Identificação de células leucêmicas por citometria de fluxo utilizando lectinas conjugadas

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(1)UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS NÍVEL DOUTORADO. IDENTIFICAÇÃO DE CÉLULAS LEUCÊMICAS POR CITOMETRIA DE FLUXO UTILIZANDO LECTINAS CONJUGADAS. ELIZANGELA FERREIRA DA SILVA. RECIFE 2010.

(2) Silva, E.F.. Identificação de Células Leucêmicas.... ELIZANGELA FERREIRA DA SILVA. IDENTIFICAÇÃO DE CÉLULAS LEUCÊMICAS POR CITOMETRIA DE FLUXO UTILIZANDO LECTINAS CONJUGADAS. Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas da Universidade Federal de Pernambuco, como pré-requisito para obtenção do título de Doutor em Ciências Biológicas, Área de concentração - Biotecnologia.. ORIENTADOR: Prof. Dr. Luiz Bezerra de Carvalho Júnior CO-ORIENTADORES: Prof. Dr. Eduardo Isidoro Carneiro Beltrão Profª. Dra Maria do Socorro de Mendonça Cavalcanti. RECIFE 2010.

(3) Silva, E.F.. Identificação de Células Leucêmicas.... Silva, Elizangela Ferreira da Identificação de células leucêmicas por citometria de fluxo utilizando lectinas conjugadas/ Elizangela Ferreira da Silva. – Recife: O Autor, 2010. 100 folhas : il., fig., tab. Tese (doutorado) – Universidade Federal de Pernambuco. CCB. Pós-Graduação em Ciências Biológicas, 2010. Inclui bibliografia e anexos. 1. Leucemia 2. Câncer 3. Doenças – Diagnóstico 4. Glicoproteínas 5. Lectinas I. Título.. 616.99419. CDD (22.ed.). UFPE/ CCB – 2010- 089.

(4) Silva, E.F.. Identificação de Células Leucêmicas....

(5) Silva, E.F.. Identificação de Células Leucêmicas.... AGRADECIMENTOS Aos professores Dr. Luiz Bezerra de Carvalho Júnior, Dr. Eduardo Isidoro Carneiro Beltrão e Dra. Maria do Socorro de Mendonça Cavalcanti pela atenção, dedicação e por acreditar em meu potencial para a execução deste trabalho. As Dra. Vera Morais, Dra. Edinalva Leite e Dra. Tereza Cartaxo do Centro de Oncohematologia Pediátrica (CEONHPE) do Hospital Universitário Oswaldo Cruz da Universidade de Pernambuco, pela oportunidade de realizar este estudo no Laboratório de Imunofenotipagem desta instituição. A Dra. Mariluze Oliveira e Juliene Coelho do Laboratório de Imunofenotipagem do CEONHPE pelo apoio e amizade que me incentivaram a concluir o trabalho. As Dra. Terezinha Sales e Dra. Eliane Ventura do Laboratório de Citogenética do CEONHPE pela amizade e ajuda na análise de microscopia de fluorescência. As Dra. Cíntia Machado, Dra. Ana Elita e Amélia do Laboratório de Imunofenotipagem da Fundação de Hematologia e Hemoterapia de Pernambuco (HEMOPE) pela amizade, carinho e ajuda durante o desenvolvimento desta tese. A Dra. Ana Paula Fernandes e amigos do Hospital Getúlio Vargas pelo apoio e afastamento temporário concedido para conclusão deste trabalho. Aos colegas de turma do Doutorado pela amizade durante esses anos, em especial para Rosiana, Thalita e Gerlane. A meus pais e irmãs que me apoiaram durante a realização da tese, em especial a minha mãe que sempre me incentivou a novas conquistas. A Levi Dias, por estar ao meu lado durante todos os momentos, desde a seleção até a defesa, me incentivando e apoiando. A Deus por todos e por tudo que já conquistei. Muito obrigada!.

(6) Silva, E.F.. Identificação de Células Leucêmicas.... RESUMO Anticorpos são largamente utilizados para caracterizar células leucêmicas dentre seus estágios de diferenciação. O uso de lectinas, (glico)proteínas que reconhecem especificamente carboidratos, como sonda de análise da superfície celular fornece informações sobre carboidratos na membrana celular. A diferenciação das células e sua transformação maligna são caracterizadas por mudanças nos resíduos de carboidratos de glicoconjugados de membrana celular as quais podem ser detectadas por lectinas. Neste estudo, células de medula óssea de pacientes com leucemia mielóide aguda (LMA) e linfóide aguda (LLA), recém diagnosticados no Centro de Oncohematologia Pediátrica do Hospital Universitário Oswaldo Cruz/UPE e Fundação de Hematologia e Hemoterapia de Pernambuco (HEMOPE), foram avaliadas usando um painel com cinco lectinas conjugadas ao isotiocianato de fluoresceina, FITC (fluorescein isothiocyanate), Wheat germ agglutinin (WGA), Lotus tetragonolobus agglutinin (LTA), Concanavalina A (Con A), Ulex europaeus (UEA I) e Arachis hypogaea (PNA), de acordo com o protocolo de marcação utilizado para o diagnóstico de rotina com anticorpos monoclonais. A WGA, específica para N-acetilglicosamina, marcou intensamente as células leucêmicas de pacientes com LLA e LMA, mas não foi capaz de diferenciá-las. Entretanto, a UEA-I (L-fucose) mostrou maior especificidade para as células de linhagem mielóide (LMA) do que para LLA, sendo capaz de diferenciá-las. A LTA marcou tanto as células de LMA quanto de LLA, embora apresente também especificidade para o carboidrato L-fucose. Não foi observada marcação seletiva para as lectinas PNA (D-galactose específica) e Con A (D-glicose/D-manose) para as células de LLA e LMA. Estes achados demonstram que lectinas são potenciais sondas para detectar mudanças no perfil sacarídico de glicoconjugados de membrana de células hematopoiéticas imaturas, sendo mais uma ferramenta para o diagnóstico dos diferentes tipos de leucemia. Palavras-chave: Lectinas, Leucemia, Citometria de Fluxo..

