Estudos ecogenômicos e bioprospectivos de Shewanella spp

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(1)UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE BIOCIÊNCIAS DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA CELULAR E GENÉTICA PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E BIOLOGIA MOLECULAR. Estudos Ecogenômicos e Bioprospectivos de Shewanella spp.. AMANDA LYS DOS SANTOS SILVA. NATAL-RN 2009.

(2) UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE BIOCIÊNCIAS DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA CELULAR E GENÉTICA PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E BIOLOGIA MOLECULAR. Estudos Ecogenômicos e Bioprospectivos de Shewanella spp.. AMANDA LYS DOS SANTOS SILVA Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Genética e Biologia Molecular, do Centro de Biociências da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como parte dos requisitos para a obtenção do título de Mestre em Genética e Biologia Molecular.. Orientador. Prof. Dr. Carlos Alfredo Galindo Blaha. NATAL-RN 2009.

(3) AGRADECIMENTOS. À Universidade Federal do Rio Grande do Norte, pela oportunidade de realizar o Curso de Pós-Graduação em Genética e Biologia Molecular. Ao CT-PETRO/CNPq pelo financiamento do projeto, e CAPES, pela concessão da bolsa de estudos. Ao Prof. Dr. Carlos A. Galindo Blaha, que felizmente aceitou ser meu orientador. Muito obrigada pela oportunidade, otimismo, apoio, amizade e exemplo de profissionalismo. Às pessoas que compõem o Laboratório de Biologia Molecular e Genômica, pelo auxílio estrutural na realização do projeto. Ao Departamento de Microbiologia e Parasitologia do CB-UFRN na pessoa da Profa. Dra. Rocely de Vasconcellos Meissner pela disponibilidade de seu laboratório. À minha mãe, pela confiança e investimento. Seu apoio foi fundamental na decisão de fazer o curso. À minha família e aos amigos que torceram de longe, em especial Ana Maria Q. López, pelos conselhos e incentivo na seleção do curso, e estímulo para continuá-lo. Aos amigos que torceram de perto, especialmente Carlos, Magda, Carvalho, Bruno e as “meninas” do PCS - minha família em Natal. À amiga e colega de profissão, Angélica Gaag, pelo companheirismo, caronas e bom-humor quando tudo parecia não ir tão bem. Muito obrigada! Aos demais colegas de turma, pelo compartilhamento de idéias, leituras de artigos, crescimento profissional e convivência. À secretária do PPG-GBM, Leila Maria J. Silva, pela sempre disposição em ajudar. A todos que, direta ou indiretamente, contribuíram para a execução deste trabalho..

(4) RESUMO. Bactérias dos gêneros Shewanella e Geobacter são os microrganismos redutores de ferro mais estudados. Esse interesse ocorre particularmente devido aos seus sistemas de transporte de elétrons e contribuição em alguns problemas industriais e ambientais, tais como corrosão de oIeodutos, bioenergia e biorremediação de locais contaminados com petróleo. O presente estudo foi tocado em duas partes: a primeira é um estudo ecogenômico comparativo de ShewanelIa spp. com genomas seqüenciados, e a segunda é um trabalho metagenômico experimental para detectar Shewanella redutoras de ferro através de PCR-DGGE de um gene metabólico. O estudo in silico resultou em correlação positiva entre o número de cópias 16S rDNA e tamanho do genoma em ShewaneIla spp., com agrupamentos de rrn. próximo à origem de replicação. Desta maneira, o gênero é inferido como oportunista. Não existem genomas compactos e o tamanho de suas sequências variam de 4306142 nt em S. amazonensis SB2B até 5935403 nt em S. woodyi ATCC 51908, sem correlação com a faixa de temperatura característica de cada espécie. Sequências intragenômicas de 16S rDNA possuem pouca divergência. mas razoável para resultar em diferentes árvores filogenéticas. dependendo da sequência que é escolhida para comparação. Para a detecção moIecuIar de ShewanelIa redutoras de ferro, é proposto o gene mtrB como um novo biomarcador, por ser codante de uma proteína fundamental na reduçao de Fe (III). Os primers específicos foram desenhados e avaliados in silico e resultou em um fragmento de 360 pb. No segundo estudo, esses primers foram testados em . amostra genômica de S. oneidensis MR-1, amplificando a região esperada. Depois desse resultado favorável, o par de primers foi utilizado como ferramenta para acessar as comunidades redutoras de ferro do gênero ShewanelIa sob um stress ambiental contaminação com óleo cru em sedimento de mangue, no Estado do Grande do Norte (Brasil). Os primers apresentaram alta especificidade e as reações resultaram em banda única de amplificação das amostras metagenômicas. O perfil obtido no DGGE revelou variação temporal de ShewanelIa spp. nas amostras analisadas. Os resultados apresentados mostram a defecção de um grupo de microrganismos biotecnologicamente importante. ShewaneIla spp. redutoras de ferro, usando um gene metabólico como alvo. Concluiu-se que existem oito ou mais sequências 16S rDNA no gênero ShewaneIla, com pouca divergência entre elas que afetam a filogenia; o par de primers desenhados para amplificar sequências mtrB é uma alternativa viável para detectar Shewanella redutoras de ferro em abordagens metagenômicas; tais bactérias estão presentes no sedimento de mangue analisado, com variações temporais nas amostras. Este é o primeiro estudo experimental que examina Shewanella redutoras de ferro em um experimento metagenômico de sedimento de mangue submetido a contaminação por óleo através de um gene metabólico. Palavras-chave: Shewanella; Redução de ferro; Metagenômica; Ecogenômica..

