Rastreio Pré-Natal de Aneuploidias

M

ONOGRAFIA

R

ASTREIO PRÉ

-

NATAL DE ANEUPLOIDIAS

Monografia apresentada à Universidade do Porto para cumprimento dos

requisitos necessários à obtenção do Grau de Mestre em Análises Clínicas.

Trabalho realizado sob a orientação da

Professora Doutora Georgina Correia da Silva.

Filipa Rafaela Marques Martins

ii

D

Eu, Filipa Rafaela Marques Martins, abaixo assinado, nº up201607925, aluna do Mestrado em Análises Clínicas da Faculdade de Farmácia da Universidade do Porto, declaro ter atuado com absoluta integridade na elaboração deste documento.

Nesse sentido, confirmo que NÃO incorri em plágio (ato pelo qual um individuo, mesmo por omissão, assume a autoria de um determinado trabalho intelectual ou partes dele). Mais declaro que todas as frases que retirei de trabalhos anteriores pertencentes a outros autores foram referenciadas ou redigidas com novas palavras, tendo neste caso colocado a citação da fonte bibliográfica.

Faculdade de Farmácia da Universidade do Porto, 28 de setembro de 2018,

iii

A

À minha família por sempre me apoiar e permitir que me formasse naquilo que desejava.

Ao meu namorado, amigos mais próximos e colegas de Mestrado pelos bons momentos e por me acompanharem durante todo este processo.

A todos os Professores com que me cruzei ao longo do meu percurso escolar e académico, pelos seus muitos ensinamentos. À Diretora deste Mestrado, a Professora Doutora Maria de São José Garcia Alexandre, pelo apoio, formação e informação que ao longo destes dois anos deu. De uma forma especial, agradeço à orientadora desta monografia, a Professora Doutora Georgina Correia da Silva, pelos seus conselhos, disponibilidade, sabedoria, cuidado e interesse pelo tema que escolhi desenvolver.

A toda a equipa do Serviço de Patologia Clínica do Centro Hospitalar do Médio Ave, E.P.E, unidade de Vila Nova de Famalicão. Em particular, à sua Diretora Técnica, a Dra. Helena Ferreira da Silva, pela oportunidade de estágio; a todos os Técnicos que me acompanharam e aos Drs. Ezequiel Moreira, Maria João Lopes, Mara Barreto e Olena Khytrych pelo companheirismo e conhecimentos nas diversas áreas. Por fim, um agradecimento ao Dr. Pedro Vale, orientador do estágio, pelas suas lições, boa disposição, ajuda e pela pessoa dedicada que sempre foi comigo.

iv

R

As células humanas apresentam 46 cromossomas, sendo 22 pares de autossomas e 1 par de cromossomas sexuais. Uma célula ou organismo que possui o número de cromossomas normal para a sua espécie diz-se ser euplóide. Erros na mitose ou meiose geram células aneuplóides. Em humanos, as aneuploidias autossómicas viáveis mais frequentes são as trissomias 13, 18 e 21.

O rastreio pré-natal permite identificar mulheres com risco significativo ter um feto portador de uma aneuploidia, de modo a beneficiarem de testes de diagnóstico adicionais. Pelo contrário, o diagnóstico pré-natal determina se o feto é, efetivamente, portador ou não dessa anomalia cromossómica.

O rastreio pré-natal pode basear-se na idade materna, nos exames ecográficos e nos marcadores bioquímicos avaliados no soro materno no primeiro e segundo trimestres como a proteína plasmática associada à gravidez, gonadotrofina coriónica, alfa-fetoproteína, inibina-A e estriol não conjugado). O teste combinado permite um aumento da taxa de deteção e redução dos falsos positivos.

O diagnóstico pré-natal convencional, apesar de vantajoso, é invasivo (amniocentese ou biópsia das vilosidades coriónicas) e acarreta risco de perda fetal, o que é uma preocupação para as gestantes.

O estudo e desenvolvimento do teste pré-natal não Invasivo (NIPT) com base na análise do DNA fetal livre no sangue materno (cfDNA) tem revelado as suas várias potencialidades, podendo vir a ser uma alternativa aos métodos convencionais num futuro próximo.

Neste trabalho pretende-se abordar algumas dos critérios utilizados no rastreio e diagnóstico pré-natal e comparar as formas de rastreio atualmente disponíveis com as alternativas emergentes.

P

-

:

v

A

.

Human cells have 46 chromosomes, 22 pairs of autosomes and 1 pair of sex chromosomes. A cell or organism that has the normal number of chromosomes for its species is said to be euploid. Errors in mitosis or meiosis generate aneuploid cells. In humans, viable autosomal aneuploidies are trisomies 13, 18 and 21.

Prenatal screening allows the identification of women at significant risk of having a fetus with an aneuploidy, in order to be given additional tests. On the contrary, prenatal diagnosis determines whether or not the fetus has actually a chromossomal anomaly.

Prenatal screening may be based on maternal age, ultrasound examinations, and biochemical markers assessed in maternal serum in the first and second trimesters, such as pregnancy-associated plasma protein, chorionic gonadotrophin, alpha-fetoprotein, inhibin-A and non- conjugated estriol).

The combined test allows an increased rate of detection and reduction of false positives.

Conventional prenatal diagnosis, although advantageous, is invasive (amniocentesis or chorionic villus biopsy) and carries a risk of fetal loss, which is a concern for pregnant women.

The study and development of noninvasive prenatal testing (NIPT) of free fetal DNA (cfDNA) in maternal blood have revealed its various potentialities and may be an alternative to conventional methods in the near future.

In this work it was intend to address some of the criteria used in screening and prenatal diagnosis and to compare the screening methods currently available with emerging alternatives.

KEY WORDS: Prenatal screening, prenatal diagnosis, non-invasive prenatal test,

vi

Í

2.CONCEITOS DE RASTREIO E DIAGNÓSTICO PRÉ-NATAL ... 3

3.MARCADORES BIOQUÍMICOS DO BEM-ESTAR FETAL NO SORO MATERNO ... 5

3.1.GONADOTROFINA CORIÓNICA ... 6

3.2.PAPP-A ... 7

3.3.ALFA-FETOPROTEÍNA (Α-FP) ... 8

3.4.ESTROGÉNIOS ... 9

3.5.INIBINA-A ... 10

4.ANEUPLOIDIAS MAIS FREQUENTES ... 12

4.1.TRISSOMIA 21... 16

4.2.TRISSOMIA 18... 19

4.3.TRISSOMIA 13... 20

5.RASTREIO PRÉ-NATAL DE ANEUPLOIDIAS ... 22

5.1.RASTREIO PELA IDADE MATERNA ... 22

5.2.RASTREIO PELA TRANSLUCÊNCIA DA NUCA ... 24

5.3.RASTREIO BIOQUÍMICO ... 26

5.4.RASTREIO COMBINADO ... 28

5.4.1.RASTREIO COMBINADO DO 1º TRIMESTRE ... 28

5.4.2.RASTREIO COMBINADO DO 2º TRIMESTRE ... 29

5.5.RASTREIO INTEGRADO/SEQUENCIAL ... 30

6.DIAGNÓSTICO PRÉ-NATAL ... 31

vii

6.2.BIÓPSIA DAS VILOSIDADES CORIÓNICAS ... 32

6.3.TÉCNICAS DE CARIOTIPAGEM ... 34

6.4.TESTE PRÉ-NATAL NÃO INVASIVO ... 37

6.4.1.DNA FETAL LIVRE (CFDNA) NO SANGUE MATERNO ... 38

6.4.2.MÉTODOS DO NIPT ... 39

6.4.3.CUSTOS DO NIPT ... 41

6.4.4.PARTICULARIDADES CLÍNICAS ... 41

6.4.5.ACONSELHAMENTO E PROBLEMAS ÉTICOS DO NIPT ... 42

6.4.6.O FUTURO DO NIPT... 43

7.A MINHA EXPERIÊNCIA ... 45

8.CONCLUSÃO ... 46

viii

Í

FIGURA 1– Distribuição de resultados de um teste e situação patológica real. ... 4

