MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL
ESCOLA DE ENGENHARIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA DE MINAS,METALÚRGICA E DE MATERIAIS –
PPGEM
CONFECÇÃO DE BIOSSENSORES ATRAVÉS DA IMOBILIZAÇÃO DE BIOCOMPONENTES POR ELETROPOLIMERIZAÇÃO DE PIRROL
Vinícius Mordini de Andrade Engenheiro Químico
Dissertação para obtenção do título de Mestre em Engenharia
Porto Alegre 2006
II
MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL
ESCOLA DE ENGENHARIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA DE MINAS,METALÚRGICA E DE MATERIAIS –
PPGEM
CONFECÇÃO DE BIOSSENSORES ATRAVÉS DA IMOBILIZAÇÃO DE BIOCOMPONENTES POR ELETROPOLIMERIZAÇÃO DE PIRROL
Vinícius Mordini de Andrade Engenheiro Químico
Trabalho realizado no Departamento de Materiais da Escola de Engenharia da UFRGS, dentro do Programa de Pós-Graduação em Engenharia de Minas, Metalúrgica e de Materiais – PPGEM, como parte dos requisitos para a obtenção do título de Mestre em Engenharia.
Área de Concentração: Ciência dos Materiais
Porto Alegre 2006
III
Esta Dissertação foi julgada adequada para obtenção do título de Mestre em Engenharia, área de concentração Ciência dos Materiais e aprovada em sua forma final, pelo Orientador e pela Banca Examinadora do Curso de Pós-Graduação.
Orientador: Prof. Dr. Carlos Arthur Ferreira
Banca Examinadora:
Prof. Dr. Carlos Arthur Ferreira
Prof. Dr. Fernando Thomé Kreutz
Profª. Drª. Simone Stülp
Prof. Dr. Alvaro Meneguzzi
Prof. Dr.-Ing. Antônio Cezar Faria Vilela Coordenador do PPGEM
IV
Dedico este trabalho a todos que se esforçam para a construção de um mundo melhor, seja através da ciência, política, ações sociais, ou apenas pelo bom exemplo e vontade.
V
AGRADECIMENTOS
À Universidade Federal do Rio Grande do Sul, pela acolhida, ensino e contribuição para minha formação técnica e pessoal.
Ao professor Carlos Ferreira pela oportunidade oferecida e por acreditar em mim e na construção desta dissertação ao longo deste período. Obrigado pela orientação, estímulo, dedicação e esforço pessoal proporcionado.
Aos amigos do LAPOL Sandro Borges, Daniel Kersting, Franco Amado, Luis Fernando “Bambam”, Flávia Abreu, Fernanda Anderle e demais colegas que acompanharam e muito opinaram em meu trabalho durante os almoços, cervejadas e churrascos. Nossas conversas foram de grande incentivo. Em especial à Liciane Bertol, por sua colaboração e companheirismo desde o início como bolsista.
Ao Dr. Fernando Kreutz, por me confiar o espaço e equipamentos sem restrições e pelas “aulas particulares” de bioquímica, fundamentais neste trabalho; à Aline Baldi pelo auxílio, reforço teórico nos fundamentos e conceitos dos experimentos e principalmente pela sua amizade, assim como de todo o pessoal da FK Biotecnologia.
Ao Sistema FIERGS, em especial ao SENAI, pelo apoio concedido nesta reta final do estudo, mostrando que esta é uma instituição que realmente estimula o estudo e a pesquisa, e pelas mensagens de carinho e otimismo de todos os colegas.
Aos meus pais pelo amor proporcionado e enorme confiança que me depositam, por acreditarem e me incentivarem em cada novo ideal que crio. Sem isto, com certeza eu não seria metade da pessoa que sou hoje. Amo muito vocês.
À minha noiva Simone Sanghi, minha companheira de todas as horas, pelo amor incondicional, respeito, compreensão e atenção dedicada nas horas em que eu mais precisei. Meus passos não seriam os mesmos sem o teu olhar e as tuas palavras.
A todos os meus amigos de perto, de longe, de hoje e de ontem, que muito colaboraram opinando, criticando ou apenas torcendo pelo sucesso deste trabalho. Obrigado pelo simples fato de vocês existirem. Esta vitória é nossa!
VI
SUMÁRIO
ÍNDICE DE FIGURAS... X ÍNDICE DE TABELAS... XIII LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS ...XIV RESUMO ...XV ABSTRACT...XVI
1. INTRODUÇÃO ... 1
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ... 4
2.1. POLÍMEROS INTRINSECAMENTE CONDUTORES ...4
2.1.1. Histórico ...4
2.1.2. Mecanismo de condução ...6
2.1.3. Síntese de polímeros condutores...7
2.1.4. Polimerização eletroquímica – conceitos e considerações gerais ...10
2.1.4.1 Eletrodos ...10
2.1.4.2 Monômeros...11
2.1.4.3 Eletrólitos...11
2.1.4.4 Dopagem (doping)...12
2.1.5. Propriedades eletroquímicas do polipirrol ...13
2.1.5.1 Condições de síntese ...13
2.1.5.2 Morfologia e propriedades mecânicas...13
2.1.5.3 Condutividade e eletroatividade ...14
2.2. COMPONENTES BIOLOGICAMENTE ATIVOS (BIOCOMPONENTES) ..15
2.2.1. Enzimas ...16
2.2.1.1 Enzimas em biossensores...17
2.2.2. Anticorpos ...18
2.2.3. Técnicas de imobilização de biocomponentes ...19
2.2.3.1 Adsorção ...20
2.2.3.2 Ligação covalente...20
2.2.3.3 Filmes ou matrizes poliméricos(as) ...21
2.3. BIOSSENSORES...22
VII
2.3.2. Conceitos e definições ...24
2.3.2.1 Receptor ...25
2.3.2.2 Transdutor ...26
2.3.3. Classificação de biossensores ...27
2.3.3.1 Quanto ao elemento de reconhecimento biológico...27
2.3.3.1.1 Reconhecimento por biocatálise...28
2.3.3.1.2 Reconhecimento por bioafinidade ou biocomplexidade ...28
2.3.3.2 Quanto ao mecanismo de transdução...28
2.3.3.2.1 Biossensores amperométricos...29
2.3.3.2.2 Biossensores potenciométricos ...30
2.3.3.2.3 Outros tipos de biossensores ...31
2.3.3.2.4 Comparação entre o método potenciométrico e amperométrico...32
2.3.3.3 Critérios de desempenho de biossensores...33
2.3.3.3.1 Sensibilidade ...33
2.3.3.3.2 Estabilidade...34
2.3.3.3.3 Tempo de resposta...36
2.3.3.3.4 Reprodutibilidade ...37
2.3.4. Aplicação de polímeros condutores em biossensores ...37
3. MATERIAIS E MÉTODOS... 41
3.1. Reagentes e soluções...41
3.2. Equipamentos ...42
3.2.1. Ensaios eletroquímicos ...42
3.2.2. Espectroscopia de infravermelho ...42
3.3. Construção dos eletrodos e montagem das microcélulas ...42
3.3.1. Eletrodos de trabalho (ET) ...43
3.3.1.1 Limpeza eletroquímica...43
3.3.2. Eletrodos de referência (ER)...43
3.3.3. Contra-eletrodos (CE) ...44
3.3.4. Células de três eletrodos ...44
3.4. Imobilização enzimática – preparo do biossensor...45
3.5. Imobilização enzimática por eletropolimerização ...46
3.5.1. Faixa de potencial ...47
VIII
3.5.3. Velocidade de varredura ...48
3.5.4. Concentração de eletrólito ...48
3.5.5. Concentração de pirrol...48
3.5.6. Concentração de enzima ...49
3.6. Caracterização do filme obtido...49
3.6.1. Análises por FTIR ...49
3.7. Teste de sensibilidade do biossensor ao H2O2...50
3.7.1. Diferença de potencial ...50
3.7.2. Concentração de eletrólito ...51
3.8. Estudos sobre o mecanismo de imobilização enzimática ...51
3.8.1. Influência do grau de pureza do monômero...51
3.8.2. Ligação inespecífica...52
3.8.3. Quantificação da imobilização de enzima ativa...53
3.9. Imobilização do V3.5R3 por entrapment com inoculação da HRPO ...54
4. RESULTADOS E DISCUSSÕES ... 55
4.1. Preparo dos biossensores...55
4.2. Células de três eletrodos...55
4.3. Condições ótimas de preparo do biossensor ...55
4.3.1. Faixa de potencial de polimerização ...56
4.3.2. Espessura do filme polimérico ...57
4.3.3. Velocidade de varredura ...59
4.3.4. Concentração de pirrol...61
4.3.5. Concentração de enzima ...63
4.3.6. Padronização dos parâmetros da etapa de eletropolimerização...66
4.4. Caracterização do filme obtido...67
4.5. Teste de sensibilidade ao H2O2 (TSP) ...68
4.5.1. Diferença de potencial ...69
4.5.2. Concentração de eletrólito ...72
