Universidade do Grande Rio “Prof. José de Souza Herdy”
UNIGRANRIO
LEONARDO JORGE CARVALHO TEIXEIRA
Potencial osteocondutor de grânulos de
hidroxiapatita em defeitos críticos na calvária de ratos
Duque de Caxias 2009
LEONARDO JORGE CARVALHO TEIXEIRA
Potencial osteocondutor de grânulos de
hidroxiapatita em defeitos críticos na calvária de ratos
Dissertação apresentada à Universidade do Grande Rio - “Prof. José de Souza Herdy”, como requisito para obtenção de grau de mestre em Odontologia.
Área de concentração: Implantologia Oral. Orientador: Prof. Dr. Márcio Baltazar Conz.
Duque de Caxias 2009
CATALOGAÇÃO NA FONTE/BIBLIOTECA - UNIGRANRIO
T266p Teixeira, Leonardo Jorge Carvalho
Potencial osteocondutor de grânulos de hidroxiapatita em defeitos críticos na calvária de ratos / Leonardo Jorge Carvalho. – 2009. 71 f. : il. ; 30 cm
Dissertação (mestrado em Odontologia) – Universidade do Grande Rio “Prof. José de Souza Herdy”, Escola de Ciências da Saúde, 2009
“Orientador: Prof. Márcio Baltazar Conz Bibliografia: f. 61-69
1. Odontologia. 2. Enxerto ósseo. 3. Hidroxiapatitas. 4. Regeneração óssea. 5 . Ratos. I. Conz, Márcio Baltazar. II. Universidade do Grande Rio “Prof. José de Souza Herdy “. III. Título.
CDD – 617.6
AGRADECIMENTOS
Em primeiro lugar a DEUS por iluminar sempre o meu caminho, me guiando e protegendo em todos os momentos dessa minha caminhada.
Ao meu orientador Márcio Baltazar Conz, pelos ensinamentos, pela orientação valiosa e segura, pela confiança depositada em mim, e pela oportunidade de dar continuidade a um trabalho de muita seriedade e dedicação de uma vida.
Aos meus queridos e amados pais, Delson Gonçalves Teixeira e Eliana Carvalho Teixeira, responsáveis por mais esse momento da minha vida e eterna gratidão por todo incentivo aos meus estudos; pelo amor, carinho e compreensão nesse momento tão importante e, acima de tudo, por nunca terem deixado de acreditar em mim.
À minha querida avó Thereza Muzitano de Carvalho pela sua dedicação sem limites a nossa família, e ao seu amor incondicional.
Aos meus irmãos Alexandre Carvalho Teixeira e Pedro Paulo Carvalho Teixeira, meus verdadeiros ídolos, meus amigos, meus incentivadores e sem dúvida maiores referências ao longo da minha vida.
A minha namorada Aline de Jesus Alexandre, pelo apoio em todos os momentos, estando sempre ao meu lado me incentivando e compreendendo com tanta paciência e carinho.
Ao coordenador do curso de Mestrado em Implantologia Oral da UNIGRANRIO, Guaracilei Maciel Vidigal Jr. e professores Nassim David Harari e Marcelo Corrêa Manso, pelos sábios ensinamentos científicos e sugestões enriquecedoras.
Ao Professor Eduardo Seixas Cardoso, pelos ensinamentos, confiança, carinho e amizade. Obrigado pelos conselhos, não apenas referentes à profissão, mas também para a vida.
Ao Professor Edson Jorge Lima Moreira pela sua valiosa contribuição na realização da análise estatística desse trabalho.
Ao meu amigo Humberto da Fontoura Carvalho, pelo incansável e fundamental auxílio na utilização dos programas de computador e confecção de gráficos.
Aos meus queridos amigos e cirurgiões-dentistas, André Rautt Alves, Liliana Sabrosa Borges da Silva, Paulo Borges Moreira de Carvalho, Rafael Metropolo Moreira, Rodrigo Carvalho de Souza e Luiz Sergio Souza de Paiva, pela amizade e companheirismo demonstrados não só nesta difícil fase, mas em todos os momentos.
Aos meus colegas de turma, Carlos Magno dos Anjos, Camila Neves Campos, Edecir Décio Bisognin, Márcio Macedo Soares, Marcelo Lievori Brandão, Thiago Degli Espoti, pela convivência humana e profissional.
Enfim, a todos que, de um modo ou de outro, por suas atitudes e seus ensinamentos, incentivaram-me a concluir este curso.
Ama-se o que se conquista com esforço. Aristóteles
RESUMO
Os biomateriais à base de fosfato de cálcio são amplamente utilizados como substitutos ósseos. O objetivo do presente estudo foi avaliar o potencial osteocondutor de hidroxiapatitas com diferentes características físico-químicas, uma com baixa cristalinidade (HA-1) e outra com alta cristalinidade (HA-2) inseridas em defeitos ósseos de tamanho crítico na calvária de ratos. Foram utilizados 45 ratos, sendo 15 enxertados com HA-1, 15 com HA-2 e 15 preenchidos apenas pelo coágulo. O sacrifício dos animais (n=5 por grupo) ocorreu em 1, 3 e 6 meses após a cirurgia e os procedimentos histotécnicos e histomorfométricos foram realizados para se determinar a densidade de volume de osso neoformado nas regiões periférica, intermediária e central do defeito, nos três grupos. A primeira análise comparou a densidade de volume de osso neoformado nas regiões periférica, intermediária e central entre os grupos. A segunda avaliou a dinâmica da neoformação óssea em cada grupo isoladamente. Ao compararmos os grupos HA-1, HA-2 e coágulo não existiram diferenças estatisticamente significante na densidade de volume de osso neoformado nas três regiões estudadas, no intervalo de tempo determinado. No entanto, analisando-se os grupos isoladamente houve diferença na dinâmica da neoformação óssea. O grupo coágulo apresentou um aumento da densidade de volume de osso neoformado na região intermediária aos 6 meses após a cirurgia. Os grupos enxertados com HA-1 aos 3 e com HA-2 em 1 e aos 6 meses após a cirurgia apresentaram equivalentes densidade de volume de osso neoformado nas regiões periférica, intermediária e central sem diferença estatisticamente significante, demonstrando satisfatório potencial osteocondutor.
ABSTRACT
The biomaterials based on calcium phosphate are widely used as bone substitutes. The purpose of this study was to evaluate the osteoconductive potential of hydroxyapatites with different physicochemical characteristics, one with low crystallinity (AH-1) and another with high crystallinity (HA-2) inserted into critical-sized bone defects of rat calvaria. A total of 45 rats being 15 grafted with HA-1, 15 with HA-2 and 15 completed only by the clot. The sacrifice of animals (n = 5 per group) occurred in 1, 3 and 6 months after surgery and histotechnical and histomorphometric procedures were performed to determine the volume density of newly formed bone in the peripheral, intermediate and central regions of the defects for the three groups. The first analysis compared the volume density of newly formed bone in the three regions between the groups. The second evaluated the dynamics of bone formation in each group separately. When comparing the groups HA-1, HA-2 and clot, did not exist statistically significant differences in the volume density of newly formed bone between the peripheral, intermediate and central regions in the periods analyzed. However, analyzing the groups separately, there was difference in the dynamics of bone formation. The clot group presented an increase in the volume density of newly formed bone in the intermediate region at 6 months after surgery. The groups grafted with HA-1 at 3 months and HA-2 at 1 and 6 months after surgery showed equivalent volume density of newly formed bone in the peripheral, intermediate and central regions without difference statistically significant, demonstrating satisfactory osteoconductive potential.
