente de células normais, onde a maior parte do ATP obtido é proveniente da fosforilação oxidativa mitocondrial, em células tumorais o ATP é proveniente majoritariamente da glicólise, mesmo na presença de oxigênio molecular. Ou seja, células tumorais apresentam predominância da glicólise e elevada produção de lactato no citosol quando comparadas com a baixa taxa glicolítica e oxidação do piruvato que ocorre na maioria das células normais. Esse fenômeno foi observado e caracterizado primeiramente por Otto Warburg há nove Matriz Mitocondrial
Introdução 8
décadas, recebendo o nome de “efeito Warburg” (WARBURG, 1925; WARBURG et
al., 1927; WARBURG, 1956; HAO et al., 2010; KOPPENOL et al., 2011).
Nos primeiros estudos de Warburg, ele observou um rápido consumo de oxigênio concomitantemente a uma rápida proliferação celular, levando-o a postular que tecidos tumorais utilizavam mais oxigênio molecular quando comparados com tecidos normais. Posteriormente, experimentos de consumo de oxigênio em fígados de ratos comprometidos por células tumorais foram realizados e observou-se que estes não consumiam mais oxigênio que tecidos normais, mas que na presença de O2 o tecido tumoral produzia lactato, o que não se observava em tecidos normais.
Isso indica que em tecidos tumorais a produção de lactato predomina sobre a entrada de piruvato no ciclo do ácido cítrico, o que daria início à fosforilação oxidativa (KOPPENOL et al., 2011).
Tecidos normais tendem a consumir menos glicose na presença de O2 do que
o verificado em uma situação de hipóxia, isso porque o rendimento energético em ATP de uma molécula de glicose é muito maior em meio aeróbico. Já os tecidos que apresentam células tumorais mostram uma produção de lactato até 100 vezes maior na presença de oxigênio molecular. Dessa forma, aproximadamente 60% da glicose consumida pelos tecidos tumorais é convertida a lactato. Com todas essas indicações, Otto Warburg propôs que o processo de respiração mitocondrial estaria danificado em células tumorais (KOPPENOL et al., 2011; WU, ZHAO, 2013). Contudo, estudos recentes têm sugerido que células tumorais apresentam mitocôndrias funcionais e que a ocorrência do efeito Warburg provavelmente está associada a uma condição que permite maior síntese de biomassa por estas células (VANDER HAIDEN et al., 2009; LUNT, VANDER HEIDEN, 2011; KOPPENOL et al., 2011).
Hipóteses vêm sendo propostas para explicar a ocorrência do efeito Warburg como mutações em proteínas responsáveis pela regulação da via glicolítica e mutações genéticas que afetam o funcionamento de enzimas do ciclo do ácido cítrico como a isocitrato desidrogenase 2 (IDH2), fumarato hidrase (FH) e a succinato desidrogenase (SDH) (WU, ZHAO, 2013). Portanto, estas alterações enzimáticas
Introdução 9
levariam a uma desregulação no metabolismo oxidativo da glicose em células tumorais.
Os fatores c-MYC e Hypoxia-Inducible Factor 1 (HIF1) também são críticos para a tumorigênese em um grande número de tumores. O c-MYC leva à indução da proliferação celular com consequente aumento em seu metabolismo. Já o HIF1 está envolvido na adaptação de células quando estas se encontram em microambientes em hipóxia, levando à ativação da glicólise (DANG, 2007). O HIF1 compreende um heterodímero constituído pelas subunidades HIF1α e HIF1β, ativando genes envolvidos na glicólise, contribuindo diretamente com o efeito Warburg. Circunstâncias em que o c-MYC e o HIF1 são aumentados na presença de oxigênio molecular, resultam em inibição do efeito Pasteur (menor consumo de glicose na presença de O2) e indução do efeito Warburg em células tumorais (KIM et al., 2006;
SIMON, 2006). Portanto, estes fatores aumentam a expressão de enzimas que irão favorecer a ocorrência da glicólise, como piruvato quinase M2 (PKM2), lactato desidrogenase (LDH-A), e hexoquinase 2 (HKII) (DANG, 2007). Estudos recentes indicaram evidências que ligam a ocorrência da glicólise aeróbica em células tumorais pela capacidade do steroid receptor coactivator (SRC) em fosforilar enzimas glicolíticas. O SRC ativa, posteriormente, o gene HIF1 que irá induzir a glicólise (KOPPENOL et al., 2011; BAYLEY, DEVILEE, 2012).
A piruvato quinase 2 (PKM2), enzima responsável pela conversão do fosfoenolpiruvato a piruvato está aumentada em células tumorais (MAZUREK et al., 2005). Sendo assim, ela permite uma maior captação e utilização da glicose e produção de lactato. Além disso, ela aumenta a transcrição do HIF1, estimulando ainda mais a glicólise (BAYLEY, DEVILEE, 2012; YANG et al., 2012). Já se sabe que ativadores da transcrição da PKM2, como o receptor de fator de crescimento epidérmico (EGFR), estão alterados em células tumorais, explicando o aumento desregulado desta enzima (PARSONS et al., 2008; YANG et al., 2012).