FIGURA 2 – Esquema representativo das células trofoblásticas e vasos sanguíneos da interface materno-fetal. ... 5

FIGURA 3 – Concentração no soro materno de hCG ao longo da gestação. ... 7

FIGURA 4 – Clivagem da IGFBP-4 pela PAPP-A. ... 8

FIGURA 5 – Níveis relativos da α-FP no soro fetal, no líquido amniótico e no soro materno, em função do tempo de gestação. ... 9

FIGURA 6 – Síntese do estriol (E3) e todo o seu percurso no feto e na grávida. ... 10

FIGURA 7 – Esquema representativo das variações de concentração de hCG, α-FP, uE3 e inibina-A na circulação materna ao longo da gestação. ... 11

FIGURA 8 – Cariótipo humano. ... 12

FIGURA 9 – Diferentes estados de euploidia. ... 13

FIGURA 10 – Processo de meiose. ... 15

FIGURA 11 – Erros na segregação cromossómica durante a meiose. ... 16

FIGURA 12 – Cariótipo de um portador de síndrome de Down. ... 17

FIGURA 13 – Características fenotípicas da síndrome de Down. ... 17

FIGURA 14 – Etiologias da síndrome de Down. ... 18

FIGURA 15–Cariótipo de um portador de síndrome de Edwards. ... 19

FIGURA 16 – Características fenotípicas da síndrome de Edwards. ... 20

FIGURA 17 – Cariótipo de uma portadora de síndrome de Patau. ... 20

FIGURA 18 – Características fenotípicas da síndrome de Patau. ... 21

FIGURA 19 – Prevalência total corrigida por 10 000 nascimentos de T21, T18 e T13 por idade materna, de 1990 a 2009. ... 23

ix

FIGURA 20 – Translucência da nuca aumentada no feto. ... 25

FIGURA 21 – Espessura da TN de acordo com o comprimento crânio-caudal. ... 25

FIGURA 22– Distribuições Gaussianas dos níveis de β-hCG livre. ... 26

FIGURA 23– Distribuições Gaussianas dos níveis de PAPP-A... 27

FIGURA 24 – Rastreio pré-natal do primeiro trimestre. ... 29

FIGURA 25 – Ilustração representativa do processo de amniocentese e análise do cariótipo. ... 32

FIGURA 26 – Interface materno-fetal: vilosidades coriónicas. ... 33

FIGURA 27 – Biópsia das vilosidades coriónicas por via vaginal. ... 33

FIGURA 28 – Esquema da técnica de hibridização in situ fluorescente. ... 34

FIGURA 29 – Princípios da hibridização in situ fluorescente. ... 35

FIGURA 30 – Exemplos de observações, ao microscópio de fluorescência, de resultados do FISH. ... 36

FIGURA 31 – Esquema dos resultados de Q-PCR. ... 37

x

Í

TABELA 1 – Resultados de um teste e comparação com a situação patológica real. ... 4

TABELA 2 – Comparação dos processos de mitose e meiose. ... 14

TABELA 3 – Risco de T21, T18 e T13 de acordo com a idade materna e a idade gestacional. ... 23 TABELA 4 – Taxa de deteção de T21, T18 e T13 para determinada taxa de falsos positivos. ... 28 Tabela 5 – Taxas de deteção e de falsos positivos dos diferentes modos de rastreio pré-natal na Columbia Britânica, de 2012 a 2015. ... 39

xi

L

α-FP

β-HCG Fração β da hormona gonadotrofina coriónica humana

ARS Administração Regional de Saúde cfDNA Cell-free DNA

DGS Direção-Geral da Saúde

DHEAS Sulfato de desidroepiandrosterona

E1 Estrona

E2 Estradiol

E3 Estriol

ECLIA Eletrochemiluminescence immunoassay ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay FISH Fluorescence in situ hybridization

FPR Taxa de falsos positivos (False positive rate) FSH Hormona folículo-estimulante

hCG Hormona gonadotrofina coriónica humana IGF Insuline-like growth factor

IGFBP-4 Insuline-like growth factor-binding protein-4 IVF Fertilização in vitro

LH Hormona luteinizante

MoM Múltiplos de mediana (Multiples of median)

xii PAPP-A Proteína plasmática associada à gravidez (Pregnancy-associated

plasma protein A)

PCR Polymerase Chain Reaction

Q-PCR Quantitative Fluorescence – Polymerase Chain Reaction RENAC Registo Nacional de Anomalias Congénitas

s-MPS Shotgun Massively Parallel Sequencing) SNP Single nucleotide polymorphism

T13 Trissomia 13

T18 Trissomia 18

T21 Trissomia 21

t-MPS Targeted massively parallel sequencing TN Translucência da nuca

uE3 Estriol não-conjugado WGS Whole Genome Sequencing

1

1.

I

A idade média das mulheres ao nascimento do primeiro filho passou de 26,5 anos, em 2000, para 29,6 anos, em 2017 [1]. O adiamento da maternidade e a redução do número de nascimentos por mulher são o reflexo de alterações como o nível de escolaridade e a inserção profissional. Há mais mulheres com nível de escolaridade secundário e superior (duplicou o número de doutoradas) [2], evidenciando-se um menor número de filhos quando comparado com mulheres menos qualificadas [3].

Nos centros de saúde, entre 2002 e 2010, o número de consultas de Ginecologia-Obstetrícia subiram 2% e as de saúde materna 24%. O número de partos por ano, de 2000 a 2010, decresceu e as interrupções voluntárias da gravidez legalmente efetuadas nos hospitais cresceram entre 2002 e 2009, sendo este aumento significativo após a introdução da Lei 16/2007 de 17 de abril [2]. Em 2013, 60,9% das residentes em Portugal, entre os 15 e os 49 anos de idade, usavam métodos de contraceção modernos, tais como hormonais, de barreira, preservativo (feminino e masculino) e esterilização (feminina ou masculina) [4].

A prevalência da infertilidade conjugal é de 15 a 20% para a população em idade reprodutiva, sendo que 80% dos casos afeta ambos os membros do casal. Nos países industrializados este valor tem vindo a aumentar, devido ao adiar da idade de conceção, aos múltiplos parceiros sexuais, ao estilo de vida sedentário, ao consumo de álcool, tabaco e outras drogas, bem como, devido aos químicos adicionados aos produtos alimentares e ambientais [5].

A infertilidade, quando ultrapassada, com ou sem recurso a técnicas de procriação medicamente assistidas, traduz-se numa gravidez extremamente desejada, por isso, o bem-estar fetal é uma preocupação e uma prioridade para estas grávidas. Para além disso, pela existência de uma população mais formada, informada e com idade materna tardia, tornaram-se imprescindíveis métodos de rastreio e diagnóstico pré-natais fiáveis, para uma correta avaliação do bem-estar materno e fetal.

Durante os anos 70 e início dos anos 80, a idade materna avançada, definida em vários critérios como superior a 35 anos, era a única forma de avaliar o risco de uma anomalia cromossómica fetal. Entre 1980 e início dos anos 90, a introdução da avaliação de marcadores no soro materno no segundo trimestre melhorou significativamente a performance do rastreio de aneuploidias. No final dos anos 90 e início do séc. XXI, o

2 rastreio foi antecipado para o primeiro trimestre com um teste combinado da medição da translucência da nuca (TN) fetal e a determinação da concentração no soro materno da fração β da hormona gonadotrofina coriónica humana (β-hCG) e da proteína plasmática A associada à gravidez (PAPP-A). Atualmente estão disponíveis protocolos de rastreio que incluem outros marcadores ecográficos e um rastreio sequencial (com avaliação no primeiro e segundo trimestres). Um diagnóstico é conseguido através de uma amniocentese ou biópsia das vilosidades coriónicas. Mais recentemente, a análise de DNA fetal livre (cfDNA) no sangue materno para rastreio pré-natal não invasivo (NIPT) tem revelado uma elevada precisão na deteção das trissomias autossómicas fetais mais comuns [6].

3

2.