(5) ABSTRACT Bacteria trom Shewanella and Geobacter ganera are the most studied ironreducing microorganisms particularly due to their electron transport systems and contribution to some industrial and environmental problems, including steel corrosion, bioenergy and bioremediation of petroleum-impacted sites. The present study was focused in two ways: the first is an in silico comparative ecogenomic study of Shewanella spp. with sequenced genomes, and the second is an experimental metagenomic work to detect iron-reducing Shewanella through PCRDGGE of a metabolic gene. The in silico study resulted in positive correIation between copy number of 16S rDNA and genome size in Shewanella spp., with clusters of rrn near lhe origin of replication. This way, the genus is inferred as opportunist. There are no compact genomes and their sequences length varied, ranging from 4306142 nt in S. amazonensis SB2B to 5935403 nt in S. woodyi ATCC 51908, without correIation to temperature range characteristic of each specie. Intragenomic 16S rDNA sequences possess little divergence, but reasonable to resuIt in different phyIogenetic trees, depending on the sequence that is chosen to compare. For moIecuIar detection of iron-reducing Shewanella, it is proposed the mtrB gene as new biomarker. because it codes to a fundamental protein at Fe (III)-reduction. The specific primers were designed and evaluated in silico and resulted in a fragment of 360 pb. In the second study, these primers were tested in a genomic sample from S. oneidensis MR-1, amplifying the expected region. After this successfuI resuIt, the primer set was used as a tool to assess the iron-reducing communities of ShewaneIla genus under an environmental stress, i.e. crude oil contamination in mangrove sediment in Rio Grande do Norte State (Brazil). The primers presented high specificity and the reactions performed resulted in one single band of ampIification in the metagenomic samples. The fingerprinting obtained at DGGE reveaIed temporal variation of Shewanella spp. in analyzed samples. The resuIts presented show the detection of a biotechnological important group of microorganisms, the iron-reducing Shewanella spp. using a metabolic gane as target. It is concluded there are eight or more 16S rDNA sequences in Shewanella genus, with little divergence among them that affects the phylogeny; the pair of primers designed to ampIify mtrB sequences is a viable alternative to detect iron-reducing ShewanelIa in metagenomic approaches; such bacteria are present in the mangrove sediment anaIyzed, with temporal variations in the samples. This is the first experimental study that screened the iron-reducing Shewanella genus in a metagenomic experiment of mangrove sediments subjected to oil contamination through a key metabolic gene.. Key-words: Shewanella; Iron-reducing; Metagenomic; Ecogenomic..