A lactato desidrogenase (LDH-A) é ativada pelo HIF1 e é a enzima responsável pela conversão do piruvato à lactato concomitante com a oxidação do NADH a NAD+, restabelecendo o potencial redutor para a ocorrência da glicólise. É
Introdução 10
proposto a importância de um ambiente ácido, promovido pelo lactato, favorecendo a invasão e proliferação de células tumorais para outros tecidos (SHIM et al., 1997; KOPPENOL et al, 2011; WOLF et al., 2011).
A hexoquinase 2 (HKII) é uma enzima glicolítica chave e geralmente está desregulada em células tumorais. Normalmente, encontra-se ligada à membrana mitocondrial externa, tendo acesso a um maior suprimento de ATP, com consequente favorecimento a sua maior atividade em células tumorais. Cérebros normais ou gliomas de baixo grau expressam predominantemente a HKI; por outro lado, gliomas de alto grau de malignidade hiperexpressam a HKII. Verificou-se que quando ocorre a deleção da HKII, as células são capazes de recuperar seu metabolismo glicolítico normal e aumentar a sensibilidade à morte celular, sendo assim, a HKII é apontada como uma possível resistência para a apoptose nessas células (GERSHON et al., 2013). Além disso, quando a HKII é inativada, ocorre a inibição da glicólise aeróbica, ou seja, a inibição do metabolismo predominantemente glicolítico característico de uma célula tumoral, favorecendo o metabolismo oxidativo normal. Observa-se ainda um aumento de proteínas da cadeia transportadora de elétrons e o aumento do consumo de oxigênio após a inativação da HKII (WOLF et
al., 2011; BAYLEY, DEVILEE, 2012).
1.3 Efeito Warburg e Síntese de Biomassa
Em células normais uma proliferação descontrolada não ocorre, pois estas células normalmente não utilizam todos os nutrientes presentes disponíveis em seus microambientes; a não ser que sejam estimuladas por fatores de crescimento. Células tumorais possuem mutações gênicas que alteram determinados receptores que iniciam a via de sinalização para a duplicação celular. Algumas destas sinalizações ativam a captação e o metabolismo de nutrientes, que promovem a sobrevivência e a proliferação celular. Como descrito anteriormente, células tumorais convertem piruvato à lactato mesmo na presença de oxigênio molecular, o que nos indica que o metabolismo glicolítico pode providenciar energia suficiente para a
Introdução 11
proliferação celular (VANDER HAIDEN et al., 2009; LUNT, VANDER HEIDEN, 2011). Ainda como característica das células que utilizam a glicólise aeróbica, estas apresentam uma elevada razão de ATP/ADP e NADH/NAD+ (CHRISTOFK et al., 2008; DEBERARDINIS et al., 2008).
Para que ocorra o processo mitótico de uma célula, é necessário que todo o conteúdo celular seja replicado. Sendo assim, nucleotídeos, aminoácidos e lipídeos são altamente necessários para esse processo. Apesar da hidrólise do ATP proporcionar energia livre para reações bioquímicas responsáveis pela formação da biomassa celular, este processo requer outros intermediários metabólicos. A saber, a síntese do palmitato, um importante constituinte da membrana celular, requer 7 moléculas de ATP, 16 carbonos provenientes de 8 moléculas de acetil-CoA e 28 elétrons de 14 moléculas de NADPH. Da mesma forma, a síntese de aminoácidos e nucleotídeos consome mais carbono e NADPH que o próprio ATP. Adicionalmente, para a produção de uma cadeia de ácidos graxos contendo 16 carbonos, uma molécula de glicose proporciona 5 vezes mais ATP que o necessário, enquanto é necessário 7 moléculas de glicose para a produção necessária de NADPH (VANDER HAIDEN et al., 2009, LUNT, VANDER HEIDEN, 2011).
A glicose, por si só, é capaz de fornecer todo o carbono, nitrogênio e energia livre necessária para suportar o crescimento e divisão celular. Direcionar toda glicose para a fosforilação oxidativa mitocondrial para maximizar a produção de ATP vai contra as necessidades do processo de proliferação celular. Parte da glicose deve ser desviada para percursores macromoleculares, tais como acetil-CoA para a produção de ácidos graxos, intermediários glicolíticos para a síntese de aminoácidos não essenciais, e ribose para a produção de nucleotídeos. Isso pode explicar a vantagem do efeito Warburg, onde até 90% do piruvato, proveniente da glicose, é convertido a lactato (DEBERARDINIS et al., 2007; VANDER HAIDEN et al., 2009; LUNT, VANDER HEIDEN, 2011).