C

-

É fundamental entender a definição de rastreio e a distinção entre este conceito e o de diagnóstico. Os testes de rastreio não são de diagnóstico [7]. O rastreio pré-natal não é definitivo, pelo contrário, é desenhado para identificar mulheres que têm um risco significativo de ter um feto portador de uma aneuploidia [6], com o intuito de lhes serem indicados testes adicionais. Por diagnóstico pré-natal entende-se o conjunto de procedimentos que são realizados para determinar se um embrião ou feto é, de facto, portador ou não de uma anomalia cromossómica [8]

Segundo a Direção-Geral de Saúde (DGS) e a Administração Regional de Saúde (ARS) do Norte [9], para a implementação de um rastreio devem considerar-se as características do exame – reprodutível, fiável, económico, pouco invasivo e aceite –, da doença – gravidade, história natural conhecida, período assintomático longo, passível de tratamento e elevada prevalência que justifique os custos – e da intervenção subsequente (diagnóstico e tratamento) – eficaz, com disponibilidade efetiva e acessibilidade adequada.

Para um rastreio são executados testes cujos resultados se pretende serem o mais próximo possível da realidade podendo nesse caso dizer-se que são verdadeiros positivos ou verdadeiros negativos. No caso de não traduzirem a situação real, designam-se falsos positivos ou falsos negativos (Tabela 1). A designam-sensibilidade e a especificidade são propriedades intrínsecas dos testes – a primeira reflete a eficácia em identificar os portadores com a característica de interesse de entre todos os testados; a segunda revela a eficácia para identificar os indivíduos não portadores. Em termos matemáticos, traduzem-se nas seguintes fórmulas:

sensibilidade = verdadeiros positivos

verdadeiros positivos+falsos negativos =

verdadeiros positivos total de portadores

4 TABELA 1 – Resultados de um teste e comparação com a situação patológica real.

Numa distribuição dos resultados versus a ocorrência ou não de patologia/anomalia (Figura 1), formam-se duas populações do tipo Gaussiano que a certa altura se intersetam, correspondendo a frequência máxima sem patologia ao pico de especificidade e a frequência máxima de patologia ao pico de sensibilidade. Para que os resultados sejam o mais corretos possível é necessário definir um critério de validação (cut-off), ou seja, um meio-termo entre as duas propriedades que confira o menor número de falsos positivos e de falsos negativos. Geralmente o cut-off estabelece-se no ponto em que a taxa de falsos positivos é cerca de 5%, sendo o limiar a partir do qual o rastreio é positivo.

FIGURA 1– Distribuição de resultados de um teste e situação patológica real.

VN – Verdadeiro negativo; FN – Falso negativo; VP – Verdadeiro positivo; FP – Falso positivo

[Fonte: https://step1.medbullets.com/stats/101006/2x2-tables-sn-sp-ppv-npv-or-rr , acedido em 01/07/2018].

O método de rastreio ideal deverá portanto ter alta sensibilidade e baixa taxa de falsos positivos, evitando-se que fetos normais sejam colocados em risco [10].

Patologia

Positivo Negativo

Teste

Positivo Verdadeiro positivo Falso positivo Negativo Falso negativo Verdadeiro negativo

5

3.

M

-

A pesquisa de biomarcadores no soro da mulher grávida tem sido um passo importante na deteção de fetos em risco de anomalias cromossómicas. O rastreio pré-natal de trissomias baseado na análise de marcadores bioquímicos no soro materno é parte integrante da prática obstétrica em vários países, tendo a β-hCG, PAPP-A, α-fetoproteína (α-FP), inibina-A e o estriol não conjugado (uE3) revelado ser de grande valor para avaliação do bem-estar fetal [11].

Estes são marcadores fetoplancentários, ou seja, sintetizados pelo feto ou pelos constituintes da placenta, aparecendo na circulação sanguínea materna e, portanto, podem ser doseados numa amostra deste produto biológico. A hormona gonadotrofina coriónica humana (hCG) e a PAPP-A são produzidas na placenta pelos sinciciotrofoblastos (Figura 2), que resultam da diferenciação dos citotrofoblastos e apresentam propriedades endócrinas [12, 13]. A α-FP é excretada pelo saco vitelino, fígado e trato gastrointestinal fetais [14]. O estriol (E3) é sintetizado pela placenta. Por fim, a inibina-A tem origem nas gónadas e placenta [15].

FIGURA 2 – Esquema representativo das células trofoblásticas e vasos sanguíneos da interface materno-fetal.

6 Regra geral, as concentrações destes marcadores bioquímicos são apresentadas em múltiplos da mediana (MoM), uma vez que os seus níveis variam com a idade gestacional [14].

3.1.

É uma glicoproteína composta por duas subunidades, α e β, ligadas não-covalentemente [12, 17]. A primeira é estruturalmente semelhante a outras hormonas, como a hormona folículo-estimulante (FSH) ou a hormona luteinizante (LH). Já a segunda é específica para esta hormona. Portanto, para diminuir o risco de reação cruzada e, consequentemente, a ocorrência de falsos positivos, os testes pesquisam apenas a fração beta. A hCG produzida pelas células trofoblásticas passa para a circulação sanguínea materna e é filtrada pelos rins, sendo parte eliminada pela urina. Assim, a hormona pode ser determinada tanto no sangue como na urina para o diagnóstico de gravidez. Existem basicamente duas formas de se avaliar a sua presença: testes β-hCG qualitativos e β-hCG quantitativos.

Os testes qualitativos não fornecem valores, apenas demonstram se há ou não gonadotrofina coriónica humana em valores relevantes. Esta é a abordagem utilizada nos testes de gravidez vendidos em farmácia que usam a urina como amostra (o teste é positivo ou negativo). Já o teste quantitativo é a forma usada na maioria dos exames de sangue. A quantificação da hormona tem um papel relevante na avaliação do bemestar-fetal. A quantidade produzida varia ao longo da gestação (Figura 3). Tem o seu pico máximo no soro materno entre a 8ª e a 10ª semanas e, em seguida, decresce até atingir um platô entre a 18ª e a 20ª semanas, permanecendo mais ou menos constante até ao termo da gestação. Conforme o embrião e a placenta se desenvolvem, mais hCG é produzida. Nas primeiras semanas de gestação, os níveis de hCG duplicam a cada 2 ou 3 dias. Se nos primeiros 30 dias o ritmo de aumento estiver inesperadamente alterado, é possível que haja alguma complicação, como perda da viabilidade fetal ou gravidez ectópica.

7 Adaptado de [18].

Esta hormona medeia múltiplas funções placentárias, uterinas e fetais,

nomeadamente o desenvolvimento das células sinciciotrofoblásticas, crescimento

e diferenciação do endométrio, supressão localizada do sistema imune materno,

modulação da morfologia uterina e expressão de genes, e a coordenação da

transdução de sinal intrínseco entre o endométrio [11].

3.2.

A PAPP-A é uma protease com ligação ao zinco, produzida pelos sinciciotrofoblastos e é responsável pela clivagem da proteína de ligação ao fator de crescimento semelhante à insulina (insuline-like growth factor-binding protein-4, IGFBP-4) (Figura 4) [19].

Os fatores de crescimento semelhantes à insulina (insuline-like growth factors, IGF), como o próprio nome indica, são estruturalmente semelhantes à insulina e têm um papel fundamental no desenvolvimento fetal e placentário. Após ligação ao seu recetor, na superfície das células, desencadeiam uma série de processos de sinalização intracelular, para estimular o crescimento e proliferação [20, 21]. Níveis aumentados de IGFBPs em circulação resultam na diminuição de IGF livre. A PAPP-A, tendo esta

8 capacidade proteolítica, quebra a ligação entre a IGFBP-4 e o IGF, permitindo que este último esteja livre para se ligar ao seu recetor e, subsequentemente dar início ao processo de sinalização intracelular.

FIGURA 4 – Clivagem da IGFBP-4 pela PAPP-A.

[Fonte: https://www.wikirefua.org.il/w/index.php/Pregnancy-associated_plasma_protein_A , acedido em 01/07/2018].

A PAPP-A pode ser doseada através de ensaios imunoenzimáticos (enzyme-linked immunosorbent assay - ELISA) [22]. A sua concentração na circulação materna aumenta rapidamente no 1º trimestre, associando-se uma baixa dos seus valores a alterações na função placentária [13], atraso no crescimento intra-uterino, parto prematuro e prognóstico desfavorável da gravidez [23, 24].

