Estágio Ciência Viva – i3S - ERiC
ERiC – Expression Regulation in Cancer
Biomarcadores em Cancro
Prémio ATG - All Time GABBAs
Sequeira José, Pontes Diogo
Abstract
O grande desafio do cancro centra-se na existência de poucas terapias direccionadas, o que o torna numa das maiores causas de morte a nível mundial. A grande mortalidade é, principalmente, derivada de um diagnóstico tardio, o que dificulta o seu tratamento.
Deste modo, a necessidade de descobrir novas formas de diagnóstico, menos invasivas e que permitam uma deteção do cancro num estado inicial, leva à investigação de novos biomarcadores.
1. Introdução
Biomarcadores são genes, transcritos e/ou proteínas que podem ser medidos experimentalmente, que permitem identificar fenómenos associados ao funcionamento do organismo. Um exemplo de um
biomarcador poderá ser a Carboxiemoglobina (COHb), que é usada para medir a quantidade de monóxido
de carbono no sangue.
Os biomarcadores podem ser utilizados para monitorizar o desenvolvimento de um cancro ou prever a resposta a determinados tratamentos. O cancro gástrico é o terceiro cancro mais mortal e o quinto com maior incidência no Mundo, dado o seu diagnóstico ser tardio e existirem poucas terapias dirigidas. A única terapia existente para cancro gástrico é o anticorpo “Trastuzumab” que tem como alvo a proteína HER2, que por sua vez poderá estar sobre-expressa em cancro gástrico. Desta forma, a proteína HER2 pode ser considerada um biomarcador para a escolha de uma terapia dirigida para pacientes com cancro gástrico. De qualquer forma, o problema da utilização deste biomarcador, é que a sobre-expressão de HER2 só está presente em 20% dos pacientes com cancro gástrico e pode ainda existir resistência ao anticorpo “Trastuzumab” em alguns destes casos.
Uma das alterações que está associada à progressão do cancro, levando à formação de metástases é a Transição Epitelial-Mesenquimal (EMT). Este é um processo celular durante o qual células epiteliais perdem polaridade e sofrem alterações que alteram a sua morfologia e organização, adquirindo características mesenquimais, tais como morfologia fibroblastoide e aumento das capacidades migratória e invasiva. O processo reverso, Transição Mesenquimal-Epitelial (MET), também poderá ocorrer quando células mesenquimais readquirem polaridade e diminuem as suas capacidades migratórias e invasivas. Pensa-se
Cancro EMT Droga X Biomarcadores
Células E
MCF10A
Células M
MCF10A+TGFβ1
Fig.1 – Células Epiteliais (E) e Mesenquimais (M)
que com a ocorrência de EMT, as células de cancro poderão migrar e invadir outros órgãos; nestes órgãos, as células de cancro poderão então sofrer MET e readquirir polaridade estabelecendo metástases. Embora já bastante investigada, esta associação entre EMT, MET e progressão de cancro ainda gera controvérsia. A Caderina-E é uma proteína envolvida na adesão celular e a sua perda de expressão está associada à ocorrência de EMT. A expressão de Fibronectina aumenta com a perda da expressão da Caderina-E.
Assumindo que o processo EMT está associado à progressão do cancro, estudando biomarcadores de EMT e o efeito de drogas sobre estes, é possível, teoricamente, descobrir novas terapias dirigidas para cancro.
2. O b j e t i v o d a a t i v i d a d e e x p e r i m e n t a l
Durante o estágio, a atividade experimental tinha como objetivo testar uma nova droga e o seu efeito ao longo do tempo em marcadores de EMT/MET em células epiteliais. A droga e o seu alvo não serão mencionados neste Relatório dado estarem sob a alçada de um projeto de colaboração e serem potencialmente patenteáveis. O efeito da droga foi avaliado às 24, 48, 72 e 96 horas, usando as células epiteliais da linha celular humana de mama normal imortalizada denominada “MCF10A” (Anexo 1 – Informação sobre MCF10A).