Introdução 12 1.4 Gliomas Humanos
Os gliomas são neoplasias tendo origem a partir de células gliais no sistema nervoso. Os gliomas podem ser originados de astrócitos, oligodendrócitos ou células ependimárias (SILVA et al., 2010). As células da glia são células não neuronais do sistema nervoso que proporcionam suporte e nutrição aos neurônios. Os neurônios são responsáveis pela propagação de impulsos nervosos, já as células da glia desempenham inúmeras funções. As células da glia são um conjunto de vários tipos celulares, dentre estes microgliócitos, células ependimárias, astrócitos, oligodendrócitos, e células de Schwann (MACHADO, 2006).
Os microgliócitos são células que representam o sistema mononuclear fagocitário no sistema nervoso central (SNC), ou seja, eles são os macrófagos do tecido nervoso, participando assim do processo de inflamação e da reparação desse tecido. Os microgliócitos também secretam diversas citocinas, as quais regulam o processo imune e removem os restos celulares que surgem nas lesões do SNC. As células ependimárias revestem os ventrículos cerebrais e o canal medular e são responsáveis pela formação do líquido cefalorraquidiano. Os astrócitos estão relacionados à homeostase metabólica e iônica do SNC, desempenhando papéis como o funcionamento e formação das sinapses, nutrição dos neurônios, regulação da concentração de diversas substâncias com potencial para interferir nas funções neuronais, liberação de neurotransmissores e participação na barreira hematoencefálica. Dentre estas funções, se destacam as de sustentação e nutrição dos neurônios. As extremidades dos prolongamentos dos astrócitos circundam os vasos sanguíneos e através deles, os nutrientes são levados até os neurônios. Os oligodendrócitos são os responsáveis pela formação da mielina a partir de lipídeos e proteínas. A mielina envolve os neurônios do sistema nervoso central fornecendo uma proteção isolante aos neurônios. As células de Schwann possuem a mesma função dos oligondendrócitos, diferenciando que as bainhas de mielina são produzidas em volta dos axônios do sistema nervoso periférico (SNP) (LODISH et al., 2005).
Introdução 13
Os gliomas são divididos em várias categorias de acordo com as células que os originaram. Os mais frequentes são os astrocitomas, oligodendrogliomas e ependimonas. De acordo com a morfologia e histologia, os astrocitomas são subdivididos em quatro grupos de acordo com seu grau de malignidade. Os astrocitomas pilocíticos, ou de grau I, apresentam um crescimento lento, limites morfológicos bem definidos e geralmente estão restritos a uma determinada região do SNC. Já o astrocitoma de baixo grau, ou grau II, é um tipo de astrocitoma de crescimento relativamente lento, porém mais rápido do que o astrocitoma pilocítico. Pode ou não invadir o tecido cerebral normal, no entanto tende a reaparecer após o tratamento. Este reaparecimento pode ocorrer em um grau de malignidade maior. O astrocitoma anaplásico, ou de grau III, cresce mais rapidamente do que o astrocitoma de grau II, tendo uma tendência a invadir o tecido cerebral normal e também de recidivar após o tratamento. O astrocitoma de grau IV, conhecido como glioblastoma multiforme, é o tipo mais maligno e com o crescimento mais rápido de todos os astrocitomas. Sob um microscópio, vários tipos de células diferentes podem ser observados neste tumor, incluindo astrócitos e oligodendrócitos. Áreas de necrose tumoral também são frequentemente observadas no centro do tumor. O glioblastoma multiforme tende a crescer e se espalhar rapidamente, invadindo o tecido normal do cérebro. A conduta no que diz respeito ao seu tratamento ainda é bastante ineficaz apresentando um prognóstico, na maioria das vezes, bem ruim, com uma expectativa média de vida de aproximadamente 14 meses a partir do momento do diagnóstico (LOUIS et al., 2007; INSTITUTO ONCOGUIA, 2012).
Existem várias linhagens celulares imortalizadas de gliomas que são utilizadas no estudo destas neoplasias malignas que acometem o sistema nervoso central. A linhagem U-87MG é uma linhagem imortalizada de glioblastoma multiforme humano que possui os genes mutantes CDKN2A, PTEN e CDKN2C. A segunda linhagem celular utilizada neste estudo, T98G, também é derivada de um glioblastoma multiforme humano. A diferença no cariótipo destas células encontra-se descrita a seguir na tabela II e foi estabelecida pelo método de análise de repetição de arranjos curtos (STR, short tandem repeat). A análise de repetição de arranjos curtos é uma
Introdução 14
técnica de análise para avaliar regiões específicas no DNA. Aproximadamente 99% do DNA de um ser humano é idêntico ao DNA de qualquer outro ser humano. No entanto, regiões polimórficas do DNA podem variar de pessoa para pessoa. Um tipo de polimorfismo do DNA são as repetições de arranjos curtos. Portanto, a análise de
STR verifica a variação do número de repetições em cada região polimórfica, sendo
assim, a variação nas repetições distingue um perfil de DNA entre os seres humanos (ATCC, 2014).