3.3.

-F

(

-FP)

A α-FP é uma glicoproteína produzida inicialmente no saco vitelino, no fígado fetal e uma pequena parte no trato gastrointestinal.

É a proteína sérica fetal dominante na fase embrionária inicial, atingindo um pico de concentração, entre a 10ª e a 13ª semanas. É capaz de se difundir através da barreira

9 placentária, para a circulação materna, aumentando aí os seus níveis ao longo da gravidez, com pico máximo às 32 semanas (Figura 5) [14, 15, 25].

[Fonte: http://www.fetalultrasound.com/online/text/5-008.HTM , acedido em 23/09/2018].

No caso de o feto ser portador de uma anomalia do tubo neural, a concentração de α-FP no líquido amniótico encontra-se elevada e, subsequentemente, também na circulação materna. Do mesmo modo, em situações de gestação múltipla, de ameaça de aborto e morte fetal, a α-FP está aumentada [25].

Após o nascimento os valores α-FP tornam-se indetetáveis, surgindo apenas em certas situações patológicas, como o carcinoma hepatocelular [26].

3.4.

Os estrogénios naturais são hormonas que derivam do colesterol, tendo uma estrutura química com 18 carbonos [27]. A estrona (E1), o estradiol (E2) e o E3 são os estrogénios principais. Participam, em vários processos fisiológicos nomeadamente, no desenvolvimento e manutenção do fenótipo feminino, na maturação das células germinativas e na gravidez.

FIGURA 5 – Níveis relativos da α-FP no soro fetal, no líquido amniótico e no soro materno, em função do tempo de gestação.

10 Durante o 2º trimestre de gravidez, no feto, o sulfato de dehidroepiandrosterona (Dehydroepiandrosterone sulfate, DHEAS), proveniente da glândula adrenal fetal, é convertido no fígado a 16-α-hidroxi-desidroepiandrosterona. Este é transportado para a placenta, passando aí a E3, e então difunde-se para a circulação materna (Figura 6) [28].

Adaptado de [29].

O tempo de semi-vida do uE3 é de 20-30 minutos, uma vez que, o fígado materno rapidamente o conjuga, para que seja mais solúvel em água e passível de ser excretado na urina. [30]. Casos de T21 apresentam valores mais baixos de E3 na urina materna [15]. O uE3 desempenha um papel importante no crescimento e desenvolvimento fetais. Regra geral, encontra-se em níveis baixos nos homens e mulheres não-grávidas, mais aumentados nas gestantes [31]. Nestas, níveis elevados ou aumentos súbitos são preditivos do início do trabalho de parto, sendo este um marcador de interesse para avaliação do risco de parto prematuro [30].

3.5.

-A

A forma ativa desta hormona é conhecida como inibina-A dimérica, uma vez que possui duas subunidades α e βA, e caracteriza-se pela inibição da libertação de FSH pela

11 hipófise [32]. Embora ainda pouco se conheça sobre a sua função, sugere-se que participe no estabelecimento da gravidez e no desenvolvimento placentário e fetal.

Durante a gestação, os seus níveis no soro materno aumentam no primeiro trimestre, havendo um declínio a partir da 10ª semana e mantendo-se estáveis entre a 15ª e a 20ª semanas. O pico máximo é atingido no termo da gravidez (Figura 7) [33].

FIGURA 7 – Esquema representativo das variações de concentração de hCG, α-FP, uE3 e inibina-A

na circulação materna ao longo da gestação.

12

4.

A

As células humanas apresentam 46 cromossomas, sendo 22 pares de autossomas e 1 par de cromossomas sexuais – XX no sexo feminino e XY no sexo masculino (Figura 8). No final da década de 60 foi desenvolvido um método de coloração, permitindo uma organização e avaliação do cariótipo mais fáceis. Para se avaliarem as alterações cromossómicas, os cromossomas devem ser corados de uma forma específica, de modo a que cada um dos pares seja identificado individualmente. Esta marcação pode ser obtida através de diferentes técnicas de bandagem. Como cada cromossoma possui um tamanho e forma típicos, assim as análises citogenéticas (hoje em dia bastante desenvolvidas) permitem a deteção de alterações significativas de anomalias cromossómicas e alterações estruturais como deleções, duplicações, translocações e inversões [34].

FIGURA 8 – Cariótipo humano.

[Fonte: https://www.colegioweb.com.br/nucleo/o-cariotipo-humano.html , acedido em 03/07/2018].

Uma célula ou organismo que possui o número de cromossomas normal para a sua espécie diz-se ser euplóide [35]. Há vários estados de euploidia (Figura 9), sendo alguns organismos haplóides (n) como os fungos, diplóides (2n) como a maioria dos

13 mamíferos e poliplóides (≥ 3n) como as plantas [36]. Esta característica deve ser mantida durante o desenvolvimento e após a reprodução do organismo.

Haplóide (n), diplóide (2n) e poliplóide: triplóide (3n) e tetraplóide (4n).

[Fonte: https://pt.wikipedia.org/wiki/Poliploidia , acedido em 02/07/2018].

Alterações numéricas cromossómicas designam-se por “aneuploidia” (i.e. “não euplóide”) e resultam de erros dos processos de divisão celular (mitose e meiose), que não mantiveram o estado euplóide do organismo nas células-filhas recém-formadas. A ocorrência de uma alteração do número de cromossomas dito “normal” está associada a anomalias na função celular [36].

A mitose e a meiose apresentam algumas características comuns e outras distintas (Tabela 2). Na mitose, de uma célula-mãe são formadas duas células-filhas geneticamente iguais. Isto é importante para o crescimento e regeneração de tecidos, divisões do zigoto e na reprodução assexuada, por exemplo [37]. Por outro lado, a meiose serve para gerar gâmetas que possuem metade do número de cromossomas da célula original, graças a uma replicação do DNA seguida de duas segregações cromossómicas – primeiro dos cromossomas homólogos (meiose I) e depois das cromátides-irmãs (meiose II). Durante a meiose é possível a recombinação, que contribui para a variabilidade genética [38].

FIGURA 9 – Diferentes estados de euploidia.

14 TABELA 2 – Comparação dos processos de mitose e meiose.

[Fonte: https://www.diferenca.com/mitose-e-meiose/ , acedido em 01/07/2018].

No ser humano, a célula-mãe diplóide (2n) originará quatro células-filhas haplóides (n), o que é fundamental para que se mantenha a euploidia na descendência (Figura 10). Caso contrário, após a fecundação obter-se-ia um zigoto com o dobro da informação genética dos seus progenitores. O fenómeno de crossing-over pode ocorrer entre os cromossomas homólogos, o que contribui para um aumentando da variabilidade genética.

Características Mitose Meiose

Definição

Divisão celular com formação de células-filhas idênticas à célula-mãe; Ocorre em todos os organismos; Replicação das células somáticas do organismo; Reprodução assexuada.

Divisão celular com formação de células-filhas de composição cromossómica diferente da célula-mãe; Para a formação de gâmetas na reprodução sexuada.

Nº de

cromossomas Mantido nas células-filhas (2n).

Reduzido para metade nas células-filhas (n).

Recombinação

genética Não ocorre.

Pode ocorrer, contribuindo para a variabilidade genética.

Fases 1- Prófase; 2- Metáfase; 3- Anáfase; 4- Telófase. 1- Prófase I; 2- Metáfase I; 3- Anáfase I; 4- Telófase I; 5- Prófase II; 6- Metáfase II; 7- Anáfase II; 8- Telófase II. Células-filhas 2 4

15 FIGURA 10 – Processo de meiose.

Meiose I ou divisão reducional – segregação dos cromossomas homologos com ocorrência de recombinação genética (crossing-over); Meiose II ou divisão equacional – segregação das cromatídes-irmãs.

[Fonte: https://pt.wikipedia.org/wiki/Meiose , acedido em 02/07/2018].

As células dependem de mecanismos precisos para assegurar uma correta segregação cromossómica durante a mitose e meiose, para que no final desses processos se mantenha o seu estado euplóide. Erros nestes mecanismos resultam em células-filhas aneuplóides [36]. A origem destas alterações pode ser materna ou paterna.

