METODOLOGIA DE INOCULACÁO DE TOSPOVIRUS
VISANDO AVALIACAO DE GERMOPLASMA DE TOMATE*
CLEISON MEDAS DUVAL 1**, F. P. CUPERTINO 1***, A. B. P. LUIZ2
&
L de B. GIORDANO3*** 1pepartamento de Fitopatologia e 2Departamento de Estatistica, Universidade de Brasilia, 70.910-970, Brasilia, DF;3Centro Nacional de Pesquisa de Hortalicas/EMBRAPA, C. Postal 0218, 70.359-970 Brasilia, DF. (Aceito para publicaCao em 12/03/93)
DUVAL, C. M., CUPERTINO, F. P, LUIZ, A. B. P. & GIORDANO, L. de B. Metodologia de inoculacao de tospovirus, visando avaliacao de germoplasma de tomate. Fitopatol. bras. 18:516-521. 1993.
RESUMO
Para triagem de germoplasma de tomate, visando resistencia a tospovirus, determinou-se o efeito de alguns fatores sobre a concentracao de tris isolados de virus (ALD, ES e SN), em 5 diferentes hospedeiras. Plantas de feijao Isnanteiga', com 11 dias de idade ou quando as folhas primarias atingem 2/3 da area final, foram usadas para inoculacao mecinica dos isolados. As melhores
hospedeiras para multiplicacio dos trés isolados foram Nicotiana rustica e fumo `TNN', seguidas de tomate
`Angela'. Tanto em casa de vegetacao, como em camara de crescimento, nUmero mais elevado de particulas infectivas ocorreu entre 10-15 dias apOs a inoculacao. A melhor diluicio do inOculo foi a de 1:5 (peso/volume).
Palavras-chave: tospovirus, tomateiro, resist6ncia.
ABSTRACT
Inoculation methodology of tospovirus for screening tomato germ plasm
In order to provide more reliable methods of inoculation for screening tomato germoplasm with tospovirus isolates, the effect of some factors on the concentration of three tospovirus isolates (ALD, ES and SN) on five different host species was evaluated. Eleven day-old `Manteiga' bean was used as local lesion host when the primary leaves reached 2/3 of the total final leaf area. On the basis of the number of local lesions obtained
on such test plant, it was verified that the best hosts for virus multiplication were Nicotiana rustica and `TNN' tobacco, followed by tomato cv. Angela. The virus
concentration in these hosts was greater in growth chamber than in greenhouse. In both conditions, higher infectible particles concentration occurred between 10 and 15 days after inoculation. Serial plant extract dilution showed that 1:5 (w/v) fold dilution was the most effective.
INTRODUCAO
Tomato spotted wilt virus (TSWV) d hoje
classificado como membro-tipo do Oiler° tospovirus, que
Parte do trabalho de dissertacio de Mestrado do primeiro autor. Financiado parcialmente pelo CNPq.
•
Bolsista da CAPES.
*** Bolsistas do CNPq.
foi incluido na faznilia Bunyaviridade (Francki et al., 1992), devido a sua similaridade corn alguns virus que infetam animais. Este género abriga agentes causais de graves molestias de plantas em todo o mundo, entre os quais encontramos TSWV, que causa severas perdas na producao do tomateiro (Costa & Forster, 1950; Francki & Hatta, 1981; de Avila, 1992). Cerca de 550 especies vegetais, de aproximadamente 70 familias botanicas, entre monocotiledOneas e dicotiledOneas (Sether & de Angelis, 1992) podem ser infetadas por tospovirus.
Recentemente, com base em comparacOes das propriedades sorolOgicas e da composicio da protein do nucleocapsideo, bem como na sequencia de nucleotideos dos RNAs virais e na reacio de diferentes hospedeiras, de Avila et al. (1993a, 1993b) propuseram trts novas especies para o genero tospovirus, a saber: "tomato chlorotic spot virus" (TCSV), "groundnut ring spot virus" (GRSV) e "Impatiens necrotic spot virus" (INSV). Todavia, a dificil e inconsistente a separacio dessas especies de tospovirus corn base unicamente em circulo de hospedeiras (CH) (de Avila et al., 1992), devido a grande superposicio verificada entre elas, corn excecio de INSV, cujo CH e menos amplo. Entretanto, para ensaios quantitativos, visando
determinacio da concentraclo de virus em diferentes hospedeiras, feijao (Phaseolus vulgaris L.) `Manteiga' pode ser bastante util, como planta-teste de lesio local (Costa, 1957).
