UNIVERSIDADE DE SÂO PAULO INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÒGICAS DEPARTAMENTO DE GENÉTICA E BIOLOGIA EVOLUTIVA

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UNIVERSIDADE DE SÂO PAULO

INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS

GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÒGICAS

DEPARTAMENTO DE GENÉTICA E BIOLOGIA EVOLUTIVA

BIO0452

Proteínas: estrutura; função e biologia celular

ROTEIRO DE AULAS PRÁTICAS

PROFESSORES RESPONSÁVEIS:

Prof. Dr. Luis Eduardo Soares Netto

APOIO

Renato Mateus Domingos (aluna PAE)

Simone Vidigal Alves (técnica de nível superior)

Thiago Geronimo Alegria (técnico nível superior)

SÃO PAULO

2016

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Aula Prática 3

Simulação Purificação de Proteínas Visualização de Estruturas de Proteínas - MOLVIZ

Parte A – SIMULAÇÃO PURIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS.

Textos de apoio: Voet & Voet ( 2011) Biochemistry. Fourth Edition: páginas 127-154.

Burguess, RR & Deutsche, MP (2009) Guide to protein purification Second Edition

Objetivo: Planejar a purificação de uma proteína e dessa forma rever forças estabilizadoras da

estrutura.

Estratégia: Simular purificação de proteínas, usando programa “Protein Purification”

desenvolvido por Andrew Booth, Faculty Biological Sciences; University Leeds; UK.

Tutorial :

(1) Acesse o endereço: http://www.agbooth.com/pp_ajax/index.html?locale=en

(2) No ícone “start”, clique em “start from beginning” que é a maneira de iniciar uma simulação de purificação de proteína.

(3) Vamos trabalhar com uma mistura simples. Na lista de misturas disponíveis em “Choose

Mixture”, selecione “Easy3_Mixture” e clique no botão “OK”

(4) Como o nome sugere, trata-se de uma mistura de três proteínas. O software irá perguntar qual das três proteínas você pretende purificar, selecione a “proteína 2”.

Portanto, nosso objetivo será a purificação da “proteína 2”, em uma mistura que também contem as proteínas 1 e 3. Serão fornecidas informações sobre essa proteína.

Repare que a proteína tem atividade enzimática e é estável entre pH 2.5-11.5. Essa propriedade será importante para rastrear a proteina ao longo do processo de fracionamento.

(5) Clique em “OK”.

A área de trabalho ficará limpa e outro menu será apresentado. Neste ponto, você estará apto a simular uma purificação a partir de uma mistura de três proteínas.

Como primeiro passo, será apresentada uma tabela que é muito conveniente para planejamento de um protocolo de purificação. Tente compreender o significado de cada coluna. Vamos discutir essa tabela ao longo da aula de hoje.

(6) Examine uma amostra da mistura de proteínas por Eletroforese de gel de poliacrilamida de uma dimensões (1D-PAGE). Selecione “PAGE” e em seguida “1-dimensional PAGE”.

(IMPORTANTE: tenha em mente que estas proteínas estão em condições nativas; portanto, interações não covalentes são interrompidas em SDS-PAGE pelo detergente SDS).

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6.1 Quantas bandas apareceram no gel? Corresponde ao numero de proteinas em estudo? Em caso negativo proponha uma explicação.

(7) Agora, examine essa mistura de proteínas por Eletroforese de gel de poliacrilamida de duas dimensões (2D-PAGE). Selecione “PAGE” e em seguida “2-dimensional PAGE”.

(IMPORTANTE: novamente, observe que estas proteínas estão em condições nativas; portanto, interações não covalentes são interrompidas em SDS-PAGE).

7.1 Quantas bandas foram observadas? Quais as diferenças em relação ao gele uni-dimensional? Quais as explicações para essas diferenças?

7.2 Quais informações podem ser obtidas dessa análise?

7.3 Registre os resultados, Tamanho dos monômeros obtidos e pI (OBSERVAÇÃO: faça um esquema no seu caderno!).

7.4 Selecione “hide gel” para iniciar fracionamento de proteinas.

(8) Fracionamento de proteínas por precipitação com sulfato de amônio

8.1 Um procedimento comumente utilizado em estágios iniciais de purificação de proteínas é o fracionamento por precipitação com sulfato de amônio. Portanto, no ícone “Separation”, selecione “Ammonium sulfate precipitation”.

8.2 No menu “Ammonium sulfate”, selecione o botão “info”. Entenda o princípio da técnica. Após a leitura, selecione “Dismiss”.

(IMPORTANTE: tenha em mente o fato que uma proteína pode ou não ter atividade enzimática. Lembrando, o seu alvo de purificação tem atividade enzimática).

8.3 Selecione distintas percentagens de sulfato de amônio (Sugestão: de 50% até 60%) e analise os resultados obtidos em várias dessas precipitações. Após cada simulação, selecione “cancel” até definir a porcentagem que será utilizada.

8.4 Qual seria uma boa percentagem de sulfato de amônio? Por que? Qual fração você coletaria, o precipitado ou o sobrenadante?