4.5.3. Estabilização ...73
4.6. Comparação com proteína inespecífica ...74
4.7. Capacidade de imobilização de enzima ativa...75
IX
4.8.1. Imobilização do anticorpo V3.5R3...79
4.8.2. Inoculação da enzima HRPO ...80
5. CONCLUSÕES ... 83
6. SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS... 85
X
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1 – Configuração de um biossensor para detecção do PSA. O anticorpo é imobilizado à superfície do eletrodo por entrapment e os demais biocomponentes
ligam-se através de reações específicas. ...2
Figura 2 – Configurações das imobilizações realizadas: a) PPy-HRPO x H2O2: imobilização por entrapment da HRPO; b) PPy-V3.5R3-HRPO x H2O2: imobilização por entrapment do V3.5R3 com inoculação da HRPO...3
Figura 3 – Condutividade de polímeros condutores em comparação com outros materiais [12]...5
Figura 4 – Estrutura com ligações duplas alternadas e caminho de condução eletrônica para o polipirrol ...7
Figura 5 – Mecanismo de eletropolimerização do pirrol [24]. ...8
Figura 6 – Gráfico corrente x tempo de uma síntese eletroquímica sob potencial constante (E=+500 mV) mostrando cálculo simplificado da carga envolvida...9
Figura 7 – Reação redox de dopagem e dedopagem do polipirrol...12
Figura 8 – Representação gráfica do “Princípio Chave-fechadura” [17]...22
Figura 9 – Principais etapas do mecanismo de operação de um biossensor [35]...25
Figura 10 – Modelo das etapas da difusão eletrônica para o processo de detecção em biossensores amperométricos descrito por Davis [33]...30
Figura 11 – Estudo da estabilidade de um biossensor enzimático amperométrico [15]. 35 Figura 12 – Esquema da microcélula de três eletrodos utilizada. A reação ocorre entre a superfície exposta do ET (Pt) e o CE (Pt), sendo monitorada pelo ER (Ag+). A imobilização da enzima e formação do polímero é verificada no ET. O CE é disposto de forma eqüidistante ao ET para manter a uniformidade do filme...45
Figura 13 – HRPO imobilizada de forma direta em matriz polimérica – método de entrapment – e a detecção de H2O2...46
Figura 14 – Imobilização de HRPO por inoculação em anticorpo V3 imobilizado por entrapment em matriz polimérica. ...54
Figura 15 – Voltametria cíclica em solução Py 50 mM, HRPO 0,5 mg.mL-1, LiClO4 0,1 M e faixa de potencial de 0 a 1000 mV e v = 50 mV.s-1...57
XI
Figura 16 – Variação da corrente em função do tempo durante a eletropolimerização em solução Py 0,1M, HRPO 0,5 mg.mL-1, LiClO4 0,1 M. Faixa de potencial entre +500
a +1000 mV e v = 50 mV.s-1...58
Figura 17 – Corrente x [H2O2] para diferentes espessuras de camada.
Eletropolimerização em solução HRPO 0,25 mg/mL, Py 0,1M e LiClO4 0,1M,
polimerização de 3, 7 e 15 ciclos entre +500 e +1000 mV...58 Figura 18 – Corrente x tempo de polimerizações com diferentes velocidades de
varredura a) 10 mV.s-1 e 50 mV.s-1; b) 20 mV.s-1 e 100 mV.s-1
...59
Figura 19 – Corrente x [H2O2] de biossensores eletropolimerizados sob diferentes
velocidades de varredura, de forma a verificar a influência deste parâmetro eletroquímico sobre a sensibilidade ao H2O2. Todos os biossensores foram
polimerizados em soluções com as mesmas concentrações de HRPO, Py e LiClO4.
...61 Figura 20 – Gráfico Corrente x tempo para eletropolimerizações com potencial cíclico
entre 0 e +1000 mV e concentrações de Py de 25, 50, 75, 100 e 200 mM. Velocidade de varredura= 50 mV.s-1; [HRPO]= 0,5 mg.mL-1 e [LiClO4]=0,1M. ...62
Figura 21 – Teste de sensibilidade ao H2O2 (TSP) para biossensores
eletropolimerizados em soluções com concentrações de pirrol de 50, 75, 100 e 200 mmol/L ([HRPO]=0,5 mg.mL-1, [LiClO4]=0,1M). ...63
Figura 22 – Gráfico corrente x tempo para eletropolimerizações sob voltametria cíclica (+500 a +1000mV/ 50 mV.s-1) com concentrações de HRPO de 0,1 a 0,4 mg.mL-1
(em intervalos de 0,1 mg.mL-1), para a verificação da influência da concentração de
enzima no grau de polimerização (LiClO4 0,1M + 0,05 M Py)...64
Figura 23 – Concentração de HRPO na solução de polimerização x Carga elétrica calculada através da integral da Figura 22...65 Figura 24 – Respostas ao H2O2 de biossensores imobilizados em soluções com
diferentes concentrações de HRPO (0,0 a 0,5 g.L-1) para verificação da influência
da concentração da enzima na sensibilidade do biossensor ([Py]=0,05M/ [LiClO4]=0,1M/ +500 mV). ...65
Figura 25 – Espectro do polipirrol eletropolimerizado em solução aquosa em concentração 0,05M de monômero e 0,1M de LiClO4...67
XII
Figura 26 – Espectro do polipirrol eletropolimerizado na concentração de 0,05M de pirrol em meio com 0,1M de LiClO4 e 0,5 mg.mL-1 de HRPO. ...68
Figura 27 – Voltametria cíclica de -500 a +500 mV em solução 0,1 M de LiClO4 com
adição de 0,1 mM de H2O2 a cada ciclo em v = 50mV.s-1. O biossensor utilizado foi
eletropolimerizado em solução 0,05 M de Py, 0,1 M de de LiClO4 e 0,5 mg.mL-1 de
HRPO...70 Figura 28 – Corrente x tempo para adições de 0,2 mmol/L sob diferentes potenciais
aplicados. Eletrodos eletropolimerizados conforme Tabela 3. ...71 Figura 29 – Corrente x tempo em adições consecutivas de H2O2. Biossensor
confeccionado sob parâmetros estabelecidos na Tabela 3, E fixo=+500 mV. ...72 Figura 30 – Corrente x Concentração de H2O2 para as respostas ao H2O2 de
biossensores confeccionados nos parâmetros estabelecidos na Tabela 3, com sensibilidade ao H2O2 testada em diferentes concentrações de LiClO4...73
Figura 31 - Teste comparativo de sensibilidade ao H2O2 entre eletrodos
eletropolimerizados com PPy puro, HRPO imobilizada e albumina. ...74 Figura 32 – Curva de calibração Absorbância x concentração de HRPO, com valores de
leitura para soluções-padrões de HRPO em comprimento de onda de 450 nm.. ...75 Figura 33 – Valores de absorbância obtidos pelo produto de reação dos biossensores
com o TMB. Os mesmos foram confeccionados nas condições descritas na Tabela 3, variando apenas a [HRPO] (n=3). ...76 Figura 34 – Gráfico tempo x corrente para eletropolimerizações de imobilização do
V3.5R3 nas concentrações de LiClO4 de 0,1 mol.L-1 e 0,2 mol.L-1 para verificação
da influência do eletrólito no grau de polimerização. ...79 Figura 35 – Comparação da sensibilidade ao H2O2 nos três experimentos de
entrapment e inoculação: a) polimerização de V3.5R3 com inoculação de HRPO; b)
polimerização de BSA com inoculação de HRPO; e c) polimerização de V3.5R3 sem inoculação. [H2O2] = 8 mmol.L-1. ...81
Figura 36 - a) Esquema de biossensor para imobilização enzimática - vista superior e inferior; b) aparelho eletrônico para a leitura da concentração do analito...85
XIII
ÍNDICEDETABELAS
Tabela 1 – Condições ótimas dos parâmetros eletroquímicos para a imobilização da HRPO em PPy segundo Razola [18], considerando como critério de eficiência a corrente obtida da reação com H2O2...46
Tabela 2 – Quantidade de cargas calculadas para cada velocidade de varredura através da integral das áreas mostradas nas Figuras 24-a e 24-b. Tempo= 100 s. ...60 Tabela 3 – Condições consideradas ótimas para a imobilização da HRPO em polipirrol
(critério de otimização: sensibilidade ao H2O2). Os parâmetros que diferem da
Tabela 1 estão em negrito...66 Tabela 4 – Resultados para a relação entre as quantidades de HRPO utilizada na
polimerização para quantidade de HRPO imobilizada ativa...77 Tabela 5 – Condições de imobilização do anticorpo V3.5R3. Em negrito os parâmetros