(7) Silva, E.F.. Identificação de Células Leucêmicas.... ABSTRACT Antibodies are largely applied for the caractherization of leukemia cells in their differentiation stages. The use of lectins, (glyco)proteins that specifically recognize carbohydrates, as cell surface probes helps to understand the sugar content of cell membrane. Changes in saccharide moieties of glycoconjugates of cell membranes are features of cell differentiation and malign transformation which can be detected by lectins. In this study bone marrow cells from patients with acute myeloid leukemia (AML) and acute lymphoid leukemia (ALL) diagnosed at the Pediatric Oncohaemathology Centre of Oswaldo Cruz University Hospital – UPE and Fundation of Haemathology and Haemotherapy of the State of Pernambuco (HEMOPE) were evaluated with lectins conjugated to fluorescein isothiocyanate, FITC, Wheat germ agglutinin (WGA), Lotus tetragonolobus agglutinin (LTA), Concanavalina A (Con A), Ulex europaeus (UEA-I) e Arachis hypogaea (PNA), according to the protocol of routine diagnosis with monoclonal antibodies. WGA, N-acetyl-glucosamine specific, was positive to AML and ALL cells but failed to differentiate them. UEA-I (L-fucose) showed higher specificity for AML cell than to ALL being able to differentiate them. LTA (also L-fucose specific) recognized both leukemia cell lineages with the same pattern. It was not observed selective staining for AML and ALL by PNA and Con A, D-galactose and D-glucose/D-mannose specific, respectively. Results demonstrate that lectins are potential probes for the detection of changes in the saccharide profile in cell membrane glycoconjugates of immature haematopoietic cells being an auxiliary tool for the diagnoses of leukemia. Keywords: Lectins, Leukemia, Flow Cytometry.

(8) Silva, E.F.. Identificação de Células Leucêmicas.... LISTA DE FIGURAS. Figura 1: Representação esquemática do citômetro de fluxo.. 22. Figura 2: Análise das características físicas das células – tamanho e complexidade interna, no citômetro de fluxo.. 23. Figura 3: Esquema de desenvolvimento das células B e T, com seus respectivos antígenos, de acordo com os diferentes estágios de maturação celular.. 25. Figura 4. Domínio de reconhecimento de carboidrato da lectina. A: α-Metilmanose no sítio de ligação da ConA. B: N-acetilglicosamina no sítio de ligação da WGA. Interações hidrofóbicas são indicadas por linhas em amarelo, interações eletrostáticas e pontes de hidrogênio são ilustradas por linhas em vermelho.. 29. Figura 5: Princípio experimental de biomarcador de glicoproteína. Este esquema mostra que alterações significantes na glicosilação ocorrem de maneira associada com os vários estágios na célula, ex. no desenvolvimento, diferenciação e tumorogênese.. 30.

(9) Silva, E.F.. Identificação de Células Leucêmicas.... LISTA DE TABELAS. Tabela 1: Classificação FAB (Grupo Franco-Americano-Britânico) da leucemia mielóide aguda.. 18. Tabela 2: Classificação da leucemia aguda de acordo com a Organização Mundial da Saúde (OMS).. 19. Tabela 3: Painel de marcadores utilizados para caracterizar leucemias agudas de acordo com grupo EGIL (Grupo Europeu para Caracterização Imunológica das Leucemias).. 26. Tabela 4: Sistema de pontuação para definição da leucemia aguda bifenotípica recomendado pelo grupo EGIL (Grupo Europeu para Caracterização Imunológica das Leucemias).. 26.

(10) Silva, E.F.. Identificação de Células Leucêmicas.... SUMÁRIO. RESUMO ABSTRACT Lista de Figuras Lista de Tabelas 1 INTRODUÇÃO. 09. 2 OBJETIVOS. 12. 2.1 GERAL. 12. 2.2 ESPECÍFICOS. 12. 3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA. 13. 3.1 Leucemia. 13. 3.2 Citometria de fluxo. 21. 3.3 Lectinas. 27. 4 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS. 33. 5 ARTIGO CIENTÍFICO I Lectin in flow cytometry: helping to diagnose Leukemia. 44. 6 ARTIGO CIENTÍFICO II Ulex europeus I auxiliary tool for diagnose acute myeloid leukemia by flow cytometry. 60. 7 ARTIGO CIENTÍFICO III Comparative Analysis of Leukemia Differentiation Stages by Cell Surface Carbohydrates Using Lectins. 71. 8 CONCLUSÕES. 87. 9 ANEXOS. 88.

(11) Silva, E.F.. Identificação de Células Leucêmicas.... 1 INTRODUÇÃO. Câncer representa um grupo heterogêneo de doenças que afeta humanos com alta frequência, e contribui significantemente para a morbidade e mortalidade (MARTINKOVA et al., 2009). O câncer infanto-juvenil (abaixo de 19 anos) é considerado raro quando comparado com os tumores do adulto, correspondendo a 2-3% de todos os tumores malignos. Estimativa realizada pelo Intituto Nacional do Câncer (INCA) para o biênio 2008/09 revela que ocorreriam cerca de 9.890 casos por ano em crianças e adolescentes com até 18 anos de idade (MINISTÉRIO DA SAÚDE/INCA/SOBOPE, 2008). A leucemia aguda é o tipo de câncer mais comum em crianças, correspondendo a um terço das doenças malignas. A leucemia linfoblástica aguda (LLA) e a leucemia mielóide aguda (LMA) representam um grupo heterogêneo de doenças, sendo a LLA mais frequente em crianças do que a LMA que é mais frequente em adultos. A expectativa de cura para a LLA tem sido em torno de 75-80%. Ao contrário da LLA a LMA é mais difícil de ser tratada (SHAH & AGARWAL, 2008). O diagnóstico e a classificação das leucemias agudas baseavam-se, em grande parte, na análise morfológica e citoquímica das células neoplásicas. A falta de reprodutibilidade dessas análises e a dificuldade para classificar algumas leucemias incentivaram à busca de outros parâmetros. Assim o diagnóstico e a classificação das leucemias agudas apóiam-se, em grande parte, nos estudos imunofenotípicos por citometria de fluxo, permitindo avançar na identificação de determinados subgrupos dificilmente classificáveis do ponto de vista morfológico (FARIAS & CASTRO, 2004). A imunofenotipagem por citometria de fluxo é essencial para estabelecer o correto diagnóstico da leucemia e definir a linhagem celular, sendo capaz de reconhecer LLA de.