8.5 Qual propriedade de proteínas está envolvida no fracionamento por precipitação com sulfato de amônio?

8.6 Pare nessa etapa, até que seja realizada a discussão em grupo.

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(9) CROMATOGRAFIA DE FILTRAÇÃO EM GEL

9.1 Vamos iniciar o fracionamento das proteínas por filtração em gel. Na aba “separation”, clique em “gel filtration”. Uma lista de resinas de filtração em gel será apresentada. Clique no botão “info” e leia atentamente primeira parte introdutória até a tabela com os meios de filtração a gel (inclusive).

9.2 Qual propriedade de proteínas está envolvida nesse processo? Qual resina você deve escolher?

(IMPORTANTE: As resinas de filtração em gel apresentadas são produtos de três fornecedores diferentes. Para obter a melhor separação, você deve escolher um meio, cujo alcance corresponda o mais próximo possível das massas moleculares das proteínas presentes em sua mistura. Tenha em mente que estas proteínas estão em condições nativas; enquanto interações não covalentes são interrompidas no SDS-PAGE).

Matrix name

Bead type

Approximate fractionation range for peptides and globular proteins

(molecular weight) Sephadex G-50¹ dextran 1500 - 30000

Sephadex G-100¹ dextran 4000 - 150000

Sephacryl S-200 HR¹ dextran/acrylamide 5000 - 250000

Ultrogel AcA 54² polyacrylamide/agarose 6000 - 70000

Bio-Gel P-60³ polyacrylamide 3000 - 60000

Bio Gel P-150³ polyacrylamide 15000 - 150000

Bio-Gel P-300³ polyacrylamide 60000 - 400000

9.3 Sabendo que a menor massa molecular presente em sua amostra é de 20kDa, qual seria a resina que melhor se adequa na separação das proteínas da amostra?

9.4 Porque aparentemente as resinas Sephadex G-50¹ e Bio-Gel P-300³ são, diante das alternativas apresentadas, as únicas resinas que não possibilitariam uma boa separação das proteínas em sua amostra?

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(NOTA: O gráfico obtido representa uma simulação da separação que você teria obtido se tivesse passado esta mistura para uma coluna com a resina Sephacryl S-200 HR. Foram coletadas as frações e mediu-se a absorbância de cada uma a 280 nm.)

9.6 O que representa o gráfico?

9.7 Olhe para o perfil de eluição. Quantos picos existem? Eles são do mesmo tamanho/intensidade? Estão bem resolvidos?

9.8 Para determinarmos a massa molecular das subunidades das 3 proteínas envolvidas na mistura, vamos analisar algumas frações por SDS-PAGE de uma dimensão.

9.9 Na aba “PAGE”, selecione “1-dimensional PAGE”.

9.10 Um menu “select fractions” aparecerá, aonde você pode selecionar até quinze frações, correspondentes a 15 canaletas de um gel do tipo SDS PAGE. Quais frações você escolheria?

9.11 O que representam as bandas do gel SDS PAGE?

9.12 O que podemos dizer sobre esse fracionamento por Sephacryl S-200 HR? 9.13 No icone “PAGE”, clique em “hide gel”

9.14 Agora no ícone “fractions”, selecione “assay enzyme activity”. Como você interpreta os resultados obtidos?

9.15 Com base nos resultados obtidos, quais frações você coletaria?

9.16 Ainda no ícone “fractions”, selecione “pool fractions” que corresponde às frações que você irá coletar.

9.17 Analise os resultados obtidos na tabela de purificação.

9.18 Analise o pool de proteínas por 2D-PAGE (Na aba “PAGE”, selecione “2-dimensional

PAGE”). Quantas bandas você observou? Como você relaciona esse gel com o cromatograma

de filtração a gel obtido anteriormente?

9.19 Uma vez que os monômeros das duas proteínas da mistura tem a mesma massa, qual propriedade poderia ser utilizada para a separação das mesmas?

(10) CROMATOGRAFIA DE TROCA IÔNICA

10.1 Na aba “separation”, selecione “ion eschange chromatography”.

(NOTA: Quatro resinas serão apresentadas. Selecione “info” e leia a informação correspondente)

10.2

Selecione a resina “Q sepharose” que é comumente empregada, frequentemente produzindo bons resultados.

10.3

Vamos selecionar “salt gradient” para eluir proteínas. Dessa forma não é necessário alterar o pH da solução que pode afetar a estabilidade de proteínas.

10.4

Selecione pH = 7.0

10.5

Sobre as concentrações salinas do gradiente, mantenha 0 e 0,5 M como concentrações inicial e final de NaCl, respectivamente.

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(NOTA: O gráfico representa um cromatograma que seria obtido da mistura de proteínas nas condições estipuladas)

9.20 No ícone “fractions”, selecione “assay enzyme activity”. Como você interpreta os resultados obtidos?

10.6

Com base nos resultados obtidos, quais frações você coletaria?

