Aproveitamento do soro do queijo "coalho" para produção e aplicação da β-galactosidase

RENORBIO

Universidade Federal do Rio Grande do Norte

Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia

Aproveitamento do soro do queijo “coalho” para produção

e aplicação da -galactosidase

Catherine Teixeira de Carvalho

Natal – RN 2019

Catherine Teixeira de Carvalho

Aproveitamento do soro do queijo “coalho” para produção

e aplicação da -galactosidase

Orientadora: Prof

Drª

Gorete Ribeiro de Macedo

Co-orientador: Prof

Dr. Francisco Canindé de Sousa Junior

Tese de Doutorado submetida ao Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia–RENORBIO, como um dos pré-requisitos necessários à obtenção do título de doutora.

Área de concentração: Biotecnologia Industrial Linha de Pesquisa: Bioprocessos

Natal – RN 2019

Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN Sistema de Bibliotecas - SISBI

Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Central Zila Mamede

Carvalho, Catherine Teixeira de.

Aproveitamento do soro do queijo "coalho" para produção e aplicação da -galactosidase / Catherine Teixeira de Carvalho. - 2020.

136 f.: il.

Tese (doutorado) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em

Biotecnologia, RENORBIO, Natal, RN, 2020.

Orientadora: Profa. Dra. Gorete Ribeiro de Macedo.

Coorientador: Prof. Dr. Francisco Canindé de Sousa Júnior.

1. Kluyveromyces sp. - Tese. 2. -galactosidase - Tese. 3. Hidrólise lactose - Tese. I. Macedo, Gorete Ribeiro de. II. Sousa Júnior,

Francisco Canindé de. III. Título.

RN/UF/BCZM CDU 608.7

CATHERINE TEIXEIRA DE CARVALHO

Aproveitamento do soro do queijo “coalho” para produção e aplicação da -galactosidase

Tese apresentada à Rede Nordeste de Biotecnologia (RENORBIO) como requisito para obtenção do título de Doutora em Biotecnologia.

Área de Concentração: Biotecnologia Industrial

Aprovada em 18 de dezembro de 2019 por:

________________________________________ Profª. Dra. Gorete Ribeiro Macedo

Presidente - Orientadora

Universidade Federal do Rio Grande do Norte – UFRN ________________________________________

Prof. Dr. Francisco Canindé de Sousa Júnior Titular – Coorientador

Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN _____________________________________

Prof Dr.Everaldo Silvino dos Santos Titular

Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN ____________________________________

Prof.ª Dra.Cristiane Fernandes de Assis Titular

Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN _____________________________________

Profª. Dra. Ana Lúcia Figueiredo Porto Titular

Universidade Federal Rural de Pernambuco– UFRPE ____________________________________

Dr. Sérgio Dantas de Oliveira Júnior Titular

AGRADECIMENTOS

Aos meus pais, Carlos César (in memorian) e em especial Arlete Teixeira, por todo carinho, apoio, dedicação e torcida em todas as etapas da minha vida, minha imensa gratidão.

À minha família meus agradecimentos.

Ao meu Coorientador Prof. Francisco Canindé de Sousa Júnior, pelo direcionamento e apoio oferecido durante este trabalho, meu muito obrigado.

À Profa. Gorete Ribeiro, minha orientadora, pelo incentivo, amizade e energia positiva que eu sempre pude contar, minha gratidão.

Ao Prof. Everaldo Silvino, coordenador do Laboratório de Engenharia Bioquímica, pelo incentivo, amizade e energia positiva que eu sempre pude contar, muito obrigado

Em especial a Fábio Macedo pela constante disposição e paciência em contribuir no desenvolvimento deste trabalho, minha eterna gratidão.

À Sérgio Dantas pelo carinho e disponibilidade em contribuir com o trabalho, todo o meu carinho e gratidão

À profa. Márcia Pedrini por disponibilizar o laboratório de bioprocessos, sempre que necessário, meu muito obrigado

.

À Waleska, Ana Laura, Júlia, Carlos Padilha e Wildson pela valiosa ajuda e apoio durante o desenvolvimento do trabalho.

Aos Colegas do Laboratório Sinara, Cleitiane, Vanessa, Petrucia, Victor, Willyan, Pedro, Marcelo pelo convívio harmonioso, companheirismo e incentivo.

À servidora do Programa de Pós-graduação em Biotecnologia/RENORBIO (Ponto focal RN) Paula Peroba, pela disponibilidade e atenção.

SUMÁRIO

LISTA DE FIGURAS ... v

LISTA DE TABELAS ... vii

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ... viii

RESUMO ... x ABSTRACT ... xi CAPÍTULO 1 – INTRODUÇÃO ... 13 CAPÍTULO 2– OBJETIVOS ... 16 2.1 Objetivo geral ... 16 2.2 Objetivos específicos ... 16

CAPÍTULO 3 – REVISÃO A LITERATURA ... 18

3.1. Setor de laticínios ... 18

3.1.1 Produção de leite ... 18

3.1.2 Soro do queijo ... 20

3.1.3 Soro do queijo um resíduo valioso ... 21

3.2. Lactose importância e aplicação ... 23

3.2.1 Hidrólise da lactose ... 24

3.3. Enzima -galactosidase ... 25

3.4. Biotecnologia aplicada a produção de -galactosidase... 29

3.4.1. Gênero Kluyveromyces e Saccharomyces: metabolismo e produção de -gal .. 29

3.5. Recuperação e purificação da β-galactosidase ... 32

3.5.1 Sistemas de Cromatografia ... 33

3.6. Imobilização de Enzimas ... 35

3.7. Aplicações da β-galactosidase na indústria alimentícia ... 38

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 43

CAPÍTULO 4 – ARTIGOS DERIVADOS DA TESE ... 54

ARTIGO 1 - Potential of “coalho” cheese whey as lactose source for β-galactosidase and ethanol co-production by Kluyveromyces spp. yeasts ... 54

ARTIGO 2 - Recovery of β-galactosidase produced by Kluyveromyces lactis by ion exchange chromatography: Optimization of pH and ionic strength conditions using experimental design ... 85

ARTIGO 3- Lactose hydrolysis using β-Galactosidase from Kluyveromyces lactis immobilized with sodium alginate for potential commercial applications ... 105

References ... 126

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Evolução da produção mundial do leite de vaca... 17

Figura 2: Evolução da produção do leite no Brasil 2006- 2018... 18

Figura 3: Estrutura química da lactose... 22

Figura 4: Estrutura molecular da -galactosidase... 25

Figura 5: Métodos de imobilização de enzima... 35

ARTIGO 1 Figure 1: Biomass growth profile for K. marxianus ATCC 36907 (●) and K. lactis NRRLY-8279 (○), and lactose consumption profile for K. marxianus ATCC 36907 (▲) and K. lactis NRRLY-8279 (△) in the orbital shaker cultivations. (A) C:N 1,5:1; (B) C:N 2,5:1. Mean values ± Standard deviation……… 64

Figure 2: Co-production profile of β-galactosidase for K. marxianus ATCC 36907 (■) and K. lactis NRRL Y-8279 (□) and of ethanol for K. marxianus ATCC 36907 (▼) and K. lactis NRRLY-8279 (▽) in the orbital shaker cultivations. (A) C/N 1,5:1; (B) C/N 2,5:1. Mean values ± Standard deviation………... 65

Figure 3: (A) Biomass (cells) growth (●) and substrate (lactose) consumption (▲) profiles; and (B) Co-production of β-galactosidase (○) and ethanol (□) for the bioreactor cultivations using K. lactis NRRLY-8279 and the C:N ratio of 1.5:1. Mean values ± Standard deviation……… 70

Figure 4: Enzymatic activity stability of β-galactosidase produced by K. lactis NRRL Y-8279, using the C:N ratio of 1.5:1 in bioreactor cultivations. (A) Stability in relation to the pH; (B) Stability in relation to metallic ions; (C) Stability in relation to temperature. Mean values ± standard deviation. Different lowercase letters (a, b, c, d) indicate statistical differences (p < 0.05) for different pH/metallic ion/temperature, at the same incubation time. Different capital letters (A, B, C) indicate statistical differences (p < 0.05) for different incubation periods within the same pH/metallic ion/temperature………... 73