(12) Silva, E.F.. Identificação de Células Leucêmicas.... linhagem T, LLA de linhagem precursora de células B, LMA e leucemia aguda bifenotípica (RUIZ-ARGUELLES et al., 2005; PUI et al., 2008). A classificação das leucemias agudas através da análise de marcadores de superfície é uma área de grande interesse na pesquisa e tem sido estimulada pela aplicação de anticorpos monoclonais (KALEEM et al., 2003). Devido à falta de anticorpos específicos relacionados à diferenciação celular, com raras exceções, a classificação imunológica é usualmente baseada no padrão de reatividade de um painel (grupo selecionado) de anticorpos monoclonais associados à linhagem (DUNPHY, 2004). Na prática laboratorial utilizam-se, rotineiramente, um painel de anticorpos monoclonais conjugados ao isotiocianato de fluoresceína (FITC - fluorescein isothiocyanate) ou ficoeritrina (PE - phycoeritrin), para o diagnóstico e classificação das leucemias. Uma alternativa ou uma abordagem complementar para estes biomarcadores (anticorpos) é o uso de lectinas conjugadas a marcadores fluorescentes, em citometria de fluxo. Lectinas são proteínas de origem não imunológica, ubiquamente distribuídas na natureza, que reconhecem especificamente carboidratos e participam de uma variedade de processos celulares (GABIUS et al., 2002; DAMODARAN et al., 2007). Como muitas lectinas ligam-se especificamente a carboidratos terminais de glicoproteínas e glicolipídeos presentes na membrana das células, elas podem ser usadas para caracterizar esses glicoconjugados (GORELIK et al., 2001). Durante a diferenciação celular e transformação maligna, a biossíntese das cadeias de oligassacarídeos de glicoproteínas é freqüentemente alterada e esta alteração pode ser detectada pelas lectinas (GORELIK et al., 2001; CASTILLO-VILLANUEVA et al., 2005; DAMODARAN et al., 2007). Numerosos dados mostram que a transformação maligna está associada a várias alterações na expressão de carboidratos, indicando que os glicoconjugados desempenham um importante papel nesta transformação (SINHA et al., 1999; GORELIK et al., 2001; SHARON.

(13) Silva, E.F.. Identificação de Células Leucêmicas.... & LIS, 2004, 2007). As lectinas muitas vezes tem maior preferência por células transformadas do que por células normais, por causa do grande número de receptores (açúcares) ou a distribuição alterada destes receptores na superfície das células cancerígenas (HEINRICH et al., 2005; SHARON & LIS, 2007). A reação de reconhecimento lectina-carboidrato é tão específica quanto a antígenoanticorpo. A partir desta característica, as lectinas estão sendo utilizadas, experimentalmente, como sondas de sacarídeos de células neoplásicas da mama (BELTRÃO et al., 1998, 2001), cérebro humano (BELTRÃO et al., 2003), leucemia (PÉREZ-CAMPOS-MAYORAL et al., 2008), entre outros. As lectinas conjugadas ao FITC, como os anticorpos, reforçam a possibilidade de utilização desta classe de macromoléculas para identificação das células leucêmicas de linhagem mielóide e linfóide. O diagnóstico e a classificação das leucemias agudas são um argumento de contínua evolução, visto que permitem a identificação do tipo celular envolvido na leucemogênese, o que é essencial, pois orienta a terapêutica e determina, até certo ponto, o prognóstico (FARIAS & CASTRO, 2004; BASSO et al., 2007)..

(14) Silva, E.F.. Identificação de Células Leucêmicas.... 2 OBJETIVOS. 2.1 GERAL. Empregar lectinas conjugadas ao FITC para o reconhecimento de células blásticas de leucemia linfóide aguda (LLA) e leucemia mielóide aguda (LMA) através da citometria de fluxo.. 2.2 ESPECÍFICOS. 1. Utilizar as lectinas Wheat germ agglutinin (WGA), Lotus tetragonolobus agglutinin (LTA), Concanavalina A (Con A), Ulex europaeus (UEA I) e Arachis hypogaea (PNA) conjugadas ao FITC como sondas para carboidratos de superfície de células leucêmicas de LLA e LMA; 2. Avaliar a ligação da lectina Ulex europaeus (UEA I) a células leucêmicas de LMA e seus subtipos; 3. Comparar os resultados obtidos com os anticorpos CD45, CD34, CD10, CD19, CD3, CD7, CD13 and CD33 conjugados a PE ou ao FITC, utilizados na rotina diagnóstica, com as lectinas WGA, LTA, Con A, UEA I e PNA conjugadas com FITC..

(15) Silva, E.F.. Identificação de Células Leucêmicas.... 3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA. 3.1 LEUCEMIA. Hematopoiese é um sistema altamente organizado responsável pela produção das células sanguíneas. O controle da proliferação, diferenciação e maturação das células são feitos através de uma complexa interação molecular das células com o microambiente da medula óssea (SACHS, 1995). É um processo complexo regulado pela expressão coordenada de diversos fatores de transcrição, os quais são ativados ou inibidos de acordo com o produto final da hematopoiese (PUI et al., 2004). Leucemia é uma doença clonal de células precursoras hematopoiéticas e desenvolve-se através de uma série de mutações no clone. Resulta em uma progressiva diversificação genética seguida por uma “seleção natural” de subclones mutantes dominantes (GREAVES, 2002). Evidências epidemiológicas sugerem que radiação ionizante; agentes químicos como pesticidas e benzeno; viroses, vírus tipo I da leucemia/linfoma de células T, vírus de EpsteinBarr e bactéria, como o Helicobacter pylori, podem estar envolvidos no desenvolvimento de alguns subtipos de leucemia e linfoma em adultos e crianças (ALEXANDER, 1995; GREAVES, 2002). Leucemia aguda é o câncer mais comum em crianças representando cerca de metade de todos os tipos de câncer entre pessoas jovens menores que 15 anos, com uma taxa de incidência crescente nos últimos anos (BASSO et al., 2007). Devido a hematopoiese em vertebrados ser intensamente ativa durante o desenvolvimento fetal e nos primeiros anos de vida, é de se esperar que a leucemia seja mais comum em crianças, podendo afetar adultos também (PUI et al., 2004). Na infância, a.