De maneira geral, na avaliacio de germoplasma visando resistencia a virus, e importante determinar previamente a metodologia de inoculacio (Costa & Reifschneider, 1991), disso dependendo em grande parte o sucesso desse tipo de trabalho. No caso das especies de tospovirus, que sic) de baixa concentracio nos tecidos de suas hospedeiras, de facil inativacio tennal e de curta longevidade in vitro (de Avila, 1992), torna-se crucial o conhecimento previo dessa metodologia.
0 objetivo do presente trabalho foi o de definir metodologia de inoculacio visando a triagem de
germoplasma de Lycopersicon para resistencia a diferentes isolados de tospovirus.
MATERIAIS E METODOS
Isolados do virus.
Foram utilizados nes isolados de tospovirus,
provenientes de Solanum americanum Mill.(SN), Emilia
sonchifolia DC (ES) e de tomate (L. esculentum Mill.) (ALD), coletados no Distrito Federal. Esses isolados foram multiplicados por inoculacao mecanica (Meissner Filho & Cupertino, 1990) em pimentio (Capsicum annuum L.), pimenteira CNPH 679 (C. chinense L.) PI 159236, Datura stramonium L, fumo (Nicotiana tabacum L.) 'TNN', N.
rustica L e tomate (Lycopersicon esculentum Mill.) `Angela I-5100'e 'Santa Cruz'. Para evitar contaminacio, usaram-se luvas de plastic° para protecio das mks e cotonetes de algodao para aplicacio do extrato.
Testes sorolOgicos.
Para os testes de imuno-difusäo dupla em agar-gel, o meio foi preparado segundo Si et al. (1991). Os antigens constituiram-se de extrato de folhas de fumo 'TNN' e N. rustica, infetadas sistemicamente corn os isolados ALD, ES ou SN. Como controle, usou-se extrato de folhas sadias dessas mesmas plantas. 0 anti-soro contra TSWV utilizado foi cedido pelo laboratOrio de Virologia da
EMBRAPA/CNPH. Cerca de 2 horas antes da realizacio
dos testes (Lima, 1979), fez-se a adsorcio intra-gel corn extrato sadio no orificio central.
Determinasiio do efeito da idade da folha primaria sobre o mimero de lesfies locals.
Pam determinacio da melhor idade das folhas primarias de feijao `Manteiga', testaram-se plantas corn 9,
11, 13 e 15 dias de idade, respectivamente. Como inOculo, usou-se extrato de folhas infetadas deN. rustica diluido a 1:5 (peso/volume) em tampio fosfato mais sulfito de sOclio. Foram inoculadas 4 plantas de feijao `Manteiga' por idade e por isolado, sendo duas delas mantidas em camara de crescimento (18-25°C) e as outras duas, em estufa (18-40°C). Cada parcela constituiu-se de duas folhas primarias inoculadas por planta-teste. 0 delineamento estatistico foi o de fatorial inteiramente casualizado, com duas repeticOes, sendo a analise de varifincia e os testes de medias feitos pelos procedimentos de GLM (General Linear Models), utilizando-se o 'Statistical Analysis System' (SAS Institute, Inc., Cary, NC, USA).
Testes de diluisio do inOculo.