alterados em relação às condições de imobilização da enzima HRPO. ...80 Tabela 6 – Esquema descritivo do teste com enzima inespecífica para o H2O2 para o
biossensor preparado pelas etapas de entrapment do V3.5R3 seguido de inoculação da enzima HRPO. ...81
XIV
LISTADEABREVIATURASESÍMBOLOS δ – Dipolo
A – Ampere Ac – Anticorpo Ag – Antígeno
BSA – Bovine albumine serum (soro de albumina bovina) CE – Contra-eletrodo
DBO – Demanda bioquímica de oxigênio
DNA – Deoxyribonucleic acid (ácido desoxirribonucléico) ECS – Eletrodo de calomelano saturado
ELISA – Enzime linked immuno-sorbent assay (ensaio imunoenzimático) EP – Eletropolimerização
EPH – Eletrodo padrão de hidrogênio ER – Eletrodo de referência
ET – Eletrodo de trabalho
FET – Field effect transistor (transistores de efeito de campo)
FTIR – Espectroscopia de infravermelho por transformada de Fourier GOx – Enzima glucose oxidase
HRPO – Horseradish root peroxidase (Peroxidase de raiz forte) i – Corrente medida
PIC – Polímero intrinsecamente condutor PPy – Polipirrol
PSA – Prostate specific antigen (Antígeno específico da próstata) S – área (superfície)
S.m-1 – Siemens por metro
TSP – Teste de sensibilidade ao peróxido de hidrogênio (H2O2)
V3.5R3 – Anticorpo específico para a enzima HRPO VC – Voltamograma cíclico
XV RESUMO
Neste trabalho é apresentado um estudo da imobilização da enzima horseradish peroxidase (HRPO) em matriz polimérica através de dois métodos diferentes. O primeiro consiste em um método de uma etapa, no qual a HRPO é imobilizada por eletropolimerização de pirrol em meio aquoso com eletrodo de platina – técnica esta denominada entrapment – visando a confecção de biossensores enzimáticos para a detecção amperométrica de peróxido de hidrogênio (H2O2). A matriz polimérica com a
enzima imobilizada foi analisada por reação colorimétrica, confirmando as afirmações de alguns autores sobre a baixa quantidade de enzima imobilizada, e FTIR mostrando espectros bastante semelhantes entre os filmes de polipirrol (PPy) puro e de PPY + HRPO. Foram realizados estudos do efeito das concentrações de monômero, enzima e eletrólito, assim como dos parâmetros eletroquímicos para a otimização da preparação do biossensor. Os valores dos parâmetros otimizados serviram de referência para o estudo do segundo método de imobilização, no qual é utilizado um anticorpo específico para a enzima HRPO, o V3.5R3, imobilizado via entrapment com a HRPO inoculada ao sistema através da imersão do substrato formado (PPy-V3.5R3) em uma solução de HRPO. Os dois métodos de confecção dos biossensores para a determinação quantitativa de H2O2 são comparados: em relação ao parâmetro comportamento linear,
verificou-se uma faixa de concentração de 0 a 15 mmol/L de H2O2 para o método via entrapment, enquanto que através do método com inoculação foi verificado um
comportamento linear de 2 a 8 mmol/L de H2O2. Em relação à resposta do biossensor,
tem-se para a concentração de 8 mmol/L de H2O2, uma corrente de aproximadamente
600 nA utilizando biossensores preparados pelo método de entrapment e 300 nA pelo método com inoculação. Apesar do baixo desempenho da imobilização do anticorpo V3.5R3 para a detecção de H2O2, o sucesso na imobilização de diferentes
biocomponentes e o desenvolvimento de mecanismos como a inoculação amplia o espectro de possibilidades para o estudo de biossensores.
XVI ABSTRACT
In this work is presented a study of the immobilization of the enzyme horseradish
peroxidase (HRPO) in polymeric matrix by two different methods. The first one consist in
a one-step method, in which the HRPO is immobilized by electropolymerization of pyrrole in aqueous solution onto platin electrode – techniques denominated entrapment – aiming the confection of enzymatic biosensors for the amperometric detection of hydrogen peroxide (H2O2). The polymeric matrix with the immobilized enzyme (substrate
PPy-HRPO) was analyzed by colorimetric reaction, confirming the affirmations of some authors about the low quantities of enzymatic immobilization, and FTIR, what shows very similar specters for the polypyrrole (PPy) film and the PPy + HRPO. Studies of the concentrations of monomer, enzyme and electrolyte, as well as of the electrochemical parameters, have been carried through for the optimization of the biossensor. The values of the optimized parameters were used as reference for the study of the second immobilization method, in which is used a specific antibody for enzyme HRPO, the V3.5R3, immobilized via entrapment. The HRPO is, then, inoculated to the system by immersion of the PPy-V3.5R3 substrate in HRPO solution. The results of the biossensores confectioned by the two methods are compared: about the linear behavior it was verified a range of concentration form 0 to 15 mmol/L of H2O2, while through the
second method was verified a linear range of 2 to 8 mmol/L of H2O2. About the signal
response, for the same concentration of 8 mmol/L of H2O2, an electric current of 600 nA
was reached, against 300 nA with the biosensors constructed by the second method. Although the low performance of the immobilization of the antibody V3.5R3 for the H2O2
detection, the success in different biocomponents immobilization and the development of mechanisms as the inoculation increases the possibilities specter for biosensors research.
Keywords: biosensor, pyrrole, peroxidase
1
1. INTRODUÇÃO
Os polímeros orgânicos são materiais de larga utilização, tradicionalmente vistos como isolantes elétricos. Porém, nas últimas décadas este papel vem sendo quebrado à medida que estudos sobre uma nova classe de polímeros conjugados têm trazido este tipo de material a assumir o papel de condutor em uma gama de novas aplicações. Cientistas de diversas disciplinas estão combinando conhecimentos para estudarem sólidos orgânicos que exibem propriedades condutoras notáveis.
Esta nova classe de polímeros, conhecida como polímeros intrinsecamente condutores (PIC) ou polímeros eletroativos conjugados, tem sido aplicada em estudos de diversas áreas, quando não raro encontrados em estudos multi-disciplinares. Estes materiais exibem propriedades elétricas e óticas muito interessantes, até então encontradas apenas em sistemas inorgânicos.
Um dos grandes avanços que os PIC’s proporcionaram foi o aprimoramento dos biossensores, substituindo as membranas e sistemas semi-permeáveis utilizados até então pela imobilização através da eletropolimerização – método que consiste na formação de uma matriz polimérica (rede) na qual o biocomponente fica fisicamente ou covalentemente ligado às cadeias poliméricas. Visto que vários PIC são biologicamente inócuos, o biocomponente mantém suas propriedades biológicas. Esta forma de imobilização é denominada entrapment, cujo mecanismo ainda não está totalmente elucidado.
Esta nova tecnologia criou os chamados “biossensores de terceira geração”, os quais são simples, de resposta rápida, estáveis, podem ser miniaturizados e com potencial de aplicação para os mais diversos fins. Parte-se do princípio que qualquer reação biológica pode ser analisada por este método através da imobilização de um dos componentes envolvidos – o qual pode ser desde células inteiras até fragmentos protéicos –, no entanto a maioria das aplicações é voltada para o uso de enzimas, formando os também classificados como “biossensores enzimáticos”.