ARTIGO 2 Figure 1: Adsorption of β-gal on 4 resins in the pH range of 6.0-8.0. Different lowercase letters (a, b, c, d) indicate statistical differences (p < 0.05) for different pH with the same adsorbent. Different uppercase letters (A, B, C) indicate statistical differences (p < 0.05) for different adsorbents considering the same pH……… 91

Figure 2: Pareto Charts of the standardized effects for the responses yield (Y) and fold

purification of β-gal (FP), respectively………. ₉₄

Figure3: Response surface (RS) of Y and FP. (A) RS of the yield and (B) of the fold

purification of β-gal as function of pH x IS……… ₉₇

Figure 4: Purification chromatogram of β-gal produced by K. lactis in a fixed bed, submitted to a NaCl gradient through elution, where (□) protein concentration and (■)

enzymatic activity………. 98

Figure 5: PAGE gel of polyacrylamide 9%. Lane M – Maker protein (MM), Lane 1–

crude extract (EB), Lane 2 – elution sample of 0,1 to 0,4 M of NaCl……… ₁₀₀

ARTIGO 3

Figure 1: Stability of the enzymatic activity of immobilized β-galactosidase with sodium alginate at different pH values. Mean values ± Standard deviation. Different low case letters (a, b, c) indicate statistical difference (p < 0.05) for different pH values at the same incubation time according to Tukey’s test. Different capital letters (A, B, C) indicate statistical difference (p < 0.05) for different incubation times at the same pH according

to Tukey’s test………. ₁₁₅

Figure 2: Stability of the enzymatic activity of immobilized β-galactosidase with sodium alginate at different temperatures. Mean values ± Standard deviation. Different low case letters (a, b, c) indicate statistical difference (p < 0.05) for different temperatures at the same incubation time according to Tukey’s test. Different capital letters (A, B, C) indicate statistical difference (p < 0.05) for different incubation times at the same

temperature according to Tukey’s test……… ₁₁₇

Figure 3: Stability of the enzymatic activity of immobilized β-galactosidase with sodium alginate at different metallic ions. Mean values ± Standard deviation. Different low case letters indicate statistical difference (p < 0.05) for different metallic ions at the same incubation time according to Tukey’s test. Different capital letters indicate statistical difference (p < 0.05) for different incubation times at the same metallic ion

according to Tukey’s test……… ₁₁₈

Figure 4: FT-IR spectra of sodium alginate, immobilization support, free −gal and

Immobilized −gal, respectively……… ₁₂₀

Figure 5: SEM of immobilization support (A, B) and immobilized -gal (C, D), pH 6,6

and fixed alginate concentration of 0,7%... ₁₂₁ Figure 6: Comparative lactose hydrolysis conversion (%) between the immobilized

system (○) and the crude enzymatic extract (●). Mean values for three repetitions (n = 3)………..

122

Figure 7: Gastroinstestinal stability of immobilized β-gal on simulated gastrical fluid

LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Alguns microrganismos produtores de −galactosidase ... ARTIGO 1

Table 1: Complete composition of the culture media used for the two carbon/nitrogen (C: N) ratios ratio) in this study. Lactose from partially deproteinized cheese whey (CWD) was used as a sole source of carbon……….

28

58

Table 2: Physicochemical parameters for cheese whey (CW) and cheese whey partially

deproteinized (CWD)………. ₆₃

Table 3: Kinetic parameters for the orbital shaker and bioreactor cultivations for the co-production of ethanol and β-galactosidase using cheese whey as substrate………. ₆₆

ARTIGO 2

Table 1: Factors and levels used in the experimental design 22_{……… 89}

Table 2: Experimental design 22 with coding and levels of variables used to purify the β-gal enzyme as a function of pH and ionic strength………

93 Table 3: Analysis of variance (ANOVA) of the adjusted models to the experimental

responses FP and ………. ₉₆

ARTIGO 3

Table 1. Immobilization conditions of the β-gal enzyme for the different concentrations

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

A Valor da atividade enzimática em equilíbrio A0 Valor inicial da atividade enzimática

ad Atividade da enzima imobilizada

ANOVA Análise de variância

ar Atividade enzimática recuperada at Atividade enzimática teórica BSA Albumina sérica bovina

C:N Razão carbono/nitrogênio

CO2 Gás carbônico

CW Cheese whey

CWD Deproteinized cheese whey EI Eficiência de imobilização FDA Food and drug Administration

FP Fator de purificação

g/L gramas por litro

gl graus de liberdade

GOS Galactooligossacarídeos GRAS Generally Recognized as safe

IS Força iônica kDa Kilodalton mg Miligrama mL Mililitro mM Milimolar MQ Média quadrática ºC Graus celsius

ONP O- nitrofenil- piranose

ONPG O- nitrofenil- -D galactopiranosídeo PAGE Eletroforese em gel de poliacrilamida

Px Máxima produtividade de células

q Capacidade de adsorção

R2 Coeficiente de determinação

rpm Rotações por minuto

SFI Fluido intestinal simulado SGF Fluido gástrico simulado SQ Soro do queijo

SQD Soro do queijo desproteinizado

SS Soma quadrática

T Temperatura

U/g Unidade de enzima por grama

U/mL Unidade de enzima por mililitro

V Volume do extrato enzimático

Vads Volume do adsorvente

Y Rendimento

-gal - galactosidase

𝑋𝑜 Concentração inicial de células (g/L)

% Percentual

𝑋_𝑚𝑎𝑥 Concentração máxima de biomassa 𝑌𝑋 𝑆⁄ Rendimento de células

RESUMO

O presente estudo teve como objetivo avaliar o potencial do soro do queijo “coalho” como substrato para produção de biomoléculas por leveduras Kluyveromyces sp. e investigar estratégias de purificação e imobilização da enzima β-galactosidade (β-gal) visando aplicação industrial. Na primeira etapa, observou-se o comportamento das leveduras para síntese de β-gal e a produção de etanol por fermentação submersa em frascos agitados e biorreator utilizando diferentes razões carbono/nitrogênio C:N (1,5:1 e 2,5:1). A melhor eficiência foi obtida com

Kluyveromyces lactis NRRL Y- 8279, que produziu 21,09 ± 0,69 U/mL de β-gal e 7,10 ± 0,09

g/L de etanol em 16 horas de cultivo. Diante dos resultados iniciais, avaliou-se as condições de purificação da β-gal em cromatografia em leito fixo utilizando um planejamento experimental 22. Os parâmetros pH e força iônica foram avaliados considerando o fator de purificação, sem prejuízo ao rendimento. Os níveis mais altos de ambos os parâmetros no estudo aumentaram o fator de purificação (FP) de β-gal para 2,00, com maior influência da força iônica na resposta para FP. A enzima purificada parcialmente foi submetida a eletroforese, que apresentou uma banda com massa molecular na faixa entre 66 e 140 kDa, configurando a enzima de interesse. Na última etapa do estudo, observou-se as condições de hidrólise da lactose no soro de queijo “coalho” com a forma imobilizada de β-gal em alginato de sódio a 1% (p/v). A eficiência da imobilização atingiu 66%. Além disso, a forma imobilizada da enzima apresentou maior estabilidade às mudanças de pH e temperatura e uma conversão de lactose (46%) sem maiores diferenças estetíticas quando comparada ao extrato bruto de β-gal (53%). Para as simulações gástricas e intestinais, cerca de 40% da atividade enzimática foi preservada após 2 horas de exposição a condições gastrointestinais simulados. No geral, os resultados aqui descritos são promissores para as aplicações industriais da β-galactosidase de K. Lactis NRRL Y- 8279.