Quatro folhas primarias de feijao `Manteiga', com a idade de 11-12 dias, foram inoculadas corn cada um dos 3 isolados, diluidos a 1:5, 1:10, 1:20, 1:40, 1:80, 1:160, 1:320, 1:640 e 1:1280 em tampfio fosfato mais Na2SO3. Como inOculo, usaram-se folhas de N. rustica, infetadas sistemicamente. A contagem do nOmero de lesiies
apresentadas pelas folhas primarias de feijao `Manteiga' foi feita cerca de 7-10 dias apOs a inoculacio. 0 delineamento experimental, por isolado, foi o de blocos ao acaso corn duas repeticOes, sendo a analise de variincia e os testes de medias feitos pelos procedimentos de GLM, utilizando-se o `Statistical Analysis System'.
Determinasio da concentracio do virus em 5 hospedeiras de infeccao sistimica.
Como hospedeiras de infeccio sistemica, usaram-se plantas de fumo 'TNN', N. rustica , tomate 'Angela 1-5.100', D. stramonium e pimentio 'Magda', previamente infetadas com os tres isolados de tospovirus e mantidas em condicOes de estufa (18-40°C) e de camara de crescimento (18-25°C). Foram inoculados 2 grupos de plantas por isolado de virus. Em cada condicio de temperatura foi mantido um grupo de plantas, inoculadas corn cada um dos isolados e constituido de 5 vasos de cada hospedeira. A concentracio do virus, nessas hospedeiras, foi avaliada em cinco periodos apOs a inoculacao (10, 15, 20, 25, 30 dias), utilizando-se feijao `Manteiga', como hospedeira de lesio local. Dois experimentos foram conduzidos, sendo que apenas no Ultimo deles se incluiu fumo 'TNN'.
A contagem das lesOes locais foi feita cerca de 7-10 dias apOs a inoculacao. A unidade amostral constituiu-se de uma plants corn duas folhas primarias. 0 delineamento estatistico foi o de fatorial inteiramente casualizado corn duas repeticOes, sendo a analise de varifincia e os testes de medias feitos pelos procedimentos de ANOVA e GLM do `Statistical Analysis Sistem'.
-A
C.M. Duval et al.
RESULTADOS E DISCUSSAO
Hospedeiras de multiplicaciio e distincio sorolOgica dos isolados de tospovirus.
Os tres isolados testados se mostraradinfectivos a
D. stramonium, N. rustica, tomate 'Angela' e 'Santa Cruz', fumo 'TNN' e pimentio 'Magda' e 'Ikeda'. Apenas o isolado ALD se mostrou infectivo a pimenteira CNPH 679 (Fig. 1-A), anteriormente relatada como resistente a TSWV e a PVY (Cupertino et al., 1988). ALD foi, tambem, mais virulento as duas cultivares de tomate, corn sintomas mais severos, de necrose da haste e clorose apical, do que os outros dois isolados. Diferentes grans de agressividade foram observados entre os isolados SN e ES, sendo que o segundo se mostrou menos agressivo e corn sintomas mais tardios do que o primeiro. Tal resultado sugere que ALD seja uma estirpe ou especie de virus, distinta de TSWV. Alem de TSWV, segundo de Avila et al. (1993a, 1993b), ocorrem no Brasil dois outros tospovirus (TCSV e GRSV) afetando o tomateiro.
No teste sorolOgico de imuno-difusäo dupla em agar gel, feitos corn anti-soro especifico para TSWV,
observou-se a formacio de esporio entre os isolados SN e ES (Figura 1-B), indicando distincio sorolOgica entre eles. Aparentemente, o isolado SN 6 uma especie de tospovirus, distinta de ES.
Efeito do ambiente e da idade da folha primaria de feijao `Manteiga' na formasiio de lesOes locals causadas pelos tres isolados.
