CAPACIDADE ANTIOXIDANTE EM HIDROLISADO DE
TILÁPIA DO NILO
O.L.G.S. Nunes
1, A. Signor
2, M.L. Fiorese
3, I.J. Baraldi
4, S. Cottica
5, J.K. Finkler
6, P.
Dalposso
7, D. Nardino
81- Grupo de Estudos de Manejo na Aquicultura – Universidade Estadual do Oeste do Paraná - Campus de – Toledo - CEP: 85903-000 – Toledo – PR – Brasil, Telefone: (45) 3379-7000 – e-mail: (ortencianunes@yahoo.com.br).
2- Grupo de Estudos de Manejo na Aquicultura – Universidade Estadual do Oeste do Paraná - Campus de – Toledo - CEP: 85903-000 – Toledo – PR – Brasil, Telefone: (45) 3379-7000.
3 - Engenharia Química - Universidade Estadual do Oeste do Paraná - Campus de – CEP: 85903-000 – Toledo – PR – Brasil, Telefone: (45) 3379-7000.
4 - Universidade Tecnológica Federal do Paraná – Campus de Medianeira – CEP: 85884-000 – Medianeira – PR – Brasil, Telefone: (45) 3240-8000.
5 - Universidade Tecnológica Federal do Paraná – Campus de Toledo – CEP: 85902-490 – Toledo – PR – Brasil, Telefone: (45) 3379-6800.
6 - Grupo de Estudos de Manejo na Aquicultura – Universidade Estadual do Oeste do Paraná – Campus de Toledo – CEP: 85903-000 – Toledo – PR – Brasil, Telefone: (45) 3379-7000.
7 - Universidade Tecnológica Federal do Paraná – Campus de Toledo – CEP: 85902-490 – Toledo – PR – Brasil, Telefone: (45) 3379-6800.
8 - Universidade Tecnológica Federal do Paraná – Campus de Toledo – CEP: 85902-490 – Toledo – PR – Brasil, Telefone: (45) 3379-6800.
RESUMO – o estudo teve por objetivo avaliar a capacidade antioxidante em hidrolisados de corte em “V”, resultante do processamento de tilápia do Nilo. Diferentes condições de pH (7,5, 8,5 e 9,5), temperatura (55, 65 e 75°C) e concentração enzima-substrato (ES) (0,05, 0,15 e 0,25% (p.p-1)) foram
estabelecidas pela aplicação da ferramenta planejamento experimental fatorial 23 com duplicata no
ponto central. Amostras foram retiradas no intervalo de 60 minutos de hidrólise e avaliadas quanto à capacidade antioxidante pelo método do DPPH. Os resultados mostraram que, de um modo geral, os hidrolisados apresentaram baixa capacidade antioxidante, porém o ensaio 6, onde as condições foram pH 9,5, temperatura 75°C e concentração da enzima-substrato 0,05% (p.p-1) apresentou o maior valor,
2,90 mg EAG.g-1 extrato.
ABSTRACT – the study aimed to evaluate the antioxidant capacity in cutting hydrolysates "V" resulting from processing of Nile tilapia. Different conditions of pH (7.5, 8.5 and 9.5), temperature (55, 65 and 75 ° C) and concentration of enzyme-substrate (ES) (0.05, 0.15 and 0.25% (w.w-1)) were
established by applying the factorial design tool 23 with duplicate in the center point. Samples were
collected within 60 minutes by hydrolysis and evaluated for antioxidant capacity by DPPH method. The results showed that, generally, the hydrolysates showed poor antioxidant capacity, but test 6, where the conditions were pH 9.5, temperature 75 °C and concentration of enzyme-substrate 0.05% (w.w-1), showed the highest, 2.90 mg GAE.g-1 extract.
PALAVRAS-CHAVE: peptídeos bioativos; corte em “V”; DPPH.