Palavras-chave: Kluyveromyces sp., Etanol, β-Galactosidase, Imobilização, Hidrólise da

ABSTRACT

The present study aimed to produce the enzyme β-galactosidase (β-gal) using “coalho” cheese whey as biotechnological substrate by yeasts of the genus Kluyveromyces and to evaluate processing strategies that enable its application in the food industry. In the first stage of this study, the co-production of β-gal and ethanol by submerged fermentation in shake flasks and bioreactors using different carbon/nitrogen C:N rations (1.5:1 and 2.5: 1). The best efficiency was obtained with Kluyveromyces lactis NRRL Y-8279, which produced 21.09 ± 0.69 U / mL gal and 7.10 ± 0.09 g / L ethanol in 16 hours of cultivation. Based on the initial results, the β-gal purification conditions in fixed bed chromatography were evaluated using experimental design 22_{. The pH and ionic strength parameters were evaluated considering the purification}

factor, without prejudice to yield. Higher levels of both parameters in the study increased the β-gal purification factor (PF) to 2.00, with greater influence of ionic strength on the PF response. The partially purified enzyme was submitted to electrophoresis, which presented a band with molecular mass in the range between 66 and 140 kDa, configuring the enzyme of interest. In the last stage of the study, lactose hydrolysis conditions were observed in the curd cheese whey with the immobilized form of β-gal in 1% (w/v) sodium alginate. The immobilization efficiency reached 66% and high recovered activity was achieved. In addition, the immobilized form of the enzyme presented higher stability to pH and temperature changes and a lactose conversion (46%) without major aesthetic differences when compared to the crude enzyme extract (53%). For the gastrointestinal simulations, around 40% of the enzymatic activity was preserved after 2 hours of exposure to simulated gastrointestinal environments. Overall, the results described here are promising for the industrial applications of β-galactosidase from K. lactis.

Capítulo 1

Introdução

CAPÍTULO 1 – INTRODUÇÃO

A indústria de laticínios desempenha um papel economicamente importante no setor agroalimentar, e sua produção anual crescente está diretamente relacionada à maior geração de resíduos e subprodutos, como o soro de queijo (SQ) (Akhlaghi et al., 2017; Escalante et al., 2018). A geração global do soro do queijo é estimada em cerca de 200 milhões de toneladas por ano, com tendência de crescimento linear (Domingos et al., 2017; Treu et al., 2019).

No nordeste do Brasil, a produção de soro de queijo está intrinsecamente relacionada à indústria do queijo de coalho. O queijo de coalho é um produto brasileiro altamente tradicional, que assume componentes socioeconômicos e nutricionais relevantes nessa região (Fontenele et

al., 2017; Soares et al., 2017). Entretanto, o soro do queijo é um subproduto com significativo

potencial poluidor devido ao seu elevado teor de matéria orgânica e alta demanda bioquímica de oxigênio (DBO) (Andrade et al., 2017). No entanto, em base seca, a composição de SQ pode atingir até 80% de lactose (Albuquerque et al., 2018; Zhou et al., 2019). Considerado um subproduto valioso, o soro do queijo é o principal componente das águas residuais de produtos lácteos, sendo avaliado como um material recuperável em relação à disponibilidade de nutrientes (Aydiner et al., 2013).

Várias estratégias têm sido investigadas para lidar com o descarte de resíduos de soro do queijo, dentre as quais se destaca o uso de processos biotecnológicos, como alternativa viável para converter tal subproduto em compostos com maior valor agregado (Carota et al., 2017). Embora difícil de degradar no meio ambiente, a lactose do soro do queijo pode ser utilizada como substrato para a fermentação visando a obtenção de etanol (Ariyanti e Hadiyanto, 2013; Beniwal et al., 2018), ácido galactônico (Zhou et al., 2019), β-galactosidase (Perini, et al., 2013; Rao e Dutta, 1977) entre outros bioprodutos.

A enzima β-galactosidase (β-gal; EC 3.2.1.23), também conhecida como lactase, é responsável pela hidrólise de ligações glicosídicas da lactose (Panesar et al., 2018) sendo um produto de grande interesse, e com diversas aplicações, na indústria alimentícia. Além de contribuir para a crescente participação, no mercado, de produtos sem lactose para consumidores com restrição de dieta (Suri et al., 2019), a β-gal também é usada para a produção enzimática de prebióticos alimentares, como lactulose e diferentes galactooligossacarídeos (GOS) (Nooshkam et al, 2018; Panesar et al., 2018).

Neste sentido, o presente estudo teve como objetivo geral avaliar o potencial do resíduo soro do queijo “coalho” como substrato para produção de biomoléculas por leveduras

Kluyveromyces sp., bem como avaliar estratégias de purificação e imobilização da enzima

β-gal visando a sua aplicação na indústria alimentícia.

A tese encontra-se dividida em cinco capítulos, apresentados da seguinte forma: O Capítulo 1 consiste em uma introdução, na qual a importância da tese é contextualizada. O Capítulo 2 mostra os objetivos propostos e o Capítulo 3 traz uma revisão da literatura, na qual são apresentados os fundamentos teóricos. No Capítulo 4, a metodologia, os resultados e as discussões são apresentados na forma de artigos. Destaca-se que os artigos são apresentados seguindo as regras de formatação exigidas pelos periódicos. Apresenta-se, em inglês, os artigos “Potential of “coalho” cheese whey as lactose source for β-galactosidase and ethanol co-production by Kluyveromyces spp. yeasts”, submetido no periódico Journal of Dairy Science, o artigo “Recovery of β-galactosidase produced by Kluyveromyces lactis in ion exchange chromatography: Optimization of pH and ionic strength conditions using experimental design” a ser submetido ao periódico Biotechnology Progress e o artigo “Lactose hydrolysis using sodium alginate immobilized Kluyveromyces lactisβ-galactosidase for use in food industry”, submetido ao periódico Process Biochemistry. No Capítulo 5, apresenta-se as considerações finais.

Capítulo 2

Objetivos

CAPÍTULO 2– OBJETIVOS 2.1 Objetivo geral

• Avaliar o potencial do soro do queijo “coalho” como substrato para produção de biomoléculas por leveduras Kluyveromyces sp. e investigar estratégias de purificação e imobilização da enzima -gal visando aplicação na indústria alimentícia.

2.2 Objetivos específicos

• Realizar a caracterização físico-química do soro do queijo coalho determinando os componentes do sobrenadante rico em lactose;

• Avaliar as condições de co-produção de β-galactosidase (β-Gal) e etanol com diferentes razões de C:N em frascos agitados;

• Otimizar a co-produção de β-gal e etanol em biorreator de bancada utilizando a melhor condição obtida nos ensaios em frascos agitados;

• Determinar os parâmetros cinéticos das leveduras do gênero Kluyveromyces sp. em cultivo submerso nas diferentes razões de C:N nos ensaios em frascos agitados

• Selecionar diferentes adsorventes para obter melhor condição de adsorção baseado nos valores de recuperação e fator de purificação da β-gal obtida por Kluyveromyces lactis;

• Otimizar o processo de purificação da enzima empregando sistema de adsorção por cromatografia em leito fixo;

• Imobilizar a enzima β-gal produzida para hidrólise da lactose em soro do queijo;

• Avaliar a estabilidade da enzima livre e imobilizada em diferentes condições de pH, temperatura e íons metálicos;

• Determinar a estabilidade da enzima imobilizada em condições de simulações gástricas e intestinais.

Capítulo 3

CAPÍTULO 3 – REVISÃO A LITERATURA

Neste capítulo será apresentado uma breve revisão com abordagem inicial sobre o leite, o soro do queijo e suas potenciais aplicações. Posteriormente, se fará uma explanação sobre a lactose e as reações de interesse com ênfase na produção e utilização da -galactosidase (-gal) e por último, uma pequena síntese sobre as técnicas de recuperação e purificação da enzima de interesse e os métodos de imobilização utilizados atualmente com a finalidade de aumentar a eficiência para aplicação industrial.

3.1. Setor de laticínios

3.1.1 Produção de leite

A produção mundial de leite vem crescente há décadas e essa tendência se mantém nos anos recentes (Figura 1). O crescimento não é linear principalmente devido a situações climáticas que atrapalham pontualmente a produção. Ainda assim, a produção aumentou 11% entre 2010 e 2017, passando de 603 bilhões de toneladas para 668,4 em 7 anos como evidenciado na Figura 1.

Fonte: IBGE (2018)

No setor agropecuário o leite ocupa terceiro lugar em produção total e o primeiro em valor monetário, fornecendo 5% de energia, 9% de gordura e 10% da proteína total consumida globalmente (Global Dairy Platform, 2016).O Brasil ocupa o quinto lugar na produção mundial de leite e apresenta grande relevância socioeconômica, sendo quase 1,2 milhão de produtores, distribuídos em 99% dos municípios (Sorio, 2018).

Os dados do diagnóstico da cadeia Industrial do leite no Brasil de 2018 (Figura 2) revelam que o leite proporciona a produção de uma infinidade de derivados lácteos, mas os produtos mais importantes, além do próprio leite fluido pasteurizado ou UHT, são o leite em pó, a manteiga e os queijos. A produção mundial de queijos, de 19,5 milhões de toneladas em 2017 foi amplamente dominada pela União Europeia e pelos EUA, sendo o Brasil o 4º maior fabricante de queijos.

