UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE BIOCIÊNCIAS
COORDENAÇÃO DO CURSO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS BACHARELADO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
Primeira caracterização citogenética para Kyphosus sectatrix
(Kyphosidae – Perciformes)
AMANDA TORRES BORGES
NATAL - RN 2018
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE BIOCIÊNCIAS
COORDENAÇÃO DO CURSO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS BACHARELADO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
Primeira caracterização citogenética para Kyphosus sectatrix
(Kyphosidae – Perciformes)
AMANDA TORRES BORGES
Trabalho de conclusão do curso de graduação em Ciências Biológicas, Centro de Biociências da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como requisito parcial para a obtenção do título de Bacharel em Ciências Biológicas, sob orientação do professor Wagner Franco Molina. Orientador: Dr. Wagner Franco Molina
NATAL - RN 2018
AMANDA TORRES BORGES
Primeira caracterização citogenética para Kyphosus sectatrix (Kyphosidae – Perciformes)
Trabalho de conclusão do curso de graduação em Ciências Biológicas, Centro de Biociências da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como requisito parcial para a obtenção do título de Bacharel em Ciências Biológicas, sob orientação do professor Wagner Franco Molina.
APROVADA EM 18/06/2018
BANCA EXAMINADORA
______________________________________________________________ Prof Wagner Franco Molina
Universidade Federal do Rio Grande do Norte (Orientador)
_______________________________________________________________ Doutor Rodrigo Xavier Soares
Universidade Federal do Rio Grande do Norte (Membro)
_______________________________________________________________ Mestre Karlla Danielle Jorge Amorim
Universidade Federal do Rio Grande do Norte (Membro)
i
Sumário
Lista de Figuras e Tabelas ... ii
Resumo ... iii
1. Introdução ... 7
2. Objetivo ... 10
3. Material e Métodos ... 10
3.1. Material ... 10
3.2. Obtenção de cromossomos mitóticos e análises citogenéticas ... 11
3.2.1. Detecção de regiões organizadoras de nucléolos ... 12
3.2.2. Detecção da heterocromatina constitutiva ... 12
3.2.3. Dupla coloração com fluorocromos base-específicos ... 13
3.3. Hibridação fluorescente in situ (fish) ... 13
3.3.1. Obtenção de sondas ... 13 3.3.2. Hibridização ... 14 4. Resultados ... 15 5. Discussão ... 17 6. Conclusão ... 18 7. Referências ... 19
ii
Lista de Figuras e Tabelas
Figura 1: Exemplar da espécie Kyphosus sectatrix, identificada segundo Carpenter, 2002. Barra = 5 cm. ... 7
Figura 2: Localização do Arquipélago de São Pedro e São Paulo, no Atlântico. ... 9
Figura 3: Cardume de Kyphosus sectatrix no Arquipélago de São Pedro e São Paulo. Foto: Rodrigo Soares. ... 11
Figura 4: Cariótipo de Kyphosus sectatrix (a, b e c), com coloração convencional (a) e bandamento C (b). Os quadros destacam a correspondência nos pares organizadores de nucléolos dos sítios Ag-RONs e regiões MM+/DAPI-. Sítios de DNAr 18S (vermelho) e 5S (Verde) (c). Barra = 5µm ... 16
Figura 5: Árvore filogenética adaptada Knudsen & Clements (2016), demonstrando relações com de espécies de Kyphosus com representantes do gênero Girella, ambos pertencentes a família Kyphosidae. ... 17
Tabela 1: Descrição cariotípica para espécies do gênero Kyphosus, tabela adaptada (Arai, 2011).