(16) Silva, E.F.. Identificação de Células Leucêmicas.... incidência é um pouco maior em pessoas do sexo masculino e de cor branca (REDAELLI et al., 2005). No Brasil é também o tipo mais freqüente de câncer em crianças e adolescentes, alcançando uma média de 29% entre os casos nessa faixa etária. Em Recife, no período 1997-2001, ocorreu uma média de 50 casos, anualmente, por um milhão em meninos. Nas meninas, esse número é um pouco menor, 47 casos por milhão. Os dados constam de um estudo inédito feito pelo Instituto Nacional de Câncer (INCA) juntamente com a Sociedade Brasileira de Oncologia Pediátrica, SOBOPE (MINISTÉRIO DA SAÚDE/INCA/SOBOPE, 2008). As leucemias são classificadas com base no tipo celular envolvido e no grau de maturação das células leucêmicas, podendo ser agudas ou crônicas. As leucemias crônicas são definidas como uma hiperplasia de elementos maduros onde a proliferação clonal não está associada inicialmente a um bloqueio maturativo. Assim a população celular diferencia-se e amadurece, embora haja graus variáveis de displasia, o que compromete funcionalmente a população afetada. Tendem a constituir distúrbios relativamente indolentes nos seus estágios iniciais, porém, tardiamente podem transformar-se em neoplasias agressivas, semelhantes às leucemias agudas (ANJOS et al., 2000). As leucemias agudas caracterizam-se pela proliferação clonal acompanhada de bloqueio maturativo variável, o que possibilita a existência de diferentes subtipos de leucemias. São reconhecidas duas variantes principais das leucemias agudas: as de origem linfóide, leucemia linfóide aguda (LLA), e as de origem mielóide, leucemia mielóide aguda (LMA) (ANJOS et al., 2000). A LLA e a LMA representam um grupo heterogêneo de doenças, que resultam de mecanismos diversos de leucemogênese. Leucemias agudas são definidas como uma doença genética, de fato, as anormalidades genéticas estão presentes em mais de 80% das LLAs e.

(17) Silva, E.F.. Identificação de Células Leucêmicas.... mais de 90% das LMAs, e a maioria destas alterações genéticas são recorrentes (BASSO et al., 2007). A LLA é uma doença maligna derivada das células linfóides indiferenciadas (linfoblastos) que estão presentes em grande número na medula óssea, sangue e outros órgãos. Acumula-se grande quantidade de linfoblastos, pois os mesmos mantêm capacidade de multiplicação, mas não de diferenciação até formas maduras e normais (LORENZI, 2003; JABBOUR et al., 2005). Embora a LLA possa ocorrer em qualquer idade, sua incidência é maior entre crianças de 2 a 5 anos (PUI et al., 2008), numa porcentagem de cerca de 70%, diminuindo entre adolescentes e adultos jovens, entre os quais a incidência das leucemias agudas é de 20% (LORENZI, 2003), voltando a crescer após os 60 anos de idade (FALCÃO et al., 2002). O evento preciso que leva ao desenvolvimento da leucemia linfóide aguda é desconhecido. Poucos casos (< 5%) estão associados com hereditariedade, síndromes com predisposição genética, como síndrome de Down, síndrome de Bloom, ataxia-telangiectasia, ou com irradiações ionizantes ou exposição a drogas quimioterápicas e específicas (JABBOUR et al., 2005; PUI et al., 2008). O diagnóstico laboratorial da LLA é complexo e baseia-se em análises citomorfológica, imunológica, citogenética e molecular. A imunofenotipagem detalhada dos blastos leucêmicos distingue vários estágios de diferenciação de linfoblastos B ou T, podendo ser classificada como LLA de linhagem B ou T. As leucemias de linhagem B foram divididas de acordo com os estágios de diferenciação dos progenitores B na medula óssea, classificando-se em: pró-B, comum, pré-B e B-maduro. As LLAs de linhagem T dividem-se também de acordo com os níveis de diferenciação: LLA pró-T, pré-T, T-cortical e T-maduro (FALCÃO et al., 2002; COOLS & VANDENBERGHE, 2009)..

(18) Silva, E.F.. Identificação de Células Leucêmicas.... A LMA é uma doença clonal que se caracteriza pela proliferação anormal de células progenitoras da linhagem mielóide, ocasionando produção insuficiente de células sanguíneas maduras normais. A expansão clonal de vários tipos de células precursoras hematopoiéticas na medula óssea conduz a desorganização do delicado balanço entre auto-renovação e a diferenciação, que é característica da hematopoiese normal (MARTINS & FALCÃO, 2000; SILVA et al., 2006). O mecanismo que leva a célula progenitora da linhagem mielóide a perder o controle da proliferação celular, ocasionando a expansão do clone leucêmico, permanece incerto. Um aumento no número de aberrações genéticas, como translocações cromossômicas, que alteram a função dos fatores regulatórios de transcrição, tem sido identificado como a causa da LMA (ALTUCCI et al., 2005). A LMA é uma doença predominante em adultos mais velhos (acima de 60 anos de idade), em mais de 50% dos casos (LÖWENBERG, 2001; IOVINO & CAMACHO, 2003). É mais comum no sexo masculino do que no feminino (DOUER, 2003), representa cerca de 1520% das leucemias agudas da infância e 80% das dos adultos (HALL, 2001; SILVA et al., 2006). O termo leucemia mielóide aguda é usado várias vezes para designar leucemias não linfóides, incluindo mielocítica (M0, M1, M2, M3), monocítica (M4, M5), eritróide (M6), e megacariocítica (M7) (CAMPANA & BEHM, 2000). É uma mistura de doenças distintas que diferem com relação a sua patogênese, anormalidades genéticas, características clínicas, resposta à terapia e prognóstico. Análise molecular e genética tem sido importante para identificação da doença dentre o grupo de subtipos de LMAs (LÖWENBERG et al., 2003). Em 1976, o grupo cooperativo Franco-Americano-Britânico (FAB) propôs um sistema de classificação para a LMA baseado nos aspectos morfológico e citoquímico. O grupo sugere que leucemia aguda com menos que 3% de blastos mieloperoxidase (MPO) e ou Sudan Black.