Figura 2: Evolução da produção de leite no Brasil 2006-2017

De acordo com o Regulamento Técnico de Identidade e Qualidade de Queijos (Brasil, 1996), o queijo é definido como um produto fresco ou maturado que se obtém por meio da separação parcial do soro do leite ou leite reconstituído (integral, parcial ou totalmente desnatado), ou de soros lácteos, coagulados pela ação física do coalho, de enzimas específicas, de bactéria específica, de ácidos orgânicos isolados ou combinados, todos de qualidade aptos

ao uso alimentar. O soro do queijo e seu aproveitamento é uma das alternativas viáveis para indústria de laticínios, podendo ser utilizado como substrato para elaboração de subprodutos de interesse industrial com a obtenção de etanol (Ariyanti e Hadiyanto, 2013; Beniwal et al., 2018), ácido galactônico (Zhou et al., 2019), β-galactosidase (Perini, et al., 2013; Rao e Dutta, 1977), entre outros.

3.1.2 Soro do queijo

Com a industrialização do leite para a produção de seus derivados, ocorre a geração de coprodutos, destacando-se o soro de queijo. Na fabricação do queijo, em torno de 85 a 95% do volume do leite utilizado resulta em soro de queijo, originado após a separação da coagulação das micelas de caseínas, de cor amarelo-esverdeada, com sabor ligeiramente ácido ou doce (Bald et al., 2014).

Segundo Suzart e Dias (2006),o soro do queijo é um líquido opaco, de coloração amarelo esverdeado, que apresenta na sua composição aproximadamente 55% de sólidos existentes no leite integral, sendo a lactose o maior constituinte presente. Além disso, é composto por sais minerais, proteínas hidrossolúveis dentre elas a α-Lactoalbumina e a β-Lactoglobulina, respectivamente com massas molares (MM) em torno de 14.000 e 18.000 Daltons; e menor quantidade de gordura, com ácidos graxos de baixo ponto de fusão (em torno de 29ºC) (Nath

et al., 2014).

O soro do queijo pode apresentar sabor ligeiramente doce, porém vai depender do tipo de queijo que está sendo fabricado; contém nutrientes importantes como: aminoácidos facilmente digeríveis (Barbosa et al., 2010) no qual esses contribuem aproximadamente com 60% do teor proteico total do soro. O soro possui ainda concentrações elevadas de leucina e lisina, além de constituir uma boa fonte de aminoácidos contendo enxofre, tais como: cisteína e metionina, e de ser uma fonte concentrada de cálcio, sendo rico em vitaminas, tais como:

tiamina, riboflavina, vitamina B6 e B12 e ácido pantotênico (Barbosa et al., 2010; Saudades et

al., 2017).

A composição do soro do queijo varia de acordo com o procedimento de separação da caseína e pode ser classificado em dois tipos: Soro ácido que apresenta uma acidez titulável de 0,5 a 0,6% em ácido láctico (Barbosa et al, 2010). Esse tipo de soro é obtido da precipitação ácida no pH isoelétrico (pH = 4,6) durante a manufatura de caseína e queijos com leites coagulados inicialmente por ácidos, como o tipo coalho, cottage, minas, prato, requeijão e ricota (Sgarbieri, 2004). Soro doce que apresenta pH entre 6,0-7,0 e uma acidez titulável de 0,15 a 0,18% em ácido lático. Esse tipo de soro é obtido do processo de coagulação enzimática do leite com o uso de uma enzima a quimosina e do processamento para a fabricação de queijos tipo cheddar, mussarela e suíço. O soro doce normalmente contém maior teor de minerais e menor concentração de proteínas do que o soro ácido e o uso desse último é mais limitado na alimentação e na indústria devido ao seu sabor ácido e ao elevado teor salino (Siso, 1996). As bebidas lácteas à base de soro são de grande valor dietético e de fácil digestão. São produzidas com o uso de soro desmineralizado ou soro concentrado (Barbosa et al., 2010; Schmidell et al., 2001).

Por meio de inúmeros processos químicos, o soro pode ser desidratado e utilizado como alimento ou aditivo alimentar, ou ainda, ser convertido em combustíveis e outros produtos (Albuquerque et al., 2016; Fernández-Gutiérrez et al., 2017). O concentrado proteico representa a maior parte da produção oriunda do soro, ultrapassado pelo soro em pó comum e desmineralizado (Barbosa et al, 2010).

3.1.3 Soro do queijo um resíduo valioso

coadjuvantes entram na cadeia de produção e completam o ciclo com o produto desejado, porém também geram produtos não específicos ou um resíduo destes produtos. Esses últimos são acumulados como resultado do processamento de matérias-primas e, muitas vezes, o descarte ocorre de forma inapropriada no meio ambiente (Jayathilakan et al., 2012).

Diante do exposto, observa-se que na questão relacionada ao aproveitamento de resíduos, a engenharia de bioprocessos surge como uma área estratégica e útil na pesquisa acadêmica industrial, agregando valor com o desafio de produção de biomoléculas de grande interesse mercadológico (Doran, 2012). A grande vantagem e desafio nesta área é converter os resíduos e subprodutos utilizando os processos biotecnológicos, que muitas vezes englobam: pré-tratamentos com agentes físicos e biológicos, com posteriores etapas de produção e purificação controladas, obtendo-se biomoléculas de alto valor agregado como antioxidantes naturais, agentes antimicrobianos, vitaminas, além de enzimas, celulose, amido, lipídeos, proteínas e pigmentos, sendo estes de grande interesse para as indústrias química, petroquímica, farmacêutica, cosmética e alimentícia (Murthy e Madhava, 2012).

A indústria de laticínios está entre as maiores geradoras de resíduos, sendo uma das mais importantes do setor agroindustrial (Fernández-Gutiérrez et al., 2017). Com o intuito de atender as leis ambientais, que estão se tornando cada vez mais rigorosas, as indústrias têm buscado alternativas biotecnológicas, inovadoras e viáveis para o tratamento dos resíduos agroindustriais e o desenvolvimento de novos produtos. Com a indústria de laticínios não é diferente, setor no qual o principal efluente (soro do queijo) apresenta elevado volume de produção, uma rica composição nutricional e alto poder poluente, tornando-se alvo de estudos para transformá-lo de poluidor ambiental em fonte de bioprodutos com alto valor agregado (Prazeres et al., 2012).

O soro do queijo, considerado um subproduto valioso, é o principal componente das águas residuais de produtos lácteos que é avaliado como um material recuperável em relação à disponibilidade de alimentos (Aydiner et al., 2013).

A composição do soro de queijo pode atingir até 80% de lactose (Albuquerque et al., 2018; Zhou et al., 2019). Porém sua produção está diretamente relacionada a geração de resíduos de alto teor poluente (Andrade et al., 2017). A produção do soro do queijo é mais relevante no nordeste do Brasil, no qual o queijo de coalho é um produto tradicional que compõe os aspectos socioeconômicos e nutricionais da região (Fontenele et al., 2017; Soares et al., 2017).

3.2. Lactose importância e aplicação

A utilização do soro do queijo pela a indústria é dificultada pela grande quantidade de lactose ( figura 3 ) que esse componente apresenta, a qual contribui para sua baixa solubilidade, baixo poder de doçura, baixa digestibilidade quando utilizado como alimento, sendo ainda, pouco fermentável quando comparado a outros açúcares (Carminatti, 2001; Guimarães et al, 2010).

O teor de lactose é inversamente proporcional à concentração de lipídios e da caseína presentes no leite variando, consideravelmente, entre as espécies e de acordo com a alimentação do animal. Além disso, é responsável por 50% da pressão osmótica do leite, que é isotônico com o sangue (Oliveira et al., 2008).

Fonte:https://www.infoescola.com/bioquimica/lactose/

A lactose é um carboidrato encontrado no leite e seus derivados. Trata-se de um dissacarídeo redutor formado por um radical D-glicose e outro D- galactose unidos por uma ligação glicosídica β-1,4, considerado o componente mais importante dos sólidos não gordurosos do leite.(Pereira et al., 2012).