Uma das questões que se levantou foi como alcançar e demonstrar o objetivo, pelo que se delinearam 3 etapas:
1. Etapa 1: Cultivar células, usando a técnica de cultura celular;
2. Etapa 2: Quantificar a expressão de marcadores EMT/MET selecionados, usando as técnicas de extração de ácidos ribonucleicos (RNA) e PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR);
3. Etapa 3: Identificar o local nas células onde os marcadores EMT/MET selecionados são (ou
3. Técnicas:
As técnicas usadas para a atividade experimental foram: 1) cultura celular; 2) extração de RNA; 3) transcrição reversa; 4) PCR quantitativo em tempo real e ainda; 5) imunocitoquímica.
3.1. Cultura Celular
1. A Cultura Celular permite-nos ter disponível células para utilizar durante toda as experiências. Requer uma linha celular imortalizada (neste caso, MCF10A), um meio adequado com nutrientes e antibióticos e ainda uma estufa que mantenha uma temperatura adequada ao crescimento celular assim como os níveis de CO2 estáveis.
2. Em relação às células, estas necessitam de ser retiradas regularmente dos frascos em que crescem, evitando crescimento excessivo. As células são retiradas dos frascos usando a enzima tripsina que quebra as ligações inter-células. Seguidamente, estas células individualizadas são ressuspendidas em meio de crescimento novo e colocadas em novos frascos para crescimento contínuo sem restrições de espaço.
3.2. Extração de RNA
Outra das técnicas desenvolvidas foi a extração do RNA, utilizando o reagente TRIpure. Esta técnica é utilizada para se obter o RNA para a realização do qRT-PCR. Para isso, é necessário a utilização dos reagentes TRIpure, clorofórmio, isopropanol e etanol a 75% (diluído em água).
Para proceder à extração do RNA é necessário:
Retirar o meio das células e acresentar o TRIpure para a lise celular, usando 1ml por cada 10cm2 de área ocupada pelas células;
Homogenizar e ressuspender num eppendorf, acrescentando o clorofórmio, num rácio de 0.2ml por
cada 1ml de TRIpure usado anteriormente;
Incubar durante 10min e centrifugar por mais 10min a 12,000 x g, a 4ºC, para permitir a separação do RNA, DNA e proteínas por solubilidade;
Transferir o RNA para um novo eppendorf e acrescentar 0.6ml de isopropanol por cada 1ml de TRIpure utilizado inicialmente;
Homogenizar, incubar à temperatura ambiente por 10 minutos e centrifugar a 12,000 x g, a 4ºC durante 10min;
Remover o sobrenadante e lavar o pellet de RNA com 0.5ml de etanol 75%.
Centrifugar durante 5min a 8,000 x g a 4ºC;
Remover o etanol usando uma micropipeta e deixar o restante evaporar;
Ressuspender o pellet em água sem contaminantes como enzimas que clivam o RNA (água
RNAse-free), quantificar RNA usando o espectrofotómetro NanoDrop e guardar a -80ºC numa arca
3.3. Transcrição reversa
Outra técnica realizada foi a transcrição reversa. Esta técnica permite a conversão do RNA em DNA complementar (cDNA), uma molécula mais estável que o RNA que poderá então para ser utilizada no qRT-PCR. Para a realização da transcrição reversa é necessário: 1) sequências de oligonucleótidos chamados “random primers” para conversão de todas as moléculas de RNA em cDNA; 2) enzima transcriptase reversa (chamada SuperScript II); 3) enzima inibidora de RNAses, que evita a degradação do RNA (chamada RNAseIN); 4) Dithiothreitol (DTT) para estabilização das enzimas; 5) dNTPs, que são os quatro tipos de deoxinucleótidos de DNA, necessários para a construção da nova cadeia de cDNA e; 6) água RNAse-free. Para esta técnica existe, igualmente, um protocolo a seguir:
Homogenizar e centrifugar todos os compostos antes de serem usados e manter as amostras em gelo;
Adicionar a um eppendorf 1μg de RNA e 1μl de random primers (0.1ug/ul).