iii
Resumo
A família Kyphosidae é um grupo de peixes de habitats recifais, com distribuição nos Oceanos Atlântico, Indico e Pacífico. São peixes herbívoros, alimentando-se principalmente de algas, podendo comer pequenos crustáceos e moluscos alimentando-se houver necessidade. Suas relações filogenéticas são confusas e estudos recentes tem demonstrado divergência em seus resultados. Apesar da ampla distribuição do grupo as informações de seus padrões citogenéticos são escassas, suas espécies têm pouca ou nenhuma informação de padrões cromossomais. O Arquipélago de São Pedro e São Paulo é uma formação rochosa constituído por material proveniente de extravasamento do manto, sua localização é estratégica e amplamente utilizada por espécies migradoras, além de possuir uma ampla diversidade de organismos recifais. A espécie K. sectatrix, coletada aos arredores do ASPSP, teve seus aspectos cromossômicos analisados através de métodos citogenéticos clássicos (coloração convencional, bandamento C, Ag-RONs), coloração com fluorocromos AT- e GC-específicos e mapeamento cromossômico in situ dos genes RNAr 18S e 5S. A espécie apresentou 2n=48 cromossomos, sendo dois cromossomos submetacêntricos e quarenta e seis acrocêntricos, com sítios ribossomais (Ag-RONs/DNAr 18S/Mitramicina+) no primeiro par cromossômico, em posição pericentromérica dos braços curtos. As informações geradas são os primeiros dados citogenéticos para a espécie e para representantes do gênero no Atlântico Ocidental, dados importantes para um maior conhecimento do grupo e suas relações evolutivas e filogenéticas.
Palavras chaves: Citogenética de peixes, mapeamento cromossômico, Hibridização in situ, salema, ASPSP, Kyphosus sectatrix.
7
1. Introdução
A espécie Kyphosus sectatrix (Figura 1), conhecida popularmente como Salema, pertence à família Kyphosidae, gênero Kyphosus (Nelson et al, 2016). Sakai & Nakabo (2014) considera como nomina dubia K. saltatrix e K. sectatrix, confusão iniciada por Linnaeus (1758) na descrição das espécies já que não foi incluído nenhum dado merístico. Sua distribuição é conhecida em parte da costa do Atlântico Ocidental, desde o Canadá até o sul de Santa Catarina, da França até o Golfo da Guiné no Atlântico Oriental (Desoutter, 1973; Robins & Ray, 1986; Scott & Scott, 1988;).
A ecologia desse grupo está associada a recifes, onde a profundidade atingida é de 1 até 30 metros. Essa espécie pode atingir cerca de 70 cm de comprimento corporal, com média de 50 cm, chegando a pesar até 6 kg (Cervigón, 1993; Carpenter, 2002).
Figura 1: Exemplar da espécie Kyphosus sectatrix, identificada segundo Carpenter, 2002. Barra = 5 cm.
8 Os representantes da família Kyphosidae são peixes de ambientes recifais tropicais e temperados, consumidores, principalmente, de macroalgas e compreendem uma parcela significativa da biomassa de peixes onde habitam
(Sakai & Nakabo, 2014; Knudsen & Clements, 2016). Na fase juvenil são
pelágicos, habitando mares de sargaços (Carpenter, 2002). As relações filogenéticas e o status taxonômico do grupo têm sido problemáticos pela ausência de características morfológicas que os diferenciem, além disso, as análises taxonômicas têm se mostrado conflitantes, sem um consenso atual sobre o número e distribuição de suas espécies. Pesquisas demonstram que as relações taxonômicas do grupo são em demasia conflitantes, com indicações de que seja um grupo parafilético, com 53 espécies validas (Knudsen & Clements, 2013; Sakai & Nakabo, 2014; Knudsen & Clements, 2016; Eschmeyer & Fong, 2018).
A morfologia da espécie é caracterizada por 11 espinhos e 11 raios moles dorsais, 3 espinhas anais e 11 raios moles anais, em geral são cinzas e seus juvenis exibem manchas na cabeça, corpo e barbatana. Pode estar associado a diferentes substratos recifais, alimentando-se principalmente de algas bentônicas, pequenos caranguejos e molusco, contudo há relatos de adaptação alimentar, podendo se alimentar de excretas de outros animais (Carpenter, 2002).