Com baixo poder edulcorante e baixa solubilidade em água quando comparada a outros açúcares em virtude das suas formas anoméricas α e β (Guimarães et al., 2010), a lactose em sua forma comercial, α-lactose, tem um poder edulcorante quatro vezes menor que o da sacarose. A β-lactose apresenta um poder edulcorante maior, além de ser mais solúvel que a α-lactose. Também é possível aumentar o poder edulcorante da lactose pela hidrólise que resulta em glicose e galactose (Oliveira et al., 2012; Panesar et al., 2018). Essa conversão pela ação da enzima β- galactosidase é interessante tanto no aspecto tecnológico, pois aumenta o teor de doçura, facilita o processo fermentativo, diminuindo a cristalização da lactose e aumenta o período de estocagem, quanto nutricional, pois possibilita a obtenção de produtos lácteos com baixo teor de lactose (Carota et al., 2017; Suri et al., 2019).

Embora difícil de degradar no meio ambiente, a lactose do soro do queijo pode ser utilizada como substrato para a fermentação visando a obtenção de etanol (Ariyanti e Hadiyanto., 2013; Beniwal et al., 2018), ácido galactônico (Zhou et al., 2019), β-galactosidase (Perini, 2013; Rao e Dutta, 1977), entre outros.

3.2.1 Hidrólise da lactose

A hidrólise da lactose é um pré-requisito para a conversão de soro do queijo em diversos produtos de valor agregado, no entanto, a maioria das espécies de leveduras, como S. cerevisiae, não possuem a capacidade de hidrolisar a lactose (Gänzle, et al., 2008).

A hidrólise da lactose realizada por via ácida ou enzimática, utilizando a enzima β-galactosidase. A hidrólise ácida exige pH ácido e elevada temperatura. Por outro lado, a hidrólise enzimática ocorre em condições mais brandas, tanto de temperatura quanto de pH, porém, exige uma etapa posterior para separação dos produtos formados (Carminatti, 2001).

Na hidrólise enzimática a β-galactosidase que está localizada na superfície chamada borda em escovado intestino delgado promove a quebra da lactose em dois monossacarídeos a glicose e a galactose, hexoses que são facilmente absorvidas pelo organismo (Zhao et al., 2018) Em humanos, a intolerância à lactose ocorre em 75% da população, sendo causada pela deficiência da β-galactosidade no organismo, que resulta em uma diminuição daatividade dessa enzima na membrana da borda da mucosa no intestino delgado em adultos.Preparações enzimáticas de lactases em produtos lácteos pode reduzir a lactose e promover um efeito benéfico para os intolerantes à lactose (Braga et al., 2014; Zhao et al., 2018).

Almeida et al (2015) estudaram a hidrólise enzimática da lactose de formulações de permeado de soro, em concentração de 0,2%, 0,7% e 1% nos tempos 30, 60 e 90 minutos com o pH do meio de 6,3 e temperatura de 37 ºC e constataram que na concentração enzimática de 0,7% no tempo de 30 minutos, as formulações se tornaram seguras para o consumo de intolerantes à lactose, de acordo com níveis mínimos estabelecidos pela legislação.

Torres et al (2016) analisaram o efeito de diferentes níveis de hidrólise enzimática da lactose (0%, 25%, 50%, 75% e 99%), na produção e estocagem de leite em pó integral. Todos os resultados indicam que a hidrólise da lactose afeta a produção do leite em pó por aumentar absorção de umidade durante a estocagem.

3.3. Enzima -galactosidase

A enzima β-galactosidase (E.C.3.1.23) (β-gal) também chamada de lactase, é classificada como hidrolase, capaz de hidrolisar a lactose em glicose e galactose. Essa biomolécula é encontrada

na forma de tetrâmeros com quatro subunidades de cadeias de polipeptídios de aproximadamente 90 a 120 KDa, cada unidade dimérica contribui com um sítio ativo de união Mg+2 e dois resíduos catalíticos (um de cada cadeia polipeptídica), conforme pode ser evidenciado na figura 4 (Klen, 2010)

Fonte: (https://www.rcsb.org/structure/4V40, [s.d.])

Figura 4: Estrutura molecular β-galactosidase

Essa enzima pode estar presente entre alguns vegetais como amêndoas, pêssego, damasco, em órgãos de animais e são produzidas por grande quantidade de microrganismos, tais como fungos filamentosos, bactérias e leveduras (Suzart e Dias, 2006). No entanto, as suas propriedades variam de acordo com a fonte respectivamente (Lima, 2012).

As β-galactosidases em sua maioria são sintetizadas intracelular por microrganismos que utilizam a lactose como substrato para produção de energia. Rajoka et al., (2004) produziram β-gal utilizando leveduras Kluyveromyces marxianus na presença de lactose, sacarose e outras fontes de carbono e observaram que o tipo de substrato e a temperatura influenciam no crescimento especifico e na taxa de produção da enzima. Para Lima et al. (2011), o soro do leite desproteinizado e suplementado serviu como fonte de carbono para

Kluyveromyces lactis NRRLY1564 na síntese da β-galactosidase obtendo-se 3,5 U/mL de

A reação da hidrólise enzimática da β-galactosidase ocorre com a utilização do substrato cromogênico O-nitrofenil-β-D-galactopiranosídeo (ONPG) sendo este processo uma das formas de confirmar a atividade desta enzima, trata-se de um teste colorimétrico, no qual após hidrólise, o ONPG que é um líquido incolor produz a galactose (incolor) e o O-nitrofenil- piranose (ONP) que tem coloração amarela (Braga et al., 2014; Machado et al., 2015).

As β-galactosidases produzidas por bactérias e leveduras apresentam um melhor desempenho em pH neutro, enquanto que as expressas por fungos são mais ativas em pH ácido. Desta forma, a escolha da enzima dependerá da reação que será catalisada e do substrato. Na hidrólise de produtos lácteos, e preferencialmente, o leite geralmente são utilizadas as enzimas produzidas por leveduras que apresentam atividade ótima de pH na faixa de 6,0 – 7,0. As enzimas expressas por leveduras parecem se tornar mais ativa na presença de íons Mg+2 e Mn+2 como cofatores (Nath et al., 2014).

Um fator limitante na atividade hidrolítica da β-galactosidase está relacionado a sua inibição por um dos produtos formados na reação, a galactose e glicose, e a formação dos isômeros. Inibidores competitivos e não competitivos respectivamente, a galactose e glicose impedem a hidrólise por completo da lactose, sendo a inibição por glicose bem menor quando comparada a galactose (Klein, 2010).

A lactose não consegue ser digerida na ausência da β-galactosidase. Diante deste aspecto, quando os alimentos que contém lactose como leite e derivados são consumidos pelo ser humano, e não existe a presença da β-galactosidase em concentrações suficientes no organismo, a lactose, conforme passa pelo cólon, é fermentada por bactérias produzindo ácidos orgânicos de cadeia curta, principalmente lático e acético e libera gases, como o dióxido de carbono, nitrogênio e metano (Chanalia et al., 2018; Suri et al., 2019). Os produtos obtidos por ação das bactérias acidificarem o meio, aumenta a osmolaridade e as contrações peristálticas

grosso o que resulta em diversos sintomas. Esses sintomas são cólicas, flatulência, desconforto abdominal e diarreia osmótica (Fani, 2010).

A intolerância a lactose é uma síndrome clínica de desconforto intestinal, também conhecida como deficiência de lactase do adulto. Ela compromete o indivíduo devido aos baixos níveis, ou até a ausência da atividade da enzima β-galactosidase no aparelho digestivo, por consequência de uma deficiência congênita desta enzima ou de uma diminuição gradativa de sua atividade com o avanço da idade (Bosso et al., 2019;Suri et al., 2019).

A β-galactosidase vem sendo utilizada amplamente como suplemento de ingestão oral por pessoas intolerantes à lactose. Outra forma diferente de utilização é a utilização desta enzima em produtos na indústria de laticínios para promover a hidrólise da lactose obtendo-se assim, alimentos com baixos teores de lactose, melhorando a solubilidade e digestibilidade do leite e derivados lácteos, ideais para consumidores intolerantes à lactose (Martarello et al., 2019; Suri et al., 2019).

A preocupação com uma alimentação com efeitos benéficos para a saúde tem aumentado a demanda por produtos alimentícios com essas características, dando suporte para novas pesquisas nesta área (Gosling et al., 2010; Chanalia et al., 2018).