Loci dos polimorfismos
Análise de Repetição de Arranjos Curtos - STR
U-87MG T98G Amelogenin X X,Y CSF1PO 10,11 10,12 D13S317 8,11 13 D7S820 8,9 9,10 D5S818 11,12 10,12 D16S539 12 13 vWA 15,17 17,20 THO1 9.3 7, 9.3 TPOX 8 8
Tabela II – Variação dos locis analisados pelo método de repetição de arranjos curtos (STR)
(fonte ATCC.org, 2014).
As linhagens celulares U-87MG e T98G foram utilizadas nos protocolos experimentais no presente trabalho. Astrócitos de ratos neonatos mantidos em cultura primária foram utilizados em um protocolo experimental com o objetivo de se estabelecer uma comparação com uma célula proliferativa, mas não tumoral.
Objetivos 15
2. OBJETIVOS
2.1 Objetivo GeralAs células tumorais utilizam quase que exclusivamente a via glicolítica para a obtenção de ATP, ao contrário da maioria das células não tumorais que utilizam a fosforilação oxidativa, uma via muito mais eficiente para a obtenção de ATP. Este trabalho objetivou uma melhor compreensão da bioenergética mitocondrial no processo de proliferação de células tumorais.
2.2 Objetivos específicos
a) Avaliar a importância da ATP sintase e da cadeia transportadora de elétrons na proliferação de células de glioblastoma e astrocíticas, conduzindo experimentos na ausência e presença de inibidores destes sistemas.
b) Correlacionar o efeito na proliferação celular de inibidores da ATP sintase e da cadeia transportadora de elétrons com alterações no metabolismo energético celular e do potencial de membrana mitocondrial.
Materiais e Métodos 16
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Linhagens de células e reagentes químicosA maioria dos compostos químicos, incluindo ácido N-2-hidroxietilpiperazina-N’-2’-etanosulfônico (HEPES), antimicina A, azul de tripan, brometo de azul tiazoil tetrazólio (MTT), carbonil cianeto de p-trifluorometoxifenil-hidrazona (FCCP), cloreto difenileneiodonio (DPI), dimetilsulfóxido (DMSO), oligomicina, tetrafenilborato de sódio (TPB-) foram obtidos da Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA). Iodeto de propídeo (PI) e tetrametilrodamina metil éster (TMRM) foram obtidos da Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). Os meios de cultura Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) contendo 2 g/L e 4,5 g/L de glicose, solução de tripsina/EDTA 250 mg %, tampão fosfato salina (PBS), soro fetal bovino e soro equino foram obtidos da Vitrocell (Campinas, SP, Brasil).
As soluções de antimicina A, oligomicina, TMRM foram preparadas em DMSO. As soluções de oligomicina e antimicina A foram preparadas em uma concentração de 4 mg/mL e 4 mM respectivamente, filtradas e utilizadas como soluções estoques. Para possibilitar a adição simultânea destes dois inibidores mitocondriais mantendo-se a mesma quantidade de DMSO, uma solução estoque foi preparada com ambos inibidores nas concentrações mencionadas acima.
As células utilizadas foram de linhagens derivadas de glioblastoma multiforme humano (grau IV), U-87MG e T98G. As linhagens U-87MG e T98G foram adquiridas da ATCC (Manassas, EUA). A linhagem T98G também nos foi cedida pela Profa Dra Suely Kazue Nagahashi Marie (USP, São Paulo). As células foram armazenadas em nitrogênio líquido na sala de cultura do laboratório de Bioenergética da FCM, prédio FCM 15, UNICAMP.
Materiais e Métodos 17
3.2 Cultura de Células
As células U-87MG e T98G foram continuamente mantidas a 37°C em atmosfera umidificada com 5% de CO2 e 95% de ar, em frascos de cultura de 150
cm2 de superfície e em meio Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) (2 g/L de glicose), suplementado com soro fetal bovino 10% e antibiótico (100 U/mL de penicilina e 100 μg/mL de estreptomicina). A manutenção das células foi realizada a cada dois ou três dias por meio da passagem das células (aproximadamente 50.000 células/cm2) para novas garrafas. As células aderidas foram previamente lavadas com tampão fosfato salina (PBS) e em seguida foi utilizada uma solução de tripsina/EDTA (250 mg %) a 37°C para dissociar as células da superfície. A ação da tripsina foi inativada pela adição de meio DMEM suplementado. A passagem das células para novas garrafas foi realizada após a centrifugação da suspensão a 2.800
g por 5 min e ressuspensão do sedimento resultante em 6 mL de DMEM 2 g/L
glicose suplementado. Os experimentos foram realizados quando as células estavam entre a 4ª e a 20ª passagem.