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
BMPs Proteínas ósseas morfogenéticas BSP Sialoproteína óssea
Ca(NO3)2 Nitrato de cálcio
Ca/P Razão molar cálcio – fosfato (CaPO4) Fosfato de cálcio
(Ca10(PO4)6OH2) Fórmula da hidroxiapatita
CBPF Centro Brasileiro de Pesquisas Físicas
CEEPA Comissão de ética no ensino e pesquisa em animais DFDBA Enxerto de osso descalcificado congelado seco
DRX Difração de raios-x EDTA Ácido diaminotetracético
ETO Óxido de etileno
FDBA Enxerto de osso mineralizado congelado seco
H+ Ácido
HA Hidroxiapatita
HA-1 Hidroxiapatita com baixa cristalinidade HA-2 Hidroxiapatita com alta cristalinidade H/E Hematoxilina-eosina
I300 Valor da intensidade do plano 300 IGF Fator de crescimento da insulina
JCPDS Joint Committee on Powder Diffraction Standards
KW Kruskal-Wallis
H2PO4H2O Monofosfato de sódio hidratado NaHPO4 12H2O Difosfato de sódio hidratado
(NH4)2 HPO4 Diamônio fosfato
OBM Osso bovino misto
p Probabilidade
PDGF Fator de crescimento derivado de plaquetas pH Sigla de potencial hidrogeniônico
q.s.p. Quantidade suficiente para ROG Regeneração óssea guiada
SNK Student-Newman-Keuls
TGF- β Fator de crescimento transformador β
V112/300 Vale no espectro de raios-X entre os planos (112) e (300) Xc Índice de cristalinidade da amostra
α Nível de significância
β-TCP β- fosfato tricálcico (Ca3(PO4)2)
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ... 12
2 REVISÃO DE LITERATURA ... 15
2.1 O tecido ósseo ... 15
2.2 Mecanismos biológicos de formação óssea ... 18
2.2.1 Osteogênese ... 19
2.2.2 Osteoindução ... 19
2.2.3 Osteocondução ... 19
2.3 Classificação dos enxertos ósseos quanto à sua origem ... 19
2.3.1 Enxertos autógenos ... 20
2.3.2 Enxertos alógenos ... 20
2.3.3 Enxertos xenógenos ... 21
2.3.4 Enxertos aloplásticos ... 22
2.4 Biomateriais para enxertos ósseos ... 23
2.4.1 Materiais a base de fosfato de cálcio ... 24
2.4.2 Hidroxiapatita ... 25
2.5 Características físico-químicas dos biomateriais para enxertos ósseos ... 26
2.6 Potencial osteocondutor dos biomateriais “in vivo” ... 29
2.6.1 Estudos em animais ... 29 2.6.2 Estudos em humanos ... 32 3 PROPOSIÇÕES ... 35 4 MATERIAIS E MÉTODOS ... 36 4.1 Materiais ... 36
4.2.1 Grupos experimentais ... 38
4.2.2 Preparo dos animais e procedimentos de implantação ... 39
4.2.3 Obtenção das biópsias e preparo histotécnico ... 41
4.2.4 Procedimento histotécnico ... 41
4.2.5 Análise histomorfométrica ... 42
4.2.6 Análise estatística ... 46
5 RESULTADOS ... 47
5.1 Comparação das regiões entre os grupos ... 47
5.2 Análise das regiões de cada grupo ... 50
6 DISCUSSÃO ... 54
7 CONCLUSÕES ... 60
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 61
APÊNDICE A ... 70
1 INTRODUÇÃO
Os avanços técnico-científicos alcançados na Medicina e Odontologia têm possibilitado o desenvolvimento de biomateriais que contribuem para uma melhoria na qualidade de vida humana. Paralelamente, o aumento da expectativa de vida tem demandado o projeto de biomateriais para aplicações biomédicas que permaneçam implantados no corpo humano de maneira satisfatória e por períodos mais longos.
Um biomaterial por definição é uma substância ou associação de duas ou mais substâncias, farmacologicamente inertes, de origem natural ou sintética, utilizadas para substituir, aumentar ou melhorar, parcial ou integralmente tecidos e órgãos (WILLIAMS, 1987).
Os biomateriais de enxerto ósseo podem ser utilizados na Odontologia para o aumento ou reconstrução do rebordo alveolar, preenchimento de defeitos intra-ósseos e de alvéolos dentários, implantes imediatos após exodontias, elevação do assoalho do seio maxilar, e tratamento de defeitos perimplantares (LEGEROS, 2002, MURUGAN & RAMAKRISHNA, 2005).
A previsibilidade dos tratamentos para a regeneração do tecido ósseo perdido depende da técnica cirúrgica utilizada, da assepsia, da topografia e extensão do defeito ósseo, da vascularização e do biomaterial de enxerto utilizado (LINDHE et al., 2005). O processo de incorporação dos enxertos está relacionado à sua intimidade com o leito receptor e ao equilíbrio dos seguintes processos: (1) proliferação das células osteogênicas; (2) diferenciação em osteoblastos; (3) osteoindução; (4) osteocondução; e (5) propriedades biomecânicas dos enxertos (BURCHARDT, 1983).
Defeitos ósseos extensos podem demandar um grande período de tempo para o reparo, diminuindo as chances de sucesso. A tendência atual é desenvolver e utilizar biomateriais que acelerem ou, ao menos, permitam o reparo normal e completo do defeito ósseo, diminuindo o risco pós-operatório (BLANK & LEVY, 1999; YOUNG et al., 1999).
Os biomateriais podem ser classificados de acordo com o seu mecanismo de ação e origem.
O mecanismo de ação diz respeito às suas propriedades biológicas e à interação com o leito receptor. São classificados como osteogênicos quando são capazes de promover a formação óssea por carregarem consigo células ósseas;
osteoindutores quando são capazes de induzir a diferenciação de células mesenquimais indiferenciadas em osteoblastos com possibilidade de formação óssea ectópica e osteocondutores quando sua estrutura serve de arcabouço ou substrato estrutural favorável para a migração celular e deposição óssea oriunda das imediações, desta forma, o biomaterial pode ser gradativamente reabsorvido e simultaneamente substituído por novo tecido ósseo (URIST, 1984, NOVAES JR. et al, 2000, URIST, 2002).
Com relação à sua origem, os biomateriais podem ser classificados como autógenos, homógenos, xenógenos e aloplásticos (MURUGAN & RAMAKRISHNA, 2005).
Os enxertos autógenos são aqueles obtidos do próprio paciente, a partir de sítios doadores intra ou extrabucais. Apresentam melhor previsibilidade, e são considerados como o “padrão ouro” por possuírem propriedades osteogênicas, osteocondutoras e osteoindutoras. A morbidade pós-operatória relacionada à necessidade de coleta de uma área doadora, eventuais aumento de tempo e custos de tratamento devido a procedimentos realizados em ambiente hospitalar, são visto com alguma resistência por parte dos pacientes e por isso tem sua indicação redimensionada (LYNCH et al., 1999).
Os homógenos, alógenos ou aloenxertos são obtidos de indivíduos da mesma espécie, porém com diferentes genótipos (MISCH & DIETSCH, 1993). O material pode provir tanto de cadáveres quanto de seres vivos que, por diferentes razões, foram submetidos a amputações terapêuticas (CHIAPASCO & ROMEO, 2007). Os três tipos de biomateriais homógenos mais citados na literatura são: osso congelado (raramente utilizado em função dos riscos de rejeição e transmissão de doenças); FDBA (osso seco e congelado), DFDBA (osso desmineralizado seco e congelado).
Os biomateriais xenógenos, provém de doadores de outra espécie, como por exemplo o osso de origem bovina (BAUER & MUSCHLER, 2000). Sua resistência biomecânica é similar a do osso humano e tratamentos adequados para a sua obtenção podem evitar respostas imunológicas ou inflamatórias adversas (MISCH, 2000). A ausência de proteína torna segura a utilização em humanos, restringindo seu uso apenas aos aspectos culturais e religiosos (BENKE et al., 2001). O Bio-oss® (Geistlich Pharma, Wolhumsen, Suíça) é um exemplo de hidroxiapatita bovina com cristalinidade e composição química semelhante ao osso humano (SU-GWAN et al., 2001).
Os materiais aloplásticos são dispositivos de origem sintética. Esses biomateriais cerâmicos a base de fosfato de cálcio podem ser porosos, cristalinos, amorfos, granulados, porém, sobretudo, devem garantir a formação de ligações estáveis com o osso neoformado, com o passar do tempo (LYNCH et al., 1999). São exemplos de biocerâmicas as hidroxiapatitas (HA), fosfato tricálcico e os biovidros. As propriedades físico-químicas de cada biomaterial, somadas ao ambiente fisiológico, influenciam diretamente na neoformação óssea e como e quando ocorrerá de forma equilibrada a sua biodegradação. As propriedades físicas dos biomateriais são específicas à área de superfície ou formato (bloco, partícula), à porosidade (denso, macro ou microporoso) e à cristalinidade (cristalino ou amorfo). As propriedades químicas dizem respeito à composição química, à razão molar cálcio/ fosfato, ao grau de impureza elementar e à substituição iônica na estrutura atômica (MISCH, 2000, KARAGEORGIU & KAPLAN, 2005, YANG et al., 2005).