A β-galactosidase vem sendo ressaltada por sua propriedade de gerar derivados de lactose através de transgalactosilação para formar galactooligossacarídeos (GOS), com um novo alcance de utilização como alimentos funcionais. Por não serem digeridos, os GOS podem alcançar a microbiota no cólon e promover a proliferação de Bifidobacterium, o que faz deles importantes aditivos em fórmulas infantis e em outros produtos lácteos (González-Delgado et

al., 2016; Chanalia et al., 2018; Panesar et al., 2018).

a enzima lactase utilizada na indústria de alimentos deve ser de origem microbiana, proveniente dos seguintes microrganismos: Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Candida pseudotropicalis, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces flagilis, Kluyveromyces marxianus

uma vez que tais espécies são classificadas como GRAS (Generally Recognized as Safe) pela

Food and Drug Administration (FDA), sendo esse um importante critério para aplicações

alimentícias (Alvarenga et al., 2017; Brasil, 2006), conforme é evidenciado na tabela 1:

Tabela 1: Alguns microrganismos produtores de β-galactosidase

Microrganismo Referências

Aspergillus niger (Martarello et al.,2019)

Aspergillus oryzae (Araujo et al., 2015)

Candida pseudotropicalis (Adalberto et al., 2010)

Guehomyces pullulans (Song et al., 2010)

Kluyveromyces fragilis (Vieira, 2009)

Kluyveromyces lactis (Bosso et al., 2016; Mörschbächeet al., 2016; Sun et al., 2016; Alvarenga et al., 2017; Darif, 2018)

Kluyveromyces marxianus (Duarte et al., 2012; Medeiroset al., 2012; Ariyanti e Hadiyanto, 2013; Beniwal et al., 2018b;)

Fonte: Adaptado (Lima, 2012)

3.4. Biotecnologia aplicada a produção de -galactosidase

3.4.1. Gênero Kluyveromyces e Saccharomyces: metabolismo e produção de -gal

Kluyveromyces spp. são leveduras que apresentam uma via metabólica

respiratório-fermentativa que pode gerar energia através do ciclo de Krebs (ciclo do ácido cítrico) ou por fermentação exclusiva, na qual o etanol é o principal produto com efeito Crabtree negativo. Em contraste com a Saccharomyces spp., leveduras com metabolismo respiratório-fermentativo que não exploram plenamente sua capacidade de absorver glicose durante o crescimento oxidativo, ou seja, apresentando efeito Crabtree positivo (Petrova et al, 2010). De fato, elas são capazes de realizar simultaneamente fermentação e processos respiratórios, e o equilíbrio entre essas

duas vias metabólicas depende da especificidade da linhagem (Lane e Morrissey., 2010). Além disso, elas também são termotolerantes e podem ser encontradas em uma variedade de habitat, representando uma ampla diversidade metabólica, atingindo uma variedade de aplicações biotecnológicas (Petrova et al., 2010; Fonseca et al., 2008).

Duarte et al.,(2012) realizaram a caracterização cinética e termodinâmica da β-gal produzida por K. marxianus com o objetivo de analisar o comportamento metabólico da levedura frente a temperatura e o pH. Os resultados mostraram a influência dos parâmetros no crescimento celular e na síntese enzimática. Em estudos realizados por Bansal et al (2008) com a finalidade de avaliar a melhor condição de produção e extração de β-gal por K. marxianus, foi observado uma produção máxima de β-gal em 30 horas de fermentação com um crescimento celular de 2,54 mg/mL, ainda foi possível identificar que o uso do clorofórmio foi o método mais eficiente e barato de extração, mantendo a atividade da enzima.

Estudos realizados por Lima (2011) utilizando o soro de leite desproteinizado e suplementado como fonte de carbono alternativa para produção da enzima β-gal por

Kluyveromyces lactis NRRL Y1564 mostrou uma capacidade interessante de expressão dessa

biomolécula com resultados de atividade em torno de 3,5 U/mL com 12 h de fermentação. Perini et al. (2013) realizaram estudos similares utilizando o soro do queijo como fonte de carbono e a milhocina como fonte de nitrogênio e por meio de um planejamento experimental reportaram atividade de 6,59 U/mL.

K. lactis possui os genes LAC 12 e LAC 4, que são responsáveis pela codificação das

enzimas lactose-permease e β-galactosidade, respectivamente, as quais desempenham papéis diferenciados. A lactose-permease participa do transporte da lactose através da membrana citoplasmática para o interior da célula, e a β-galactosidase é responsável pela hidrólise da

lactose (dissacarídeo) em dois monossacarídeos, a glicose e a galactose (Rubio-Texeira, 2005; Guimarães et al., 2010).

A β-galactosidase de K. lactis apresenta massa molar em torno de 120 a 150 kDa (Zhou e Dill, 2001), sendo assim considerada uma proteína de alta massa molecular. Por ter uma elevada atividade hidrolítica, tem sido utilizada para produzir alimentos livres de lactose (Fischer et al., 2013). Esse microrganismo não é muito utilizado para produção de etanol, mas tem sido muito usada na produção de proteínas e, principalmente, da lactase usando o soro do leite como meio de cultura (Spohner et al., 2016).

Várias estratégias têm sido investigadas para lidar com o descarte de resíduos de soro do queijo dentre as quais destaca-se o uso de processos biotecnológicos como uma maneira interessante de converter tal subproduto em compostos com maior valor agregado (Carota et

al., 2017).

A técnica de fermentação submersa tem se tornada atrativa para indústria, em virtude dos avanços na instrumentação e controle de processos, sendo bem adaptada para o cultivo de microrganismos recombinantes, empregados de forma cada vez mais crescente na produção de enzimas e outras biomoléculas de interesse (Lima, 2012; Schmidell et al., 2001).

A fermentação submersa utiliza substratos líquidos como meio de cultivo nutritivo, facilitando o controle de parâmetros como: temperatura, pH e aeração, além de outros fatores que podem interferir no processo. Os nutrientes presentes, o pH, temperatura e agitação podem exercer influência na taxa de crescimento dos microrganismos, no rendimento da biomassa e na produção de metabólitos. Os componentes nutritivos do meio com as fontes de carbono e nitrogênio, estão diretamente ligados ao crescimento e a produção enzimática microbiana (Alvarenga et al., 2017; Sundarram et al, 2014).

entanto, na concepção de um processo para produção de -galactosidase e etanol a partir do soro do leite, esta tem que ser acompanhada para maximização do título/produtividade das biomoléculas de interesse e minimização da concentração de açúcar residual do efluente, uma vez que a finalidade do processo é normalmente o tratamento de resíduos (Guimarães et al., 2010; Martarello et al, 2019).

Em um estudo recente You et al. (2017), propôs a utilização da lactose comercial como substrato para uma produção por fermentação submersa de baixo custo de β-Gal usando uma estratégia de co-produção na qual o etanol, um subproduto da fermentação, também foi recuperado, usando a lactose comercial com um meio enriquecido os autores conseguiram maximizar a produção de duas biomoléculas de grande interesse industrial.

3.5. Recuperação e purificação da β-galactosidase

Inúmeras são as técnicas utilizadas para a recuperação e purificação de enzimas de origem animal, vegetal ou microbiana, porém existem muitas dificuldades, do ponto de vista técnico que exigem um elevado número de etapas (Braga et al., 2014).

Ao iniciar um processo de recuperação e purificação de uma enzima é importante saber o grau de pureza exigido. As enzimas que são usadas para fins terapêuticos ou de uso direto em seres humanos necessitam de um alto grau de pureza, o que não é necessário para as enzimas que serão aplicadas em outros processos industriais. Na purificação em larga escala, dependendo do grau de pureza durante a etapa de downstream diversas operações unitárias são aplicadas para promover a purificação da biomolécula de interesse (Pessoa Jr e Kilikian, 2008).

A escolha das técnicas a serem empregadas no processo de recuperação e purificação está vinculada às propriedades moleculares inerentes a cada enzima. Dessa forma, a combinação correta de várias etapas que exploram estas propriedades permitirá a recuperação

e purificação a partir de uma mistura (Pessoa Jr e Kilikian, 2008).