Incubar a 70ºC durante 10min e colocar no gelo durante 2min;
Preparar uma solução com 4μl de Buffer (5x), 2μl de DTT (100mM), 1μl de dNTPs (10mM), 0.2μl de
RNAseIn (40 Unidades/µL), 0.75μl de RT-SuperScript (200 unidades/µL) e 0.75μl de água
RNAse-free;
Desta solução, adicionar 8 μl aos eppendorfs que já contêm o RNA e random primers;
Homogeneizar e incubar durante 1 hora a 37ºC num termociclador;
Guardar o cDNA gerado a -20ºC numa arca congeladora.
3.4. PCR quantitativo em tempo real
Uma outra técnica utilizada foi o PCR quantitativo em tempo real. Esta técnica é baseada no princípio da reação em cadeia da polimerase (PCR) e é utilizada para amplificar zonas de ácidos nucleicos (determinadas pelas sequências de oligonucleótidos/sondas usados) e quantificar o material genético (DNA/RNA) obtido. Para a sua realização é necessário: 1) sondas fluorescentes desenhadas para detetar determinados genes; 2) Master Mix comercial que contem DNA polimerase e dNTPs numa solução tamponizada; 3) água RNAse-free; 4) placa de 96 poços e; 5) película para selar a placa.
Para a correta realização de qRT-PCR é necessário respeitar um protocolo, a saber:
Preparar uma solução com 17 μl de Master Mix (2x), 11.9 μl de H2O, 3.4 μl de cDNA (a 50 ng/ μl obtido anteriormente) e 1.7 μl de sonda (20x) (para cada amostra, sendo que os volumes indicados serão para a realização de três réplicas técnicas por cada sonda selecionada); Transferir 10 μl da solução para cada poço correspondente na placa;
Selar a placa e manter a 4ºC até ser processada pelo técnico, que colocará a placa num termociclador chamado 7500 System que permite a deteção de fluorescência emitida pelas sondas quando estas se ligam a cDNA .
3.5. Imunocitoquímica
Uma outra técnica utilizada foi imunocitoquímica. Esta técnica permite a identificação da expressão de marcadores através das interações anticorpo-antigene e a sua localização nas células. A imunocitoquímica assenta ainda na realização da fixação e bloqueio das ligações em excesso de proteínas, possibilitando a ligação específica dos anticorpos selecionados. Para esta técnica é necessário utilizar: 1) solução PBS para lavagens (phosphate buffered saline); 2) BSA (albumina de soro bovino, diluída a 5%); 3) metanol (permite a fixação das células e seu conteúdo); 4) Vectashield com DAPI (solução de montagem com tinta que intercala e marca o DNA com fluorescência); 5) anticorpos primários selecionados e ainda; 6) anticorpos secundários com diferentes fluorescências.
Tal como para as outras técnicas, foi necessário seguir um procedimento:
Remover o meio da cultura das células, que foram crescidas em lamelas de vidro de 10 mm por 10
mm;
Lavar três vezes as células em lamelas com PBS;
Fixar as células em lamelas com metanol durante 10min, em gelo;
Lavar 3x as lamelas com células usando solução PBS;
Colocar BSA durante 30min;
Remover BSA e incubar as células em lamelas com solução diluída do anticorpo primário (anti-E-caderina e anti-Fibronectina, ambos a 1:50) durante 1h;
Repetir o processo para o anticorpo secundário (1:500), mas no escuro, para preservar a fluorescência emitida por este anticorpo;
Lavar as lamelas com células com PBS;
Montar as lamelas com células numa lâmina com 3μl de Vectashield+DAPI colocando uma lamela
maior no topo;
Selar com verniz as extremidades das lamelas;
Guardar as lâminas com as lamelas em caixas opacas a -20ºC numa arca congeladora.