2
Devido às propriedades “redox” dos polímeros utilizados para a imobilização, as enzimas do tipo oxidoreductases, como a glucose oxidase (GOx), a urease e as
peroxidases são as mais freqüentemente utilizadas, geralmente para aplicações clínicas,
como a detecção e quantificação da glicose, uréia e peróxidos.
Uma das aplicações mais recentes e promissoras é a identificação e quantificação de biomarcadores (produto natural que pode ser associado a determinado processo biológico) no diagnóstico e acompanhamento de doenças crônicas como, por exemplo, o câncer de próstata. Alguns estudos obtiveram sucesso construindo um biossensor para a detecção do PSA (prostate specific antigen), o qual poderá ser útil no diagnóstico e acompanhamento de pacientes.
Este tipo de biossensor é produzido com a imobilização de um anticorpo anti-PSA, (o que pode ser feito em matriz polimérica), seguido da adição da amostra contendo PSA e a adição de um segundo anticorpo anti-PSA conjugado à peroxidase. A presença de H2O2
gera o sinal amperométrico, como mostrado na Figura 1.
Figura 1 – Configuração de um biossensor para detecção do PSA. O anticorpo é imobilizado à superfície do eletrodo por entrapment e os demais biocomponentes ligam-se através de reações específicas.
Neste estudo são apresentadas as etapas de imobilização semelhantes a este processo, sendo utilizados a peroxidase de raiz forte – horseradish peroxidase – (HRPO) e o anticorpo V3.5R3 (anti-peroxidase). A imobilização da HRPO é realizada em matriz polimérica de polipirrol (PPy), sendo estudados os parâmetros físicos e eletroquímicos das etapas de eletropolimerização/ imobilização e a respectiva influência de cada parâmetro na sensibilidade do substrato PPy-HRPO ao peróxido de hidrogênio (H2O2), como mostra o
3
A imobilização do anticorpo V3.5R3, também é feita por entrapment, seguido de uma etapa de inoculação da HRPO para sensibilizar o substrato ao H2O2, como mostra a
Figura 2b.
Figura 2 – Configurações das imobilizações realizadas: a) PPy-HRPO x H2O2: imobilização por entrapment
da HRPO; b) PPy-V3.5R3-HRPO x H2O2: imobilização por entrapment do V3.5R3 com inoculação da HRPO.
Nesta segunda configuração (b) a enzima fica mais exposta ao meio e espera-se que seja menos suscetível a efeitos de impedimento espacial. A eficiência da imobilização deste método também é avaliada pela sensibilidade ao H2O2.
O H2O2, assim como outros peroxigênios, tem como principais aplicações o
branqueamento da pasta de papel, a indústria têxtil, os cosméticos e o campo ambiental. Suas propriedades únicas os tornam particularmente adequados para fornecer proteção ao meio ambiente em áreas da vida cotidiana e na indústria em geral, desde a prevenção da poluição até sua redução e eliminação.
O uso do H2O2 apresenta as vantagens de ser um líquido totalmente miscível com
água, permitindo facilidade de dosagem e controle; não é tóxico; apresenta como produtos de degradação apenas água e oxigênio; quando manuseado e armazenado corretamente, é um oxidante seguro e fácil de se trabalhar e, em reação com certos ácidos, pode formar o ácido de Caro (ácido permonossulfúrico), um sistema de oxidação particularmente potente.
Este trabalho é fruto de uma parceria entre o Laboratório de Polímeros da UFRGS - LAPOL e a empresa FK Biotecnologia, os quais somaram recursos humanos, tecnológicos e financeiros para darem este passo na grande e promissora área dos biossensores.
4
2. REVISÃO
BIBLIOGRÁFICA
2.1. POLÍMEROSINTRINSECAMENTECONDUTORES
Uma nova classe de polímeros conhecida como polímeros intrinsecamente condutores (PIC), ou polímeros conjugados, está sendo estudada devido às interessantes propriedades elétricas e ópticas que vêm a satisfazer diversas necessidades de áreas como a microeletrônica [1, 2], química analítica [3], biotecnologia [4], entre outras. Os polímeros intrinsecamente condutores diferenciam-se dos outros semicondutores cristalinos por serem em sua natureza de estrutura molecular e apresentarem comprimento de cadeias em menor escala [5]. A condução elétrica ocorre pelo fenômeno de conjugação de ligações duplas, resultando na sobreposição de seus orbitais moleculares parcialmente preenchidos e permitindo o livre movimento dos elétrons entre estas lacunas.
Os polímeros condutores são conhecidos em aplicações físicas e físico-químicas, como inibidores de corrosão [6], capacitores compactos, revestimento eletrostático [7], proteção eletromagnética de computadores, dispositivos de “janela inteligente” [8] – a qual varia a quantidade de luz que permite passar –, entre outras. Devido a algumas vantagens como baixo custo, propriedades biológicas inertes, capacidade de exclusão de interferentes, alta velocidade de transferência de elétrons e facilidade de síntese sobre qualquer superfície metálica, independentemente da forma [9], os PIC’s tem sido intensamente utilizados para a confecção de sensores. Juntamente com a moderna instrumentação eletroquímica disponível atualmente, a associação dos PIC’s aos eletrodos quimicamente modificados resulta em sensores com alta seletividade e sensibilidade [10].
2.1.1. HISTÓRICO
As pesquisas em polímeros condutores intensificaram-se logo após a descoberta do poli(súlfur-nitrido) [(SN)x], em 1975, o qual torna-se supercondutor em baixas temperaturas. No entanto, os polímeros condutores complexos na forma de tetraciano e tetraoxalato-platinato – os complexos de transferência de cargas (sais de Krogman) – já
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eram conhecidos desde 1971 [11]. A descoberta do poliacetileno dopado, o qual é considerado o marco inicial dos PIC’s, iniciou-se em 1974, quando este polímero – comumente conhecido como um pó preto – foi sintetizado via catálise com catalisadores do tipo Ziegler-Natta, formando um filme de aparência metálica. Apesar disto, as propriedades condutoras não chegaram a obter alterações significativas. No entanto, em 1977 Shirakawa, MacDiarmid e Heeger [12] descobriram que a oxidação com vapor de cloro, bromo ou iodo tornou o filme de acetileno dez vezes mais condutor do que o original. Este tratamento com halogênios foi chamado de “doping” (dopagem) pela analogia com a dopagem de semicondutores.
A forma “dopada” do poliacetileno chegou a uma condutividade de 10 Siemens por metro (S.m-1), um valor maior do que qualquer outro polímero conhecido. Como comparação, o teflon apresenta uma condutividade de 10-16 S.m-1 enquanto a prata e o cobre 108 S.m-1, como mostra a Figura 3:
Figura 3 – Condutividade de polímeros condutores em comparação com outros materiais [12].
A síntese eletroquímica de PIC's teve seu primórdio com os estudos de Dall'Olio e col. em 1968, quando obtiveram o polipirrol, polímero na forma de um pó preto insolúvel, por oxidação eletroquímica do monômero pirrol em solução aquosa de ácido sulfúrico em eletrodo de platina. Porém o polímero resultante apresentava condutividade elétrica muito baixa (0,08 S.m-1) se comparada a de outros polímeros obtidos por síntese química na
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Estes estudos ganharam força em 1979, quando Diaz e col. obtiveram filmes de polipirrol por síntese eletroquímica com condutividades elétricas muito mais altas (100 S.cm-1) e excelente estabilidade ao ar [14, 15, 16, 17]. A partir de então os principais aspectos da síntese eletroquímica passaram a ser estudados sob o ponto de vista da química, física, ciência de polímeros e de materiais, entre outros.
Em 1987, surgiu a primeira aplicação dos polímeros condutores na imobilização de enzimas. A co-deposição da enzima GOx em polipirrol sobre eletrodos de platina criou o primeiro biossensor por polimerização eletroquímica e abriu uma vasta gama de possibilidades que resultou na denominada terceira geração de biossensores [18, 19, 20].
2.1.2. MECANISMO DE CONDUÇÃO
O mecanismo da condução em alguns polímeros é muito complexo, já que um mesmo material pode exibir uma condutividade dentro de uma escala de até quinze ordens de valor e muitos envolvem diferentes mecanismos dentro de regimes diferentes [11].