(6) SUMÁRIO. LISTA DE FIGURAS ................................................................................................. IV LISTA DE TABELAS ................................................................................................. V LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS ................................................................... VI RESUMO.................................................................................................................. VII ABSTRACT............................................................................................................. VIII 1. INTRODUÇÃO GERAL........................................................................................... 1 1.1. Redução Dissimilatória do Ferro ....................................................................... 1 1.2. Shewanella e Ambientes com Petróleo ............................................................ 5 1.3. Potencial Biotecnológico de Shewanella spp.................................................... 6 1.4. Ecogenômica .................................................................................................... 8 2. OBJETIVOS.......................................................................................................... 10 3. RESULTADOS...................................................................................................... 11 Capítulo I – PAPER “Comparative Genomic Analyses in Sequenced Shewanella strains” ................................................................................................................... 11 Summary ............................................................................................................... 12 Introduction ............................................................................................................ 13 Results and discussion .......................................................................................... 14 Acknowledgments .................................................................................................. 26 Experimental Procedures....................................................................................... 31 Capítulo II – BRIEF REPORT “Detection of Shewanella through a Metabolic Gene in Mangrove Sediment, Brazil” ............................................................................... 32 Summary ............................................................................................................... 29 Introduction ............................................................................................................ 34 Results ................................................................................................................... 35 Acknowledgments .................................................................................................. 37 4. CONCLUSÕES GERAIS E PERSPECTIVAS ...................................................... 37 5. REFERÊNCIAS ..................................................................................................... 38 5.1 Introdução ...................................................................................................... 39 5.2 Capítulo I ........................................................................................................ 42 5.3. Capíulo II ........................................................................................................ 45 ANEXOS ................................................................................................................... 46.

(7) LISTA DE FIGURAS Figura 1. Ciclo biogeoquímico do ferro (adaptado de Schröder et al. 2003). ............. 1 Figura 2. Modelos de respiração extracelular (adaptado de Gralnick e Newman, 2007). .......................................................................................................................... 2 Figura 3. Transferência extracelular de elétrons em Shewanella oneidensis MR-1 (Fredrickson et al., 2008)............................................................................................. 4 Figura 4. Bacia Petrolífera Potiguar. Localizada no Nordeste brasileiro, compreende o Estado do Rio Grande do Norte e uma parte do Ceará. .......................................... 7. iv.

(8) LISTA DE TABELAS Tabela 1. Códigos de acesso (GenBank) das espécies de Shewanella com genomas seqüenciados utilizadas no presente estudo............................................................... 9. v.

(9) LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS DGGE: eletroforese em gel com gradiente de desnaturação DIR: redutor dissimilatório de ferro DNA: ácido desoxirribonucléico DOE: Departamento de Energia dos Estados Unidos GC: conteúdo GC (gGC= do genoma; 16GC= da sequência 16S rDNA) ITS: espaço interno transcrito NCBI: Centro Nacional para Informação Biotecnológica MtrB: proteína precursora da membrana externa nt: nucleotídeo ori: origem de replicação pb: pares de bases PCR: reação em cadeia da polimerase rDNA: DNA ribossomal RNA: ácido ribonucléico rrn: operon ribossomal tRNA: RNA transportador (tRNA-ala: de alanina; tRNA-ile: de isoleucina). vi.

(10) 1. 1. IN NTRODU UÇÃO GE ERAL 1.1.. Reduçã ão Dissim milatória do Ferro o Um doss elemento os mais ab bundantes na crosta terrestre é o ferro (Nealson e Saffa arini, 199 94), e sua ciclag gem cons siste princcipalmente e de rea ações de e óxido o-redução (Figura 1, 1 adaptad do de Sch hröder et al. 2003). A contrib buição doss micrrorganismo os para a oxidação o do Fe (II) não é destaca ada porque o ferro o gera almente oxxida rapida amente na a ausência a de seress vivos (W Weber et al., a 2006), preccipitando no o ambiente e (Schröde er et al. 2003). Devid do à insolub bilidade de esse metall em pH p neutro, a maneira a abiótica foi, f por mu uito tempo, considera ada a princ cipal e até é mesmo a únicca forma de d reduzir Fe (III), po ois acredittava-se qu ue o ferro só estaria a biodisponível se s estivessse solúvel (Lovley, 19 991).. Figurra 1. Ciclo biiogeoquímico o do ferro (adaptado de Schröder S et al. a 2003).. Atualme ente, sabe--se que a redução do o ferro (so olúvel ou nã ão) é útil em e um doss dois eventos do d metabo olismo microbiano: assimilação a o – permite e que o fe erro esteja a dispo onível para sua in ncorporaçã ão em prroteínas; e dissimilação – como um m meccanismo de e geração o de energ gia (Lovley y, 1991). Devido ao o intenso e diverso o meta abolismo, ao peque eno tamanho, à in nteração com c os m metais no ambiente e circu undante e à utilização o de metal como coffator (Myerrs e Myerss, 1992; Orren, 2004), está claro que e os micro organismoss são os principais p r responsáve eis pela re edução do o.