3.3 Cultura Primária de Astrócitos
Cultura primária de astrócitos foi obtida a partir de 10 a 12 ratos Wistar com idade de 2 dias, utilizando o método de MECHA et al. (2011), com modificações. Primeiramente os neonatos foram higienizados com etanol 70% e em seguida decapitados dentro de uma cabine de fluxo laminar horizontal. Utilizando materiais esterilizados, os cérebros foram dissecados em meio DMEM 4,5 g/L de glicose, sem vermelho de fenol, suplementado com antibiótico (100 U/mL de penicilina e 100 μg/mL de estreptomicina). O cerebelo, tronco encefálico e bulbos foram descartados, assim como as meninges, com auxílio de uma lupa. Em seguida, o tecido foi picotado, tratado com tripsina 30 μM e incubado a 37ºC em atmosfera umidificada com 5% de CO2 e 95% de ar para dissociação. Após 20 min, DMEM 4,5 g/L de
glicose, suplementado com 10% de soro eqüino, 5% de soro fetal bovino e antibiótico (100 U/mL de penicilina e 100 μg/mL de estreptomicina) foi adicionado para
Materiais e Métodos 18
inativação da tripsina na presença de DNAse 1 mg/mL. O tecido foi então dissociado mecanicamente com pipeta sorológica previamente revestida com soro fetal bovino, e o homogenato celular resultante foi filtrado em malha de nylon de 100 μm (BD Falcon Cell Strainer) para retirada de resíduos celulares. Na sequência, a suspensão foi centrifugada a 1.000 rpm durante 10 min. O sobrenadante foi descartado e a suspensão celular foi novamente centrifugada em solução de BSA 4% para impedir contaminação por bactérias. O pellet foi ressuspendido em DMEM 4,5 g/L de glicose, suplementado com 10% de soro equino, 5% de soro fetal bovino e antibiótico (100 U/mL de penicilina e 100 μg/mL de estreptomicina). A seguir, o pellet foi disposto e mantido em 2 ou 3 garrafas com superfície de 75 cm2 próprias para a aderência de culturas celulares primárias. Após três dias, as garrafas foram mantidas sob agitação constante de 240 rpm, durante 6 horas para descolamento de oligodendrócitos e outros tipos celulares. Em seguida, as garrafas foram lavadas de 3 a 5 vezes com PBS e os astrócitos que permaneceram aderidos foram tripsinizados e passaram pelo procedimento usual de manutenção das culturas celulares, permanecendo viáveis por até 5 passagens.
3.4 Microfotografias
As microfotografias das células U-87MG e T98G foram capturadas através de microscópio Leica DMLB operando com sistema digital de imagem Leica DC 300F acoplado ao software de aquisição “Image Manager 50 1.2” (Leica Microsystems, Bannockburn, IL), localizado no Instituto de Biologia, UNICAMP. Para captura das fotos foi empregado o modo de contraste de fase óptico invertido, utilizando objetiva com aumento de 20x.
Estas células foram dispostas em placas de 6 poços (9,6 cm²/poço) em uma confluência de 15.000 células/cm² em 4 mL de meio DMEM contendo vermelho de fenol, glicose 2 g/L, suplementado como descrito no item 3.2. As culturas de células foram mantidas a 37°C em atmosfera umidificada com 5% de CO2 e 95% de ar. Após
24 h do plaqueamento (D0), o meio foi trocado e foram adicionados DMSO 0,025%, oligomicina 1 µg/mL, antimicina A 1 µM ou oligomicina mais antimicina A. Após 2 e 4
Materiais e Métodos 19
dias (D2 e D4), o meio foi renovado com as respectivas drogas. As microfotografias foram realizadas 24 horas após o plaqueamento (D0) e após 5 dias de tratamento (D5) com os inibidores mitocondriais.
3.5 Medida de Viabilidade Celular por MTT
O método de viabilidade celular por MTT é um teste colorimétrico que utiliza o sal brometo de azul tiazoil tetrazólio como substrato de uma reação enzimática. O método tem como princípio testar a viabilidade celular pela atividade enzimática de desidrogenases intracelulares (LIU et al., 1997), que convertem o sal em cristais de formazan. Os cristais de formazam são solubilizados pela adição de uma solução ácida de dodecil sulfato de sódio (SDS 10% em HCl 10 mM) e após 24 horas a densidade óptica das amostras é determinada pela subtração das absorbâncias nos comprimentos de onda 570 e 650 nm, através de um leitor de placas (BIOTEK, Power Wave XS2) (CHAPDELAINE, 2011). Este teste foi aplicado para se estimar a proliferação das células de glioblastomas em cultura, U-87MG e T98G, como também a proliferação de astrócitos em cultura primária.
A solução de MTT 1 mg/mL foi preparada em meio DMEM 2 g/L de glicose e sem vermelho de fenol e mantida por até uma semana a 4ºC. Em cada amostra, após a remoção do meio de incubação foi adicionado 2 mL da solução de MTT, seguindo-se uma incubação por 90 min a 37°C em atmosfera umidificada com 5% de CO2 e 95% de ar. Em seguida foi adicionada a solução ácida de SDS e após 24 h, as
amostras foram lidas conforme descrito anteriormente.