A aneuploidia constitucional surge da fertilização de um gâmeta aneuplóide que foi gerado de um defeito na segregação de cromossomas durante a meiose. Se a não-disjunção ocorrer na meiose I, todas as células-filhas serão aneuplóides e, após a fecundação com gâmetas normais (n), geram-se duas células trissómicas (n+1) e duas monossómicas (n-1). Por outro lado, se a não-disjunção se der na meiose II, apenas metade das células-filhas serão afetadas, formando-se duas células euplóides, uma trissómica e uma monossómica (Figura 11).

Replicação do DNA

16 FIGURA 11 – Erros na segregação cromossómica durante a meiose.

[Fonte: https://biology.stackexchange.com/questions/54231/aneuploidy-in-meiosis , acedido em 03/07/2018].

Por norma, as aneuploidias constitucionais são incompatíveis com desenvolvimento fetal normal. Em humanos, aneuploidias autossómicas viáveis são as trissomias 13, 18 e 21 [36], sendo estas a maioria das anomalias cromossómicas identificadas em amostras pré-natais, associadas aos fenótipos das síndromes de Patau, Edwards e Down, respetivamente [7].

O Registo Nacional de Anomalias Congénitas (RENAC), no relatório referente ao período de 2011 a 2013, registou uma elevada prevalência para as anomalias cromossómicas, sendo esta de 25 casos por 10 000 nascimentos. Destes, cerca de 53,2% são casos de síndrome de Down e 19,1% das síndromes de Edwards e Patau [39].

4.1.

21

A Trissomia 21 (T21) é uma aneuploidia que se caracteriza pela presença de um cromossoma extra no par de autossomas 21 (Figura 12).

17 FIGURA 12 – Cariótipo de um portador de síndrome de Down.

[Fonte: http://tanya-biologia.blogspot.com/2012/09/divisao-celular-meiose.html , acedido em 02/07/2018].

Os indivíduos afetados têm características comuns, como dismorfia facial, comprometimento cognitivo e defeitos cardíacos congénitos [36], nariz e rosto achatados, olhos inclinados para cima, mãos com vinco palmar único, quinto dedo curto que curva para dentro, primeiro e segundo dedos dos pés amplamente separados e aumento dos vincos da pele (Figura 13). A manifestação de sinais e sintomas não é previsível, variando entre ‘pouco aparentes’ e ‘severos’.

FIGURA 13 – Características fenotípicas da síndrome de Down.

18 A síndrome de Down tem prevalência de 1 caso em cada 800 gravidezes [7] e pode ter diferentes etiologias (Figura 14). Cerca de 97% de todos os casos de T21 resultam de defeitos na divisão celular, 90% dos quais com origem materna e 5% paterna. Destes, 2/3 devem-se à não-segregação na meiose I e 1/3 na meiose II, tendo todas as células do organismo esta trissomia – síndrome de Down livre. Os restantes 5% devem-se a erros de mitose pós-zigótica. Os 3% excedentes (do total de casos de T21) devem-se a translocações não-balanceadas, sendo as principais t(14,21) e t(21,21) que ocorrem de novo. Casos de T21 mosaico têm, por norma, fenótipos menos pronunciados [41].

FIGURA 14 – Etiologias da síndrome de Down.

Adaptado de [41].

A expectativa de vida dos indivíduos com síndrome de Down tem vindo a aumentar. Estudos apontam que a qualidade de vida é melhorada quando estes crescem num ambiente estimulador das suas capacidades. Os avanços médicos e terapias têm também permitido a correção, atenuação ou controlo de algumas das características e patologias decorrentes desta trissomia [42, 43].

19

4.2.

18

A síndrome de Edwards, ou trissomia 18 (T18) (é uma anomalia cromossómica que se caracteriza pela presença de três cromossomas 18 em vez dos dois normais (Figura 15). É uma alteração rara e aleatória, com uma frequência de 1 em cada 5000 nascimentos e é três vezes mais comum no género feminino que no masculino [44].

FIGURA 15–Cariótipo de um portador de síndrome de Edwards.

[Fonte: http://worms.zoology.wisc.edu/zooweb/Phelps/47XY_18.html , acedido em 01/07/2018].

Afeta o desenvolvimento fetal dos órgãos principais e apresenta características fenotípicas como micrognatia (mandíbula inferior subdesenvolvida), occipital proeminente, orelhas baixas, punhos fechados com sobreposição dos dedos, planta dos pés abaulada (rocker-bottom) e abdução limitada da anca (Figura 16) e atra.

A severidade destas manifestações faz com que a maioria dos fetos não sobreviva durante a gestação ou poucos dias após o nascimento. Apenas 5 a 10% dos portadores desta trissomia viverão além do primeiro ano. As crianças que conseguem sobreviver apresentam graves problemas de saúde e desenvolvimento mental e físico [45].

20 FIGURA 16 – Características fenotípicas da síndrome de Edwards.

[Fonte: http://usmle-notes.tumblr.com/post/166044129913/trisomys , acedido em 03/07/2018].

4.3.

13

A T13 à semelhança da T18, é rara, tendo uma frequência de 1 em cada 16 000 nascimento. É uma anomalia cromossómica que se caracteriza pela presença de um cromossoma extra no par de autossomas 13 (Figura 17).

FIGURA 17 – Cariótipo de uma portadora de síndrome de Patau.

21 A trissomia 13 é responsável pela síndrome de Patau [44] (Figura 18), cujo fenótipo se traduz, de entre outras características, em microcefalia, microftalmia, polidactilia, palato e lábio fendidos, hérnia umbilical, planta dos pés curva (rocker-bottom) e ainda em defeitos renais e cardíacos. Tal como os portadores de T18, estes indivíduos apresentam anomalias severas do desenvolvimento e tipicamente não sobrevivem além do primeiro ano [36].

FIGURA 18 – Características fenotípicas da síndrome de Patau.

Fonte: http://usmle-notes.tumblr.com/post/166044129913/trisomys , acedido em 03/07/2018].

A deteção pré-natal precoce tem permitido o diagnóstico de mais casos de trissomia que, de outra forma, não sobreviveriam após o parto. Para as T18 e T13 isto tem ainda mais impacto, pois, apesar da baixa prevalência, têm taxas de perda fetal natural elevadas. A taxa de mortalidade pré-natal das três trissomias combinadas é de 1,9 por 10 000 nascimentos, dos quais dois terços são T18 e T13 [46].

22

5.

R

-

O rastreio de anomalias cromossómicas durante a gestação faz-se através da combinação de determinados marcadores, com o intuito de selecionar o grupo de grávidas com maior probabilidade de ter um feto afetado [10]. Pressupõe um acompanhamento desses casos de risco, para maior segurança e informação do casal relativamente ao bem-estar fetal, às opções reprodutivas (continuidade ou termo da gestação),de terapia intrauterina (em caso de ser possível), de preparação para o parto e dos cuidados que exigirá uma criança com uma aneuploidia [47]. O rastreio pré-natal de aneuploidias está direcionado principalmente para a deteção da T21, que é de entre as três trissomias, aquela que apresenta maior sobrevivência e com qualidade de vida.

A idade materna, as observações e registos ecográficos e as determinações dos marcadores bioquímicos do bem-estar fetal são os parâmetros gerais de um rastreio pré-natal. A avaliação conjunta destes fatores, um rastreio combinado, leva a um rastreio mais completo e mais fiável.

5.1.

Quanto maior a idade materna, maior o risco de o feto ser portador de uma anomalia cromossómica, como a T21, T18 e T13 (Figura 19). Mães jovens (entre os 15-18 anos) apresentam também uma prevalência ligeiramente aumentada para T21 [41].

23 Adaptado de [46].

Há um maior risco de aborto espontâneo, com o aumento da idade gestacional, para os fetos com anomalias cromossómicas [48]. Assim, e à semelhança da síndrome de Edwards e de Patau, a prevalência da síndrome de Down aumenta com a idade materna e diminui com a idade gestacional (Tabela 3), visto que nem todos os fetos sobrevivem entre as 12 semanas e o termo da gestação [49]. Os índices de morte fetal entre a 12ª e a 40ª semanas são de 30% para a T21 e cerca de 8% para T18 e T13 [48].