(11) 2. ferro. Esse processo é, então, uma das mais importantes mudanças geoquímicas do planeta (Lovley 1991, Myers e Myers, 2003; Methé et al., 2005), além de constituir uma enorme reserva de potencial biotecnológico, como por exemplo, na biorremediação e geração de energia elétrica a partir da oxidação da matéria orgânica (Oren, 2004). Na maioria dos habitats, o pH é neutro, e portanto, a redução biótica do Fe (III) deve ocorrer extracelularmente, isto é, os elétrons derivados da oxidação dos doadores de elétrons são transferidos até a superfície externa da célula para reduzir o aceptor de elétrons terminal (o substrato insolúvel) (Lovley, 2008). Em algumas bactérias, a redução de Fe (III) é constitutiva, como reportado por Vargas et al. (1998). Ou seja, os organismos reduzem o ferro mesmo cultivado na presença de outros aceptores de elétrons. A interação microrganismo-substrato acontece de várias maneiras, com ou sem especificidade, mas geralmente é espécie-dependente (Ledin, 2000; Newman e Banfield, 2002; Macalady e Banfield, 2003). Entretanto, apesar de todo o esforço para compreender a microbiologia da redução de metais, as estratégias pelos quais os microrganismos respiram extracelularmente ainda são pouco compreendidas (Leang et al., 2005; Gralnick e Newman 2007; Shi et al., 2007), e alguns mecanismos têm sido propostos (Figura 2, adaptado de Gralnick e Newman, 2007).. Figura 2. Modelos de respiração extracelular (adaptado de Gralnick e Newman, 2007). Nessas figuras, o substrato Fe (III) é representado como um retângulo e o seu produto reduzido, Fe (II), como um círculo (o). Em A, célula em contato direto com o substrato. B, um apêndice celular (pili) forma uma ponte entre a célula e o substrato. C e D: a célula libera uma pequena molécula (quelante, C) ou carregador de elétrons (D)..

(12) 3. Em artigo publicado em 2001, Hernandez e Newman afirmaram que as razões principais pelas quais a compreensão do nível molecular da redução de metais ainda não ter sido elucidada são: o envolvimento de muitos fatores (química do ambiente e estratégias espécie-específicas de transferência de elétrons) e a pouca. quantidade. de. genomas. de. microrganismos. redutores. de. metais. sequenciados (apenas dois, na época). A. capacidade. dissimilatória. do. ferro. já. foi. descrita. em. diversos. microrganismos (desde psicrofílicos, mesofílicos até hipertermofílicos), dos domínios Archaea e Bacteria (Liu et al., 1997; Slobodkin et al., 1999; Head et al., 2003; Handelsman, 2004; Hamamura et al., 2006; Weber et al., 2006; Lin et al., 2007). Além do ferro, podem reduzir outros metais, como cobalto, vanádio, urânio e manganês (Marshall et al., 2006). Tais organismos também reduzem uma grande variedade de substratos orgânicos e inorgânicos, incluindo fumarato, nitrato, nitrito e tiossulfato. Essa diversidade estimula a pesquisa a fim de determinar as atividades metabólicas dos organismos envolvidos na redução do ferro e importantes descobertas têm resultado de um crescente esforço para estudar estes microrganismos no contexto de seus ambientes (Lovley, 1991; Macalady e Banfield, 2003; Myers e Myers, 2003; von Canstein et al., 2008). Em ambientes aquáticos, sedimentos e solos, ocorre abundância de manganês e óxidos de ferro e, portanto, microrganismos redutores de metais devem contribuir para a solubilização redutiva dos substratos presentes. Embora vários microrganismos possam servir como modelos na redução de Fe (III) (Lovley, 1993), Geobacter e Shewanella são os gêneros redutores de ferro mais investigados (Childers et al., 2002; Lloyd, 2003; Lee e Newman, 2003; Myers e Myers, 2003; Leang et al., 2005; Weber et al., 2006; Shelobolina et al., 2007). Os trabalhos de Myers e Myers (2003), Leang et al. (2005), Marshall et al. (2006) e de Shelobolina et al. (2007) sugerem a existência de vias comuns e diferenciadas de transferência de elétrons em Geobacter e Shewanella. Nos dois gêneros, as estratégias utilizadas para transferir elétrons mostram-se bem conservadas (Shi et al., 2007), e neste estudo enfatiza-se a família Shewanellaceae. Shewanella oneidensis (antiga Alteromonas putrefaciens) MR-1 é uma bactéria Gram-negativa, anaeróbica facultativa, com grande diversidade respiratória, cujos componentes da cadeia de transporte de elétrons entram em contato direto.