Estudos citogenéticos são escassos para o grupo, estando descritos fórmula cariotípica para as espécies Kyphosus cinerascens, K. vaigiensis e K.
bigibbus (Takai & Ueno, 1997), todas com número diploide 2n = 48, número
fundamental NF = 50, com fórmula cariotípica 2SM + 46A, com dois sítios AgRONs (Arai, 2011) (Tabela 1).
Tabela 1: Descrição cariotípica para espécies do gênero Kyphosus, tabela adaptada (Arai, 2011).
Família Kyphosidae 2n Cariótipo NF AgRONs Localidade Referências
Kyphosus cinerascens 48 2 SM+ 46A 50 2 Japão Takai & Ueno, 1997
Kyphosus vaigiensis 48 2SM + 46A 50 2 Japão Takai & Ueno, 1997
9 O Arquipelágo de São Pedro e São Paulo (ASPSP) (Figura 2) é uma formação rochosa, formada por exumação do manto, único exemplo acima do nível do mar no oceano Atlântico (Motoki et al., 2015) , situado a 958 km da América do Sul (Figura 2). Considerado local estratégico para diversos animais migrantes, o ASPSP é um local remoto, com vasta gama de recursos disponíveis. Esse conjunto de ilhotas também é habitat de diversas espécies, sejam elas pelágicas, como espécies de albacoras, atuns e tubarões, como também de espécies recifais, como as donzelas, sargentinhos e salema (Lubbock & Edward, 1981). Algumas espécies são possivelmente endêmicas do Arquipelágo, ocasionada provavelmente por especiação alopátrica (Feitosa et al., 2003).
Figura 2: Localização do Arquipélago de São Pedro e São Paulo, no Atlântico.
A falta de conhecimento genético em diversos grupos ainda é uma barreira para o pleno conhecimento biológico das espécies e de suas relações filogenéticas (Arai, 2011). No presente estudo, indivíduos da espécie de Kyphosidae foram coletados no Arquipélago de São Pedro e São Paulo e analisados quanto padrões e aspectos citogenéticos, visando a ampliação de conhecimentos ainda tão escassos sobre o grupo.
10
2. Objetivo
Determinação dos aspectos cariotípicos através de citomarcadores em espécie do gênero Kyphosus, por meio de técnicas clássicas (coloração convencional com Giemsa, bandamento-C e técnica de Ag-RONs), coloração com fluorocromos base-específicos (MM/DAPI) e mapeamento dos genes ribossomais 5S e 18S por meio de hibridização fluorescente in situ (FISH).
3. Material e Métodos
3.1. Material
As coletas de indivíduos da espécie Kyphosus sectatrix (Figura 3) foram realizadas durante a 491º Expedição ao Arquipélago de São Pedro e São Paulo (ASPSP)(Figura 2), localizado no Oceano Atlântico (0°55'00.2"N 29°20'44.1"O), distante 958 Km da costa do Rio Grande do Norte, 630 Km do Arquipélago de Fernando de Noronha e cerca de 1830 Km da costa do Continente Africano. O ASPSP pertence ao Parque Nacional Marinho de Fernando de Noronha e é administrado pela Marinha do Brasil. Os exemplares vivos foram capturados por meio de linha e anzol com o auxílio dos pescadores tripulantes da embarcação Transmar I. As espécies foram identificadas segundo Carpenter (2002).
11 Figura 3: Cardume de Kyphosus sectatrix no Arquipélago de São Pedro e São Paulo. Foto:
Rodrigo Soares.