10.7

Ainda no ícone “fractions”, selecione “pool fractions” que corresponde às frações que você irá coletar.

10.8 Analise os resultados obtidos na tabela de purificação. Será que conseguimos obter a proteína 2 totalmente pura? Como poderíamos fazer para avaliar o grau de pureza?

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CONSIDERAÇÕES FINAIS

Essa simulação foi baseada em uma situação simplificada, aonde apenas três proteínas estavam presentes. Na prática, o problema é mais complexo, envolvendo a participação de um maior número de proteínas e outras biomoléculas presentes nas células.

Como atividade extra-aulas, realize simulações com maior número de proteínas, procurando compreender o significado dos procedimentos utilizados, bem como dos resultados obtidos relacionando-os com as propriedades físico-químicas das proteínas que se deseja purificar.

Em qualquer protocolo de purificação é sempre desejável o menor número possível de passos para se obter o maior rendimento possível, ao menor custo.

Parte B – VISUALIZAÇÃO DE ESTRUTURAS DE PROTEÍNAS EM COMPUTADOR. Textos de apoio:

Voet & Voet (2011) Biochemistry. Forth Edition: páginas 167-175.

Berg JM, Tymoczko JL, Stryer L. Biochemistry. 5th edition. New York: W H Freeman; 2002. Section 1.3 Chemical Bonds in Biochemistry

Objetivo: aprender a visualizar diferentes representações de proteínas, sabendo considerar vantagens

e limitações de cada uma delas.

Estratégia: Utilizar programa molviz; modalidades hemoglobina e colágeno. Tutorial :

(1) Acesse https://www.umass.edu/microbio/chime/ e selecione “Hemoglobin”. Aparecerá uma

representação de hemoglobina, uma proteína tetramérica composta por duas globulinas α e duas globulinas β. Portanto, para a expressão de uma hemoglobina funcional, é necessária a transcrição e tradução de dois gene (um para a globulina α e outro gene para a globulina β). (2) Selecione “Glycine representations” e siga os passos descritos no programa. A

nalise as

diferentes representações da glicina, o amino ácido de estrutura mais simples.

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Cada forma de representa-lo apresenta vantagens e limitações. Nenhum é perfeito para expressar a realidade. O ideal é analisar diferentes representações para ter uma visão mais aproximada da molécula. Observe pelo menos algumas rotações

Quais as vantagens e limitações de cada representação? “Stick and ball” :

“Spacefilling” : “Stick” :

(3) Em “Peptides and backbone” e siga os passos descritos no programa.

Vamos agora para um nível maior de complexidade. A representação de cores de amino ácidos em geral segue o seguinte padrão: Oxigênio = vermelho; nitrogênio = azul; carbono =cinza; hidrogênio = branco; laranja = enxofre.

Em View 2, nessa representação de um peptídeo de três amino ácidos, tente identificar os planos peptídicos e as extremidades N e C terminal.

Perceba que ao selecionar “toggle spinning”, a rotação da molécula para. Ao clicar com o botão esquerdo do mouse sobre a molécula você pode orientá-la para o ângulo que considerar mais conveniente para analise de algum detalhe. Botão esquerdo várias opções são apresentadas, inclusive zoom.

Em View 3 , observe que as cadeias laterais de amino ácidos vizinhos se orientam em direções aproximadamente opostas.

Identifique os carbonos - α ( que se ligam a grupo amino; a um grupo carboxila; a um átomo de hidrogênio e a uma cadeia lateral; nesse caso como são três alaninas, todas as cadeias laterais são grupos metila)

Em View 4 ,temos uma ideia da proporção da cadeia lateral em relação a cadeia primaria. Em View 8, esqueleto (‘backbone”) composto pelas ligações peptídicas é apresentado sem cadeias laterais.

Após analisar View 9, vá para a secção “Hemoglobin and Heme”.

(3) Em “Hemoglobin and Heme” siga views como proposto pelo programa.

Com as informações apresentadas nas secções anteriores, vamos agora analisar a proteína, com centenas de aminos ácidos e milhares de átomos.

Em View 1, observe que os átomos se mexem, isso ocorre porque proteínas apresentam DINÂMICA.

Quantos genes estão envolvidos na formação desse tetrâmero?

Em View 2, quais as diferenças das representações 1 e 2? Vantagens e limitações de cada uma delas? Em quais delas você consegue identificar alfa hélices e alças?

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View 4: porque H não são resolvidos nas estruturas cristalográficas?

View 6: qual o tipo de ligação química entre Fe e N do grupo heme? covalente ou iônica? Em View 10, observe que o átomo de ferro é hexa coordenado; e cadeias laterais de histidinas estabilizam esse complexo

Termine as outras “view”. Sugerimos retornar a essa apresentação do MOLVIZ para ilustrar conceitos que serão apresentados ao longo da disciplina.

Em https://www.umass.edu/microbio/chime/, existem outras apresentações que você pode

explorar. Uma sugestão é a apresentação sobre colágeno, na qual você deve seguir links em fontes verde para fazer tutorial e deve ler com atenção cada instrução