(13) 4. com o ambien nte extrace elular (Myyers e Mye ers, 1992)). Seu gen noma foi totalmente t e sequ uenciado por p Heidelb berg et al. (2002), e desde entã ão, outros genomas da família a Shew wanellacea ae vêm se endo seqüe enciados para p melho or entendim mento dos processoss resp piratórios desses d miccrorganism mos. Citocrromos do tipo-c liga ados à me embrana e pressentes no periplasm ma que pa articipam diretamentte do tran nsporte de e elétronss nece essários para a redu ução do fe erro são: CymA, C MtrA, MtrC ((ou OmcB) e OmcA A (Mye ers e Myers, 2003; Maier e Myers, M 200 04; Methé et al., 200 05; Shi et al., 2007; Rosss et al., 2007; 2 Fred drickson ett al., 2008 8) (Figura 3), sendo o OmcB a principall redu utase (Borlo oo et al., 2007). 2. Figurra 3. Transfe erência extra acelular de elétrons e em Shewanella S oneidensis M MR-1 (Fredrickson et al.,, 2008). Elétrons transferido os para menaquinona m o repassad dos para CymA, C que e (MQ) são subse equentemente os transfe ere para MtrA A. Esse citoc cromo, facilita ado por MtrB B, transfere elétrons e para a OmcA A/OmcB (ou u MtrC, com mo apresenta ado na ilustração), loca alizados na membrana externa. S.. oneid densis MR-1 e outras esspécies de Shewanella S ta ambém têm sido mostra adas com capacidade de e expellir flavinas que q podem carregar os o elétrons dos citocrom mos na sup perfície celu ular para oss acepttores externo os de elétron ns.. A proteína MtrB funciona f co omo um centro c orga anizador esssencial na redução o de Fe F (III), po ois facilita a transfe erência de e elétrons de MtrA no peripla asma para a OmccB/OmcA (Shi ( et al., 2007), alé ém de ser a proteína a responsá ável pela lo ocalização o apro opriada. d dos citocro omos OmccB/OmcA na superffície celula ar (Myers e Myers,. 2002 2). Sem MtrB, M a bactéria não o utiliza ferrro como aceptor de e elétrons. OmcA e.