3.2. Obtenção de cromossomos mitóticos e análises citogenéticas
Os exemplares foram coletados e levados à Estação Científica do ASPSP onde foram sacrificados (permissão Comitê de Ética em Pesquisa UFRN, 044/2015). A obtenção de suspensão celular foi obtida através da remoção do rim anterior e dissociação do mesmo em meio de cultura RPMI 1640 com auxílio de seringas de vidro, de acordo com Gold et al. (1990). Foram adicionadas cinco gotas de solução colchicina a 0,025%, em temperatura ambiente, por 30 minutos, depois o material foi centrifugado por 10 minutos à 900 rpm. Após a centrifugação o sobrenadante foi removido e então adicionado 9 ml de solução hipotônica de KCl (0,075M), também em temperatura ambiente e por 30 minutos, ao fim do tempo foi acrescentado 0,5 ml de solução Carnoy (metanol e ácido acético – 3:1) e o material foi centrifugado por 10 minutos à 900 rpm. No final o material foi conservado em tubo tipo Eppendorf de 1,5 ml à -20°C.
12 Para análise do material foi gotejado 150μl (3 gotas) de suspensão sobre lâminas coberto por um filme de água destilada aquecida à 60°C, foram então secas e coradas com Giemsa à 5%, diluído em tampão fosfato pH 6,8. Foi utilizado microscópio ótico com lente de aumento de 1.000X para as análises citogenéticas, as melhores metáfases foram fotografadas em fotomicroscópio de epifluorescência Olympus™ BX51 acoplado a um sistema digital de captura de imagens Olympus DP72® utilizando o software cellSens (Olympus Optical Co. Ltd.).
Para a montagem do cariótipo, os cromossomos foram classificados quanto à posição dos centrômeros, em metacêntricos (M), com a razão entre o braço maior e menor (RB) variando de 1,00 a 1,70; submetacêntricos (SM), RB=1,71–3,00; subtelocêntricos (ST), RB=3,01–7,00; e acrocêntricos (A), RB>7,01 (Levan et al., 1964).
3.2.1. Detecção de regiões organizadoras de nucléolos
As regiões organizadoras de nucléolos foram analisadas utilizando a técnica preconizada por Howell & Black (1980), cobrindo a lâmina, previamente preparada com suspensão celular, com solução gelatinosa (1g de gelatina, dissolvida em 50 ml água e 0,5ml ácido fórmico) e nitrato de prata (AgNO3) à 50%, 450 μl (9 gotas) e 300 μl (6 gotas) respectivamente. Depois de homogeneizar as soluções sobre a lâmina, ela foi recoberta por uma lamínula e incubada em estufa a 60°C até ser obtido cor amarelo âmbar, retirando a lamínula com jatos de água e secando-a ao ar.
3.2.2. Detecção da heterocromatina constitutiva
A metodologia descrita por Summer (1972) foi utilizada para a detecção de bloco heterocromáticos através do bandamento C. A suspensão celular já devidamente pingada em lâminas foi acondicionada à 37°C por três dias em estufa, depois desse período estas foram mantidas em HCl 0,2N por 15 minutos, lavadas com água destilada e secas. Posteriormente foram colocadas em solução salina 2xSSC à 60°C por 15 minutos, lavadas com água destilada e
13 secas. Em seguida, foram imersas em uma solução saturada de hidróxido de bário (Ba(OH)28H2O) à 5%, previamente aquecida a 42°C, por 1 minutos e 40 segundos e imediatamente após a reação foi interrompida mergulhando-as em HCl 0,2N, depois lavadas com água destiladas e secas. Para finalizar as lâminas foram imersas novamente em solução salina 2xSSC à 60°C por 45 minutos e então lavadas com água destilada, secas e coradas com Giemsa à 5% por 5 minutos.