Previamente à adição da solução de MTT, as células foram plaqueadas em placas de 6 poços (9,6 cm²/poço) em uma confluência de 15.000 células/cm² em 4 mL de meio DMEM contendo vermelho de fenol, glicose 2 g/L, suplementado como descrito no item 3.2. As placas foram mantidas a 37°C em atmosfera umidificada com 5% de CO2 e 95% de ar durante 24 h após o plaqueamento para aderirem à
superfície dos poços. Logo após, as células foram tratadas com DMSO 0,025% (controle), oligomicina 1 µg/mL, antimicina A 1 µM ou oligomicina mais antimicina A.
Materiais e Métodos 20
Este experimento transcorreu durante 7 dias corridos, D0 – D7, onde “D” representa os dias. D0 é o tempo em que as células começaram a ser tratadas (após 24 horas do plaqueamento). D0, D2, D4 e D6 foram os dias em que o teste do MTT foi iniciado e as respectivas leituras foram feitas em D1, D3, D5 e D7. As células tiveram o meio renovado com as respectivas drogas em D2 e D4.
3.6 Medida de Viabilidade Celular por Azul de Tripan
Primeiramente foi realizado o plaqueamento das células U-87MG e T98G (5.000 células/cm2) em placas de 6 poços (9,6 cm2) e estas foram mantidas em 4 mL de meio DMEM 2 g/L com vermelho de fenol suplementado como descrito no item 3.2, mantidas a 37°C em atmosfera umidificada com 5% de CO2 e 95% de ar. Após
transcorridas 24 h (D0) para aderência das células na superfície dos poços, o meio foi trocado e foram adicionados DMSO 0,025% (Controle), oligomicina 1 µg/mL, antimicina A 1 µM ou oligomicina mais antimicina A. Após 2 e 4 dias (D2 e D4), o meio foi renovado com as respectivas drogas e as células permaneceram incubadas nas mesmas condições descritas anteriormente. Posteriormente, as células foram ressuspendidas e a estimativa da viabilidade celular foi realizada por meio da contagem das células em câmara de Neubauer após a diluição da suspensão celular em azul de tripan 0,1% em PBS. Os valores absolutos obtidos são de células viáveis por poço encontrados no quinto dia após a adição dos compostos mencionados acima (D5).
3.7 Medida do consumo de O2 por células U-87MG e T98G intactas
Para as medidas do consumo de oxigênio molecular (O2) por células intactas
em suspensão foi utilizado um oxígrafo constituído por uma cubeta de 1,4 mL com temperatura controlada a 37ºC, agitação constante e um eletrodo sensível ao oxigênio, eletrodo de Clark (Yellow Spring Instruments, EUA). Este eletrodo é envolto por uma membrana de poliestireno e por uma solução saturada de cloreto de potássio (KCl), localizada entre o eletrodo e a membrana, sendo possível a
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passagem de corrente elétrica. Considerou-se a solubilidade do oxigênio molecular (O2) em água como sendo de 200 μmol/L, a 37°C e 1 atm (ROBINSON, COOPER;
1970).
As células U-87MG e T98G foram tripsinizadas, contadas em câmara de Neubauer e adicionadas a uma concentração de 4.000.000 células/mL na cubeta do oxígrafo em meio DMEM 2 g/L com vermelho de fenol suplementado com HEPES 20 mM (pH 7,2). Após o registro da respiração basal, foi adicionada oligomicina 1 µg/mL e/ou antimicina A 1 µM, seguida pela adição de FCCP 1 µM, para se obter o máximo consumo de oxigênio.
3.8 Medida do Consumo de Glicose e Produção de Lactato
As medidas do consumo de glicose e da produção de lactato por células U-87MG e T98G em cultura foram realizadas através de kits colorimétricos comercializados pela empresa Bioclin (Belo Horizonte, MG, Brasil), cuja referência dos produtos é K082 e K084, respectivamente.
O kit de glicose é constituído por elemento tamponante (pH 7,0) 36 mmol/L, fenol 10 mmol/L, 4-aminoantipirina 0,3 mmol/L, azida sódica 7,7 mmol/L, glicose oxidase >10.000 U/L e peroxidase >700 U/L. O teste consiste na oxidação da glicose pela enzima glicose oxidase (GOD), de acordo com a seguinte reação:
Na presença da peroxidase, o peróxido de hidrogênio formado, reage com a 4-aminoantipirina e fenol, originando um produto de coloração avermelhada, cuja cor é proporcional à concentração de glicose no meio. Como padrão foi utilizado uma amostra contendo 100 mg/dL de glicose. A absorbância das amostras foi lida em um comprimento de onda de 505 nm.