A tabela 1 apresenta o efeito da idade da planta-teste sobre o rainier° de lesOes locais produzidas pelos &és isolados de tospovirus. Verifica-se, por outro lado, que as condicOes de estufa foram significativamente mais favoráveis ao aparecimento de lesOes locals do que as de camara de crescimento, o que resultou numa media de duas vezes mais lesOes em estufa (82,06) do que em cfimara de crescimento (40,47). A explicacio para este fato a que temperaturas miximas mais elevadas (18-40°C) na estufa do que em samara de crescimento (18-25°C) tenham favorecido a multiplicacio do virus nas plantas de feijäo, induzindo a formacio de maior nlimero de lesOes locais naquelas condicOes. Verificou-se, tambem, que a idade de 11 dias foi a que apresentou maior nfimero de lesOes locais, diferindo significativamente das demais. A idade de 15 dias, correspondente ao maxima de expansao das folhas primirias, foi a que apresentou o menor dimero de lesOes locais. Outrossim, tanto em estufa como em samara, os isolados ES e ALD produziram, em media, maior warner° de lesOes do que o isolado SN, do qual diferiram
significativamente; em samara de crescimento houve diferenca entre os dois primeiros, o que nio aconteceu em estufa. Comparando-se as medias dos n6meros de lesOes por idade da planta, verifica-se que houve diferencas significativas entre elas, para os mesmos isolados, sendo que, como media geral, a idade de 11 dias foi
significativamente superior as demais. Neste experimento, a Area foliar inicial, aos 11 dias de idade, foi de 76,2% da
FIG. 1- A) Sintomas de mosaico, embolhamento e defonnaciio foliar, induzidos pelo isolado ALD em pimenteira CNPH 679 (Capsicum chinense
PI 159236).
B) Testes de imunodifusiio dupla em agar gel
para determinacao do relacionamento sorolOgico entre os trés isolados:
0 = Anti-soro contra TSWV;
1 = `TNN' infetado corn o isol. ALD; 2 = N. rustica infetada corn o isol. ALD; 3 = N. rustica sadia;
4 = N. rustica infetada corn o isol. ES; 5 = N. rustica infetada corn o isol. SN;
6 = N. rustica sadia.
area final, equivalendo, pois, a 2/3 de expansio das folhas primirias indicadas por Costa (1957), como a idade mais adequada para detecceio de TSWV.
TABELA 1- Ntimero medio de lesOes locais, produzidas por folhas primririas de feijiio `Manteiga', inoculadas mecanicamente com 3 isolados de tospovirus em 2 ambientes
Ambiente Isolado
Idade da plants (dias)
11 13 15 Media**
Estufa SN 26,00" 51,75a 0,00c 0,00c 19,44E
(18-40°C) ES 98,25b 238,75a 121,75" 1,75c 115,13A
ALD 88,50" 203,50a 154,50ab 0,00° 111,63A
Media 70,92" 164,67a 92,08" 0,58c 82,06A
Camara SN 1,00a 1,50a 0,00a 0,00a 0,63c
(18-25°C) ES 156,25a 103,75ab 63,50b 32,50" 89,00A
ALD 33,00b 77,75a 16,50bc 0,00c 31,81E
Media 63,42a 61,00a 26,67" 10,83b 40,47E
Media geral 67,13b 112,83a 59,38" 5,75C 61,26
Inoculagio feita com extrato de folhas de N. rustica, infetadas sistemicamente, coletadas cerca de 12 dias apes a inoculagio. 0 extrato obtido foi diluido a 1:5 (peso/volume) em tamplo fosfato mais sulfito de sddio.
** Medias seguidas da mesma tetra maiescula na vertical ou mintiscula na horizontal nao diferem entre si, pelo teste de Duncan, ao nivel de 5% de probabilidade.
Efeito da diluicfio do inOculo.
Verificou-se (tabela 2) que, como media geral, a diluicao do inOculo influenciou significativamente o nUmero de lesOes locais, sendo a diluicao de 1:5 (365,7), superior as demais. Com relacio a cada urn dos isolados, notou-se que, para o isolado ALD, a melhor diluicao foi a de 1:5 (557,2), o mesmo ocorrendo corn o isolado ES (278,2). Pam o isolado SN, a diluicio de 1:5 (251,2) (peso/volume) nao diferiu significativamente da de 1:10 (278,2). Verificou-se, também, como media geral, que o isolado ALD produziu maior niimero de lesOes locais (146,5) do que os isolados SN (80,9) e ES (70,8). Conforme ja descrito para o virus da influenza (Nayak et al., 1985) e para evitar o efeito multiplicativo (Resende et al., 1991, 1992) das formas defectivas interferentes em relacao aos segmentos completos do L RNA dos isolados de tospovirus, de Avila (comunicacio pessoal) recomenda que as inoculacOes sejam feitas corn inOculo mais diluido (1:30 a 1:50), embora os resultados acima mostrem a superioridade das diluicOes de 1:5 e 1:10.