(19) Silva, E.F.. Identificação de Células Leucêmicas.... (SBB) positivo são LLA, onde se maior ou igual a 3% de blastos positivos o diagnóstico é LMA (BENNETT et al., 1976; STASI et al., 1999). A revisão desta classificação publicada em 1985 foi amplamente usada e reconhecida como a classificação padrão para LMA. Foi incluído na classificação FAB dois grupos que exibiam diferenciação monocítica, leucemia mielomonocítica (LMA-M4), e leucemia monocítica/monoblástica (LMA-M5) (BENNETT et al., 1985; XU et al., 2009). Em 1991, o grupo propôs critérios para designar a leucemia mielóide aguda minimamente diferenciada a LMA-M0 (STASI et al., 1999). Contudo, a classificação FAB está sendo substituída pela classificação da Organização Mundial da Saúde (OMS). Em 2001 a OMS em conjunto com a Sociedade de Hematopatologia e Associação Européia de Hematopatologia, publicou uma nova classificação para neoplasias mielóides. Ao contrário da classificação FAB (Tabela 1) a OMS inclue achados morfológicos, genéticos, imunofenotípicos, biológicos, e características clínicas para definir grupos específicos da doença (SHAH & AGARWAL, 2008). Recentemente, uma revisão desta classificação foi publicada como parte da 4a edição da série de monografias da OMS. O objetivo desta revisão foi incorporar novas informações científicas e clínicas para refinar os critérios de diagnóstico para neoplasias já descritas, e introduzir doenças recentemente reconhecidas (SWERDLOW et al., 2008; VARDIMAN et al., 2009). A Tabela 2 lista os subtipos da leucemia aguda de acordo com a classificação OMS. Muitos casos de leucemia aguda podem ser classificados como mielóide e linfóide usando a classificação FAB e um painel de marcadores imunológicos. Entretanto, mesmo com morfologia, citoquímica e imunofenotipagem ainda é difícil determinar, em alguns pacientes, se as células leucêmicas são derivadas de linhagem mielóide ou linfóide. Estes casos são classificados como leucemia de linhagem ambígua de acordo com a classificação da OMS de.

(20) Silva, E.F.. Identificação de Células Leucêmicas.... doenças hematológicas, incluindo leucemia aguda indiferenciada, leucemia aguda bilineal, e leucemia aguda bifenotípica, as quais representam cerca de 5% do total de leucemias agudas (XU et al., 2009).. Tabela 1. Classificação FAB (Grupo Franco-Americano-Britânico) da leucemia mielóide aguda. Subtipo. Classificação. M0. LMA com mínima diferenciação. M1. Leucemia mieloblástica sem maturação. M2. Leucemia mieloblástica com maturação. M3. Leucemia promielocítica aguda. M4. Leucemia mielomonocítica aguda. M5. Leucemia monoblástica/monocítica aguda. M6. Leucemia eritroblástica aguda. M7. Leucemia megacarioblástica aguda. (Fonte: SHAH & AGARWAL, 2008). Leucemia aguda bifenotípica e bilineal são também conhecidas como leucemia de linhagem mista, nas quais ambas células mielóide e linfóide estão envolvidas. Por definição, leucemia bifenotípica significa uma linhagem de células leucêmicas, mas que expressam marcadores mielóide e linfóide. Por outro lado, leucemia aguda bilineal significa que há distintas populações (dois ou mais subtipos) de células expressando marcadores linfóides e mielóides, em um único paciente (RUBNITZ et al., 2009; XU et al., 2009)..

(21) Silva, E.F.. Identificação de Células Leucêmicas.... Tabela 2. Classificação da leucemia aguda de acordo com a Organização Mundial da Saúde (OMS). Leucemia mielóide aguda Leucemia mielóide aguda com anormalidades genéticas recorrentes LMA com t(8;21)(q22;q22); RUNX1-RUNX1T1 LMA com inv(16)(p13.1q22) or t(16;16)(p13.1;q22); CBFB-MYH11 LMA com APL with t(15;17)(q22;q12); PML-RARA LMA com t(9;11)(p22;q23); MLLT3-MLL LMA com t(6;9)(p23;q34); DEK-NUP214 LMA com inv(3)(q21q26.2) or t(3;3)(q21;q26.2); RPN1-EVI1 LMA (megacarioblástica) com t(1;22)(p13;q13); RBM15-MKL1 Entidade provisória: LMA com mutação NPM Entidade provisória: LMA com mutação CEBPA Leucemia mielóide aguda com alterações relacionadas a mielodisplasia Neoplasia mielóide relacionada à terapia Leucemia mielóide aguda (mesma classificação) LMA com mínima diferenciação LMA sem maturação LMA com maturação Leucemia mielomonocítica aguda Leucemia monoblástica/monocítica aguda Leucemia eritróide aguda Leucemia eritróide pura Eritroleucemia, eritróide/mielóide Leucemia aguda megacarioblástica Leucemia Basofílica aguda Panmielose aguda com mielofibrose Sarcoma mielóide Proliferações mielóide relacionada com a síndrome de Down Mielopoiese anormal transitória Leucemia mielóide associada com a síndrome de Down Neoplasia de células dendrítricas blástica plasmocitóide Leucemia aguda de linhagem ambígua.

(22) Silva, E.F.. Identificação de Células Leucêmicas.... Leucemia aguda indiferenciada Leucemia aguda com fenótipo misto com t(9;22)(q34;q11.2); BCR-ABL1 Leucemia aguda com fenótipo misto com t(v;11q23); rearranjo MLL Leucemia aguda com fenótipo misto, B-mielóide Leucemia aguda com fenótipo misto, T-mielóide Entidade provisória: leucemia/linfoma linfoblástica de células natural killer (NK) Leucemia/linfoma linfoblástica B Leucemia/linfoma linfoblástica B Leucemia/linfoma linfoblástica B, com alterações genéticas recorrentes Leucemia/linfoma linfoblástica B com t(9;22)(q34;q11.2);BCR-ABL 1 Leucemia/linfoma linfoblástica B com t(v;11q23); rearranjo MLL Leucemia/linfoma linfoblástica B com t(12;21)(p13;q22) TEL-AML1 (ETV6-RUNX1) Leucemia/linfoma linfoblástica B com hiperdiploidia Leucemia/linfoma linfoblástica B com hipodiploidia Leucemia/linfoma linfoblástica B com t(5;14)(q31;q32) IL3-IGH Leucemia/linfoma linfoblástica B com t(1;19)(q23;p13.3);TCF3-PBX1 Leucemia/linfoma linfoblástica T (Fonte: VARDIMAN et al., 2009). Uma classificação apropriada de LMA é importante para a clínica e permite que futuros estudos possam expandir e refinar a compreensão dessa doença (XU et al., 2009), assim como uma adequada classificação da LLA, que atualmente apresenta um percentual de cura de 80%, devido à evolução das terapias, correspondendo a um grande sucesso na história da medicina moderna (PUI & JEHA, 2007). O diagnóstico e a classificação das leucemias envolvem vários métodos incluindo morfologia, citoquímica, citogenética clássica e genética molecular, imunofenotipagem e biologia molecular. Estes métodos de diagnóstico são pré-requesitos para estratégias de tratamento individual e para avaliação da resposta ao tratamento, especialmente considerando que vários tipos de leucemia possuem terapia específica (BASSO et al., 2007)..