1. INTRODUÇÃO
A hidrólise proteica consiste no rompimento de ligações peptídicas das proteínas, com liberação de peptídeos de diferentes tamanhos e aminoácidos livres. Pode ser catalisada por ácidos, bases ou enzimas. O processo enzimático apresenta vantagens como especificidade, controle do grau de hidrólise, condições moderadas de ação, menor conteúdo de sal no hidrolisado final e, ainda, formação mínima de subprodutos (BIASUTTI et al., 2007). O controle das condições de hidrólise enzimática das proteínas é fundamental para se obter produtos com qualidade nutricional elevada, propriedades funcionais desejáveis, características sensoriais agradáveis e atividades biológicas interessantes para aplicação em alimentos ou fármacos com o objetivo de prevenir síndromes metabólicas humanas (BIZZOTTO et al., 2005; CAPOBIANGO et al., 2006; BIASSUTI et al., 2007, BATISTA, 2011).
De alguns hidrolisados proteicos de pescado têm sido isolados e purificados peptídeos que exibem elevada atividade antioxidante (BATISTA, 2011). O mecanismo exato ainda não é conhecido, porém, sabe-se que a presença de alguns aminoácidos aromáticos, assim como histidina, tirosina, prolina têm papel importante nesse processo.
O problema da oxidação lipídica é muito relevante na alimentação e nutrição do homem. Além da deterioração da qualidade sensorial e nutricional dos alimentos, há a formação de substâncias tóxicas que contribuem para a ocorrência de processos como a aterosclerose e, possivelmente, o câncer. Assim, processos de oxidação lipídica em alimentos e em fisiologia humana devem ser estudados e conhecidos para que o homem possa melhorar suas condições de existência (FERRARI, 1998).
A indústria de filetagem de tilápia produz diariamente partes como cabeça, carcaça, víscera, escama, pele e aparas que representam mais de 65% do peixe integral. Trata-se de um material fonte de minerais, proteínas e gordura (BOSCOLO e FEIDEN, 2007) o que o torna um coproduto interessante para extração de moléculas bioativas, com destaque para as antioxidantes, benéficas para a alimentação e saúde humana.
2. MATERIAL E MÉTODOS
2.1 Matéria-prima
A matéria-prima utilizada para a hidrólise foi aparas ou cortes em “V”, originários do processo de filetagem da tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus), obtidos em um frigorífico do município de Toledo/PR. O material fresco foi moído e armazenado em embalagens próprias para alimentos a -18°C até o momento do preparo dos hidrolisados.
2.2 Hidrólise Enzimática
A hidrólise foi realizada empregando-se a enzima Alcalase® 2.4 L FG EC (3.4.21.62),
gentilmente cedida pela empresa Novozymes Latin America Ltda. Foram produzidos hidrolisados em diversas condições como pH a 7,5, 8,5 e 9,5, temperatura a 55, 65 e 75 °C e concentração enzima-substrato (ES) a 0,05, 0,15 e 0,25% (p.p-1). A hidrólise foi conduzida em reator experimental de vidro
borossilicato, encamisado com banho termostático acoplado e controle dos parâmetros pH, agitação e temperatura. Amostras foram coletadas nos intervalos de 60 minutos de hidrólise e a inativação da enzima foi feita pelo aumento da temperatura até 90 oC durante 20 minutos. Os produtos da hidrólise
foram acondicionados em recipientes e estocados em freezer para posterior liofilização e avaliação da atividade antioxidante.
2.3 Secagem dos Hidrolisados
Para obtenção de um produto em pó com suas características preservadas e assim, poderem ser avaliadas quanto a capacidade antioxidante, realizou-se o processo de secagem dos hidrolisados em liofilizador marca Labconco.
2.4 Planejamento Experimental
Para a realização dos ensaios foi utilizado um planejamento experimental fatorial 23 com
duplicata no ponto central cujas variáveis foram pH, temperatura (°C) e concentração de enzima-substrato (p.p-1) e seus valores reais e codificados constam na Tabela 1.
Tabela 1 - Níveis reais e codificados das variáveis estudadas no planejamento fatorial 2³.