Existe um longo caminho entre o desenvolvimento de um novo biomaterial ou técnica até a utilização em seres humanos. Para utilização na clínica, é mandatório que os materiais e técnicas sejam testados in vitro e in vivo.
Espera-se de um biomaterial, biocompatibilidade, osteocondutividade, e que ele seja gradualmente reabsorvido à medida que novo osso viável é formado.
O objetivo do presente trabalho foi avaliar através da análise histomorfométrica o potencial osteocondutor de grânulos de hidroxiapatita com diferentes cristalinidades no reparo de defeito ósseo de tamanho crítico na calvária de ratos.
2 REVISÃO DE LITERATURA 2.1 O tecido ósseo
O sistema esquelético é tão essencial à vida quanto qualquer outro sistema orgânico, pois desempenha um papel imprescindível na homeostase mineral (ROBBINSet al., 2000; MURUGAN & RAMAKRISHNA, 2005). O tecido ósseo serve de suporte para os tecidos mucosos e protege órgãos vitais, como os contidos nas caixas craniana e torácica e no canal medular. Aloja e protege a medula óssea, formadora das células sanguíneas. Proporciona apoio aos músculos esqueléticos, transformando suas contrações em movimentos úteis, e constitui um sistema de alavancas que amplia as forças geradas na contração muscular (JUNQUEIRA & CARNEIRO, 2004).
Apesar do aspecto aparentemente inerte, os ossos crescem, são remodelados e se mantém ativos durante toda a vida do organismo. Quando lesados, como em fraturas, são capazes de reparação, fenômeno que demonstra sua permanente vitalidade. O processo pelo qual o tecido ósseo se desenvolve é denominado ossificação ou osteogênese. Os ossos podem se originar de duas maneiras: no seio de uma região condensada de natureza conjuntiva ou quando o tecido ósseo se forma substituindo gradualmente um modelo cartilaginoso preexistente. Pelas suas características, esses dois processos foram denominados, respectivamente, ossificação intramembranosa e ossificação endocondral (LYNCH et al., 1999; KATCHBURIAN & ARANA, 2004).
O osso é um tipo especializado de tecido conjuntivo formado por células e material extracelular calcificado, a matriz óssea (JUNQUEIRA & CARNEIRO, 2004). Bioquimicamente é definido por uma mistura especial de matriz orgânica (35%) e elementos inorgânicos (65%). O componente inorgânico, hidroxiapatita de cálcio [Ca10(PO4)6OH2], é o mineral que confere força e resistência aos ossos, sendo o armazém de 99% do cálcio, 85% do fósforo e 65% do sódio e magnésio corporais (MISCH & DIETSH, 1993; ROBBINSet al., 2000; HERNÁNDEZ-GIL et al.,2006). No osso maduro, a matriz orgânica contém 85% de colágeno do tipo I, que atua como uma malha na qual minúsculos cristais de hidroxiapatita são embutidos e o restante é composto de moléculas não colágenas e líquido intersticial. Os minerais não estão diretamente ligados ao colágeno, e sim ligados às moléculas (proteínas) não
colágenas. As moléculas não colágenas constituem aproximadamente de 3 a 5% do osso, e são as responsáveis pela promoção de sítios ativos para a biomineralização e para a adesão celular. Alguns exemplos de moléculas não colágenas são: fosfoproteínas, GLA-proteínas (osteocalcina), glicoproteínas acídicas (osteonectina), osteopontina, sialoproteína óssea (BSP), proteoglicanas/ glicosaminoglicanas (principalmente decorina, biglicana, osteoaderina e lumican), proteínas séricas e alguns lipídios. Outro importante constituinte da matriz do tecido ósseo é o grupo das proteínas morfogenéticas ósseas (BMPs), relacionadas à superfamília dos fatores de crescimento (TGF-ß), que são encontradas durante o desenvolvimento de vários órgãos, inclusive do esqueleto (KATCHBURIAN & ARANA, 2004; MURUGAN & RAMAKRISHNA, 2005).
As células ósseas são os osteoblastos, os osteócitos e os osteoclastos.
Os osteoblastos são as células responsáveis pela formação do tecido ósseo, sintetizam os componentes da matriz orgânica e controlam a mineralização dessa matriz. Estas células são completamente diferenciadas e não apresentam capacidade de migração e proliferação. Assim, para permitir que ocorra a formação óssea em um sítio determinado, células progenitoras mesenquimais indiferenciadas (células osteoprogenitoras) podem migrar para o sítio e proliferar para se tornar então osteoblastos. A diferenciação e o desenvolvimento dos osteoblastos pelas células osteoprogenitoras são dependentes da liberação das BMPs e de outros fatores de crescimento tais como fatores de crescimento da insulina (IGF), fatores de crescimento derivados de plaquetas (PDGF) e fatores de crescimento dos fibroblastos (LYNCH et al., 1999; LINDHE et al., 2005). Os osteoblastos são capazes de concentrar fosfato de cálcio, participando da mineralização da matriz e em fase de síntese mostram as características ultra estruturais das células produtoras de proteínas (JUNQUEIRA & CARNEIRO, 2004).
Os osteoblastos, além da produção dos componentes da matriz, funcionam como transmissores de sinais para a remodelação. Vários fatores locais como prostaglandinas, citocinas e interleucinas também agem em relação a sua proliferação, diferenciação e atividade (KATCHBURIAN & ARANA, 2004).
Os osteócitos são as células aprisionadas no interior da matriz óssea mineralizada, ocupando as lacunas das quais partem canalículos. Cada lacuna contém apenas um osteócito. Dentro dos canalículos os prolongamentos dos osteócitos estabelecem contatos através de junções comunicantes, por onde podem
passar pequenas moléculas e íons de um osteócito para o outro. Esse arranjo permite aos osteócitos (1) participar na regulação da homeostasia do cálcio sanguíneo e (2) perceber a carga mecânica e transmitir essa informação às outras células dentro do osso. Os osteócitos são células com a forma estrelada, achatadas, que exibem pequena quantidade de retículo endoplasmático rugoso, aparelho de Golgi pouco desenvolvido e núcleo com cromatina condensada (JUNQUEIRA & CARNEIRO, 2004; LINDHE et al., 2005).
A atividade de formação óssea está consistentemente associada à reabsorção óssea que é iniciada e mantida pelos osteoclastos. Os osteoclastos são células móveis, gigantes, multinucleadas e extensamente ramificadas, observadas nas superfícies ósseas que se originam da fusão de células da linhagem monócito-fagocítica dos tecidos hematopoiéticos (LYNCH et al., 1999; KATCHBURIAN & ARANA, 2004; LINDHE et al., 2005). Os osteoclastos possuem citoplasma granuloso, algumas vezes com vacúolos, fracamente basófilo nos osteoclastos jovens e acidófilos nos maduros. A zona clara é um local de adesão do osteoclasto com a matriz óssea e cria um microambiente fechado, onde tem lugar a reabsorção óssea. Os osteoclastos secretam para dentro desse microambiente fechado, ácido (H+), colagenase e outras hidrolases que atuam localmente digerindo a matriz orgânica e dissolvendo os cristais de sais de cálcio. A atividade dos osteoclastos é coordenada por citocinas e por hormônios como a calcitonina, produzida pela glândula tireóide, e o paratormônio, secretado pelas glândulas paratireóides (JUNQUEIRA & CARNEIRO, 2004; HERNÁNDEZ-GIL et al., 2006).
A matriz óssea mineralizada é coberta por duas membranas não calcificadas de natureza conjuntiva, que, embora geralmente seja dito que a separam dos outros tecidos, devem ser consideradas membranas que possibilitam uma gradual relação entre um tecido mineralizado e o restante do organismo. São elas o periósteo e o endósteo. O periósteo, mais externamente, é constituído de fibras colágenas e fibroblastos, e na sua região mais interna, além de uma camada de células de revestimento potencialmente osteogênica, possui células indiferenciadas. Já o endósteo é constituído apenas por uma camada de osteoblastos ou de células de revestimento e apresenta, em geral, mais atividade que o periósteo (KATCHBURIAN & ARANA, 2004).