O kit de lactato é constituído por tampão borato (pH 10,0), lactato desidrogenase (LDH) >24 kU/L, azida sódica 15,38 mmol/L, NAD+ >4 mmol/L e
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tampão citrato (pH 3,0) 200 mmol/L. O teste consiste na reação catalisada pela LDH entre lactato e NAD+, com a produção de piruvato e NADH.
Como padrão foi utilizado uma amostra contendo 10 mg/dL de lactato. A absorbância do NADH foi determinada em um comprimento de onda de 340 nm.
As células foram plaqueadas em placas de 6 poços (9,6 cm²/poço) em uma confluência de 15.000 células/cm² em 4 mL de meio DMEM contendo vermelho de fenol, glicose 2 g/L, suplementado como descrito no item 3.2, mantidas a 37°C em atmosfera umidificada com 5% de CO2 e 95% de ar. Após 24 h o meio foi renovado e
depois de 48 h as células foram tratadas com DMSO 0,025% (Controle), oligomicina 1 µg/mL, antimicina A 1 µM ou oligomicina mais antimicina A em meio DMEM 2 g/L de glicose, suplementado e sem vermelho de fenol. Após 20 h do tratamento, foi retirado 1 mL de meio de cada poço para a realização das dosagens de glicose e lactato, em placas de 96 poços. Os valores obtidos foram descontados do valor do branco (reagentes dos kits de determinação mais meio de cultura).
3.9 Estimativa do Potencial de Membrana Mitocondrial de Células Intactas
Dois protocolos experimentais foram utilizados para a avaliação dos efeitos dos inibidores mitocondriais no potencial de membrana mitocondrial em células intactas, U-87MG e T98G. No primeiro protocolo, avaliou-se o efeito imediato no potencial de membrana dos inibidores mitocondriais. Em um segundo protocolo, avaliou-se o impacto da incubação durante 24 horas com os inibidores mitocondriais (oligomicina e/ou antimicina A) no potencial de membrana. Em ambos os protocolos, o potencial de membrana das suspensões celulares foi avaliado sob proteção da luz em um fluorímetro (Shimadzu RF-5301PC, Kyoto, Japão) equipado com agitação magnética constante e operando em comprimentos de onda de 553 e 576 nm para excitação e emissão respectivamente, slits de 3 nm e uma resposta de 2 segundos. As suspensões celulares foram tripsinizadas e ressuspensas em meio de leitura
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DMEM 2 g/L de glicose, sem vermelho de fenol e suplementado com HEPES 20 mM (pH 7,2). Ambos protocolos foram estabelecidos pela metodologia de PERRY et al. (2011).
Para a avaliação do efeito imediato dos inibidores mitocondriais no potencial de membrana, o meio foi acrescido do marcador fluorescente catiônico, TMRM 500 nM, que é rapidamente sequestrado pelas mitocôndrias ativas, na presença de TPB -1 µM. Após 3-4 minutos adicionou-se as células (2.000.000 células/mL) ao meio de leitura e durante os 7-8 minutos seguintes observou-se a captação, pelas células, do marcador TMRM. A seguir, os inibidores mitocondriais foram adicionados conforme mostrado nas figuras correspondentes. Ao final de cada medida adicionou-se o desacoplador mitocondrial FCCP 250 nM, um protonóforo que desfaz o gradiente eletroquímico de prótons transmembrana.
No segundo protocolo para avaliação do potencial de membrana mitocondrial, 15.000 células/cm2 foram mantidas em placas de 6 poços de 9,6 cm2 e incubadas em meio DMEM 2 g/L de glicose suplementado como descrito no item 3.2 e mantidas a 37°C em atmosfera umidificada com 5% de CO2 e 95% de ar. O meio foi renovado
após 24 h e as culturas de células foram mantidas por mais 48 h a 37°C em atmosfera umidificada com 5% de CO2 e 95% de ar. A seguir, as células foram
incubadas durante 24 h na presença dos inibidores mitocondriais. Posteriormente, as células foram ressuspensas em 2 mL no meio de leitura acrescido de seus respectivos inibidores mitocondriais e TPB- 1 µM. Após os 3 primeiros minutos, adicionou-se TMRM 500 nM e a fluorescência foi acompanhada por 9-10 min. Ao final de cada traçado adicionou-se FCCP 250 nM. Para cada condição experimental, a diferença entre a fluorescência antes (F) e após a adição de FCCP (FFCCP) foi
utilizada como um parâmetro na estimativa do potencial de membrana mitocondrial.