Em geral, os PIC’s apresentam uma configuração de ligações conjugadas – ligações simples e duplas alternadas ao longo das cadeias (Figura 4) – responsável pelo processo de condução eletrônica. Além da condutividade elétrica, estes elétrons alternados são responsáveis por outras propriedades como baixa energia de transição ótica, baixo potencial de ionização e alta afinidade elétrica [13]. Devido a isto, os PIC's são também chamados de "metais sintéticos", e têm sido muito utilizados em eletrocatálise, separação por membranas e cromatografia, porém a aplicação destes na modificação de eletrodos convencionais criou novas possibilidades no desenvolvimento de sensores químicos e bioquímicos [21, 22].
No entanto, a configuração conjugada não é o bastante para tornar um material polimérico condutor. Além deste fator “transportadores de carga” em forma de elétrons extras ou “lacunas” têm de ser injetados no material, e esta é a função do dopante [23]. Uma lacuna é uma posição na qual está faltando um elétron. Quando uma lacuna é
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preenchida por um elétron que saltou de uma posição vizinha, uma nova lacuna é criada nesta antiga posição e assim por diante, permitindo o transporte das cargas por toda a extensão do material.
Figura 4 – Estrutura com ligações duplas alternadas e caminho de condução eletrônica para o polipirrol
2.1.3. SÍNTESE DE POLÍMEROS CONDUTORES
A formação do filme de polímero condutor em uma superfície envolve um número de subseqüentes passos. De uma forma geral, pode-se simplificar o mecanismo de síntese dos PIC’s citando-se as etapas principais de transporte de difusão do monômero à superfície do eletrodo e os sucessivos passos de acoplamentos oxidativos:
i. oxidação do monômero a um radical cátion seguido pelo acoplamento para formar um dímero (dimerização);
ii. oxidação eletroquímica dos oligômeros formados;
iii. propagação da cadeia devido às reações de acoplamento;
iv. precipitação das cadeias do polímero policatiônico na superfície do ânodo quando o comprimento destas ultrapassar o limite de solubilidade [24].
Após a formação do radical cátion do pirrol por eletro-oxidação na superfície do eletrodo, ocorre a dimerização e então aromatização por deprotonação. O dímero se oxida ligeiramente mais facilmente do que o monômero e permite assim que reações sucessivas de acoplamento prossigam [13], o potencial de oxidação do polímero é sempre mais baixo do que o do monômero. O polímero é ionizado eletroquimicamente a um estado condutor, sendo a neutralidade de cargas, do composto como um todo, mantida pela incorporação do contra-íon proveniente do eletrólito. Isto é essencial porque a precipitação do polímero não oxidado, por estar no estado isolante, pararia a reação [24].
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Os passos acima citados do mecanismo da reação de polimerização são mostrados na Figura 5 – Mecanismo de eletropolimerização do pirrol [24]., tendo o polipirrol como exemplo [24].
Figura 5 – Mecanismo de eletropolimerização do pirrol [24].
As reações de síntese de PIC’s podem ser obtidas via química ou eletroquímica. Na síntese química a oxidação é feita pelo contato com um agente oxidante capaz de produzir um potencial de oxidação igual ou superior ao necessário para oxidar o monômero em um meio adequado. Como exemplo pode-se citar a oxidação do pirrol pelo FeCl3 (Fe+3 + e-
Fe+2, +0,77 V) em meio aquoso com pH neutro, a qual resulta em um pó preto insolúvel com condutividade de 0,01 a 1 S.cm-1 quando comprimido [7].
Uma das principais vantagens da síntese química é a possibilidade de obtenção de grandes quantidades do polímero [8]. Na técnica de eletropolimerização a dopagem ocorre de forma mais uniforme por ser simultânea à polimerização. A espessura do filme, ou seja, a massa depositada é proporcional ao tempo de reação, e pode ser calculada pela
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quantidade de carga elétrica pela integral da área no gráfico corrente x tempo, como mostra o exemplo da Figura 6.
As propriedades do filme polimérico (porosidade, espessura) podem ser facilmente controladas pelos parâmetros eletroquímicos [25]: por exemplo, o valor da corrente ou potencial (método galvânico ou potenciostático, respectivamente), influencia diretamente na homogeneidade e densidade do filme obtido [26, 27, 28].
q=15s * 520 µA q=7,8 mC q= 48,75 mC q=(90 - 15)s * 650 µA 520 µA 90s 15s 650 µA µΑ
Figura 6 – Gráfico corrente x tempo de uma síntese eletroquímica sob potencial constante (E=+500 mV) mostrando cálculo simplificado da carga envolvida.
A eletropolimerização pode ser realizada em temperatura ambiente na maioria dos casos, sofrendo menor influência da temperatura que a oxidação química. A grande vantagem é que o filme polimérico pode ser produzido em qualquer objeto metálico inerte no meio e na faixa de potencial aplicada, sobre qualquer forma e tamanho, ou mesmo em eletrodos de áreas muito pequenas, com um bom grau de aderência [6], o que favorece na criação de microcélulas eletroquímicas (atualmente tem-se referências de microcélulas de até 50 L), reduzindo assim as quantidades de reagentes consumidos nos experimentos [18].
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2.1.4. POLIMERIZAÇÃO ELETROQUÍMICA – CONCEITOS E CONSIDERAÇÕES GERAIS
A polimerização eletroquímica, ou eletropolimerização, consiste em conduzir de forma potenciostática (isto é, sob tensão constante) ou galvanostática (sob corrente constante) o monômero a um potencial acima de seu potencial de oxidação. É uma técnica realizada normalmente em uma célula eletroquímica na configuração padrão de três eletrodos, em solução geralmente aquosa de um monômero e de um eletrólito [24, 29].
Filmes eletroquimicamente polimerizados de monômeros aromáticos heterocíclicos, tais como pirrol, tiofeno, fenileno e a polianilina têm sido fonte de muitos estudos encontrados na literatura [30, 31], que mostram como as condições de síntese (concentração do eletrólito, concentração do monômero, número de ciclos e velocidade de varredura) influenciam nas propriedades físicas, eletroquímicas e morfológicas do filme [29]. Esta forma de síntese será revista com enfoque nos métodos mais utilizados no preparo de biossensores.
2.1.4.1 ELETRODOS
A eletropolimerização geralmente é conduzida em um sistema padrão de célula de três eletrodos consistindo de um eletrodo de trabalho, um contra-eletrodo e de um eletrodo de referência. O eletrodo de trabalho atua como suporte para a formação do polímero. Como os filmes são produzidos por um processo oxidativo, é necessário que o material do eletrodo não seja propenso à oxidação. Por esta razão, são utilizados materiais como o ouro, platina, titânio, níquel e paládio, eletrodos de carbono e eletrodos de vidro revestido com óxido de estanho.
A função do contra-eletrodo é fornecer a corrente requerida pelo eletrodo de trabalho sem influenciar nas característica nos dados medidos e, como conseqüência, o contra-eletrodo deve ter uma área grande quando comparada ao eletrodo de trabalho [13].
Para que seja obtido um filme de espessura uniforme e homogêneo, a célula deve ser configurada com o contra-eletrodo eqüidistante de todos os pontos do eletrodo de
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trabalho, mantendo as linhas de força entre o ânodo e o cátodo o mais semelhantes possível. Isto garante uma densidade de corrente uniforme durante a eletropolimerização, o que interfere na natureza do filme. O eletrodo de referência tem a função de medir o potencial e servir como um parâmetro para o potenciostato mantê-lo estável durante a eletropolimerização.
2.1.4.2 MONÔMEROS
Os monômeros eletroquimicamente polimerizáveis apresentam potenciais de oxidação relativamente baixos, suscetíveis a reações de substituição eletrofílica [13] e decréscimo no potencial de oxidação no decorrer das reações de acoplamento, o que favorece o crescimento das cadeias. Na aplicação de PIC's em biossensores e na modificação de superfícies de eletrodos, os monômeros que mais se destacam são a anilina e, principalmente, o pirrol e seus derivados para o procedimento de imobilização de biomoléculas por estes serem solúveis em água [24].