(23) Silva, E.F.. Identificação de Células Leucêmicas.... 3.2 CITOMETRIA DE FLUXO. O diagnóstico e tratamento da leucemia dependem da detecção inequívoca da população de células leucêmicas e a identificação da linhagem hematopoética da qual a população se origina. Esta tarefa é melhor realizada pelo uso da análise imunológica contemporânea, a imunofenotipagem das doenças hematológicas por citometria de fluxo (CAMPANA & BEHM, 2000). A citometria de fluxo é uma técnica multiparamétrica que utiliza anticorpos monoclonais conjugados a um composto fluorescente para analisar qualitativa e quantitativamente padrões de expressão de antígenos em populações celulares de interesse (RADCLIFF & JAROSZESKI, 1998; HARRIS et al., 1999). O equipamento utilizado para a técnica é denominado citômetro de fluxo que possui quatro componentes principais, incluindo um laser que incide sobre as células, fotodetectores de sinais, suspensões celulares marcadas com anticorpos fluorescentes e um computador ligado ao sistema. O computador elabora gráficos e histogramas, divididos em regiões de parâmetros de fluorescência denominadas FL1, FL2, FL3, FL4, etc., que possibilitam a análise de populações celulares diferentes, dentro de uma mesma amostra, desde que marcadas com fluorocromos distintos (Figura 1) (QUIXABEIRA & SADDI, 2008). Os fluorocromos mais utilizados são o isotiocianato de fluoresceína (fluorescein isothiocyanate - FITC) e a ficoeritrina (phycoerythrin - PE), que emitem luz com diferentes comprimentos de onda. Outros fluocromos como PerCP (peridinin chlorophyll protein complex), APC (allophycocyanin), vermelho Texas e rodamina também são utilizados (CAMPANA & BEHM, 2000)..

(24) Silva, E.F.. Identificação de Células Leucêmicas.... Figura 1: Representação esquemática do citômetro de fluxo. (Fonte: http://www.fleury.com.br/.../figura3_capitulo2.gif). Os parâmetros celulares avaliados pelo método podem ser divididos em dois principais grupos, os evidenciados pela luz dispersa (que refletem o tamanho celular e complexidade interna FSC- forward scatter e SSC- side scatter, respectivamente – Figura 2) e os associados à presença de um ou mais anticorpos conjugados com fluorocromos que reconhecem moléculas celulares específicas, que podem estar no interior da célula (antígenos citoplasmáticos ou nucleares) ou na sua superfície (LORENZI, 2003), refletindo características fenotípicas importantes, como grau de diferenciação celular, linhagem celular, ploidia, expressão de proteínas apoptóticas, dentre outras (ORFAO et al., 1995; QUIXABEIRA & SADDI, 2008). A citometria de fluxo é uma técnica que oferece objetividade, sensibilidade, rapidez e precisão na análise das características celulares, incluindo o conteúdo de DNA/RNA, a detecção e quantificação de antígenos celulares, a análise de resistência celular a drogas e a análise do conteúdo citoplasmático (QUIXABEIRA & SADDI, 2008)..

(25) Silva, E.F.. Identificação de Células Leucêmicas.... Figura 2: Análise das características físicas das células – tamanho e complexidade interna, no citômetro de fluxo. (Fonte: http://www.fleury.com.br/.../figura1_capitulo2.gif). A combinação da alta afinidade, anticorpos monoclonais específicos juntamente com a sensibilidade, e processamento rápido da amostra resultam na obtenção de várias informações, que fazem da imunofenotipagem por citometria de fluxo um método de alta importância para o diagnóstico das leucemias (SAXENA & ANAND, 2008). A citometria de fluxo tem sido largamente utilizada nos laboratórios clínicos e tornouse uma poderosa ferramenta diagnóstica para caracterização imunofenotípica das leucemias e doenças linfoproliferativas crônicas, podendo ser utilizada para a identificação das linhagens mielóide e linfóide, detecção de doença residual mínima (MDR), e, mais recentemente, monitoramento de estratégias de tratamento baseadas em anticorpos (RUIZ-ARGUELLES et al., 1998; SCHABATH et al., 2003; VASCONCELOS, 2007). Embora muitas leucemias possam ser identificadas morfologicamente, com ou sem análise citoquímica, a imunofenotipagem é indispensável para a identificação da leucemia mielóide aguda minimamente diferenciada (LMA-M0), eritroleucemia (LMA-M6), megacarioblástica (LMA-M7), leucemia bifenotípica mielóide-linfóide e a determinação da.

(26) Silva, E.F.. Identificação de Células Leucêmicas.... linhagem de células B ou T nas leucemias linfoblásticas (GARAND & ROBILLARD, 1996; KALEEM et al., 2003; SAXENA & ANAND, 2008). Células precursoras de diferentes linhagens expressam diferentes tipos de moléculas na superfície, muitas delas definidas por antígenos CD (Clusters of Differentiation – “grupamentos” de diferenciação). Antígenos CD associados com a membrana plasmática de leucócitos podem ser moléculas envolvidas em uma variedade de funções como: interação célula-célula, receptores de citocinas, sinalização celular, canais iônicos, transportadores, enzimas, imunoglobulinas ou moléculas de adesão (BELOV et al., 2001). O processo de categorizar as moléculas e epítopos associados a antígenos com leucócitos humanos data dos anos 80 e, até bem recentemente, mais de trezentas moléculas relacionadas aos leucócitos são conhecidas (VASCONCELOS, 2007). A Figura 3 mostra o esquema de desenvolvimento das células B e T, com seus respectivos antígenos de acordo com os diferentes estágios de maturação celular. Antígenos leucocitários são raramente de linhagem específica. Contudo, painéis de anticorpos monoclonais utilizados para detectar antígenos restritos de linhagem podem ser usados para identificar a linhagem de células leucêmicas na maioria dos casos (JANOSSY et al., 1989; ROTHE & SCHMITZ, 1996; BOROWITZ et al., 1997; CAMPANA & BEHM, 2000)..