3.2.3. Dupla coloração com fluorocromos base-específicos
De acordo com Schweizer (1976), foi empregado o fluorocromo DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol) para a identificação de regiões ricas em bases A-T e o fluorocromo Mitramicina (MM) para detecção de regiões ricas em G-C. Foi utilizado 30µl de Mitramicina 0,5 mg/ml nas lâminas com suspensão celular, recobertas com lamínulas e colocadas em câmara úmida, no escuro, sendo lavadas com água destilada após um período de 60 minutos. Após secas as lâminas foram coradas com 30 µl de DAPI (2µl/ml), cobertas novamente por lamínulas e acondicionadas em câmara úmida, no escuro, por 30 minutos. Logo após as lâminas foram lavadas com água destilada e finalizadas com tampão glicerol-Mcllvaine pH 7,0 (1:1) cobertas com lamínulas e seladas com esmalte incolor. As lâminas foram então mantidas em câmara escura à 4oC e analisadas após um prazo mínimo de três dias com fotomicroscópio de epifluorescência sob filtros apropriados.
3.3. Hibridação fluorescente in situ (FISH)
3.3.1. Obtenção de sondas
As sondas para emprego em dual-color FISH foram obtidas por amplificação do DNA da espécie Rachycentron canadum, utilizando primers para DNAr 18S (Hatanaka & Galetti, 2004) e DNAr 5S (Martins & Galetti, 1999). As sondas DNAr 18S foram marcadas por nick translation com
digoxigenina-11-14 dUTP (Roche) e a sonda DNAr 5S com biotina-14-dATP (Roche), de acordo com as especificações do fabricante.
3.3.2. Hibridização
A técnica de FISH (Fluorescence in situ hybridization) foi realizada em cromossomos mitóticos, de acordo com Pinkel et al. (1986). Os cromossomos foram tratados com RNAse livre de DNAse (20mg/mL em 2×SSC) à 37°C por 1 hora, com pepsina (0,005% em HCl 10mM) à 37°C, por 10 minutos, e fixados com formaldeído a 1%, por 10 minutos. Logo após desidratados em série alcoólica (70%, 85% e 100%). Os cromossomos foram desnaturados em solução de 70% formamida/2×SSC à 72°C, por 5 minutos. Uma solução de hibridização consistindo de 50% de formamida, 2×SSC, 10% de sulfato dextrano e a sonda desnaturada (5 ng/µl) foi depositada sobre as lâminas, que foram recobertas com lamínula. Após a hibridização em câmara úmida, overnight à 37°C, as lâminas foram lavadas em 15% formamida/0,2×SSC à 42°C, por 20 minutos, 0,1×SSC à 60°C, por 15 minutos e Tween 20 0,5%/4×SSC, à temperatura ambiente. O sinal de hibridização da sonda foi detectado usando avidina-FITC (Sigma) para a sonda DNAr 5S e anti-digoxigenina-rhodamina(Roche) para a sonda DNAr 18S. Os cromossomos foram contracorados com Vectashield/DAPI (1,5 µg/ml).
As preparações com FISH e fluorocromos base específicos foram analisadas em fotomicroscópio de epifluorescência Olympus BX51, equipado com sistema digital de captura de imagens Olympus DP73, utilizando o software cellSens (Olympus Optical Co. Ltda.)
15 4. Resultados
A espécie Kyphosus sectatrix apresentou um cariótipo com 2n=48, com um par bibraquial e os demais acrocêntricos, 2SM + 46A (NF = 50) (Figura 4).
Os sítios Ag-RONs (MM+/DAPI-), estão localizados nos braços curtos do único par submetacêntrico (Figura 4a). As regiões hetecromáticas estão distribuídas em posição pericentromérica, além das regiões terminais nos braços longos, bem evidenciado, em alguns cromossomos (Figura 4b)
FISH com sondas DNAr 18S, mostraram sítios exclusivamente localizados nos braços curtos do primeiro par. Os sítios DNAr 5S estão localizados nos homólogos do par 9 em posição terminal (Figura 4c).
16 Figura 4: Cariótipo de Kyphosus sectatrix (a, b e c), com coloração convencional (a) e bandamento C (b). Os quadros destacam a correspondência nos pares organizadores de nucléolos dos sítios Ag-RONs e regiões MM+/DAPI-. Sítios de DNAr 18S (vermelho) e 5S (Verde) (c). Barra = 5µm
17
5. Discussão
.