(Risco = 1 / número apresentado na tabela).

Adaptado de[48]. FIGURA 19– Prevalência total corrigida por 10 000 nascimentos de T21, T18 e T13 por idade materna, de 1990 a 2009.

24 Um rastreio baseado apenas na idade materna não permite identificar a maioria dos casos com trissomias. Por exemplo, menos de metade dos casos de T21 são detetados apenas pela idade materna, correspondendo os restantes a mães com menos de 35 anos, de grupos etários com maior número de nascimentos [50].

O risco de cada gestante ter um feto portador de uma anomalia cromossómica – risco basal – tem em consideração a idade materna e outros fatores maternos (por exemplo, hábitos tabágicos ou de consumo de outras drogas), a idade gestacional e histórico familiar da ocorrência destas anomalias [48].

5.2.

A ecografia é uma técnica imprescindível na vigilância da grávida [51], que permite, para além de informações sobre a saúde fetal, determinar a idade gestacional exata pelo comprimento crânio-caudal [49]. Numa gravidez não complicada, este tipo de teste é realizado entre a 11ª e a 13ª semanas (primeiro trimestre), a 20ª e a 22ª semanas (segundo trimestre) e entre a 30ª e a 32ª semanas de gestação (terceiro trimestre). Num exame ecográfico é obrigatório avaliar o número de fetos e placentas, atividade cardíaca, movimentos fetais, biometria, localização placentária e quantidade de líquido amniótico [52].

A TN corresponde ao espaço subcutâneo preenchido por fluido, entre a coluna vertebral e a pele do pescoço do feto (Figura 20). Esta aumenta com a idade gestacional, cerca de 17% por semana. A sua medição foi reportada pela primeira vez por Schulte-Valentine e Schindler, em 1992. Deve ser realizada por profissionais experientes e deve ser obtida entre as 10 e as 13 semanas e seis dias, uma vez que a área translucente desaparece após a 14ª semana de gestação, que é quando o tecido subcutâneo se torna mais ecogénico.

25 FIGURA 20 – Translucência da nuca aumentada no feto.

[Fonte: https://www.germanodesousa.com/page/doencas/article/diagnostico-pre-natal/, acedido em 01/09/2018].

.

É, portanto, um fenómeno transiente [11], sendo de notar quando esta se encontra acima dos valores de referência, para a idade gestacional em que o feto se encontra (Figura 21). O seu aumento está associado a anomalias estruturais, síndromes genéticas, defeitos cardiovasculares e risco de morte fetal intrauterina [11, 53, 54]. Se a medição estiver alterada a grávida é convidada a realizar outra ecografia após uma semana, para nova avaliação da TN [54].

[Fonte:http://www.jaypeejournals.com/eJournals/ShowText.aspx?ID=969&Type=FREE&TYP=TOP&IN=_eJournals/images/ JPLOGO.gif&IID=84&isPDF=NO , acedido em 08/09/2018].

Os relatórios dos exames ecográficos são fornecidos à grávida, registados no Boletim de Saúde da Grávida e no seu processo clínico [52].

26

5.3.

Várias proteínas na circulação materna são encontradas durante a gravidez, sendo algumas produzidas ou modificadas pela placenta. Diferenças nos seus níveis têm sido observadas em pacientes com fetos portadores de determinadas anomalias cromossómicas. Estas variações da concentração das proteínas são a base de protocolos de rastreio pré-natal e são referidas como marcadores bioquímicos [11]. A β-hCG, PAPP-A, α-FP, a inibina-A e o uE3 são os marcadores mais comuns.

Uma elevação dos níveis de hCG no soro materno de grávidas cujos fetos têm síndrome de Down (Figura 22), foi reportada em 1987 [55], sendo, desde então, este parâmetro constituinte da maioria dos programas de rastreio [11].

Comparação dos valores de gestações não afetadas e em gestações com feto portador de síndrome de Down. FPR designam os resultados falsos-positivos e DR os casos identificados como positivos para síndrome de Down.

[Fonte: http://www.humgenpeine.de/doc/ersttrimester-screening , acedido em 25/09/2018].

Numa gravidez normal, a concentração de PAPP-A na circulação materna aumenta exponencialmente com um tempo de duplicação de 3-4 dias durante os primeiros trimestres, depois os níveis continuam a aumentar durante a gravidez até ao parto. Um decréscimo dos níveis desta proteína é encontrado em associação com função anormal da placenta e nas T21 (Figura 23), T18 e T13 [11]. O doseamento da PAPP-A a partir da 15ª semana de gestação não apresenta vantagens para o rastreio pré-natal, daí que apenas seja usado apenas como marcador bioquímico do 1º trimestre [15].

27 Comparação dos valores de gestações não afetadas e em gestações com feto portador de síndrome de Down. FPR designam os resultados falsos-positivos e DR os casos identificados como positivos para síndrome de Down.

[Fonte: http://www.humgenpeine.de/doc/ersttrimester-screening , acedido em 25/09/2018].

Como já referido anteriormente, a concentração da α-FP atinge um pico, no soro fetal, entre a 10ª e a 13ª semanas. Pela capacidade de se difundir através da barreira placentária, é possível o seu doseamento na circulação materna, sendo um marcador bioquímico do 2º trimestre. Situações de gestação múltipla, de ameaça de aborto e morte fetal originam também valores da α-FP elevados [25]. Em casos de fetos portadores de T21, a sua concentração na circulação materna encontra-se diminuída, em relação a gestações com fetos normais [14].

A inibina-A foi introduzida como marcador bioquímico no rastreio pré-natal há poucos anos [56]. Alguns estudos revelam uma correlação entre a concentração de inibina-A dimérica no soro materno no segundo trimestre e a T21 fetal, com aumento de cerca de duas vezes nos indivíduos afetados e uma secreção associada à hCG [15]. Também se mostrou útil na previsão de outras aneuploidias, como na T18 [33].

O uE3 é importante para o crescimento e desenvolvimento fetal, por isso, alterações nos seus níveis podem ser indicadores do comprometimento destes processos. Valores elevados ou aumentos súbitos são preditivos do trabalho de parto [30, 31]. Concentrações diminuídas de uE3 e de α-FP, em comparação com fetos não afetados, são encontradas no soro de gestantes com fetos portadores de T21 [14, 57].

A taxa de deteção de T21 aumentou para 69% (subida de 11%) quando associada a α-FP e a β-hCG ao uE3, com uma taxa de falsos positivos de 5% [58].

28

5.4.

Um rastreio combinado, como o próprio nome indica, pressupõe a interpretação conjunta de vários fatores na avaliação do bem-estar materno-fetal. Subdivide-se em 2 tipos - rastreio combinado do 1º trimestre e rastreio combinado do 2º trimestre – de acordo com a fase gestacional em que são obtidos os parâmetros.

O rastreio combinado permite a obtenção de resultados mais fidedignos, em comparação com um rastreio que se baseia apenas num fator materno ou fetal.

5.4.1.RASTREIO COMBINADO DO 1º TRIMESTRE

O objetivo dos programas de rastreio em soro materno no 1º trimestre é identificar as mulheres com risco aumentado de ter um bebé afetado pelas síndromes de Down, Patau e Edward (Tabela 4) e, aquelas mulheres que beneficiaram de serem testadas. É realizado entre a 10ª e 14ª semanas de gestação [59], e combina nesta avaliação os marcadores bioquímicos (β-hCG e PAPP-A), a idade materna e os parâmetros ecográficos (TN, osso nasal, ângulo facial e o fluxo do ducto venoso), como recomendado pela Fetal Medicine Foundation [60].

A maioria dos fetos com síndrome de Down têm aumentada TN, quando comparados com fetos normais com a mesma idade gestacional. Regra geral, nas T21, T18 e T13, os valores da β-hCG no soro materno estão significativamente aumentados e os da PAPP-A encontram-se diminuídos [10, 59].

TABELA 4 – Taxa de deteção de T21, T18 e T13 para determinada taxa de falsos positivos.