O pirrol apresenta a vantagem de ser altamente solúvel em água, o que permite a solução deste no mesmo meio que as enzimas sem provocar a desnaturação destas [24, 31], além de que a imobilização em um procedimento de única etapa facilita a funcionalização da superfície de eletrodos [32], assim como o controle da espessura do filme polimérico [1, 33]. Devido a estas características, o polipirrol e seus derivados são os mais utilizados por sua versatilidade e grande variedade de espécies com propriedades redox capazes de ligar-se ao grupo pirrol [34, 35, 36].
2.1.4.3 ELETRÓLITOS
O eletrólito fornece o caráter condutor à solução eletroquímica, conduzindo a corrente entre os eletrodos imersos. Além desta finalidade principal, na eletropolimerização o eletrólito também é responsável pela dopagem do polímero formado, influenciando na etapa de protonação e no aspecto conjugado, característico dos polímeros condutores [37, 38].
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A escolha do eletrólito depende da solubilidade, do grau de dissociação e do caráter nucleofílico. No método convencional de oxidação química este papel é desenvolvido pelo agente oxidante (ou redutor), como na eletropolimerização não há a necessidade de que o composto dopante tenha este caráter redox, a variedade de sais possíveis de serem utilizados é enorme [29, 38]. A escolha do eletrólito tem influência nas características mecânicas, elétricas, óticas e na morfologia dos filmes formados [28].
2.1.4.4 DOPAGEM (DOPING)
Tratando-se de PIC's, o conceito de dopagem é crucial para a observação de que estes materiais eletrônicos exibem a uma propriedade bastante particular de variarem seu comportamento elétrico de isolante a supercondutor, dependendo da modificação química aplicada.
O termo “dopagem” significa a conversão de um polímero neutro (ou seja, na forma isolante) em um complexo iônico condutor por uma transformação de oxi-redução. O equilíbrio de cargas como um todo é conseguido pela incorporação dos contra-íons, ou seja, dos íons dopantes. Com o nível de dopagem é possível controlar a condutividade elétrica do polímero, quanto mais facilmente os elétrons das cadeias poliméricas puderem ser removidos ou adicionados para formarem compostos iônicos (mobilidade do ânion dentro e fora da película), mais o polímero é propenso à dopagem.
A dopagem química com uso de agente oxidante corresponde à dopagem tipo "p". O polímero forma um complexo catiônico, incorporando a forma reduzida do agente oxidante como íon dopante. A dopagem química com agente redutor é denominada tipo "n", onde é formado um complexo polimérico aniônico, incorporando a forma oxidada do agente redutor.
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O mesmo efeito pode ser obtido eletroquimicamente submetendo o polímero neutro ao potencial correspondente de oxidação ou redução (dopagem eletroquímica) [1]. Neste caso, os íons dopantes são provenientes do eletrólito presente na solução eletrolítica, podendo-se assim trocar o íon dopante do polímero. Um esquema geral para a dopagem do polipirrol e seus compostos mostrado na Figura 7.
2.1.5. PROPRIEDADES ELETROQUÍMICAS DO POLIPIRROL 2.1.5.1 CONDIÇÕES DE SÍNTESE
Os filmes de polipirrol eletroquimicamente sintetizados são preparados em células eletrolíticas, com variações no material do eletrodo de trabalho e contra-eletrodo, assim como no eletrodo de referência. Alguns autores utilizam o ECS, enquanto a grande maioria utiliza prata/ cloreto de prata pela facilidade de confecção em tamanho compatível com as microcélulas.
A concentração do monômero mais utilizada na solução eletroquímica é de 0,05M, tanto para a imobilização de GOx [19] como de HRPO [14, 39]. Os eletrólitos mais utilizados são sais com os ânions perclorato (ClO4-) e cloreto (Cl-).
2.1.5.2 MORFOLOGIA E PROPRIEDADES MECÂNICAS
A natureza dos íons dopantes influencia muito nas propriedades micro-estruturais mecânicas e elétricas dos filmes resultantes. Por exemplo, Salmon e col. demonstraram que os fatores morfológicos superficiais variam para a eletropolimerização conforme o ânion presente, como hexaflúorfosfato, perclorato, sulfato, triflúormetanosulfonato, fluorsulfonato e trifluoracetato [40].
14 2.1.5.3 CONDUTIVIDADE E ELETROATIVIDADE
O ânion dopante também desempenha um papel importante nas propriedades elétricas das películas de polipirrol que contêm anions poliflúor e do perclorato. Em geral, estes ânions conduzem a filmes mais condutores (de 30 a 200 S.cm-l) do que os filmes
sintetizados com ânions de sulfonato ou carboxilato (de 0,01 a 10 S.cm-l) [13], com
exceção de filmes com ânions sulfonato aromáticos (± 50 S.cm-l). O efeito de condições de síntese e dos ânions dopantes nas propriedades mecânicas, assim como nas propriedades elétricas de filmes de polipirrol foi investigado por Wang et al. [38]. Eles mostraram que o grau de ordenação é determinado pela composição do ânion e pelas condições de síntese, e que aumentando a ordenação é possível obter filmes altamente condutores.
Hoa e Kumar [41] estudam a influência do potencial hidrogeniônico (pH) e do potencial eletroquímico em um biossensor suportado em polianilina, estabelecendo que a condutividade eletrônica desta classe de polímeros apresenta uma forte resposta a alterações destes dois parâmetros.
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2.2. COMPONENTES BIOLOGICAMENTE ATIVOS (BIOCOMPONENTES)
É considerado biocomponente todo o elemento vivo ou derivado de um agente vivo capaz de ser imobilizado em contato íntimo com a superfície de um sensor, de forma a reconhecer determinada espécie de interesse quantitativo. Entende-se por imobilização o método pelo qual o componente biológico liga-se ou é passivamente ligado ao sensor, mantendo suas propriedades biológicas naturais [42].
Desde a demonstração por Clark e Lyons da integração entre uma enzima e um eletrodo formando um biossensor de alta seletividade [34], o desenvolvimento deste tipo de dispositivo obteve considerável progresso. Este aprimoramento tem sido obtido pela biotecnologia moderna com a pesquisa dos mais diversos tipos de componentes biologicamente ativos (biological components – ou “biocomponentes”), os quais atuam como agentes de reconhecimento, tais como tecidos, células, anticorpos, antígenos e enzimas devido a diversas vantagens destes sobre detectores químicos na reação com o analito [11, 34, 43, 44].
No entanto, a imobilização estável sobre superfícies condutoras com total retenção de suas propriedades biológicas é um problema crucial: dentro do biossensor o biocomponente incorporado apresenta um alto grau de seletividade, mas continua sendo vulnerável a condições extremas como temperatura, pH e força iônica [13].
A estabilidade in vitro – tanto em condições de armazenagem como de operação – de enzimas e proteínas continua sendo um tema crítico deste estudo. A estabilidade de armazenagem, ou tempo de meia-vida (t1/2), refere-se ao período em que o componente
mantém suas propriedades catalíticas entre a manufatura e seu eventual uso. A estabilidade operacional é definida como o tempo em que o componente mantém a atividade durante o uso contínuo sob as condições de uso [45].
16 2.2.1. ENZIMAS
Enzimas são em sua maioria proteínas de elevado peso molecular, com propriedades catalíticas específicas presentes em todos os seres vivos. Consistem de uma estrutura tridimensional complexa com um centro ativo, local onde se processam as reações com determinados substratos. Este centro ativo é geralmente formado por resíduos de aminoácidos da cadeia protéica e um grupo não-protéico (resíduos de carboidratos, por exemplo), responsável pela atividade biológica da enzima [46].
Existem certas desvantagens no uso de enzimas as quais devem ser consideradas no planejamento de pesquisas e estudos sobre o tema: as enzimas trabalham sob condições estreitas de temperatura, pressão e pH; em particular, o alto custo de isolamento e purificação e a natureza instável quando fora de seu meio natural são as principais barreiras para o seu uso ainda maior.
Como outros catalisadores, elas aceleram as reações promovendo o alcance do equilíbrio sem alterá-las, através da diminuição da energia de ativação. Além de sua função catalítica, enzimas são caracterizadas por sua alta especificidade. Elas catalisam uma certa espécie de reação química com um único reagente ou número de reagentes estruturalmente similares, sendo estes reagentes denominados substratos. Dessa forma, a razão principal para o amplo uso de enzimas em biossensores envolvem sua especificidade e propriedades catalíticas. As reações catalisadas por enzimas podem ser usadas para a determinação de substratos, ativadores, inibidores e também da própria enzima [2].