4. Resultados e Discussão da Experiência
Para a realização da experiência foram estabelecidos 4 time points (24h, 48h, 72h e 96h), sendo que foi preparada uma placa de 6 poços para cada time point, incluindo:
- Três poços com células para adição de DMSO (Dimethyl sulfoxide, o solvente da droga) ao meio normal de cultura: 2 poços para recolha de células para extração de RNA e 1 poço com lamelas para imunocitoquímica (Fig.2);
- Três poços com células para adição de Droga X ao meio normal de cultura: : 2 poços para recolha de células para extração de RNA e 1 poço com lamelas para imunocitoquímica (Fig.2);
Fig. 2 - Esquema das Placas utilizadas na Experiência DMSO Lamelas X Lamelas X RNA DMSO RNA DMSO RNA X RNA
Fig.3 - A expressão dos genes não sofreu alteração
No final de cada time point foi necessário fixar as lamelas, para imunocitoquímica, e tripsinizar os restantes
poços com recolha de células, para extração de RNA e quantificação de marcadores EMT/MET por qRT-PCR.
No que diz respeito à imunocitoquímica, foram testados dois marcadores: Caderina-E (marcador epitelial) e Fibronectina (marcador mesenquimal). Já para qRT-PCR foram testados os seguintes marcadores:
- CDH1 (gene que codifica a proteína Caderina-E, marcador epitelial);
- FN1 (gene que codifica a proteína Fibronectina, marcador mesenquimal);
- SNAI1 (gene que codifica a proteína Snail, marcador mesenquimal);
- SNAI2 (gene que codifica a proteína Slug, marcador mesenquimal);
- ZEB1 (gene que codifica a proteína Zeb1, marcador mesenquimal);
- ZEB2 (gene que codifica a proteína Zeb2, marcador mesenquimal);
- Marcador Y (gene que codifica uma proteína Y que é alvo da droga em estudo);
- GAPDH (gene que codifica a proteína GAPDH e que funciona como controlo endógeno);
No que diz respeito ao qRT-PCR, foi necessário quantificar a expressão de marcadores de EMT/MET, por comparação da expressão destes genes com o respetivo controlo (células em contacto com DMSO vs. células em contacto com a droga X, Fig.3 e 4).
Fig.5
Y
Fig.4
No que diz respeito ao gene Y, ao contrário do esperado, uma vez que se acredita que este gene é inibido pela droga X, a sua expressão génica não sofreu alterações; no caso do gene SNAI1, verificou-se uma diminuição da sua expressão às 72h, tendo normalizado às 96h. Já no caso do gene ZEB2, verificou-se um aumento da sua expressão às 24h, tendo sido normalizada às 48h.
Já nos resultados da imunocitoquímica, foram obtidas imagens de microscopia de fluorescência de células Epiteliais (E) MCF10A na presença de DMSO ou Droga X ao longo do t empo. A imunocitoquímica foi realizada fazendo a marcação de Caderina-E a verde, Fibronectina a vermelho e a azul o DAPI. [Fig.5]
D
ro
ga
X
D
MS
O
5. Discussão e conclusão
Quando fomos integrados no grupo ERiC (Expression Regulation in Cancer, i3S), informaram-nos sobre os resultados obtidos em experiências anteriores com esta droga. Ao longo do estágio continuámos essa mesma investigação, tendo chegado a resultados inconclusivos, uma vez que, ao contrário do esperado, a droga não inibiu o gene Y comparativamente com os resultados obtidos, previamente pelo grupo. Assim sendo, acreditamos que é necessário continuar a investigação, realizando réplicas, utilizando a droga X em diferentes concentrações, fazendo reboosts da droga X (acrescentando X às 72h por exemplo), aumentando o número de time points testados (testar a droga durante 168h por exemplo) e utilizando técnicas laboratoriais diferentes (Western blot por exemplo).
6. Anexos
Anexo 1 - https://www.lgcstandards-atcc.org/Products/All/CRL-10317.aspx?geo_country=pt
7. Bibliografia
EMT as the ultimate survival mechanism of cancer cells - Neha Tiwari, Alexander Gheldof, Marianthi Tatari, Gerhard Christofori;
Role of cancer microenvironment in metastasis: focus on colon cancer - Gout S, Huot J
Procedimentos – Adaptações a partir do arquivo do IPATIMUP
8. Agradecimentos
Sara Teles, Patrícia Oliveira, Ana Sofia Valente, Carla Oliveira, ERiC – Expression Regulation in Cancer, Luís Cirnes, Pedro Veloso, Cláudia Moreira, Ciência Viva, i3s, IPATIMUP