(14) 5. OmcB, proteínas com sobreposições de funções (Myers e Myers, 2003), são sintetizadas no citoplasma e processadas no periplasma (Heidlberg et al., 2002). De acordo com Shi et al. (2007), esses dois citocromos formam entre si um complexo de alta afinidade. Os resultados de Ross et al. (2007), por sua vez, sugerem que a interação OmcA/OmcB é baixa e requer estudos posteriores que comprovem em quais situações essas duas proteínas podem ser consideradas uma unidade funcional.. 1.2. Shewanella e Ambientes com Petróleo Shewanella spp. têm sido encontradas em ambientes extremos e variados (Hau e Gralnick, 2007), inclusive em experimentos metagenômicos utilizando microcosmos incubados em baixas temperaturas e em locais com histórico de contaminação por petróleo (Gerdes et al., 2005; Deppe et al., 2005). A detecção de Shewanella spp. em ambientes inóspitos tem importante aplicação quando se estuda não apenas a microbiologia autóctone de reservatórios de petróleo (Magot et al., 2000; Newman e Banfield, 2002; Lovley, 2003), processos de corrosão de oleodutos (Lee e Newman, 2003; Marsili et al., 2008), biodegradação do petróleo (Magot et al., 2000) e principalmente o efeito da contaminação na comunidade microbiana após sua derramamento de petróleo e seus derivados (Duarte et al., 2001; Yoshida et al., 2006), já que mudanças nas populações microbianas podem ser utilizadas como indicadores de pertubação ambiental (Macalady e Banfield, 2003). Como as características físico-químicas do petróleo não são favoráveis ao crescimento da maioria dos seres vivos, devido entre outros fatores, à presença de metais tóxicos e limitação do número de aceptores/doadores de elétrons (Magot et al., 2000; Newman e Banfield, 2002), não são todos os microrganismos que toleram as condições e sobrevivem na presença desse contaminante. Adicionalmente, a biodegradação do petróleo em solo e sedimentos deve ser limitada ao metabolismo microbiano anaeróbico (Head et al., 2003). Dessa maneira, acredita-se que as estruturas de comunidades microbianas são mais simples em tais ambientes e, sendo o ferro muito abundante no subsolo, a redução desse metal deve ser uma característica. comum. compartilhada. por. uma. grande. quantidade. dos.

(15) 6. microrganismos presentes, incluindo Shewanella spp. (Slobodkin et al., 1999; Röling et al., 2003; Lovley, 2003; Lloyd, 2003; Methé et al., 2005).. 1.3. Potencial Biotecnológico de Shewanella spp. A habilidade de Shewanella em sobreviver em diferentes temperaturas, aliada com a sua notável diversidade respiratória, faz desse gênero o alvo de intensas investigações (Weber et al., 2006; Marsili et al., 2008). A transferência de elétrons extracelularmente para minerais tem sido apontada como um meio efetivo de imobilização de contaminantes (Beliaev et al., 2005; Lovley, 2008). A biorremediação de ambientes contaminados utilizando Shewanella spp. é, assim, uma alternativa para a indústria (Brigé et al., 2008). Mais recentemente, o foco tem sido as pesquisas com célula de combustível microbiana. Ou seja, a transferência de elétrons de bactérias para materiais condutores (Marsili et al., 2008). O princípio desse tipo de geração de energia alternativa consiste em cultivar bactérias numa câmara anaeróbica com poluentes orgânicos, sobre uma superfície sólida condutora, que serve como um eletrodo. Após oxidar a matéria orgânica, as bactérias transferem elétrons para o ânodo, e finalmente para o cátodo, gerando energia elétrica (Hau e Gralnick, 2007). Acerca do conhecimento da dinâmica microbiana após contaminação do ambiente circundante por petróleo e/ou derivados, muito do nosso conhecimento atual é limitado aos microrganismos que são cultivados in vitro (Macalady e Banfield, 2003; Handelsman, 2004). Entretanto, o estudo baseado em cultura fornece acesso apenas para uma pequena parte das comunidades microbianas presentes. A metagenômica, por sua vez, tem o desafio de ligar a informação genética com o organismo ou ecossistema do qual o material genético foi isolado (Handelsman, 2004). Num local sob risco de derramamento de óleo, por exemplo, informações prévias sobre o comportamento das populações microbianas (cultiváveis ou não) são de suma importância para determinar a estratégia de biorremediação local. Os ambientes que podem ser atingidos diretamente, caso ocorra derramamento de petróleo no Rio Grande do Norte, por exemplo, compreendem a caatinga e o mangue, ambientes localizados na Bacia Petrolífera Potiguar (Figura 4)..