As enzimas apresentam diversas vantagens sobre os catalisadores químicos convencionais, com destaque para a especificidade e a seletividade, não apenas para reações particulares como também na discriminação entre partes similares das moléculas (regioespecificidade) ou isômeros óticos (estereoespecificidade). Elas catalisam as reações apenas de uma faixa bastante estreita de reagentes (substratos), a qual pode consistir de um pequeno número de compostos intimamente relacionados (como a
trypsina, que catalisa a hidrólise de alguns peptídeos e ésteres); uma única classe de
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algumas hexoses); ou um simples composto (GOx oxida apenas a glicose entre os diversos tipos de açúcares existentes).
Isto significa que além das altas velocidades de reação atingidas pela catálise de enzimas, a especificidade deste sistema mantém o controle das reações paralelas, eliminando co-produtos indesejados, o que aumenta a produtividade e reduz os custos com purificação, uma vez que o produto é gerado em um meio sem contaminantes. Além disto, algumas reações estereoespecíficas – como a conversão de glicose em frutose – não podem ser atingidas por métodos químicos clássicos sem o consumo de grande quantidade de tempo e trabalho.
2.2.1.1 ENZIMAS EM BIOSSENSORES
Entre as diversas espécies de biocomponentes a serem imobilizados, as enzimas e os anticorpos são os mais utilizados em biossensores, com maior destaque para as enzimas [14, 19, 32, 35, 31, 47, 48]. Dentre estas, as mais utilizadas são a GOx [49], para biossensores de detecção e quantificação de glicose e a horseradish peroxidase (HRPO), para peróxidos, principalmente para o H2O2 [50, 51]. Outras enzimas, como a urease,
utilizada na detecção e quantificação da uréia, lactate oxidase ou lactate dehydrogenase – lactato e cholesterol oxidase – colesterol também são encontradas na literatura, porém com menor expressão que as duas primeiras.
A multiplicidade dos processos de imobilização de enzimas reduz os custos de análises. A enzima imobilizada é mais estável em condições de funcionamento extremas, como alta temperatura, e pode facilmente ser combinada com um transdutor apropriado no conjunto do biossensor [52].
A GOx, extraída do Aspergillus niger catalisa a conversão da -D-glicose e oxigênio a D-glico-1,5-lactona e H2O2. A GOx é uma flavoproteína, altamente específica à
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urina através da formação de compostos coloridos. Por ser consumida na reação, esta enzima não pode ser usada como um sensor reversível [53]:
A HRPO é a mais usada na construção de eletrodos, e a mais citada como exemplo para as reações de enzimas do tipo peroxidase [19]. A utilização de outras peroxidases é limitada por diversas razões, como a pouca disponibilidade comercial, instabilidade à temperatura ambiente e baixa taxa de transferência eletrônica atingida [19]. A HRPO é considerada uma enzima de comportamento relativamente compreendido [54], a qual foi imobilizada com sucesso em diferentes tipos de suportes e métodos [31].
2.2.2. ANTICORPOS
Os anticorpos (Ac), também chamados de imunoglobulinas, são glicoproteínas de alto peso molecular (em torno de 150 kD) sintetizadas e secretadas pelos linfócitos B que interagem especificamente com um epítopo. Representam cerca de 2% das proteínas séricas e localizam-se na fração gamaglobulina do soro [55]. Possuem duas cadeias "leves" e duas cadeias pesadas, as quais são ligadas entre si por pontes de dissulfeto, formando estrutura simétrica em forma de Y. Próximo ao topo desta estrutura as cadeias têm sua porção amino terminal, onde se encontra o paratopo, que determina a especificidade do Ac que se liga ao antígeno. Conforme as seqüências de aminoácidos neste sítio ativo, os Ac reconhecem o analito alvo (antígeno) ou grupos de analitos e reagem especificamente.
É definido como antígeno (Ag) qualquer molécula ou substância estranha ao organismo capaz de produzir uma resposta imune com produção de anticorpos e linfócitos T específicos para a mesma. Um Ag completo tem duas propriedades: imunogenicidade e antigenicidade [55]. São proteínas que, apesar de seu baixo peso molecular em relação aos anticorpos, possuem uma complexidade química que os diferem das substâncias reconhecidas pelo organismo.
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A interação antígeno-anticorpo (Ag-Ac) forma um complexo Ag-Ac que envolve ligações não covalentes como Van der Waals, ligação eletrostática, ponte de hidrogênio e ligações hidrofóbicas. Estas ligações ocorrem à curta distância, de modo que só as moléculas que contém o determinante antigênico ligam ao sítio antígeno ligante do respectivo Ac [3]. O biossensor que utiliza como receptor um Ac ou um Ag é denominado imunossensor [56].
2.2.3. TÉCNICAS DE IMOBILIZAÇÃO DE BIOCOMPONENTES
Várias técnicas de imobilização de biocomponentes – mais particularmente de enzimas e anticorpos – têm sido desenvolvidas: encapsulação, ligação covalente, adsorção e entrapment [22].
Em um biossensor a biomolécula incorporada atribui um alto grau de seletividade, porém é vulnerável a condições extremas do meio, tais como temperatura, pH e força iônica [57]. A maioria dos biocomponentes apresenta um curto período de meia-vida quando em solução. Devido a isto, estes devem ser estabilizados em uma matriz adequada. A imobilização do biocomponente resulta em um decréscimo de sua atividade [58], porém prolonga o tempo de meia-vida. A atividade do biocomponente imobilizado depende da área superficial, porosidade e caráter hidrofílico da matriz, assim como das condições da reação e método de imobilização. Em alguns casos o próprio produto de reação pode causar o decréscimo da atividade de reação (auto-inativação): Bourdillon et
al. mostra como a enzima GOx pode sofrer inativação pelo H2O2 formado na reação com a
glicose [59].
Como a estabilidade é um dos principais problemas que afetam o potencial comercial, uma grande variedade de técnicas tem sido investigada para a produção de biossensores mais estáveis [60, 61]. As técnicas utilizadas para a imobilização de biocomponentes são bastante diversificadas. Entre as mais destacadas, pode-se citar a adsorção física, a ligação cruzada, a ligação covalente, a imobilização em gel e a imobilização em matriz polimérica [62]. No entanto, a maioria destes procedimentos
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convencionais apresenta baixa reprodutibilidade assim como baixo controle de deposição espacial [34].
2.2.3.1 ADSORÇÃO
A adsorção consiste na dissolução do agente modificador em um solvente apropriado e na exposição, em geral por imersão, do eletrodo a esta solução [10]. Proporciona incorporação simples e rápida do composto em uma ampla gama de eletrodos base e é bastante empregada, dada sua simplicidade e eficiência em muitos casos. No entanto apresenta a desvantagem de produzir no máximo uma monocamada do modificador imobilizado, o que limita a faixa de resposta linear. Como a adsorção é um processo de equilíbrio, pode haver a ocorrência de dessorção do modificador para o meio durante a sua utilização, resultando na perda de reprodutibilidade e redução da vida útil do sensor preparado por este método [10].
2.2.3.2 LIGAÇÃO COVALENTE
Este método consiste na formação de uma ligação entre o agente modificador e o substrato, incorporando de forma estável o agente modificador através da manipulação da reatividade dos grupos funcionais existentes na superfície do eletrodo. Reações de silanização, envolvendo organosilanos e óxidos presentes na superfície do eletrodo são bastante exploradas. Os eletrodos metálicos oxidados em meio ácido são recobertos com uma fina camada de óxido. Após a silanização este eletrodo pode reagir com outra molécula, levando à incorporação do grupo funcional que se queira imobilizar, ligado covalentemente [10].
A imobilização via ligação covalente é bastante estável em relação aos demais métodos, contudo, se comparado à adsorção, requer maior tempo para ser realizado e é mais difícil de ser executado, gerando também cobertura máxima de uma monocamada. Seu emprego é de especial interesse para a imobilização de enzimas, sendo amplamente empregado nesta área [10].