Variáveis Níveis
-1 0 +1
pH 7,5 8,5 9,5 Temperatura (°C) 55 65 75 Concentração enzima-substrato (%) 0,05 0,15 0,25
2.5 Capacidade Antioxidante dos Hidrolisados
A capacidade antioxidante foi desenvolvida utilizando a metodologia da captura de radicais livres pelo DPPH. (1,1-difenil-2-picril-hidrazila) e a quantificação foi em espectrofotômetro a 517 nm,
empregando metanol como branco e Trolox como controle positivo, conforme descrito por Bondet et al., (1997). Os resultados foram expressos em mg de equivalente em ácido gálico por grama de extrato (mg EAG.g-1 extrato).
2.6 Análise Estatística do Planejamento Experimental
A metodologia de superfície de resposta, e a análise de variância (ANOVA) foram utilizadas para avaliar os resultados obtidos pelo planejamento estatístico fracionado 23, a partir do software
STATISTICATM, versão 7.0 (Statsoft, Inc.).
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
A Tabela 2 apresenta os resultados obtidos para a capacidade antioxidante, nas diferentes condições de hidrólise testadas para um tempo fixo de 60 minutos de reação.
Tabela 2 – Valor médio da capacidade antioxidante com o respectivo desvio padrão para os ensaios de hidrólise após 60 minutos de reação com enzima Alcalase®.
Ensaio pH Temperatura (°C) Concentração enzima-substrato (%) (p.p-1) Capacidade antioxidante (mg EAG.g-1extrato) Desvio Padrão 1 7,5 55 0,05 1,96 ± 3,23 x 10-5 2 7,5 55 0,25 2,22 ± 2,77 x 10-5 3 7,5 75 0,05 2,17 ± 3,39 x 10-5
4 7,5 75 0,25 1,91 ± 5,66 x 10-6 5 9,5 55 0,05 1,93 ± 3,33 x 10-5 6 9,5 55 0,25 2,71 ± 1,98 x 10-4 7 9,5 75 0,05 1,79 ± 2,83 x 10-5 8 9,5 75 0,25 1,94 ±1,90 x 10-5 9 8,5 65 0,15 2,07 ±2,83 x 10-5 10 8,5 65 0,15 2,05 ±2,01 x10-5
De um modo geral, os hidrolisados não produziram expressiva capacidade antioxidante. Observa-se na Tabela 2, que o melhor valor encontrado se refere ao ensaio 6 (2,71 mg EAG.g-1
extrato), onde tem-se a condição de maior pH (9,5) e adição de enzima (0,25% (p.p-1)), e baixa
Temperatura (55oC).
A Tabela 3 apresenta a estimativa dos efeitos principais e de interação das variáveis utilizadas no planejamento experimental fracionado 23. De acordo com a Tabela 3, verifica-se que,
entre as variáveis estudadas, com exceção do pH, todas são significativas, incluindo as suas interações, ou seja, possuem influência na quantidade de antioxidante produzido dentro do intervalo de confiança de 95% (p-valor<0,05).
Os resultados obtidos foram submetidos à análise de variância (ANOVA), a qual foi utilizada na regressão dos dados experimentais e das superfícies de resposta, conforme os valores apresentados na Tabela 4. A partir do teste F, comparou-se o valor de F calculado (Fcalc) com F
tabelado (Ftab). O valor de F tabelado para um intervalo de confiança de 95% é de Ftab(1;9;0,05) = 5,12.
Verifica-se que Fcal é muito maior que Ftab, mostrando que, pelo teste F, o modelo de
regressão resultante da análise estatística descreve adequadamente a capacidade antioxidante como resposta à influência das variáveis significativas, conforme equação obtida: Capacidade antioxidante = 2,90606 + 0,49750* pH + 0,09500*T + 0,62500*Enzima 0,01013*pH*T + 1,16250pH*enzima -0,14375*T*Enzima.
Portanto, o coeficiente do modelo de regressão com maior relevância para a capacidade antioxidante é o termo linear da variável Enzima, seguido do termo quadrático da variável de interação pH e enzima.
Tabela 3 - Análise de variância para o planejamento fatorial completo 23 com 60 minutos de hidrólise.