A associação da hidroxiapatita com fibras colágenas é responsável pela dureza e resistência do tecido ósseo. Histologicamente existem dois tipos de tecido ósseo: o
imaturo ou primário, e o maduro, secundário ou lamelar. Os dois tipos possuem as mesmas células e os mesmos constituintes da matriz. No tecido primário as fibras colágenas se dispõem irregularmente, sem orientação definida. No lamelar, as fibras se organizam em lamelas. O osso primário tem menor quantidade de minerais e maiores proporções de osteócitos do que o lamelar. Este por sua vez possui fibras colágenas organizadas em lamelas de três a sete micrômetros de espessura, que ou ficam paralelas umas às outras, ou se dispõem em camadas concêntricas em torno de canais com vasos, formando o sistema de Havers ou ósteons. Cada ósteon é um cilindro, às vezes bifurcado, formado por quatro a 20 lamelas ósseas concêntricas. No centro desse cilindro ósseo existe um canal revestido de endósteo, o canal de Havers, que contém vasos e nervos. Os canais de Havers comunicam-se entre si, com a cavidade medular e com a superfície externa do osso por meio de canais transversais ou oblíquos, que atravessam as lamelas, os canais de Volkmann (LYNCH et al., 1999; JUNQUEIRA & CARNEIRO, 2004; MURUGAN & RAMAKRISHNA, 2005).
Em um osso maduro, geralmente dois tipos de tecido podem ser diferenciados macroscopicamente: o osso esponjoso e o osso compacto. Entretanto em ambos a estrutura é basicamente a mesma, sendo constituídos por sistemas lamelares e existindo diferenças apenas na quantidade e disposição das lamelas e na existência ou não de espaços entre os referidos sistemas. O osso esponjoso é formado por lamelas, na sua maioria paralelas entre si. As lamelas formam delgadas trabéculas que deixam, entre elas, amplos espaços preenchidos por tecido conjuntivo frouxo, vasos sanguíneos e tecido hematopoiético, constituindo, portanto, parte da medula óssea. O osso compacto é formado por numerosos sistemas de lamelas concêntricas (KATCHBURIAN & ARANA, 2004).
2.2 Mecanismos biológicos de formação óssea
Os biomateriais utilizados como enxertos ósseos podem agir através de três diferentes mecanismos: osteogênese, osteoindução e osteocondução (BURCHARDT, 1983; MISCH & DIETSH, 1993; GARG, 1999; GAROFALO, 2007).
2.2.1 Osteogênese
Osteogênese é a formação e desenvolvimento do osso. Neste mecanismo, os biomateriais são capazes de promover a formação óssea por carregarem consigo células ósseas. Células osteogênicas podem encorajar a formação óssea em tecidos mucosos ou ativar rapidamente a neoformação nos sítios ósseos. O osso autógeno intra-oral e extra-oral são exemplos de materiais de enxertos com propriedades osteogênicas e são capazes de formar tecido ósseo mesmo na ausência de células mesenquimais indiferenciadas (LINDHE et al., 2005).
2.2.2 Osteoindução
Osteoindução é o ato ou processo de estimular a osteogênese. Envolve a formação de um novo tecido ósseo, pela diferenciação local das células mesenquimais indiferenciadas em osteoblastos, sob a influência de um ou mais agentes indutores, como as proteínas ósseas morfogenéticas (BMP), presentes nos enxertos (LINDHE et al., 2005).
2.2.3 Osteocondução
Na osteocondução o biomaterial funciona como uma matriz física ou arcabouço para deposição de novo osso oriundo das imediações. É caracterizada por um processo de crescimento e invasão de vasos sanguíneos, de tecidos perivasculares e de células osteoprogenitoras do sítio receptor para o enxerto. O biomaterial é gradativamente reabsorvido e simultaneamente substituído por novo tecido ósseo (BAUER & MUSCHLER, 2000; CARVALHO et al., 2004).
2.3 Classificação dos enxertos ósseos quanto a sua origem
Com relação à sua origem, os biomateriais podem ser classificados em autógeno, alógeno, xenógeno, e aloplástico.
2.3.1 Enxertos Autógenos
Os enxertos autógenos são aqueles obtidos do próprio paciente. Geralmente indicados como a primeira escolha, são os biomateriais que apresentam melhor previsibilidade, considerados como o “padrão ouro”, por possuírem propriedades osteogênicas, osteocondutoras e osteoindutoras, além de evitar incompatibilidades imunológicas. Sua eficácia baseia-se no transplante da matriz óssea autógena contendo células ósseas vivas para a região receptora (MARX & SAUNDERS, 1986). Podem ser de osso cortical ou medular ou da associação de ambos. O medular é o material mais eficiente na reconstrução de defeitos ósseos, pois fornece uma maior quantidade de células osteogênicas (MISCH, 2000).
São utilizados na forma de blocos ou particulados quer seja de sítios doadores intra ou extra-orais. Os intra-orais comumente utilizados são a tuberosidade maxilar, o ramo mandibular, exostoses, e a sínfise mandibular, e os extra-orais são a crista ilíaca, a calota craniana e a tíbia (GARG, 1999; MISCH, 2000). Com relação à escolha do sítio doador, isso dependerá da quantidade em volume, e do tipo de enxerto desejado para a cirurgia proposta. Entretanto, a morbidade pós-operatória relacionada à necessidade de coleta de uma área doadora, e eventuais aumento de tempo e custos de tratamento devido a procedimentos realizados em ambiente hospitalar, têm sido vistos com alguma resistência por parte dos pacientes e por isso tem sua indicação redimensionada (MISCH & DIETSH, 1993; LYNCH, 1999; GAROFALO, 2007).
2.3.2 Enxertos Alógenos
Os enxertos alógenos ou homógenos são obtidos de indivíduos da mesma espécie, porém com diferentes genótipos. O material pode provir tanto de cadáveres quanto de seres vivos que, por diferentes razões, foram submetidos a amputações terapêuticas (BUCK & MALININ, 1994; CHIAPASCO & ROMEO, 2007). Após um específico processamento, que consiste de lavagem e desidratação, o material é irradiado ou esterilizado em óxido de etileno (ETO) visando diminuir, ainda mais, seu potencial osteogênico. A esterilização com óxido de etileno pode diminuir a capacidade de indução do DFDBA e a exposição do material a altas temperaturas pode desnaturar suas proteínas. Além disso, as formas de esterilização podem não
remover os resíduos formados durante o próprio processo (AMERICAN ACADEMY OF PERIODONTOLOGY, POSITION PAPER, 2001). Os biomateriais são armazenados sob várias formas e tamanhos em bancos de ossos. Suas principais vantagens são: a disponibilidade, a eliminação de um sítio doador no paciente, a diminuição da quantidade de anestesia e do tempo cirúrgico, e a diminuição da perda de volume sanguíneo. As desvantagens estão relacionadas principalmente ao fato dos tecidos serem oriundos de outro indivíduo, com possibilidades de transmissão de doenças infecciosas.
Os três tipos de biomateriais homógenos mais citados são: osso congelado, raramente utilizado em função dos riscos de rejeição e transmissão de doenças; FDBA (osso seco e congelado), DFDBA (osso desmineralizado, seco e congelado) (MELLONIG & LEVEY, 1984; GARG, 1999; MISCH, 2000). O FDBA e o DFDBA diferem no modo em que são processados, o DFDBA sofre uma remoção de seu componente mineral (desmineralização) por meio de imersão em ácido clorídrico, objetivando a exposição das proteínas ósseas morfogenéticas que induzirão a diferenciação das células mesenquimais indiferenciadas em osteoblastos.
O potencial osteoindutor do DFDBA pode ser perdido ou reduzido se houver falha durante o processamento do material, ocasionando falta ou quantidade insuficiente de proteína indutora ou, ainda, se a proteína estiver presente, porém inativa (MISCH & DIETSH, 1993; AMERICAN ACADEMY OF PERIODONTOLOGY, POSITION PAPER, 2001; URIST, 2002; GAROFALO, 2007).
Os enxertos alógenos induzem uma resposta imunológica no hospedeiro, com possibilidade de serem rejeitados. A histoincompatibilidade antigênica está provavelmente relacionada às proteínas ou glicoproteínas na superfície celular. A rejeição do enxerto alógeno é histologicamente expressa pela descontinuidade dos vasos, por um processo inflamatório caracterizado pela presença de linfócitos, encapsulação fibrosa, reabsorção periférica do enxerto, não união e fratura por fadiga (BURCHARDT, 1983).
2.3.3 Enxertos Xenógenos
Os biomateriais xenógenos provém de doadores de outra espécie, como exemplo o osso de origem bovina. Sua resistência biomecânica é similar a do osso humano e tratamentos adequados para a sua obtenção podem evitar respostas
imunológicas ou inflamatórias adversas. A ausência de proteína torna-o seguro para a utilização em humanos, deixando como restrições ao seu uso apenas os aspectos culturais e religiosos.