(27) Silva, E.F.. Identificação de Células Leucêmicas.... Figura 3: Esquema de desenvolvimento das células B e T, com seus respectivos antígenos de acordo com os diferentes estágios de maturação celular. (Fonte: PUI & JEHA, 2007). O Grupo Europeu para Caracterização Imunológica das Leucemias (EGIL), em 1995, propôs critérios para a classificação imunológica das leucemias agudas com objetivo de estabelecer as diretrizes desta classificação baseado na expressão de marcadores, e uniformizar o diagnóstico dos vários tipos de doenças hematológicas nos diversos centros de diagnóstico (BENE et al., 1995). O painel de marcadores recomendados pelo grupo EGIL para caracterizar as leucemias agudas está listado na Tabela 3. Também foi proposto pelo EGIL critérios para o diagnóstico da leucemia aguda bifenotípica, que ainda é comumente utilizado. O sistema de pontuação (scoring) é basedo no número e grau de especificidade de certos marcadores para blastos mielóide ou linfóide B ou T (Tabela 4) (BENE et al., 1995)..

(28) Silva, E.F.. Identificação de Células Leucêmicas.... Tabela 3. Painel de marcadores utilizados para caracterizar leucemias agudas de acordo com grupo EGIL (Grupo Europeu para Caracterização Imunológica das Leucemias). Primeira triagem Linfóide B. CD 19, CD22 citoplasmático, CD79a, CD10. Linfóide T. CD3 citoplasmático, CD2, CD7. Mielóide. anti-aMPO, CD13, CD33, CDw56, CD117. Não específico de linhagem. TdT, CD34, HLA-DR. Segunda triagem Se LLA de linghagem B. IgM citoplasmático, kappa, lambda, CD20, CD24. Se LLA de linghagem T. CD1a, CD3 membrana, CD4, CD5, CD8, anti-TCRαβ, anti-TCRγδ. Se LMA. anti-lisozima, CD14, CD15, CD41, CD61, CD64, anti-glicoforina A. (Fonte: BENE et al., 1995). Tabela 4. Sistema de pontuação para definição da leucemia aguda bifenotípica recomendado pelo grupo EGIL (Grupo Europeu para Caracterização Imunológica das Leucemias). Pontuação. Linhagem B. Linhagem T. Linhagem Mielóide. 2. CD79a, cIgM cCD22. cCD3/mCD3 anti-TCRαβ anti-TCRγδ. anti-aMPO (anti-lisozima). 1. CD19, CD10 CD20. CD2, CD5 CD8, CD10. CD13, CD33,CDw65. TdT, CD24. TdT, CD7 CD1a. CD14, CD15, CD64, CD117. 0,5. Nota: Cada marcador corresponde à pontuação indicada; c (citoplasmático); m (membrana). (Fonte: BENE et al., 1995).

(29) Silva, E.F.. Identificação de Células Leucêmicas.... O impacto da imunofenotipagem por citometria de fluxo no diagnóstico e acompanhamento da leucemia aguda tem sido rapidamente expandido. Este avanço pode ser atribuído ao resultado da inovação da ciência que levou a produção de centenas de anticorpos monoclonais e o avanço na tecnologia a laser (JENNINGS & FOON, 1997; SCHABATH et al., 2003), e futuramente, a utilização das lectinas como mais uma ferramenta de identificação e monitoramento dos diferentes tipos de leucemia. A citometria de fluxo também tem sido utilizada na pesquisa com lectinas conjugadas a fluocromos na determinação de glicoconjugados de superfície celular (MISLOVICOVÁ et al., 2009). Omtoft e colaboradores (1988) quantificaram o conteúdo de DNA e a ligação de carboidratos em subpopulações celulares de carcinoma de células transicional. Langkilde e colaboradores (1989) estudaram a ligação das lectinas WGA e PNA a carcinomas de células transicional, correlacionando com a classificação histopatológia, invasão, e ploidia do DNA. Sinhá e colaboradores (1999) utilizaram a lectina AchatininaH (ATNH) como sonda para identificação de 9-O-acetil sialogliconjugados (9-OAcSGs) que podem servir como biomarcadores na detecção e monitoramento de linfoblastos na leucemia linfoblástica aguda em criança, utilizando a citometria de fluxo. Mais recentemente, Pérez-Campos-Mayoral e colaboradores (2008) verificaram que a lectina Macrobrachium rosenbergii pode ser considerada como uma ferramenta útil no diagnóstico da leucemia linfoblástica aguda de células T, através da citometria de fluxo.. 3.3 LECTINAS. No século XIX foi descoberta na natureza proteínas açúcar-específico, com atividade hemaglutinante, que foram posteriormente denominadas de lectinas (SHARON, 2007)..

(30) Silva, E.F.. Identificação de Células Leucêmicas.... Do Latin legere, selecionar/escolher, as lectinas são uma classe de proteínas estruturalmente diversa, de origem não imunológica que compartilham a característica de ligar, de forma específica e reversível, a carboidratos (HAMELRYCK et al., 1999; GORELIK et al 2001; CASTILLO-VILLANUEVA & ABDULLAEV, 2005). Ubiquamente distribuídas na natureza são encontradas não apenas em plantas, mas também em microorganismos, insetos, animais e humanos (GORELIK et al., 2001; SHARON & LIS, 2007; DAMODARAN et al., 2007). Lectinas. apresentam. especificidade. definida. para. monossacarídeos. e/ou. oligossacarídeos, dentre elas podemos citar as lectinas de Canavalia ensiformis (Con A) específica para glicose/manose, Triticum vulgaris (WGA) específica para N-acetilglicosamina ou oligossacarídeos de N-acetilglicosamina e Lotus tetragonolobus agglutinin (LTA) específica para L-fucose (SHARON & LIS, 2004). As lectinas são comumente utilizadas em bioquímica, biologia celular e histoquímica para caracterizar carboidratos de superfície e glicoproteínas, devido a sua habilidade de se ligarem a carboidratos na superfície das células. Elas requerem complementariedade estrutural e conformacional do açúcar (Figura 4) para a interação ocorrer. Nas últimas duas décadas centenas de estruturas tem sido estabelecida, e a maioria das lectinas contém tipicamente dois ou mais sítios de ligação a carboidrato (THOMAS & SUROLIA, 2000; NEUMANN et al., 2004; SHARON & LIS, 2007). Há diferentes famílias de lectinas que são diversas em sua seqüência, arquitetura do sítio de ligação a carboidrato, estrutura quaternária, afinidade por carboidrato, e especificidade, bem como desempenham diferentes papéis biológicos (CHANDRA et al., 2006). Nos últimos anos, tem havido um aumento no interesse em lectinas devido a sua atividade biológica, como citoaglutinação, atividade mitogênica, citoxicidade e sonda.