(16) 7. Figurra 4. Bacia Petrolífera P Po otiguar. Loca alizada no No ordeste brasileiro, comprreende o Esttado do Rio Grande do Norte e uma parte e do Ceará.. Os man nguezais são s algunss dos ecos ssistemas mais prod dutivos da natureza, por isso, a inffluência do o petróleo nas comu unidades microbiana as do sedimento de e man ngue de Diogo D Lop pes (Maca au-RN) vem sendo estudada desde 2006, 2 com m resu ultados prromissoress na dettecção metagenômiica de g grupos microbianoss utilizzando gene es metabó ólicos (Blaha et al., 2007). 2 E embora e alg guns estud dos sejam m divergentes em m relação à real co ontribuição in situ de e espéciess de Shew wanella na a redu ução de Fe F (III) (We eber et all., 2006; Lin et al.,, 2007), a sua dete ecção em m amb bientes con ntaminadoss e/ou sob b risco de contaminaç c ção por óle eo é releva ante. Com m essa a visão, o Departame ento de En nergia dos Estados Unidos U (DO OE) tem in ncentivado o o seqüenciame ento genôm mico de divversas linh hagens de Shewanellla (Heidelb berg et al., 2002 2), assim como im mportantes estudos relaciona ados ao m metabolism mo de S. oneiidensis MR R-1 (Myers e Myerss, 1992; Beliaev B et al., 2005;; Fredricks son et al., 2008 8) para re emediar os locais contaminad c dos pela instituição. Há inclu usive uma a orga anização multidiscipli m inar de pe esquisadorres, denom minada Fed deração Shewanella S a (http p://www.shewanella.o org/), apoia ado pelo DOE, D que integra esstudos de biologia e geno oma desse e gênero. Esses E fatoss permitem m a realização de análises com mparativas, tanto o no nívell genômico o, proteôm mico como o ecológico o (Makaro ova e Koonin, 2005, Ward e Fraserr, 2005)..

(17) 8. Como o ferro é abundante no ambiente, a redução dissimilatória do ferro tem impacto ambiental maior do que a redução microbiológica de qualquer outro metal, por isso a necessidade de estudos mais intensos sobre as bactérias redutoras de Fe (III) foi enfatizada por Lovley na sua publicação de 1993. A oportunidade de estudá-las através de análises genômicas foi destacada na revisão de Lloyd (2003).. 1.4. Ecogenômica Ecogenômica é a aplicação de técnicas moleculares na ecologia. Essa área de pesquisa define biodiversidade baseada nos ácidos nucléicos e usa esse conhecimento para quantificar as funções e interações dos organismos no ecossistema, relacionando-os aos processos ecológicos e evolutivos (Carter, 2007). De acordo com Doney et al. (2004), as questões de maior relevância que podem resultar da pesquisa ecogenômica compreendem as relações entre a genômica microbiana, variabilidade ambiental, estrutura de comunidades e ciclagem biogeoquímica. Estudos ecogenômicos in silico podem ser realizados em qualquer organismo cujo genoma esteja completamente sequenciado, e as pesquisas acontecem de maneira experimental e/ou utilizando ferramentas de bioinformática. A crescente disponibilidade de dados genômicos de várias linhagens de uma mesma espécie permite realizar estudos quantitativos de relações genômicas (Ward e Fraser, 2005), o que é totalmente aplicável às linhagens de Shewanella. É provável que o acúmulo de diversos dados genômicos, tanto de isolados cultivados como de fontes metagenômicas, confirme teorias e revele outras informações que hoje são categorizadas como exceções sobre as capacidades de determinados grupos de microrganismos (Macalady e Banfield, 2003; Ward e Fraser, 2005). Heidelberg et al. (2002) por exemplo, analisando o genoma de. Shewanella. oneidensis MR-1, documentaram vias metabólicas para açúcares que nunca tinham sido observadas em culturas puras até então. Já Beliaev et al. (2005) compararam padrões de expressão de mRNA de Shewanella oneidensis MR-1 expostas a diferentes aceptores de elétrons (metais e não-metais) utilizando microarranjos de DNA do genoma inteiro. Aliar essas informações ao ambiente no qual o organismo se insere é o desafio da ecogenômica. O crescente banco de dados de genomas completamente seqüenciados permite uma análise mais acurada de grupos específicos de microrganismos.