Nas primeiras etapas de purificação quase sempre é desejável reduzir o volume, e para isto é frequentemente utilizada à precipitação fracionada com sais ou solventes orgânicos. Posteriormente são utilizadas técnicas que exploram interações eletrostáticas (cromatografia de troca iônica) pela sua relativa alta capacidade. Para as etapas finais, o objetivo quase sempre é um aumento de resolução, e para isto utilizam-se técnicas como cromatografia em gel filtração ou cromatografia de afinidade. Análise via eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) pode indicar a pureza e o número de contaminantes presentes (Harris, 2001).

3.5.1 Sistemas de Cromatografia

O processo de purificação de proteínas tem como objetivo principal alcançar um rendimento máximo com alta seletividade, levando sempre em consideração os custos da operação. Em se tratando de enzima o desempenho de qualquer técnica de purificação é evidenciado pelas variáveis rendimento e fator de purificação. A primeira estabelece o percentual da molécula que foi recuperado durante a etapa, e a outra mensura o aumento da atividade específica da enzima ao usar etapas que promovam a purificação (Padilha, 2013).

A cromatografia é uma das muitas técnicas de purificação que tem se destacado por seu alto desempenho e eficiência na separação de misturas complexas. A adsorção de biomoléculas da fase fluida para uma superfície sólida é um fenômeno comum utilizado em várias áreas como biologia, biotecnologia e processamento de alimentos (Lima, 2014).

A cromatografia em leito fixo se fundamenta na propriedade de alguns materiais (adsorventes) que possuem a capacidade de reter moléculas (adsorbato) sobre sua superfície. A busca por adsorventes com elevada capacidade de adsorção e seletividade tem sido um desafio no desenvolvimento de recuperação e purificação de subprodutos (Villeneuve et al., 2000).

Medeiros et al., (2012) no estudo de purificação da β-galactosidase comercial por meio da técnica de cromatografia de troca iônica utilizando a resina sepharose Q obtiveram valores de recuperação de 88%.

Boeris et al., (2012) obtiveram valores de recuperação próximos a 65% quando submeteram a enzima à cromatografia de troca iônica em leite expandido usando a resina Streamline DEAE.

Lima et al., (2016) analisando as condições de recuperação e purificação da β-gal comercial usando a técnica de cromatografia multimodal e alcançaram 48% de rendimento e um fator de purificação de 1,17.

Ji et al., (2019) sobre a cinética de purificação, caracterização e inativação térmica da -gal Lactobacillus leichmannii 313 as proeteínas foram separadas por meio de um sistema de cormatografia de alta eficiência (FPLC) utilizando uma coluna de troca iônica alcançando condições favoráveis de purificação.

Portanto, independentemente do método utilizado no processo de purificação, deve ser considerado dois fatores importantes o rendimento e o fator de purificação, conforme equações 1 e 2, respectivamente . Para enzimas, a concentração total de proteínas e atividade enzimática são analisadas normalmente. A partir da atividade enzimática do extrato bruto e purificado, se obtém o rendimento do processo (Padilha, 2013).

Rendimento (%) = 𝐴𝑡𝑖𝑣𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒 𝑒𝑛𝑧𝑖𝑚á𝑡𝑖𝑐𝑎 𝑑𝑜 𝑚𝑎𝑡𝑒𝑟𝑖𝑎𝑙 𝑝𝑢𝑟𝑖𝑓𝑖𝑐𝑎𝑑𝑜

𝐴𝑡𝑖𝑣𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒 𝑒𝑛𝑧𝑖𝑚á𝑡𝑖𝑐𝑎 𝑑𝑜 𝑚𝑎𝑡𝑒𝑟𝑖𝑎𝑙 𝑏𝑟𝑢𝑡𝑜 x 100 (1)

Fator de Purificação =𝐴𝑡𝑖𝑣𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒 𝑒𝑠𝑝𝑒𝑐í𝑓𝑖𝑐𝑎 𝑑𝑜 𝑚𝑎𝑡𝑒𝑟𝑖𝑎𝑙 𝑝𝑢𝑟𝑖𝑓𝑖𝑐𝑎𝑑𝑜

3.6. Imobilização de Enzimas

Uma estratégia biotecnológica que está sendo frequentemente utilizada com a finalidade de melhorar a aplicação industrial da -galactosidase permitindo redução de custos é a imobilização de enzimas (Klein, 2010). Cada enzima possui características especificas e requer um critério minucioso na escolha dos métodos com a proposta de fornecer procedimentos simples, econômicos e que resultem em uma enzima imobilizada com boa retenção de atividade e alta estabilidade operacional (Fai et al., 2015; Mendes et al., 2011).

O desenvolvimento dessas técnicas de imobilização é de grande avanço para a indústria alimentícia, uma vez que proporciona a reutilização das enzimas, pode aumentar a estabilidade térmica e melhorar a separação dos produtos (Lemos, 2018; Vieira, 2009).

Existem alguns tipos de imobilização de enzimas, por aprisionamento físico ou por adsorção na superfície. O primeiro método faz o encapsulamento das enzimas em esferas ou matrizes de polissacarídeos, proteínas ou polímeros sintéticos. As enzimas ainda podem ser fixadas ao suporte de imobilização diretamente por ligações químicas (iônicas ou covalentes) (Meersman, 1992). O método de adsorção física para imobilização de enzimas é baseado na interação física da enzima na superfície de suportes insolúveis. A enzima pode ser retida na superfície do suporte insolúvel e essa interação pode ser ocasionada por ligações hidrofóbicas, interações de Van der Waal, pontes de hidrogênio e interações específicas (Cunha et al., 2007; Muguruma et al., 2006; Souza et al., 2019). A Figura 5 mostra esquematicamente os métodos de imobilização enzimática.

Figura 5: Métodos de imobilização de enzimas

Fonte:(Fischer, 2010)

O encapsulamento em matrizes de biopolímeros é um tipo de imobilização de enzima que pode aumentar a estabilidade da biomolécula, sendo esse um dos fatores primordiais em aplicações industriais. Neste método, as enzimas são mantidas dentro de um espaço confinado, com restrita mobilidade que contribui para sua maior estabilidade (Escobar et al., 2014; Zhou e Dill, 2001). Esse processo confere uma maior proteção da enzima contra condições extremas de pH e a matriz pode evitar a evasão da enzima durante a catálise. Essas vantagens são importantes tanto economicamente quanto do ponto de vista ambiental (Albuquerque et al., 2018).

Entre os vários suportes utilizados para o método de aprisionamento enzimático, o alginato de sódio tem mostrado características adequadas para encapsulação. O alginato é um polímero aniônico solúvel em água, obtido de algas marrons e composto por ácidos β-1-4-D-manurônico e α-1,4-gulurônico (Blandino et al., 2001; Bustamante-Vargas et al., 2015). O processo de geilificação do alginato ocorre quando há troca de íons sódio por cátions divalentes tais como Ca2+, Cu2+, Zn2+ ou Mn2+ (Darif, 2018).

A imobilização com alginato de sódio consiste em dissolver a enzima em uma solução aquosa contendo alginato, que é gotejada em uma solução

aquosa contendo íons bivalentes (Ca2+, por exemplo). Em contato com a solução

CaCl2, a gota de alginato de sódio forma esfera de alginato de cálcio na qual a

enzima fica aprisionada (Freitas, 2007; Schmidell et al., 2001). A malha de gel formada, induzida pela ligação do íon Ca2+_{, por exemplo, formam junções estáveis (uma rede}

tridimensional) (Roy e Gupta, 2003).

Estudos realizados por Shen et al., (2011) que testaram uma matriz híbrida de alginato-gelatina-fosfato de cálcio para a imobilizar de β-galactosidase de K. lactis constataram uma menor atividade relativa (58,6 %) de β-galactosidase imobilizada em esferas de alginato-gelatina-fosfato de cálcio, quando comparada à β-galactosidade imobilizada em esferas do matriz controle (62,3 %) utilizando apenas alginato. Os autores atribuíram este resultado a problemas de transferência de massa ocasionados pela camada de fosfato de cálcio e gelatina formada no suporte.

Ansari e Husain,(2012) analisaram a imobilização de β-galactosidase de amêndoa em alginato de cálcio-celulose revestido com concanavalina A, empregando glutaraldeído como agente reticulante. O derivado obtido reteve 72% de sua atividade inicial e as condições ótimas de pH (5,5) e temperatura (50 °C) não sofreram alterações em relação à enzima livre, sendo que a enzima imobilizada mostrou um alargamento notável nestes perfis. Por outro lado, o derivado obtido sofreu maior inibição aos produtos formados e a taxa de conversão de lactose foi menor em relação à enzima livre.