O Bio-oss® (Geistlich Biomaterials, Wolhuser, Suíça) é um exemplo de hidroxiapatita bovina, com cristalinidade e composição química semelhante ao osso humano. De acordo com o fabricante encontra-se disponível em blocos ou triturado em grânulos corticais ou esponjosos, com uma faixa granulométrica de 250µm a 1000 µm. Sua especial arquitetura porosa natural (75-80%) possibilita uma melhor vascularização e, ainda, mantém um arcabouço para osteocondutividade, aumentando a estabilização do coágulo e absorção sanguínea natural entre os micros e macroporos (MISCH & DIETSH, 1993; PIATTELLI et al., 1999; GARG, 1999; MISCH, 2000).
Dentre as várias opções de biomateriais disponíveis o enxerto bovino tem se mostrado como uma alternativa para as mais diversas modalidades, existindo uma variedade de estudos que sustentam as suas indicações (BERGLUNDH & LINDHE, 1997; PIATTELLI et al., 1999; MAIORANA et al., 2005).
2.3.4 Enxertos Aloplásticos
Os materiais aloplásticos são dispositivos de origem sintética. Esses biomateriais, bioinertes e bioativos, podem ser porosos, cristalinos, amorfos e granulados, porém, sobretudo, devem garantir a formação de ligações estáveis com o osso neoformado, com o passar do tempo. Utilizados para reconstrução de defeitos ósseos e aumento do rebordo alveolar reabsorvido, funcionam através da promoção de um arcabouço para a angiogênese e conseqüente neoformação óssea. Em geral, estes materiais exibem boa resistência à compressão e pobre resistência à tensão, similares ao osso humano. São exemplos de materiais aloplásticos, as hidroxiapatitas (HA), o fosfato tricálcico e os biovidros.
A hidroxiapatita representa o componente inorgânico do tecido calcificado do corpo humano, pode ser reabsorvível ou não reabsorvível, e possui uma proporção de cálcio / fósforo de 10:6. Esta semelhança estrutural com a apatita óssea mineral permite crescimento e contato quando implantado no tecido ósseo. O fosfato tricálcico apresenta estrutura semelhante à HA, bioativo e com propriedades
osteocondutoras, possui capacidade de ser reabsorvido por dissolução química (MISCH & DIETSH, 1993; GARG et al.,1999).
O crescimento ósseo no interior do biomaterial aloplástico poroso é dependente da biocompatibilidade, das interconexões e dimensões da estrutura porosa (SCHLIEPHAKE et al., 1991).
2.4 Biomateriais de enxerto ósseo
Biomateriais podem ser definidos como uma substância ou combinação de duas ou mais substâncias, farmacologicamente inertes de origem natural ou sintética, que são utilizados para melhorar, aumentar ou substituir, parcial ou integralmente, tecidos e órgãos (WILLIAMS, 1987). A utilização de biomateriais para enxerto ósseo apresentou um grande avanço nas últimas décadas com o desenvolvimento destes para o tratamento de aumento ou reconstrução do rebordo alveolar, preenchimento de defeitos intra-ósseos periodontais e de alvéolos dentários, elevação do assoalho do seio maxilar, e tratamento de defeitos perimplantares (BERGHLUNDH & LINDHE, 1997; FUGAZZOTTO & VLASSIS, 1998; MAIORANA et al., 2005; ARTZI et al., 2005).
O biomaterial deve ser osteocondutor e susceptível a bioabsorção osteoclástica para permitir substituição pelo osso do hospedeiro no espaço do enxerto (FLECKENSTEIN et al., 2006).
Os biomateriais direcionam a forma geral e a estrutura do tecido a ser substituído, promovem a adesão celular e subseqüente crescimento tecidual permitindo a difusão de nutrientes e células através do seu arcabouço (ROSE et al.,2004).
A biocompatibilidade dos biomateriais está intimamente relacionada ao comportamento celular no contato e particularmente na adesão celular a sua superfície. Para isso é importante uma apropriada topografia, química e energia de superfície. Assim, a aproximação, a adesão e o “espraiamento” que ocorrem na primeira fase da interação entre a célula e o biomaterial, e a qualidade desta primeira fase influenciará a capacidade celular para proliferar e se diferenciar em contato com o material enxertado. Isto é essencial para a eficácia dos enxertos no sentido de se estabelecer uma interface mecanicamente sólida com completa fusão
entre a superfície do material e o tecido ósseo sem a presença de uma interface fibrosa (ANSELME, 2000).
A regeneração óssea é um processo complexo e contínuo que objetiva uma restauração anatômica e funcional. Inúmeros eventos ocorrem quando um determinado biomaterial entra em contato com o ambiente biológico. Interações moleculares e celulares influenciam as características teciduais ao redor dos biomateriais. Na presença destes, fatores de crescimento são adsorvidos ou umidecem a superfície dos substitutos ósseos, promovendo uma adequada integração com o osso do hospedeiro. A função dos biomateriais é promover rápida formação óssea. Assim, quando se estabelece uma total integração, uma gradual substituição por novo osso ocorrerá (GAROFALO, 2007).
2.4.1 Materiais de enxerto ósseo a base de fosfato de cálcio
Os biomateriais à base de fosfato de cálcio utilizados como materiais de enxerto ósseo ou no recobrimento de implantes dentários ou ortopédicos são considerados materiais bioativos devido à sua capacidade de participar ativamente no processo de cicatrização e/ou regeneração do tecido ósseo (MURUGAN & HAMAKRISHNA, 2005).
A reatividade superficial é uma característica comum das cerâmicas ósseas bioativas e consiste na habilidade da biocerâmica aderir ao osso, gerando grande impacto na adesão, proliferação, diferenciação e mineralização das células ósseas
A adesão entre o biomaterial e o tecido ósseo e, o aumento do crescimento ósseo são o resultado de múltiplas, paralelas e seqüenciais reações que ocorrem na interface (DUCHEYNE & QIU, 1999).
Embora as cerâmicas inorgânicas não demonstrem osteoindução, elas certamente possuem habilidades osteocondutoras, bem como uma notável habilidade de se ligar diretamente ao osso (BURG et al., 2000).
Uma das vantagens das biocerâmicas à base de fosfato de cálcio, utilizadas como enxertos ósseos, é que tanto os íons cálcio quanto os íons fosfato não interferem na função celular e fisiológica dos tecidos adjacentes, proporcionando uma resposta tecidual favorável ao tratamento. A liberação de cálcio e fosfato, por parte das biocerâmicas, pode participar, dentro de certos limites, como estimuladores da formação óssea, bem como na reprecipitação de uma camada de
apatita carbonatada sobre a superfície do biomaterial estabelecendo uma ligação química com o osso neoformado (LEGEROS, 2002).
As apatitas e seus derivados, em particular a hidroxiapatita (HA), bem como o fosfato tricálcio são os principais biomateriais de enxertos ósseos sintéticos que têm sido investigados (TOTH et al., 1995; RODRIGUES-LORENZO et al., 2001).
2.4.2 Hidroxiapatita
A hidroxiapatita (HA) é o constituinte principal da fase mineral dos tecidos calcificados, representando entre 30% e 70% da massa dos ossos e dentes, respectivamente. Sua fórmula estequiométrica é [Ca10(PO4)6(OH)2], com a razão Ca/P igual a 1,67 (MISCH, 2000).
Muitos métodos são utilizados para sintetizar a hidroxiapatita. O mais convencional é a precipitação em meio aquoso utilizando como matéria-prima o nitrato de cálcio [Ca (NO3)2] e o diamônio fosfato [(NH4)2HPO4]. No entanto a síntese de uma hidroxiapatita pura por este método requer um controle de vários parâmetros tais como: o pH da reação, o tempo, a temperatura, e a estequiometria da matéria prima. Uma discreta variação destes parâmetros pode gerar drásticas variações na composição do produto final (HORNEZ et al., 2007).
Tampieri et al. (2001) sugeriram ao estudarem hidroxiapatitas cerâmicas com porosidade graduada como substitutos do osso natural, que pequenas variações na geometria e propriedades físico-químicas poderiam causar significantes diferenças na resposta biológica. Neste estudo as hidroxiapatitas exibiram forte adesão ao osso com os poros contribuindo para uma interligação mecânica conduzindo a uma firme fixação do material com o tecido ósseo.