(18) 9. (Boucher et al., 2004; de Vries et al., 2006), especialmente em relação aos padrões de divergência inter- e intragenômica (Acinas et al., 2004; Boucher et al., 2004). Desse modo, a investigação ecológica, análise genômica e detecção ambiental de microrganismos redutores de Fe (III) podem resultar no entendimento dos papéis de cada gênero de bactéria redutora desse metal em diversos nichos geoquímicos (Nealson et al., 2002). Baseado nos itens abordados sobre a importância de realizar estudos microbianos de Shewanella redutoras de Fe (III), o presente trabalho ocorreu em duas etapas. Primeiramente, foram realizados estudos de ecogenômica in silico com dados genômicos de todas as linhagens seqüenciadas de Shewanella disponíveis no. GenBank-NCBI. (USA). (Tabela. 1).. Posteriormente,. realizou-se. estudo. experimental utilizando métodos moleculares independentes de cultivo com amostras de metagenoma de um ambiente sem histórico de contaminação com petróleo e/ou derivados, porém provenientes da área de influência da indústria de Petróleo e Gás no estado do Rio Grande do Norte, para verificar a ocorrência de Shewanella redutores de Fe(III) naquele ambiente. Tabela 1. Códigos de Acesso (GenBank) das espécies de Shewanella com genomas seqüenciados utilizadas no presente estudo..

(19) 10. 2. OBJETIVOS Este trabalho foi realizado com o intuito de estudar microrganismos redutores de Fe (III) do gênero Shewanella, nativos da área de influencia de atividades petrolíferas no Rio Grande do Norte, Brasil, utilizando duas abordagens: 1) Realizar estudos ecogenômicos in silico nos genomas completamente seqüenciados de Shewanella spp para a escolha de um novo biomarcador molecular; 2) Estabelecer uma metodologia de PCR-DGGE para detecção molecular de Shewanella spp. redutores de Fe (III) em amostras de metagenoma..

(20) 39. 5. REFERÊNCIAS 5.1 Introdução Beliaev, A., Klingeman, D., Klappenbach, J., Wu, L., Romine, M., Tiedje, J., Nealson, K. et al. (2005). Global transcriptome analysis of Shewanella oneidensis MR-1 exposed to different terminal electron acceptors. J Bacteriol 187 (20): 7138– 7145. Borloo, J., Vergauwen, B., de Smet, L., Brigé, A., Motte, B., Devreese, B. e van Beeumen, J. (2007). A kinetic approach to the dependence of dissimilatory metal reduction by Shewanella oneidensis MR-1 on the outer membrane cytochromes c OmcA and OmcB. FEBS J 274: 3728–3738. Childers, S., Ciufo, S. e Lovley, D. (2002). Geobacter metallireducens accesses insoluble Fe(III) oxide by chemotaxis. Nature 416: 767-769. Deppe, U., Richnow, H., Michaelis e W., Antranikian, G. (2005). Degradation of crude oil by an arctic microbial consortium. Extremophiles 9(6): 461-70. Duarte, G., Rosado, A. Seldin, L. Araujo, W. e van Elsas, J. (2001). Analysis of bacterial community structure in sulfurous-oil-containing soils and detection of species carrying dibenzothiophene desulfurization (dsz) genes. Appl Environ Microbiol 67 (3): 1052–1062. Fredrickson, J., Romine, M., Beliaev, A., Auchtung, J., Driscoll, M., Gardner, T., Nealson,K. et al. (2008). Towards environmental systems biology of Shewanella. Nature Rev. 6: 592-603. Gerdes, B., Brinkmeyer, R. Dieckmann, G. e Helmke, E. (2005). Influence of crude oil on changes of bacterial communities in arctic sea-ice. FEMS Microbiol Ecol 53: 129–139 Gralnick, J. e Newman, D. (2007). Extracellular Respiration. Mol Microbiol 65(1): 1– 11. Hamamura,N., Olson, S., Ward, D. e Inskeep, W. (2006). Microbial population dynamics associated with crude-oil biodegradation in diverse soils. Appl Environ Microbiol 72: 6316–6324. Handelsman, J. (2004). Metagenomics: application of genomics to uncultured microorganisms. Microbiol Mol Biol Rev 68: 669–685. Head, I.M., Jones, D.M. e Larter, S.R. (2003). Biological activity in the deep subsurface and the origin of heavy oil. Nature 426:344-352..

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(28) 47. ANEXOS.

(29) 48.

(30) 49. Montagem dos Microcosmos e Coleta de Amostras. Figura 1. Esquema da montagem dos microcosmos de sedimento de mangue.. Extração de Ácidos Nucléicos. PCR. DGGE.

(31)