Efeito da temperatura e do periodo apOs a inoculactio sobre a concentrasfio dos tees isolados em cinco hospedeiras.
As condicOes do ambiente, em que foram
multiplicados os trés isolados de tospovirus, influenciaram significativamente sua concentracio nas hospedeiras (tabela 3). A concentracio do virus foi maior quando as hospedeiras foram mantidas em temperaturas amenas, variando de 18 a 25°C (99,0) do que em temperaturas mais elevadas (18-40°C)(74,6). N. rustica e fumo `TNN' mostraram, em media, ser superiores as demais
TABELA 2 - Ntimero midi° de lesties locais obtidas em folhas primarias de feijito `Manteiga' inoculadas com cada um dos 3 isolados de tospovirus, em diferentes diluisties do
Isolados ALD SN ES Media** 1:1 117,2CD 5,5cD 52,5DE 58,4D 1:5 557,2A 251,2" 278,5" 365,7A 1:10 457,2B 278,2A 123,0E 286,28 1:20 160,7C 107,28 102,0Bc 123,3c 1:40 65,5DE 76,7EC 66,7cD 69,7D
1:80 61,5DE 26,0CD 52,2ED 46,6DE
1:160 18,7E 8,2CD 235DEF 16,8EF
1:320 20,0E 3,2cD 7,7EF 10,3F
1:640 6,0E 1,5D 1,0F 2,8F
1:1280 1,2E 0,5D 0,5F 0,8F
Media 146,5a 80,9b 70,8b
* Extrato de folhas infetadas de N. rustica diluido em tampio fosfato mais sulfito de sddio.
** Medias seguidas da mesma letra maidscula na vertical ou mintiscula na horizontal nä° diferem entre si, pelo teste de Duncan, ao nivel de 5%. hospedeiras, para multiplicacio do virus. Sob condic6es de temperaturas elevadas (estufa), a concentracio do virus em fumo `TNN' (137,5) foi significativamente superior a de N. rustica (119,9). Ji em temperaturas mais amenas (camara de crescimento), nao houve diferenca entre elas. Quanto ao
C.M. Duval et al.
TABELA 3 - Concentracito dos tees isolados de tospovirus em cinco hospedeiras de infeccfio sistemica, medida pela inoculagito em fekjilo `Manteiga'
Amb. Hosp.• Isol.
Periodos (dias)**
Media*** M.G.
10 15 20 25 30
SN 104,5 , 236,5a 34,2b 20,0b 22,7b 83,6B
NR ES 179,2a 172,2a 215,5a 40,7b 18,7b 125,3A
ALD 270,0a 122,0b 69,0bc 252,0a 41,7c 150,9A
Med. 184,6a 176,9a 48,0b 162,5a 27,7b 119,9B
SN - - - -
-TA ES
232,0a
10,0b 8,0b 0,5b 7,0 515BE ALD 344,5a 7,7c 0,5c 50,2b 4,7c 81,5A
S
T Med. 288,2a 8,9b 4,2b 25,4b 5,9b 66,5C
U SN
-F DS ES 1,7a 1,5a 0,7ab 0,0b 0,2b 0,8B
A ALD 10,0a 0,0b 0,0b 0,0b 0,2b 2,0A
Med. 5,9a 0,7b 0,4b 0,0b 0,2b 1,4D SN -PM ES 40,0a 8,2b 1,0c 0,0c 0,0c 9,8A ALD 10,5a 0,0b 0,0b 0,2b 0,0b 2,1B Med. 25,2a 4,1 b 0,5c 0,1c 0,0c 6,0D SN 69,7b 139,0a 20,0b 76,2B
TNN ES 185,0ab 68,7c 115,0bc 226,7a 116,2be 142,3A
ALD 553,7a 109,0b 69,0b 52,0b 62,7b 169,3A
Med. 269,5a 105,6 bc 68,0c 139,4b 89,5c 137,5A 74,6B
SN 259,7a 247,7a 65,0b 28,5b 18,7b 123,9E
NR ES 165,7b 314,2a 294,5a 157,2b 10,0c 188,3A