Rosa et al. (2003) estudaram in vitro a diferenciação de osteoblastos oriundos da medula óssea de ratos sobre hidroxiapatitas com diferentes topografias de superfície avaliando: a adesão celular, a proliferação celular, a quantidade de proteína total, a atividade de fosfatase alcalina e a formação de nódulos ósseos. Seus resultados sugeriram que os eventos celulares iniciais, como por exemplo, a adesão celular, não foi afetada pela topografia de superfície da hidroxiapatita. Entretanto os eventos intermediários e finais testados foram favorecidos em superfícies com uma topografia mais regular.
Dean-Mo Liu, (1996) fabricou e caracterizou grânulos de hidroxiapatita com 0,7 a 4 mm de diâmetro e com 24 a 76% do seu volume constituído de poros, com tamanhos variando de 95 e 400 µm, simulando a estrutura porosa do osso humano. Segundo o autor, geralmente os poros da superfície são menores em tamanho e em quantidade, e mais estreitos do que nas regiões mais internas. Esta diferença na característica do poro da superfície e das camadas interiores deve ser levada em consideração clinicamente já que os poros da superfície podem em alguns casos restringir a entrada de fluídos corpóreos através dos grânulos.
Um estudo em 2005 avaliou as características físico-químicas de seis grânulos de hidroxiapatitas comumente utilizadas no mercado brasileiro e constatou marcantes diferenças com relação à cristalinidade, área de superfície, e composição de um fabricante para o outro ou em diferentes lotes de um mesmo fabricante. Estas variações podem ser uma conseqüência da quebra do controle de qualidade no processo de fabricação e podem afetar diretamente o resultado clínico esperado, tornando um fator limitante para o uso de determinados biomateriais. Neste estudo, apenas um dos biomateriais, uma hidroxiapatita bovina (Bio-oss® - Geistlich Biomaterials, Wolhuser, Switzerland) teve seus resultados perfeitamente de acordo com a especificação do fabricante (CONZ et al., 2005).
2.5 Características físico-químicas dos biomateriais para enxertos ósseos
Inicialmente, os estudos in vitro sobre a interação entre os osteoblastos e o biomaterial eram essencialmente preocupados com o efeito da resposta celular a diversos tipos de materiais com pouca atenção sendo dada a influência da caracterização físico-química (ROSA et al., 2003).
As propriedades físicas dos biomateriais são específicas à área de superfície ou formato (bloco, partícula), a porosidade (denso, macro ou microporoso) e a cristalinidade (cristalino ou amorfo).
O tamanho da partícula do biomaterial impacta diretamente no tamanho da área da superfície disponível para reagir com células e fluído biológico. Quanto maior o tamanho das partículas, maior será o tempo de reabsorção do biomaterial.
A porosidade melhora a conexão mecânica entre o biomaterial e o osso, promovendo melhor estabilidade mecânica na interface. Dimensões adequadas de poros favorecem o entrelaçamento do tecido com o biomaterial. Os biomateriais
macroporosos (> 50 µm) ou microporosos (< 50µm) possuem uma área de superfície maior para a solução e a reabsorção mediada pelas células sob condições estáticas, além disso, ocorre uma redução significativa na resistência à compressão e tensão. O material poroso também oferece regiões adicionais para o crescimento interno e a integração do tecido promovendo uma estabilização mecânica e, portanto, a minimização do movimento e da deterioração dinâmica associada ao desgaste na interface. Desta forma, poros com diâmetro de 100µm são necessários para a migração e o transporte celular, entretanto poros maiores que 300µm permitem o desenvolvimento de um sistema de capilares favorecendo a neoformação óssea.
O controle da macro e microporosidade é um fator de suma importância para a eficiência do material enxertado no paciente. A colonização celular dos substitutos ósseos depende das características de porosidade do biomaterial, em particular ao tamanho e a distribuição dos poros e ao número e tamanho das interconexões entre os macroporos. Estas interconexões formam uma espécie de sistemas de túneis os quais permitem o acesso e o retorno dos fluídos biológicos e a entrada de células ósseas que subseqüentemente irão facilitar a neoformação óssea no interior dos macroporos do biomaterial.
Por outro lado, os poros também aumentam a área de superfície do material, porém quanto maior a porosidade mais rápida será a dissolução do enxerto.
Um biomaterial cristalino possui uma organização atômica bem definida, ao contrário de um material amorfo, que apresenta um formato de cristal irregular. A cristalinidade é uma propriedade que altera o índice de dissolução do biomaterial e é dependente da temperatura de sinterização. O uso de altas temperaturas (acima de 1000◦ C) por um período de no mínimo 6 horas, seguido de um resfriamento lento durante o processo de síntese, resulta na mais perfeita forma do cristal e com isso menor o grau de degradação.
A composição química, a razão molar cálcio/ fosfato, o grau de impureza elementar e substituição iônica na estrutura atômica são propriedades químicas que somadas ao ambiente mecânico influenciam o índice de dissolução do biomaterial assim como na indicação ou restrição da sua aplicação clínica.
Acelerada reabsorção dos biomateriais ocorre quando impurezas são observadas em sua estrutura (ex. carbonato de cálcio) e quando o ph do leito receptor diminui. A fórmula da hidroxiapatita estequiométrica (estável) é Ca10(PO4)6(OH)2, com sua razão molar cálcio/ fosfato igual a 1,67, um material que
possuir alteração em sua estrutura atômica, como por exemplo, o fosfato tricálcico (Ca3(PO4)2) possuirá uma razão molar inferior (1,5), desta forma, sua velocidade de reabsorção será mais rápida, ou seja, mais solúvel.
É de suma importância entender que as propriedades dos biomateriais dependem primariamente da natureza e do processo de fabricação, além disso, deve ser destacada a importância da caracterização levando-se em consideração as propriedades físico-químicas relacionadas à composição química, morfologia, cristalinidade, área superficial específica e expectativa de degradação (MISCH & DIETSH, 1993; GARG, 1999; BURG et al., 2000; MISCH, 2000; TAMPIERI et al., 2001; CONZ et al., 2005; DALAPÍCULA et al., 2006; HORNEZ et al., 2007).
O desempenho de um material sintético depende de parâmetros fundamentais tais como: a composição química, a morfologia e a biodegradabilidade (TADIC & EPPLE, 2004).
Se o tamanho do cristal é pequeno e/ou se existem incorporações de carbonatos, a biodegradação é fortemente aumentada devido à alta solubilidade (TADIC & EPPLE, 2004).
Accorsi-Mendonça et al., (2008) realizaram a caracterização físico-química de dois xenoenxertos bovinos desproteinizados amplamente usados como enxertos ósseos, o Bio-oss® (Geistlich Biomaterials, Wolhuser, Switzerland) e o Gen-Ox (Baumer S.A., Brasil). Para a remoção da porção orgânica estes biomateriais passam por um tratamento térmico específico, que no Bio-oss® gira em torno dos 300°C enquanto que no Gen-Ox este processo oscila entre 950°C a 1000°C. Os resultados sugeriram que a presença de fases não cristalinas, provavelmente material orgânico e carbonatos, identificados no Bio-oss® através da termogravimetria, espectroscopia com infravermelho e difração de raio-x, geraram um biomaterial de baixa cristalinidade e conseqüentemente mais propenso a degradação. Assim, a temperatura do processamento pode ser um caminho para se alterar as propriedades físico-químicas do biomaterial, produzindo materiais com diferentes níveis de reabsorção.
Uma completa caracterização físico-química de 14 biomateriais utilizados como substitutos ósseos à base de fosfato de cálcio foi realizada por Tadic & Epple., (2004) e pôde ser constatado que os biomateriais possuíam composição e morfologia completamente diferentes. Ficou claro também que a mera definição “cerâmica de fosfato de cálcio” não foi suficiente para caracterizar totalmente um
material. Por outro lado, esta diversidade de características cobre uma ampla variedade de aplicações, desde enxertos permanentes a enxertos com rápida biodegradabilidade.
2.6 Potencial osteocondutor dos biomateriais “in vivo”
Uma grande variedade de biomateriais de enxertos ósseos e implantes tem sido avaliada “in vivo” em diferentes modelos animais, como ratos (SCHILIEPHAKE et al., 2004; BRAZ et al., 2003; SILVA et al., 2005; ACCORSI MENDONÇA, 2008), coelhos (THALLER, 1994), cães (BERGLUNDH & LINDHE, 1997; SU-GWAN et al., 2001; SCHLEGEL et al., 2003) e macacos (McALLISTER et al., 1999). A escolha do modelo animal para avaliar o reparo de defeitos ósseos utilizando biomateriais geralmente envolve animais jovens com alto potencial para osteogênese (SCHIMITZ & HOLLINGER, 1986).