21 2.2.3.3 FILMES OU MATRIZES POLIMÉRICOS(AS)
Este método é baseado na imobilização do biocomponente durante o crescimento de polímeros gerados por oxidação eletroquímica do monômero em solução com o biocomponente [31]. Os polímeros cujos monômeros são solúveis em água são mais utilizados, pois apresentam a vantagem de não denaturarem enzimas. Além disso, o procedimento de imobilização em uma etapa permite a fácil funcionalização da superfície de eletrodos, assim como o controle eletroquímico da espessura do filme polimérico [31].
Ao contrário das técnicas vistas anteriormente, a modificação com membranas poliméricas permite a imobilização de muitas monocamadas da espécie ativa na superfície modificada, com o recobrimento com filmes poliméricos condutores ou permeáveis ao eletrólito de suporte e à espécie de interesse, ampliando consideravelmente a resposta eletroquímica. Os filmes poliméricos ainda oferecem a vantagem de proteger a superfície do sensor contra impurezas, bloquear interferentes, permitir alta velocidade de transferência de elétrons e fornecer biocompatibilidade.
No entanto este método sofre algumas limitações: é necessária uma grande quantidade do biocomponente em solução para que a imobilização seja perceptível. E embora a quantidade de polímero depositada possa ser controlada, segundo alguns autores [34, 31] a quantidade de enzima imobilizada na matriz polimérica não pode ser estimada.
22 2.3. BIOSSENSORES
2.3.1. INTRODUÇÃO
A progressiva expansão de pequenos dispositivos capazes de monitorar a saúde, os alimentos, o meio ambiente e diversas novas aplicações que vêm surgindo a cada dia tem causado uma verdadeira revolução no cenário científico, comparável, segundo especialistas, à dos microprocessadores. Os biossensores prometem ser uma forma simples, compacta, rápida e acessível no ramo da detecção química, bioquímica e imunológica.
Investigações sobre biossensores podem ser encontradas em diversas revistas e jornais científicos, visto a multidisciplinaridade do tema. O desenvolvimento desta área iniciou-se em meados da década de 80, sendo hoje motivo de diversas patentes publicadas e encontrando-se em plena etapa de expansão comercial, com investimentos milionários no setor.
O que difere os biossensores dos sensores comuns é a presença de um elemento biológico, o qual é o responsável pela identificação do analito. Este elemento (o qual pode ser uma célula, tecido, anticorpo, enzima ou uma combinação destes [47]) é rigorosamente seletivo, mesmo sem etapas de separação no preparo da amostra. Devido a isto, denominou-se este princípio de “princípio chave-fechadura", ilustrada pela Figura 8.
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O papel crescente da tecnologia dos biossensores está estimulando a pesquisa para a criação de sensores novos e o desenvolvimento dos já existentes [63], chamando a atenção dos laboratórios para a descentralização das aplicações clínicas: por tratar-se de um dispositivo de fácil confecção, sensibilidade elevada, portáteis e de resposta rápida, possibilitando o diagnóstico o paciente no local de atendimento ou em salas de emergência (por exemplo, para saber a natureza da droga em pacientes com suspeita de overdose); monitoramento contínuo em leitos de pacientes, graças aos mecanismos eletroquímicos de transdução; e kits de autodiagnóstico (home self testing), como os utilizados para a quantificação de glicemia, já bastante conhecidos no mercado.
Por estes fatores, os biossensores tornaram-se rapidamente uma nova tendência na tecnologia de diagnósticos. Com a aplicação dos biossensores é possível simplificar qualquer análise química que utilize como detector um organismo capaz de ser imobilizado, reduzindo o custo e o tempo de análises para as quais eram necessários equipamentos robustos e/ou procedimentos complexos. Por exemplo, a DBO (demanda bioquímica de oxigênio), a qual estima a quantidade de matéria orgânica que pode ser degradada facilmente pelos microorganismos presentes na água: pelo método padrão, são utilizados ensaios de pelo menos três dias de duração, enquanto que um biossensor desenvolvido de células microbianas e um eletrodo detector de oxigênio, pode obter este resultado em aproximadamente uma hora [64].
Detecção de micróbios [64], análises de microorganismos patogênicos e monitoramento de alimentos [16, 20, 65, 66, 67], análise de água potável [68], medicina preventiva [69, 70], análises clínica [71, 72, 73], monitoramento de drogas terapêuticas [74], identificação de drogas ilícitas [75], veterinária, controle de processos [76] e aplicações industriais – como os processos fermentativos [77, 78] e controle de qualidade [79, 80], controle da poluição em rios [81], reconhecimento do DNA para identificação e controle de alimentos e outras aplicações [82, 83, 84, 85], análise contínua dos nutrientes e pesticidas no solo para agricultura [42, 86, 87] e outras aplicações de cunho ambiental [43, 81, 82, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94].
O exemplo mais conhecido e mais bem-sucedido de um biossensor é a medida da glicose no sangue de pacientes diabéticos. Trata-se de um dispositivo menor que um
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telefone celular, o qual utiliza a enzima GOx imobilizada como elemento de reconhecimento. Com apenas uma gota de sangue sobre tiras descartáveis o paciente tem a leitura de sua glicemia. O próximo passo desta inovação consiste em produzir o chamado “pâncreas artificial”: como alguns modelos de biossensores apresentam um tempo de meia-vida relativamente longo, tendo-se exemplos de biossensores enzimáticos com t1/2 de até 3 semanas [15], desenvolveu-se um sistema no qual um biossensor de
glicose é introduzido na região sub-cutânea (biossensor implantável tipo agulha, para monitoramento in vivo), e este monitora a taxa de glicose, liberando sistematicamente por um sistema de feedback a dose de insulina precisamente necessária para o bem estar do paciente [42, 74].
Enfim, as expectativas futuras são promissoras, mostrando possíveis soluções para problemas bastante atuais, e não será nenhuma surpresa quando surgir, em um futuro próximo, sistemas de identificação do DNA – atingindo casos cotidianos, como exames de paternidade, identificação pessoal em aeroportos, fronteiras e sistemas de segurança – baseados na tecnologia dos biossensores, saindo dos limites dos laboratórios e hospitais para influenciar na vida da sociedade como um todo.
2.3.2. CONCEITOS E DEFINIÇÕES
Biossensores são dispositivos analíticos que quantificam uma substância presente de forma seletiva, convertendo a concentração desta em uma grandeza capaz de ser medida pela combinação de um sistema de reconhecimento biológico e um transdutor físico-químico. A princípio, é possível construir um biossensor para qualquer molécula orgânica capaz de interagir com uma espécie biológica. Das várias definições encontradas, a que parece mais completa, citada por Lowe, define biossensores como: "uma ferramenta ou sistema analítico que consiste em um material biológico imobilizado em contato íntimo com um dispositivo adequado de transdução o qual converte o sinal bioquímico em um sinal elétrico quantificável” [47].
No que diz respeito aos biossensores eletroquímicos, ou seja, os que convertem o sinal biológico em uma grandeza tal como corrente ou potencial elétrico, a União
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Internacional de Química Pura e Aplicada (IUPAC) criou algumas definições, classificações e nomenclaturas, as quais definem biossensor eletroquímico como "um dispositivo integrado auto-referente (self-contained), capaz de fornecer informação analítica específica, quantitativa ou semiquantitativa, utilizando um elemento de reconhecimento biológico (receptor bioquímico), o qual é mantido em contato espacial direto com um elemento de transdução eletroquímica" [95, 96]. O receptor e o transdutor são as principais etapas do processo de detecção em biossensores [97], como mostra a Figura 9.
Figura 9 – Principais etapas do mecanismo de operação de um biossensor [35].
2.3.2.1 RECEPTOR
O receptor é o elemento biologicamente ativo, o qual interage de forma específica e reversível com o analito, gerando uma alteração em um ou mais parâmetros físico-químicos associados com esta interação. Esta alteração pode produzir íons, elétrons, gases, luz ou calor. O receptor é responsável pelo reconhecimento do analito e também pela especificidade e sensibilidade do sensor [13].
Nos sensores em geral, como receptor pode ser utilizado qualquer substância ou sistema capaz de detectar o sinal bioquímico [96]. Porém quando se trata de biossensores, o receptor deve ser por definição um elemento vivo (do latim, bio - vida), o qual pode ser uma célula, organela, enzima ou anticorpo, entre outras inúmeras possibilidades. Até