Parâmetros do rastreio T21 FPR: 5.0% T18 FPR: 0.5% T13 FPR: 0.5% Idade materna + TN 81 68 61

Idade materna + β-hCG + PAPP-A 67 80 59

Idade materna + TN + β-hCG + PAPP-A 91 97 84

29 A fase final do rastreio pré-natal pressupõe o cálculo do risco, com base nas determinações feitas. No caso do rastreio combinado do primeiro trimestre (Figura 24) são considerados os marcadores bioquímicos, medições ecográficas e fatores clínicos como idade materna, etnia, peso, estilo de vida (tabagismo e consumo de drogas, por exemplo), estado diabético e/ou se para a conceção se recorreu a fertilização in vitro (IVF).

FIGURA 24 – Rastreio pré-natal do primeiro trimestre.

Adaptado de [11].

5.4.2.RASTREIO COMBINADO DO 2º TRIMESTRE

O rastreio do segundo trimestre para as T18 e T13, baseia-se essencialmente nas anomalias detetadas no exame ecográfico, e para a T21 são também tidos em conta os marcadores bioquímicos (β-hCG, α-FP e uE3) [10, 61]. Alguns estudos designam ainda como “duplo”, “triplo” ou “quadruplo”, dependendo do número de marcadores bioquímicos que forem determinados e levados em consideração no rastreio (β-hCG + α-FP, β-hCG + α-FP + uE3 ou hCG + α-FP + uE3 + inibina-A, respetivamente) [15]. Os resultados dos doseamentos e as observações ecográficas são combinados com os fatores maternos e, então, é calculado o risco do feto ser portador de uma aneuploidia.

30 A ecografia do segundo trimestre permite confirmar alguns dados da ecografia do trimestre anterior, mas destina-se, sobretudo, à identificação de malformações fetais. São de especial relevância as malformações incompatíveis com a vida ou associadas a elevada morbilidade pós-natal, anomalias com potencial para tratamento intrauterino ou que exijam tratamento ou investigação pós-natal [52].

Quando comparados com os valores de gestações com fetos normais, as concentrações de uE3 e de α-FP encontram-se diminuídas no soro de gestantes com fetos portadores de T21 [14, 57].

5.5.

/

Uma vez que, existem variações naturais nos parâmetros ecográficos e bioquímicos ao longo da gestação é importante também a combinação dos resultados dos testes do 1º e 2º trimestres, fazendo-se assim um rastreio pré-natal integrado/sequencial.

Este rastreio é considerado o melhor, por ser o mais completo. Para a T21 oferece uma taxa de deteção de cerca de 96% com uma taxa de falsos positivos de 5%, quando integrados os critérios do rastreio combinado do 1º trimestre e o rastreio combinado do 2º trimestre mais abrangente, com doseamento de quatro marcadores bioquímicos (α-FP, uE3, inibina-A e β-hCG) [62].

31

6.

D

-

Um rastreio pré-natal que utiliza marcadores avaliados no soro materno tem algumas limitações. Por exemplo, a deteção de defeitos no tubo neural requereria um doseamento da α-FP após as 15 semanas, ou observações morfológicas da ecografia do segundo trimestre. Por outro lado, um rastreio muito precoce essencialmente identificaria gravidezes com anomalias cromossómicas que estão destinadas a aborto espontâneo, sendo as mulheres levadas a terminar uma gravidez que já estaria comprometida [11].

O diagnóstico pré-natal tem vindo a assumir, nos últimos anos, um papel preponderante como componente essencial da prestação de cuidados de saúde [63]. Este tipo de teste permite que os casais saibam com segurança se o feto é o não portador de alguma anomalia, confirmando ou contrariando-se as suspeitas decorridas do rastreio pré-natal.

Um diagnóstico pré-natal preciso das anomalias cromossómicas é possível obtendo células fetais através de procedimentos invasivos, como a amniocentese e a biópsia das vilosidades coriónicas [7, 64]. A análise cromossómica de células fetais obtidas por culturas celulares das vilosidades coriónicas e do líquido amniótico podem identificar uma aneuploidia fetal, rearranjos estruturais (como translocações e inversões) e relativamente grandes duplicações e deleções [6].

A DGS recomenda que seja oferecido um diagnóstico pré-natal para anomalias cromossómicas às grávidas com mais de 35 anos de idade, pois é a partir dessa idade que a probabilidade de se diagnosticar, por exemplo, T21 no feto é superior ao risco de aborto secundário à realização dos procedimentos invasivos [50].

6.1.

A

A amniocentese é um método de diagnóstico pré-natal invasivo (Figura 25), realizado a partir da 16ª semana de gestação.

32 Com ajuda da ecografia, é inserida uma agulha, por via abdominal, até à cavidade amniótica para obtenção de líquido amniótico. Deste, são retiradas as células fetais para cultura e análise de parâmetros, microbianos, genéticos e moleculares [65].

[Fonte: http://maeaos37.blogspot.com/2011/06/amniocentese.html , acedido em 20/08/2018].

A análise cromossómica de células do líquido amniótico é considerada o gold standard do teste pré-natal, uma vez que a sua taxa de erro é extremamente baixa (provavelmente menor que 0,01-0,02%) e a maioria é devida a contaminação com células maternas, erros laboratoriais ou enganos tipográficos [6]. É o teste mais comum para diagnóstico genético, mas a taxa de aborto espontâneo devido ao procedimento é, em média, de 1 em cada 200 [11].

6.2.

B

À semelhança da amniocentese, a biópsia das vilosidades coriónicas é um procedimento invasivo para obtenção de amostra – que neste caso são vilosidades

33 coriónicas (Figura 26), e não o líquido amniótico - para um diagnóstico pré-natal que usa a ecografia como guia e também pressupõe obtenção e cultivo das células fetais, para a execução uma série de análises de interesse [49, 66-68].

[Fonte: https://gl.wikipedia.org/wiki/Ficheiro:2910_The_Placenta-02.jpg , acedido em 30/08/2018].

Esta técnica é realizada entre a 11ª e a 14ª semanas de gestação (mais precocemente que a amniocentese), por via abdominal ou vaginal (Figura 27) [69].

[Fonte: http://ensaio.org/produco-de-novas-variedades-de-plantas-e-de-animais.html , acedido em 25/08/2018].

FIGURA 27 – Biópsia das vilosidades coriónicas por via vaginal.

34 As taxas de erro são superiores às da amniocentese, e podem ser devidas ao mosaicismo placentário confinado, contaminação com células maternas ou menor resolução da bandagem dos cromossomas [70]. Em caso de biópsia das vilosidades coriónicas com cariotipagem com resultados ambíguos é necessária uma nova amostra ou uma amniocentese para clarificação [6].

6.3.

T

A análise do cariótipo de células em cultura está, por norma, disponível após mais de uma semana. De forma a reduzir a ansiedade e a melhorar a gestão da gravidez, eram necessários testes de deteção de aneuploidias mais rápidos, como a hibridação in situ FISH (fluorescent in situ hybridization) e o PCR quantitativo (Quantitative fluorescence – polymerase chain reaction, Q-PCR).

A técnica de marcação por FISH é uma técnica de citogenética molecular, que se baseia na marcação de cromossomas ou segmentos cromossómicos por hibridação in situ e é um método amplamente estabelecido (Figura 28).

Adaptado de [71].

35 Consiste na utilização de sondas específicas para determinados cromossomas, marcadas com fluorescência, vão hibridar aos núcleos em interfase das células fetais, sem necessidade de culturas celulares [7]. A marcação das sondas pode ser direta – utiliza nucleótidos diretamente modificados para conter um fluoróforo – ou indireta – sondas marcadas com nucleótidos modificados que contêm um hapteno (Figura 29). O FISH com sondas diretamente marcadas é mais rápido. Por outro lado, a marcação indireta oferece a vantagem da amplificação do sinal usando várias camadas de anticorpos, e pode, portanto, produzir um sinal mais brilhante em comparação a fluorescência basal [72].

FIGURA 29 – Princípios da hibridização in situ fluorescente.