2.6.1 Estudos em animais
Um estudo em 1997 analisou a cicatrização ao redor de implantes instalados em defeitos ósseos tratados com Bio-oss® (Geistlich Biomaterials, Wolhuser, Switzerland) em cães. Após a análise histológica, foi observado que partículas de Bio-oss® estavam claramente presentes nas áreas teste, porém com redução no número de partículas entre 3 e 7 meses, e que o Bio-oss® tornou-se totalmente integrado e subseqüentemente substituído por novo osso. Além disso, os implantes instalados nas áreas enxertadas demonstraram após 4 meses, quantidade e qualidade de osseointegração na interface osso-titânio, similares ao grupo controle, em osso normal sem enxerto (BERGLUNDH & LINDHE, 1997).
Schlegel et al., (2003) ao compararem os resultados histológicos em cirurgias de levantamentos de seio enxertados com osso autógeno versus Bio-oss® (Geistlich Biomaterials, Wolhuser, Switzerland) em dez cães beagles, com biópsias realizadas após 90 e 180 dias constataram que o Bio-oss® não reabsorveu, no entanto o osso natural neoformado estava integrado ao biomaterial penetrando no arcabouço e formando camadas de osso vital sobre o trabeculado não vital da estrutura do Bio-oss® . Os poros intercomunicantes do biomaterial permitiram completa incorporação deste corpo estranho e, as camadas de osso vital neoformado participaram do
turnover que envolve o processo de remodelamento. Os resultados deste estudo
sugeriram que o Bio-oss® pode ser utilizado com sucesso como material de enxerto para levantamento de seio quando não se necessita de total regeneração óssea da área enxertada e que o mesmo pode prevenir a indesejável reabsorção precoce que freqüentemente ocorre nos seios submetidos aos procedimentos de aumento ósseo.
Em 18 meses de avaliação histológica e radiográfica de levantamentos de seio maxilar com enxerto de osso bovino inorgânico em chimpanzés, foi constatado que o osso bovino mineral mantinha evidência radiográfica de densidade e estabilidade do seu tamanho, além de histologicamente suportar a hipótese de substituição por osso vital (McALLISTER et al., 1999).
O potencial osteocondutor de biomateriais de enxertos tem sido amplamente estudado utilizando tamanho de defeito crítico na calvária de ratos (DUPOIRIEUX et al., 2001; BRAZ et al., 2003; SILVA et al., 2005; ACCORSI MENDONÇA, 2008; FLECKENSTEIN et al., 2006). A calvária pode ser definida como a porção do crânio que se estende do arco supra orbital até a protuberância occiptal externa, possuindo uma origem embrionária intramembranosa. Anatomicamente, a calvária de ratos apresenta duas camadas corticais paralelas separadas por um tecido esponjoso com uma média de espessura de 0,68mm variando de 0,3 a 1,2mm (STRONG & MOULTHTROP, 2000).
O menor defeito intra-ósseo em um determinado osso de uma espécie animal que não se regenera espontaneamente por completo durante o período de vida do animal é definido como tamanho de defeito crítico (SCHMITZ & HOLLINGER, 1986). Um defeito de tamanho crítico de 8mm de diâmetro na calvária de ratos com 6 meses de idade, reduz para 5mm em 4 semanas e após esse período não ocorre alteração no defeito, e a sua porção central cicatriza pela formação de um tecido conjuntivo fibroso (URIST, 1984). Algumas vantagens para as pesquisas de enxertos ósseos, utilizando defeitos críticos de 8mm na calvária de ratos são o custo baixo dos animais, a necessidade de um espaço físico pequeno na manutenção, pequena quantidade de material para realizar o estudo piloto e as partículas dos biomateriais são inseridas com facilidade no defeito (SCHMITZ & HOLLINGER, 1986).
Um estudo realizado em defeitos críticos em calvárias de ratos onde o principal objetivo era quantificar a neoformação óssea pela histomorfometria entre três diferentes configurações de uma hidroxiapatita bifásica/ tricálcio fosfato, foi observado que as diferenças na neoformação óssea estavam relacionadas ao
tamanho dos poros. Os macroporos medindo entre 150 e 500µm promoveram o espaço necessário para a invasão vascular e subseqüente maior neoformação óssea através do biomaterial (FLECKENSTEIN et al., 2006). Artzi et al., (2003) analisaram em um primeiro estudo a histologia de defeitos ósseos experimentais criados em mandíbulas de cães e constataram que em até 2 anos de observações partículas de osso bovino mineral (Bio-oss®) dominavam os sítios sem substancial reabsorção. O Bio-oss® provou ser um excelente biomaterial osteocondutor em todos os sítios enxertados estando biologicamente incorporado ao tecido ósseo neoformado e servindo de guia para a completa restauração dos defeitos intra-ósseos. Em um segundo estudo, seguindo a mesma metodologia, foi realizado uma avaliação histomorfometrica da quantidade de osteocondutividade deste biomaterial e a configuração final do sítio cicatrizado aos três, seis, 12 e 24 meses. As partículas do osso bovino sofreram parcial atividade reabsortiva e biodegradação durante os seis primeiros meses, o que foi validado pelos osteoclastos e a alta celularidade presentes na proximidade das partículas. Entre seis e 24 meses discreta diminuição da fração correspondente à área da partícula foi observada (ARTZI et al., 2003).
Em 2004, o mesmo grupo em outro estudo onde compararam a taxa de reabsorção do osso bovino mineral (Bio-oss®) com o ß-fosfato tricálcico, também em defeitos ósseos experimentais em cães, concluíram que ambos os materiais podem ser de grande utilidade em cirurgias reconstrutivas, porém atenção deve ser dada às características de biodegradabilidade de cada um, já que o ß-fosfato tricálcico fosfato possui um padrão de reabsorção mais rápido do que o osso bovino mineral (ARTZI et al., 2004). Estes estudos estão em concordância com as observações feitas por Jensem et al. (2006), em um modelo de estudo similar, com análises histológicas e histomorfométricas, em defeitos criados em mandíbulas de miniporcos, onde os biomateriais estudados (Bio-oss® e ß-fosfato tricálcio) formaram osso em um padrão mais lento do que o osso autógeno nas fases iniciais de cicatrização (duas primeiras semanas). Ao final das oito semanas todos os defeitos regeneraram com osso neoformado e um desenvolvido osso medular. Os biomateriais demonstraram completa integração óssea, sugerindo sua utilização em cirurgias reconstrutivas onde diferentes indicações clínicas requerem diferentes padrões de biodegradabilidade.
O potencial osteocondutor de um osso bovino misto (OBM) em relação a dois ossos bovinos inorgânicos medulares (Bio-Oss® e Gen-Ox®) inseridos em defeitos
de tamanho crítico na calvária de ratos foi analisado comparativamente após 1, 3, 6 e 9 meses. Na análise microscópica comparativa não se observou o completo fechamento do defeito em quaisquer dos grupos estudados. No grupo controle a ossificação ocorreu na borda do defeito, sendo a região central preenchida por tecido conjuntivo fibroso. No grupo tratado com Bio-Oss ocorreu ossificação na borda do defeito com denso fibrosamento ao redor das partículas. No grupo tratado com Gen-Ox houve neoformação óssea ao redor das partículas do biomaterial e no grupo tratado com OBM o infiltrado inflamatório persistiu no primeiro mês sendo substituído por tecido conjunto fibroso ao redor das partículas (ACCORSI MENDONÇA, 2008).
2.6.2 Estudos em humanos
Ozyuvaci et al., (2003) através de avaliações radiológicas e histomorfométricas de seios maxilares relataram que os sítios enxertados com materiais aloplásticos (ß-fosfato tricálcico) reabsorveram mais do que aqueles enxertados com biomaterial xenógeno, no entanto, ambos mostraram respostas cicatriciais similares.
Em um estudo baseado em observações clínicas, o Bio-oss® (Geistlich Biomaterials, Wolhuser, Switzerland) foi utilizado sobre áreas enxertadas com bloco autógeno. Devido as suas propriedades osteocondutoras, que compensaram a reabsorção óssea natural e a invaginação de tecido mucoso, ocorreu a promoção de uma ponte para nova formação óssea funcionando como uma barreira durante o processo osteoclástico no período de cicatrização (MAIORANA et al., 2005).