SQ GL QM F p-valor (1) pH 0,001513 1 0,001513 2,8628 0,189228 (2) Temp 0,127512 1 0,127512 241,3486 0,000580 (3) Enzima 0,108113 1 0,108113 204,6293 0,000740 1by2 0,082012 1 0,082012 155,2287 0,001114 1by3 0,108113 1 0,108113 204,6293 0,000740 2by3 0,165313 1 0,165313 312,8943 0,000394 Error 0,001585 3 0,000528 Total SQ 0,594160 9 R2 = 99,73 %
Tabela 4 – Análise de variância (ANOVA) dos ensaios do planejamento fracionado 23 para 60 minutos de hidrólise. SQ GL QM F p-valor Intercept 98,36235 1 98,36235 26485,67 0,000000 Tratamento 1,24222 9 0,13802 37,17 0,000000 Error 0,04828 13 0,00371
As superfícies de resposta geradas a partir da análise estatística dos resultados são apresentadas na Figura 1 (a), (b) e (c).
A avaliação das relações existentes entre as variáveis significativas sobre a capacidade antioxidante mostra que a variável enzima, seguida da interação enzima pH mostraram maior influência sobre a mesma, em comparação com as demais variáveis estudadas. A temperatura influenciou de forma negativa, ou seja, valores menores promovem capacidade antioxidante melhor.
Figura 2 - Superfícies de resposta: (a) Conc. enzima x pH; (b) pH x Temperatura e (c) Conc. enzima x Temperatura para o planejamento experimental com 60 minutos de hidrólise.
(a) (b)
4. CONCLUSÕES
Apesar dos hidrolisados de corte em “V” de tilápia do Nilo, utilizando enzima Alcalase®
terem apresentado baixa capacidade antioxidante, os parâmetros pH, temperatura e concentração e enzimática e suas interações influenciam fortemente nessa atividade.
A continuidade da pesquisa prevê a avaliação da capacidade antioxidante dos hidrolisados por outras metodologias mais sensíveis para a matriz estudada.
5. AGRADECIMENTOS
À CAPES pela concessão da bolsa de pós-doutorado à primeira autora. Às empresas Tilápia Brazilian Fischeries Pescados e Peixes pelo fornecimento da matéria-prima e à Novozymes pelo fornecimento da enzima Alcalase®.
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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Pescado. Ciência, Tecnologia, Inovação e Legislação. Editora Atheneu, São Paulo, Brasil, p. 386 –
398.
Biasutti, E.A.; Lopes, D.C.; Souza, M.W.S.; Campos, R.B.D.; Segall, S.D.; Silvestre, M.P.C. (2007). Obtenção de hidrolisados do soro de leite com alto teor de oligopeptídeos utilizando-se a subtilisina.
Braz. J. Food Techonol., v. 10, n. 4, p. 225-232.
Bizzotto, C.S.; Capobiango, M.; Silvestre, M.P.C. (2005). Evaluation of functional properties of a blood protein. Pak. J. Nutr., v. 4, n. 1, p. 11-16.
Bondet, V.; Brand-Williams, W.; Berset, C. (1997). Kinetics and mechanisms of antioxidant activity using the DPPH. free radical method. Lebensmittel-Wissenschaft und-Technologie, 30 609-615.
Boscolo, W.R. & Feiden, A. (2007). Industrialização de tilápias. Toledo: GFM Gráfica & Editora. 117p.
Capobiango, M.; Bizzotto, C.S.; Biasutti, E.A.R.; Silvestre, M.P.C. (2006). Action of pepsin on emulsifying properties of globin. Int. J. Food Prop., v. 9, n. 2, p. 357-364.
Ferrari, C. K. B. (1998). Oxidação lipídica em alimentos e sistemas biológicos: mecanismos gerais e implicações nutricionais e patológicas. Rev. Nutr., Campinas, 11(1): 3-14, jan./jun.
Lowry, O. H.; Rosebrough, N. J.; Farr, A. L.; Randall, R. J.; J. (1951). Protein measurement with the folin phenol reagente. Biol. Chem. 193, p.265 – 275.