(a) Os elementos básicos do FISH são uma sonda de DNA e uma sequência alvo. (b) Antes da hibridização, a sonda de DNA é marcada (indireta - painel esquerdo; direta - painel direito). (c) A sonda marcada e o DNA-alvo são desnaturados. (d) A combinação da sonda e alvo desnaturados permite a ligação de sequências de DNA complementares. (e) Se a sonda foi marcada indiretamente, uma etapa extra é necessária para a visualização do hapteno não-fluorescente que utiliza um sistema de deteção enzimático ou imunológico. Adaptado de [72].

36 O número de sinais fluorescentes em cada núcleo representa o número de cópias cromossómicas (Figura 30) [7].

Visível marcação de três cópias de cromossomas (a vermelho), indicativo de trissomia.

[Fonte: https://www.micropticsl.com/products/metaclass-karyotyping-fish/ e https://www.clgenetics.com/our-services/fluorescence-in-situ-hybridization/ , acedidos em 20/08/2018].

A Q-PCR é uma técnica mais recente que envolve a quantificação relativa de alelos microssatélites para determinar o número de cópias da sequência, a amplificação usando primers marcados com fluorescência, seguida da separação por tamanho e medição dos picos dos alelos num analisador [7]. Uma amostra diplóide normal tem dois alelos para cada um dos cromossomas em estudo. Em caso de heterozigotia o resultado será a formação de dois picos com uma razão de 1:1 e em homozigotia ou monossomia apenas aparecerá um pico, o que é pouco informativo. A deteção de três picos, na razão 1:1:1, ou de dois picos, nas proporções 2:1 ou 1:2, é indicativa da presença de uma cópia extra, como no caso da trissomia (Figura 31) [73]. A Q-PCR é fiável na deteção de trissomias [74]. Suspeitas de T13 e T21 devem ter seguimento citogenético para perceber se são casos de herança de translocações Robertsianas [74].

37

[Fonte: https://devyser.com/articles/principles-of-qf-pcr/ , acedido em 20/05/2018]1.

Pelo facto destes procedimentos invasivos acarretarem risco de aborto, estes procedimentos são aplicados apenas a um pequeno grupo de mulheres que têm um elevado risco de descendência com alterações cromossomais [7].

6.4.

T

-

Recentemente, vários esforços têm sido feitos para encontrar alternativas de teste pré-natal menos invasivas [75] e sem o risco da perda fetal que têm os métodos invasivos (amniocentese e biópsia das vilosidades coriónicas). Uma opção envolve a análise de DNA fetal livre (extracelular) no plasma materno [75, 76].

38 Foi então proposto um método de duas fases, do qual fazem parte um rastreio combinado de 1º trimestre seguido de um teste ao DNA fetal – conhecido como non-invasive prenatal test, teste pré-natal não invasivo (NIPT) –, caso o teste combinado seja indicativo de um risco acima de um limite específico [77].

De salientar que o NIPT é considerado um rastreio e não um diagnóstico [78].

6.4.1.DNA FETAL LIVRE (CFDNA) NO SANGUE MATERNO

Em 1997, Lo et al., reportaram que o plasma de mulheres grávidas continha cfDNA, incluindo uma fração fetal [6, 75]. O cfDNA permite uma nova realidade na análise pré-natal de anomalias cromossómicas [79].

São possíveis origens de cfDNA, a destruição de células fetais no sangue materno, transferência via placentária ou da apoptose de trofoblastos que delimitam o espaço entre vilosidades. Contudo, a origem ainda é controversa [75]. O cfDNA pode ser detetado às 4 semanas de gestação e os seus fragmentos têm cerca de 150 pares de bases [6]. O tempo de semi-vida do DNA fetal no plasma materno é de 16,3 minutos, sendo a sua análise livre da interferências de gestações anteriores [75].

Níveis significativos de DNA fetal, no plasma materno, são encontrados em grávidas com fetos com aneuploidias. Níveis elevados de cfDNA estão presentes nas gestantes com fetos portadores de T21 [75]. O isolamento e análise de cfDNA fetal permitem uma deteção de T21 a uma taxa de 99,2% e uma taxa de falsos positivos de 0,09% (Tabela 5) [62].

39 Tabela 5 – Taxas de deteção e de falsos positivos dos diferentes modos de rastreio pré-natal na Columbia Britânica, de 2012 a 2015.

Adaptado de [60].

6.4.2.MÉTODOS DO NIPT

O primeiro teste comercial para deteção de aneuploidias com recurso ao cfDNA ficou disponível em 2011 e desde então outros testes com aplicação de técnicas de sequenciação genética têm sido desenvolvidos [80].

Uma dessas metodologias, a shotgun massively parallel sequencing (s-MPS), conta e sequencia milhões de fragmentos de DNA no plasma [79]. Essas pequenas sequências são mapeadas no cromossoma de origem e se houver excesso ou défice de informação no cromossoma de interesse, é compatível com a existência de uma aneuploidia. Esta abordagem sequencia todas as regiões informativas dos cromossomas, daí a designação de “shotgun” [6, 80]. Tem alta performance para a deteção de T21, T18 e T13, com baixa taxa de erro (2%) [79].

A sequenciação massiva paralela dirigida/alvo (targeted massively parallel sequencing, t-MPS) é uma alternativa semelhante à s-MPS, com a diferença que sequencia apenas cromossomas específicos (Figura 32). Ambas têm a desvantagem de não distinguir o cfDNA maternal do fetal [80].

40 A s-MPS analisa cfDNA fetal de todos os cromossomas. A t-MPS é dirigida aos fragmentos de cromossomas de interesse, possuindo, para tal, uma fase inicial de amplificação da sequência-alvo. Adaptado de [81]

O DNA materno e o fetal apresentam diferenças nos polimorfismos de um único nucleótido (single nucleotide polymorphism, SNPs). Isto permite a determinação do risco de o feto ser portador de uma aneuploidia, através da amplificação direcionada para os cromossomas de interesse (21, 18 ou 13, por exemplo) e a análise de vários SNPs [80]. Como recorre também a amostra paterna para comparação, este método tem a vantagem de poder dar informação sobre a origem (paterna ou materna) da aneuploidia, recombinação e mutações herdadas, e a desvantagem de revelar casos de consanguinidade ou de não-paternidade, inadvertidamente. Os procedimentos e análise de dados é diferente da s-MPS e da t-MPS [6].

Todas estas metodologias têm provado ser eficazes, dependendo o seu sucesso dos avanços na biologia molecular e na sequenciação, dos últimos anos [6].

41

6.4.3.CUSTOS DO NIPT

Atualmente, o custo da análise de cfDNA é elevado. Embora isto possa não dissuadir os indivíduos de quererem ser testados e até seja uma despesa suportável, quando se considera a aplicação generalizada, o seu preço tem um impacto significativo [80]. É uma consideração importante para os responsáveis pela Saúde Pública, não estando o NIPT ao alcance de qualquer país [6, 82].

O estabelecimento do teste dependerá do seu custo-efeito, comparando-se com as estratégias de rastreio e diagnóstico já disponíveis [80]. Assim, terá de ser avaliada qual a política de distribuição mais vantajosa, de entre as seguintes:

 para as gestantes que apresentam risco elevado no rastreio combinado – pequena redução dos casos detetados; grande redução dos falsos positivos; é a política menos dispendiosa;

 ser universal, substituindo todas as modalidades de rastreio atuais – alta taxa de deteção; pequena taxa de falsos positivos; custo elevado;

 ser contingente, para 10-20% das mulheres com o maior risco, baseado no teste combinado – plano eficiente; custos menores em comparação com a política universal;

 apenas para grávidas com idade avançada e jovens com teste combinado positivo – política mais adequada com redução massiva da taxa de falsos positivos; menos eficaz e mais dispendiosa que a contingente.

Apesar de tudo, o desenvolvimento dos testes e o seu uso generalizado levará consequente e inevitavelmente à redução dos custos [6, 79]

6.4.4.PARTICULARIDADES CLÍNICAS

Nem todas as gestantes são elegíveis para o NIPT [79], não estando validado para as que apresentam baixo risco de ter um feto portador de aneuploidia ou para gestações múltiplas [83].