3.10 Análise do Ciclo Celular em Células U-87MG e T98G
O protocolo experimental para a avaliação do ciclo celular nas células U-87MG e T98G foi adaptado de POZAROWSKI, DARZYNKIEWICZ (2004) e CARVALHO et
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al. (2008) utilizando-se iodeto de propídeo (PI) mediante a presença dos tratamentos
com DMSO 0,025% (Controle), oligomicina 1 µg/mL, antimicina A 1 µM ou oligomicina mais antimicina A. O experimento transcorreu durante 6 dias. Primeiramente, as células foram plaqueadas em garrafas de 25 cm² (7.000 células/cm²) em 6 mL de meio DMEM 2 g/L de glicose com vermelho de fenol, suplementado conforme descrito no item 3.2 e mantidas a 37°C em atmosfera umidificada com 5% de CO2 e 95% de ar. Após 24 horas do plaqueamento, essas
células sofreram o processo de carenciamento, que consiste na troca por um meio DMEM 2 g/L de glicose suplementado apenas com antibiótico (100 U/mL de penicilina e 100 μg/mL de estreptomicina). Nesta etapa, o soro fetal bovino, que é um fator de crescimento celular, foi retirado possibilitando que todas as células partissem da mesma fase do ciclo celular. Após 24 horas do carenciamento (D0), as primeiras amostras foram retiradas e mantidas à -20ºC, para avaliar a sincronização das fases do ciclo celular, e as outras amostras receberam seus tratamentos específicos. Após 48 horas (D2), o meio foi renovado com seus respectivos tratamentos e então, após mais 48 horas (D4) as amostras foram tripsinizadas, centrifugadas a 4°C durante 5 minutos à 500 g. As suspensões celulares foram ressuspendidas em 1 mL de etanol 70% e mantidas a -20ºC. As células permaneceram nesta temperatura por pelo menos 24 horas para que ocorresse a lise da membrana plasmática e nuclear, liberando o DNA.
As amostras retiradas do freezer foram centrifugadas à 4°C, durante 10 minutos, à 500 g. O sobrenadante foi aspirado delicadamente com uma pipeta automática e descartado. Ao pellet de células, foi adicionado 4 µL de RNAse 1 mg/mL, e 40 µL de uma solução com o marcador fluorescente iodeto de propídeo (1% citrato de sódio, 1% triton X-100 e 500 µg/mL de iodeto de propídeo) e 356 µL de PBS, totalizando um volume final de 400 µL. As amostras foram incubadas à 37ºC, durante 30 min, protegidas da luz e em seguida foram incubadas à 4ºC, durante 2 h, protegidas da luz. A análise do ciclo celular foi realizada por um citômetro de fluxo FACSCalibur (Becton Dickinson), equipado com laser de argônio, por meio da leitura da fluorescência do iodeto de propídeo (PI) captado no canal
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2, coletando-se 10.000 eventos de cada amostra. Os dados resultantes foram analisados utilizando-se o software ModFit LT versão 2.0.
3.11 Análise Estatística
Os dados experimentais foram analisados utilizando-se o software GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, La Jolla, CA). Os valores foram submetidos à análise de variância de medidas repetidas (ANOVA de uma ou duas vias), seguida por teste Bonferroni. Os dados estão representados como a média ± erro padrão da média (± SEM) de pelo menos quatro experimentos independentes onde P < 0,05 (*, #) e P < 0,01 (**, ##) foram considerados significativos.
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4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Células tumorais utilizam preferencialmente a glicólise como fonte de obtenção de ATP, ao contrário de células diferenciadas e não tumorais que utilizam sobretudo a fosforilação oxidativa para a produção do mesmo. Na glicólise são produzidos somente 2 ATPs por molécula de glicose, enquanto que na fosforilação oxidativa são obtidos aproximadamente 30 ATPs. Sendo assim, as células tumorais utilizam pouco a mitocôndria para a obtenção de energia. Os experimentos descritos a seguir foram realizados tentando elucidar qual o papel da bioenergética mitocondrial na proliferação de células de glioblastoma humano.4.1 Efeito da inibição da ATP sintase e/ou da cadeia transportadora de elétrons na proliferação de células de glioblastoma humano
Para verificar a taxa de proliferação das células de glioblastoma humano, U-87MG e T98G, três metodologias distintas foram utilizadas: teste de redução do MTT com a produção de cristais de formazan (Fig. 5), contagem de células viáveis pelo método de exclusão com azul de Tripan (Fig. 6) e aquisição de microfotografias por um microscópio de contraste de fases invertido (Fig. 7).
Em células U-87MG mantidas em cultura durante 6 dias, observou-se que em situação controle ocorre um aumento de aproximadamente 14 vezes na atividade metabólica de redução do MTT, o que pode ser evidenciado pelos valores de absorbância que passaram de 0,1 para 1,4 neste período. Quando estas células foram tratadas com oligomicina, um inibidor da ATP sintase, observou-se uma inibição de 21,1% na proliferação desta linhagem. Uma vez que o tratamento transcorreu com antimicina A, um inibidor do complexo III da cadeia transportadora de elétrons, a inibição da proliferação celular foi de 49,8%. Quando ambas as drogas estavam presentes, i.e. oligomicina mais antimicina A, as células mostraram um pequeno aumento na proliferação durante os 4 primeiros dias, seguido por uma tendência à diminuição da atividade metabólica da redução do MTT até o final do