Freitas et al., (2012) utilizando a β-galactosidase de K. lactis imobilizada em alginato de sódio, gelatina, e ligação cruzada com glutaraldeído. Constataram que as condições ótimas para a imobilização da enzima foram 6,60 % de alginato (m/v), 4,05 % de gelatina (m/v) e 3,64 % de glutaraldeído (v/v). A enzima imobilizada obtida nas condições otimizadas de adsorção

permaneceu com 80 % da sua atividade inicial após 25 utilizações. Nas concentrações de lactose estudadas (10 a 100 g/L), não houve inibição pelo produto para enzima imobilizada.

Estudo mais recente realizado por Darif, (2018) sobre a imobilização de β-galactosidase de Aspergillus oryzae, Kluyveromyces lactis e Saccharomyces marxianus var lactis em matriz de alginato de cálcio, gelatina e transglutaminase (T-Gase). Mostrou que as β-galactosidases A e B neutras, obtidas de Kluyveromyces lactis, nas formas livre e imobilizadas em alginato de cálcio-gelatina-TGase, apresentaram temperatura ótima de atividade a 35 °C em pH 7,0 enquanto que a β-galactosidase C, obtida de Saccharomyces marxianus var. lactis, na forma livre e imobilizada em alginato de cálcio-gelatina-TGase apresentou temperatura ótima de atividade a 40 °C em pH 7,0. A β-galactosidase ácida D obtida de Aspergillus oryzae na forma livre apresentou temperatura ótima de atividade a 50 °C em pH 4,5 e a sua forma imobilizada, em pH 4,5, apresentou atividade máxima a 45 °C. Temperaturas acima de 50 °C mostrou alteração da textura dos grânulos de alginato de cálcio-gelatina-TGase e diminuição da atividade enzimática. Essa técnica permite uma infinidade de aplicações da β-galactosidase na indústria alimentícia em virtude da maior estabilidade proporcionada a biomolécula.

3.7. Aplicações da β-galactosidase na indústria alimentícia

A β-galactosidase vem sendo amplamente utilizada como suplemento de ingestão oral por pessoas intolerantes à lactose (Khan e Husain, 2019). Outra forma diferente de utilização além da ingestão direta é a utilização desta enzima na indústria de laticínios promovendo a hidrólise da lactose em produtos com alto teor deste açúcar e obtendo-se assim, alimentos com baixos teores de lactose, melhorando a solubilidade e digestibilidade do leite e derivados lácteos, ideais para consumidores com esse tipo de restrição alimentar (Cavalcante et al, 2015; Suri et al., 2019).

A preocupação com uma alimentação e seus efeitos benéficos para a saúde tem aumentado a demanda por produtos alimentícios com essas características, dando suporte para novas pesquisas nesta área (Bosso et al., 2019; Gosling et al., 2010).

A β-galactosidase vem sendo ressaltada por sua propriedade de gerar derivados de lactose através de transgalactosilação para formar galactooligossacarídeos (GOS), com um novo alcance de utilização como alimentos funcionais (Silvério et al., 2018). Por não serem digeridos, os GOS podem alcançar a microbiota no cólon e promover a proliferação de

Bifidobacterium, o que faz deles importantes aditivos em fórmulas infantis e em outros produtos

lácteos (Panesar et al., 2018).

Atualmente os insumos produzidos por Kluyveromyces spp e Aspergillus são comumente utilizados nos processos industriais (Carota et al., 2017; Eskandarloo e Abbaspourrad, 2018; Husain, 2010; Oliveira et al., 2012). O fungo Aspergillus spp produz lactase extracelular, que apresenta valores ácidos de pH ótimo entre 2,5 - 5,4 e uma temperatura ótima alta de 50 °C (Panesar et al., 2018). Sua principal aplicação é na hidrólise ácida de soro de queijo resultando em queijos frescos (Chiara Mollea, 2018). A lactase de Kluyveromyces spp. é produzida intracelularmente, a lactose é transportada para o interior da levedura por uma permease, onde é hidrolisada em glicose e galactose, que seguem então a via glicolítica ou o caminho de Leloir, respectivamente (Guimarães et al., 2010). Essa lactase possui um pH neutro (6,0 – 7,0), o que permite uma gama de aplicações mais ampla. Uma de suas aplicações é a hidrólise de leite (Panesar et al., 2018; Suri et al., 2019).

Inúmeras são as pesquisas desenvolvidas sobre a produção de β-galactosidase com a utilização de inúmeros microrganismos, porém sobre otimização das condições de produção desta enzima poucos trabalhos são relatados. O efeito da temperatura nos parâmetros cinéticos que quantificam a reprodução e morte celular, o consumo de substrato e a produção da enzima

são informações importantes para a elaboração de estratégias de controles mais eficientes nas indústrias (Schmidell et al., 2001).

Mariotti et al., (2008) realizaram o estudo referente a hidrólise da lactose do soro de leite em reator com a β-galactosidase proveniente de A. oryzae imobilizada em sílica. Verificaram que os melhores resultados de imobilização foram alcançados usando o glutaraldeído como ativante do suporte e estabilizador da enzima. A proporção otimizada entre enzima e suporte foi 15-20 mg/g. A atividade de β-galactosidase imobilizada em torno de 650 U/g.

Klein, (2010) analisou o efeito da utilização da enzima β-galactosidase frente o processo de cristalização da lactose no doce de leite. Foram avaliadas as seguintes concentrações de enzimas: 0 a 0,4g/L. A verificação do grau de cristalização do produto foi realizada por análise sensorial após 30, 60, 90 e 180 dias de armazenamento à temperatura ambiente, por provadores previamente treinados. Constatou-se que a concentração de 0,2 g/L de β-galactosidase utilizada (23,16 % de hidrólise da lactose) foi suficiente para que a arenosidade no doce de leite não fosse percebida sensorialmente, durante todo o período considerado.

De acordo com Chanalia et al., (2018) que analisaram a utilização da β-galactosidase para hidrólise da lactose e síntese de GOS, mostram que a enzima apresentou uma ótima estabilidade de pH e temperatura com uma leve ativação na presença do íon Ca+2 o que revela ser adequada para o processamento do leite na produção de alimentos com baixo teor de lactose e consequente síntese de prebióticos.

Outra aplicação de extrema necessidade e com grande avanço na indústria farmacêutica se refere à utilização ampla de enzimas como agentes terapêuticos. Por administração oral em uso clinico ou como coadjuvantes no tratamento de patologias especificas como doença celíaca e a fenilcetonúria (Fuhrmann e leroux, 2014). Como medicamento essas biomoléculas são de

grande interesse para indústria em virtude da sua elevada atividade, seletividade e pela a possibilidade de manipulação das suas propriedades. No entanto, o uso de enzimas em grau farmacêutico administrada via oral é um aspecto desafiador devido ao potencial de inativação desta molécula em ambiente hostil gastrointestinal (Wang et al., 2009).

Diante do exposto, a busca de alternativas biotecnológicas viáveis para o tratamento dos resíduos agroindustriais e o desenvolvimento de novos produtos, marca a relevância desta pesquisa por estudar técnicas acessíveis e eficientes que permitam o aproveitamento do soro do queijo “coalho” para produção, recuperação e aplicação da β-galactosidase na indústria de alimentícia.

O capítulo a seguir por meio de artigos evidencia as técnicas de bioprocessos utilizadas para obtenção, recuperação e aplicação da enzima. O artigo 1 contextualiza o perfil de co-produção de β-galactosidase e etanol por leveduras Kluyveromyces marxianus ATCC 36907 e Kluyveromyces lactis NRRL Y-8279 usando lactose do soro de queijo "coalho" como fonte de carbono. O artigo 2 utiliza o extrato enzimático de β-galactosidase produzido por

Kluyveromyces lactis NRRL Y-8279 com a finalidade de recuperar e purificar a enzima por

cromatografia de troca iônica, em coluna de leito fixo, avaliando a influência do pH e da força iônica. E por fim o artigo 3 utiliza a β-galactosidase produzida por Kluyveromyces lactis NRRL Y-8279, parcialmente purificada por cromatografia de troca iônica e imobilizada com alginato de sódio para avaliar as condições de hidrólise da lactose do soro de queijo "coalho" e sua possivel aplicação na indústria alimentícia.