Em aspectos gerais os padrões encontrados em Kyphosus sectatrix se assemelham ao encontrado em outras três espécies de Kyphosus analisadas (Takai & Ueno, 1997). Nas espécies analisadas pelo trabalho citado foi identificado a mesma morfologia cromossômica de K. sectatrix, com um par bibraquial, RONs únicas localizadas na porção centromérica dos cromossomos submetacêntricos. Grandes blocos heterocromáticos evidenciados em região centromérica dos cromossomos, incluindo regiões terminais em alguns pares, corroboram com dados da espécie K. lembus (atual nome cientifico K. vaigensis), característica evolutiva que em alguns grupos pode representar um importante marcador taxonômico (Galetti et al., 1991; 2000)
Figura 5: Árvore filogenética adaptada Knudsen & Clements (2016), demonstrando relações com de espécies de Kyphosus com representantes do gênero Girella, ambos pertencentes a família Kyphosidae.
Para as demais espécies do gênero não há registro de estudos citogenéticos resolutivos, apesar de Arai (2011) relatar um estudo em Kyphosus
sp., onde há pouca diferença entre as descrições supracitados, com fórmula
cariotípica 2M + 2SM + 44A (NF 52). As espécies da família têm demonstrado conservadorismo em estrutura cromossômica, corroborando com a dificuldade
18 de caracteres diferenciadores dentro do grupo, além de uma filogenética pouco resolutiva. Não há um pleno consenso em estudos realizados sobre relações filogenéticas, quantidade de espécies ou mesmo nomenclatura de alguns de seus representantes. O conservadorismo entre os gêneros (Figura 5) demonstra a estreita relação dentro do grupo (Northland-Leppe et al., 2010; Eschmeyer & Fong, 2018)
Os Perciformes tem demonstrado conservadorismo cromossômico marcante entre seus representantes, com presença de maioria dos cromossomos acrocêntricos, blocos heterocromáticos reduzidos, único sítio AgRONs, cenário que coincide com a descrição para a espécie K. sectatrix, com exceção da presença de marcantes e grandes blocos heterocromáticos distribuido por diversos cromossomos e um par cromossômico bibraquial, resultado provável de um evento de inversão pericentromérica (Galetti et al., 2000, Molina, 2007).
Padrões conservados entre os Perciformes têm sido demonstrado através de análise em diversas espécies de peixes marinhos, o que pode ser explicado por facilitação do fluxo gênico entre as populações, seja por disperção larval ou migração em algumas espécies (Mota Neto et al., 2011; Amorim et al., 2017; Soares et al., 2017). O fluxo gênico de K. sectatrix pode ser apoiado pela dispersão do grupo em fase juvenil, o qual se associa a mares de sargaço (Carpenter, 2002; Knudsen & Clements, 2016). Posicionamento em subunidades diferentes dos sítios de DNAr 18S e 5S tem sido descrito como o mais comum para peixes (Martins & Galetti, 2001).
6. Conclusão
Apesar da espécie analisada ter uma ampla distribuição geográfica e estar presente em ambientes recifais de todo o Atlântico, não havia até o presente momento dados prévios de padrões cariotípicos, informações importantes para que se possa entender relações ambientais, ecológicas e evolutivas do gênero. Foi demonstrado com o estudo que existe uma variação morfológica cromossômica resultante de uma inversão pericentromérica na espécie analisada, comparado com os dados existentes na literatura de outras espécies da família. Análises adicionais de mapeamento de sequências repetitivas em
19
Kyphosus sectatrix e nas demais espécies do grupo se fazem necessários para
elucidar problemáticas ainda tão marcantes, como a falta de caracteres diferenciadores entre as espécies, a estase cariotípica presente na família, a falta de consenso na quantidade de espécies e nas suas relações filogenéticas e as relações filogenéticas da família.
7. Referências
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