ALD 589,2a 163,0b 110,7b 194,0b 30,2b 217,4A
C Med. 338,2a 241,7b 156,7c 126,6c 19,7d 176,6A
M SN
-A TA ES 218,Oa 78,0b 2,5c 5,5c 0,5c 60,9B
ALD 630,2a 1,2b 0,2b 15,5b 2,5 b 129,9A
A Med. 424,13a 39,63 b 1,4b 10,5b 1,5 b 95,43B D E DS SN ES -4,7b -18,2a -2,7bc -1,0bc 0,0c 5,3B
ALD 36,2a 1,7a 2,7bc 1,0bc 0,0b 7,7A
C Med. 20,5a 10,0b 1,4c 0,7c 0,0c 6,5C
R
SN
-E
S PM ES 1,0b 15,2a 6,0b 1,0b 0,5b 4,7A
C. ALD 17,2a 0,5b 0,0b 0,0b 0,0b 3,5A
Med. 9,1a 7,9ab 3,0ab 0,5b 0,2b 4,1C
SN 117,5a 72,0a 8,7b 66,1B
TNN ES 339,2a 143,7b 117,2b 26,0c 33,2c 131,9B
ALD 697,0a 102,3b 90,3b 135,3 b 147,5b 234,4A
Med. 384,6a 106 ,Ob 72,1b 80,6 b 90,4b 156,1 A 99,0A
* Hospedeiras: NR= N. N.rustica; TA= tomate 'Angela': DS= D. D.stramonium; PM= pimentio 'Magda' a TNN= fumo 'TNN'.
** Nfimero m6dio de lesOes locais por folha primula inoculada com extrato de folhas infetadas das respectivas hospedeiras, diluido a 1:5 (peso/volume) em tamplo fosfato mais sulfito de s6dio.
**• M6dias seguidas da mesma letra maidiscula na vertical ou mintiscula na horizontal nio diferem entre si, pelo teste de Duncan, ao nivel de 5%.
efeito do period° apOs a inoculacio sobre a concentracao do virus, verificou-se que, em estufa, nä° houve diferenca entre o 10° e o 15° dia para N. rustica, period° em que a concentracio do virus foi maxima. Em fumo `TNN'(269,5) e em tomate `Angela'(288,2), o mimero de lesOes locais no 10° dia foi, em media, significativament
►
maior do que nos demais periodos. Em camara de crescimento, N. rustica (338,2), tomate 'Angela' (424,1) e fumo (384,6), apresentaram pico de concentracio aos 10 dias apOs a inoculacao. D. stramonium e pimentio 'Magda' nao foram boas multiplicadoras dos tres isolados em ambas as condicOes de ambiente testadas, apesar de apresentarem sintomas bastante nitidos de infecrsio.Com base neste experimento, constatou-se que as melhores hospedeiras para multiplicacão do virus foramN. rustica, fumo `TNN' e tomate 'Angela'. A concentracio dos tospovirus, nessas hospedeiras, foi mais alta em condicties de temperaturas amenas (18-25°C) do que sob temperaturas elevadas (18-40°C). EmN. rustica, o pico de concentracio ocorreu entre o 10° e o 15° dia apOs a inoculacio, o que difere dos dados de Patterson et al. (1989) que apontou o period° de 7 a 10 dias, como o mais adequado para retirada do inOculo.
AGRADECIMENTOS
Agradecimentos sic) devidos ao Dr. AntOnio Carlos de Avila e a Prof' Maria Lucia R. Z. da Costa Lima pela revisio do texto e pelas sugestOes apresentadas e a André N. Dusi, pelo fornecimento do antissoro para TSWV.
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