(31) Silva, E.F.. Identificação de Células Leucêmicas.... histoquímica (SALLAY et al., 2000; MORIWAKI et al., 2000; OHBA & BAKALOVA, 2003, CAMPOS et al., 2006; SOBRAL et al., 2010).. A. B. Figura 4. Domínio de reconhecimento de carboidrato da lectina. A: α-Metilmanose no sítio de ligação da ConA. B: N-acetilglicosamina no sítio de ligação da WGA. Interações hidrofóbicas são indicadas por linhas em amarelo, interações eletrostáticas e pontes de hidrogênio são ilustradas por linhas em vermelho. (Fonte: NEUMANN et al., 2004). Embora a pesquisa com lectinas tenha sido iniciada há mais de 100 anos atrás, é ainda repleta de novas descobertas. Alguns subgrupos de lectinas parecem ser instrumento da comunicação inter-celular, como as selectinas que são moléculas de adesão célula-célula envolvida na interação célula endotelial-leucócito solicitada para extravasamento da corrente sanguinea nos tecidos alvos, ou colectinas que desempenham um importante papel na imunidade inata sem envolvimento de anticorpos (SALLAY et al., 2000; SHARON & LIS, 2007). Na superfície celular elas participam de processos como adesão célula-célula ou célula-matriz extracelular bem como a proliferação celular e apoptose. Muitas lectinas são conhecidas como mediadores da inflamação e quimiotáxicas. Lectinas de macrófagos, células dendríticas e natural killer estão envolvidas na proteção antitumoral, antiviral e.

(32) Silva, E.F.. Identificação de Células Leucêmicas.... antimicrobiana de organismo (HIGASHI et al., 2002; McGREAL et al., 2005; ARESCHOUG & GORDON, 2008; YOKOYAMA & RILEY, 2008; KURMYSHKINA et al., 2009). Um potencial uso de lectinas no diagnóstico envolve a determinação de alterações nos carboidratos em tecidos humanos, células, soro e outros fluidos biológicos (MISLOVICOVÁ et al., 2009). Modificações estruturais de oligossacarídeos de glicoconjugados ocorrem durante o desenvolvimento normal das células sendo a glicosilação principal modificação postranslacional (LEHLE et al., 2006). Entretanto, variação na glicosilação está associada com diferenciação e transformação maligna (Figura 5), de acordo com vários trabalhos publicados com tumores experimentais e humanos (DWEK et al., 2001; CAMPOS et al., 2006; HIRABAYASHI, 2008; TAO et al., 2008; SOBRAL et al., 2010).. Figura 5. Princípio experimental de biomarcador de glicoproteína. Este esquema mostra que alterações significantes na glicosilação ocorrem de maneira associada com os vários estágios na célula, ex. no desenvolvimento, diferenciação e tumorogênese. (Fonte: HIRABAYASHI, 2008). Células hematopoéticas normais e leucêmicas tem sido objeto de pesquisa utilizando lectinas, tendo em vista a variedade de células em seus diferentes estágios. A sensibilidade das lectinas de reconhecer resíduos de açúcares de antígenos de grupos sanguineos é comparável aos anticorpos (MATSUI et al., 2001). Diversas lectinas como: Dolichos biflorus.

(33) Silva, E.F.. Identificação de Células Leucêmicas.... agglutinin (DBA), Vicia villosa agglutinin (VVA), Phaseolus lunatus agglutinin (LBA), Glycine max agglutinin (SBA) e Helix pomatia agglutinin (HPA) reconhecem o antígeno A no grupo ABO usando o método de hemaglutinação. As lectinas Griffonia simplicifolia (GS IB4) e Ulex europeus agglutinin (UEA-I) reconhecem no sangue os antígenos B e 0 (H) do grupo ABO, respectivamente (MATSUI et al., 2001; SHARON & LIS, 2004). Células mononucleadas derivadas da medula óssea possuem oligossacarídeos Oligados a glicoproteinas, lectinas que mostram especificidade para este tipo de oligossacarídeos tem sido comumente utilizadas para fracionar subpopulações de timócitos e linfócitos (PORRAS et al., 2000). A lectina HPA pode ser empregada para identificação e isolamento de células do tipo T (DE PETRIS & TACKARS, 1983), e VVA reconhece especificamente. linfócitos. CD8+. (citotóxico). (FORTUNE. &. LEHNER,. 1988).. Fracionamento seqüencial de linfócitos pelas lectinas SBA e PNA obteve uma fração enriquecida de células pluripotente stem cell, que foram transplantadas em pacientes (REISNER, 1983). Nagler e colaboradores (1999) também estudaram a possibilidade de se utilizar a aglutinina de soja (SBA) para fracionar células da medula óssea (CD 34+), na clínica do transplante de medula. Ohba e colaboradores (2002) utilizou a lectina DBA em um método rápido de fracionamento de células leucêmicas do tipo T cultivadas, através da cromatografia de afinidade em coluna. Utilizando o mesmo procedimento, Bakalova e Ohba (2003) utilizaram as lectinas DBA e SBA para purificar linfócitos normais de células leucêmicas. Várias técnicas tem sido utilizadas com lectinas para caracterizar células de acordo com o perfil de carboidratos, dentre elas (hema)aglutinação, histoquímica, ELLA (enzyme linked lectin assay), LAC (lectin affinity chromatography), western lectin blotting, CAIE (crossed affinoimmunoelectrophoresis) e SPR (surface plasmon resonance) (TAO et al., 2008; MISLOVICOVÁ et al., 2009)..

(34) Silva, E.F.. Identificação de Células Leucêmicas.... A citometria de fluxo também tem sido empregada, como no trabalho descrito por Boldt e Nelson (1983) que utilizaram esta técnica para comparar a ligação das lectinas de germe de trigo (WGA) e Lens culinaris (Lcl) a linfócitos de doadores normais e pacientes com Leucemia Linfocítica Crônica (LLC). Mais recentemente, Pérez-Campos-Mayoral et al., (2008) utilizou a lectina Macrobrachium rosenbergii como sonda de diagnósico da Leucemia Linfoblástica aguda de células do tipo T. Várias pesquisas têm sido desenvolvidas no intuito de demonstrar a viabilidade e eficiência das lectinas como marcadores de células transformadas, verificando sutis diferenças em carcboidratos de glicoconjugados presentes na superfície de células não malignas e malignas (MODY et al., 1995; BELTRÃO et al., 1998, 2001, 2003; MORIWAKI et al., 2000). Tais aplicações aumentam o campo de utilização desta família de (glico)proteínas..

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