Um estudo histológico de longo prazo de 20 casos de levantamentos de seio em humanos avaliou as reações ósseas ao osso bovino inorgânico (Bio-oss® - Geistlich Biomaterials, Wolhuser, Switzerland). Neste estudo foram realizadas biópsias após seis, nove, 18 meses e quatro anos. Os resultados indicaram alta biocompatibilidade e osteocondutividade do Bio-oss®, no entanto, suas partículas foram reabsorvidas muito lentamente e após quatro anos ainda se encontravam presentes sendo facilmente reconhecidas (PIATTELLI et al., 1999).
Após 10 anos de acompanhamento de um caso de levantamento de seio utilizando Bio-oss® (Geistlich Biomaterials, Wolhuser, Switzerland) com biópsias realizadas após oito meses, dois e 10 anos para avaliação histomorfométrica, foi
observado que a comparação das médias de cada período demonstrou um aumento significante na formação óssea associada à lenta reabsorção do biomaterial, já que suas partículas estavam circundadas por osso lamelar neoformado (SARTORI et al., 2003).
Com o objetivo de examinar a eficácia de uma nova hidroxiapatita bifásica (hidroxiapatita e tricálcio fosfato) utilizada como substituto ósseo em combinação com osso autógeno particulado em procedimentos de levantamento de seio em humanos, Artzi et al., (2008) verificaram após 6 e 9 meses a presença de osso neoformado altamente celular predominando ao redor das partículas. No entanto, este crescimento ósseo ocorreu sem a significante remoção das partículas. O fato da fração da área óssea e da fração da área da partícula não exibirem correlações significantes sugeriram que os dois elementos alteraram independentemente.
Sabendo que a quantidade de osso neoformado é dependente do tipo e da quantidade residual de material enxertado, um experimento relatou após análise histológica de seios maxilares humanos 12 meses pós-aumento que o osso bovino e o ß-fosfato tricálcico fosfato promoveram nova formação óssea, provando ser materiais biocompatíveis, mas com valores significantemente maiores para os enxertos com osso bovino, que pareceu possuir melhores propriedades osteocondutoras. Assim, ficou evidente que a configuração das partículas do osso bovino com seus macros e microporos resultaram em uma melhor propriedade osteocondutora e que a presença contínua do material estabeleceu um maior volume de tecido combinado pelo osso neoformado e o material enxertado, funcionando como uma nova rede densa trabeculada (ARTZI et al., 2005).
Um estudo multicentro controlado analisou entre 6 e 8 meses os resultados histomorfométricos de 48 cirurgias de levantamento de seio em 37 pacientes onde foi utilizado um fosfato de cálcio bifásico (Straumann® Bone-Ceramic) em 25 seios. O Bio-oss® foi utilizado na pesquisa como grupo controle em 23 seios. Os parâmetros avaliados foram: (1) a fração da área do osso neoformado, tecido conjuntivo e medular, e material de enxerto na região enxertada; (2) a fração da área óssea, e tecido conjuntivo e medular no rebordo alveolar residual; (3) o percentual da superfície de contato entre o biomaterial e o osso neoformado. Histologicamente ambos os grupos demonstraram íntimo contato entre o osso neoformado e as partículas do enxerto, sem diferenças estatisticamente significantes na quantidade de osso mineralizado. O percentual de contato entre o Bio-oss® e o osso
neoformado foi de 48,2% e de 34% no Straumann® Bone-Ceramic. Quantidade menor de partículas de enxerto foi observada no grupo teste aos 6 meses e uma maior quantidade de tecido conjuntivo e medular, porém a quantidade de tecido conjuntivo e medular em ambos os grupos não foi maior do que a encontrada no rebordo alveolar residual (CORDARO et al., 2008).
Uma análise histomorfométrica do osso neoformado 10 meses após cirurgias de levantamento de seio em 10 pacientes enxertados com uma combinação de osso autógeno e DFDBA e com osso autógeno e uma hidroxiapatita revelou satisfatória formação óssea em ambos os grupos na área enxertada, com 50,46% para o grupo com DFDBA e 46,79% para a HA. A avaliação histológica revelou a presença de osso maduro com áreas compactas e medulares em ambos os grupos. O infiltrado inflamatório não foi significante com prevalência de mononucleares. Os resultados indicaram que tanto o DFDBA quanto a HA associados ao osso autógeno foram biocompatíveis e promoveram osteocondução, atuando como matrizes para a neoformação óssea. No entanto, ambos os materiais continuavam claramente presentes após 10 meses (BöECK-NETO et al., 2002).
Hallman et al., (2002) avaliaram clínica e histologicamente a integração de implantes na região posterior da maxila após levantamento de seio com osso autógeno, Bio-oss® ou uma mistura de autógeno com Bio-oss® em uma proporção de 20:80. Os resultados indicaram uma resposta óssea similar e que a integração dos implantes pôde ser vista nas três situações, pelo menos em uma perspectiva de curto prazo, sem diferenças estatisticamente significantes. As partículas do Bio-oss® permaneceram no tecido ósseo e foram vagarosamente embutidas em osso lamelar, o que pôde resultar em maior densidade óssea, influenciando positivamente a estabilidade do implante. Assim, a resistência do Bio-oss® à reabsorção e degradação pode ser vantajosa para a manutenção das dimensões iniciais da área enxertada.
3 PROPOSIÇÃO
O objetivo desse trabalho foi avaliar por meio da análise histomorfométrica o comportamento osteocondutor de hidroxiapatitas com diferentes características físico-químicas no reparo de defeito ósseo de tamanho crítico na calvária de ratos.
Os objetivos específicos foram:
- Comparar a densidade de volume de osso neoformado nas regiões periférica, intermediária e central de um grupo enxertado com uma hidroxiapatita de baixa cristalinidade, um grupo enxertado com uma hidroxiapatita de alta cristalinidade e um grupo preenchido pelo coágulo em 1, 3 e 6 meses após a cirurgia.
- Analisar a densidade de volume de osso neoformado nas regiões periférica, intermediária e central de cada grupo (hidroxiapatita de baixa cristalinidade, hidroxiapatita de alta cristalinidade e coágulo) isoladamente em 1, 3 e 6 meses após a cirurgia.
4 MATERIAIS E MÉTODOS
Dentre os procedimentos relatados a seguir, destaque-se que as hidroxiapatitas utilizadas, os procedimentos cirúrgicos, o processamento histológico e a análise histomorfométrica foram realizados e descritos por CONZ (2006).
4.1 Materiais
Foram produzidos dois diferentes grânulos de hidroxiapatita (HA-1 e HA-2), com razão molar Ca/P igual a 1,60 e 1,67 respectivamente e cristalinidades diferentes. As diferenças nas cristalinidades dos materiais de partida foram obtidas por meio de um controle dos reagentes empregados, da temperatura e do tempo de processamento.
Figura 1 - Difratogramas de raios-X dos grânulos das hidroxiapatitas com diferentes cristalinidades, HA-1 e HA-2 (CONZ, 2006).
Os difratogramas dos grânulos produzidos com os pós HA-1 e HA-2 estão apresentados na figura 1. Os espectros obtidos apresentaram os picos principais referentes à hidroxiapatita sintética (JCPDS-ICDD cartão 9-432, 1992), podendo destacar a presença dos picos nas intensidades de 100% correspondente ao plano (211), o pico na intensidade de 60% correspondente ao plano (300) e o pico na intensidade de 40% correspondente ao plano (002).
Na Tabela 1 estão apresentados os índices de cristalinidade dos pós de hidroxiapatita e dos grânulos de hidroxiapatita após o processamento, determinado pela técnica preconizada por Landi et al. (2000), onde a cristalinidade do material é avaliada por meio dos espectros de raio-X aplicando a seguinte fórmula: Xc =1- (V112/300/ I300)X 100, onde Xc é o índice de cristalinidade da amostra, V112/300 corresponde ao vale existente no espectro de raios-x entre os planos (112) e (300); e I300 corresponde ao valor da intensidade do plano 300.
Tabela 1 - Índice de cristalinidade das amostras (CONZ, 2006).
Amostra Antes do processamento dos grânulos (%) Após o processamento dos grânulos (%) HA-1 ≈ 28 ≈ 28 HA-2 ≈ 70 ≈ 70
