M é to d o s U tiliza d o s no
B io c o n tro /e d e F ito p a tó g e n o s
Métodos usados no . . .2007
LV- 2008.00018
EnJ^pa
E m p re s a B ra s ile ira d e P e s q u is a A g r o p e c u á r ia E m b ra p a U v a e V in h o
M in is t é r io d a A g r ic u ltu r a , P e c u á r ia e A b a s t e c im e n t o
M é to d o s usados no
B iocontrole de Fito p ató g en o s
E d ito re s :
Rosa M a ria V a ld e b e n ito S a n h u e z a Ita m a r S o a re s d e M e lo
Bento Gonçalves, RS 2007
E x e m p la re s d e s ta p u b lic a ç ã o p o d e m s e r a d q u ir id o s na: E m b ra p a U v a e V in h o Rua Livramento. 515 Caixa Postal 130 Fone: (0xx)54 3455 8 0 0 0 Fax: (0xx)54 3451 2792 h ttp ://w w w .cn p u v.e m b ra p a.b r sac@cnpuv.embrapa.br C o m itê d e P u b lic a ç õ e s
Presidente: Lucas da Ressurreição Garrido Secretária-Executiva: Sandra de Souza Sebben
Membros: Luiz A n te n o r fíizzon. Kátia M id o ri Hiwatashi, Osmar Nickel.
Viviane M aria Zanella Be/Io Fialho
Normalização bibliográfica: Kátia M id o ri Hiwatashi Elaboração da capa: Luciana Elena M endonça Prado
1f e d iç ã o
1* impressão (2007): 5 0 0 exemplares
T o do s os d ire ito s r e s e r v a d o s .
A reprodução não-autorizada desta publicação, no todo ou em parte, constitui violação dos direitos autorais (Lei ne 9.610).
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP) Embrapa Uva e Vinho
M étodos usados no biocontrole de fitopatógenos/E ditado por Rosa Maria Valdebenito Sanhueza e Itamar Soares de Melo. - Bento Gonçalves: Embrapa Uva e Vinho. 2007.
141 p.
ISBN 978-85-89921-05-3
1. Doença de planta. 2. Antagonismo. 3. M icrorganismo. I. Valdebenito Sanhuez:a, Rosa Maria, ed. II. Melo, Itamar Soares de. ed.
CDD 579 ( 21. Ed.) © Embrapia, 2007
A p r e s e n ta ç ã o
Em consonância com a missão institucional da Embrapa Uva e Vinho, desde longa data vêm sendo desenvolvidas ações de pesquisa e desenvolvim ento que têm gerado im portantes resultados no tocante ao com ponente am biental. E isto ocorre porque é com provada a necessidade de buscar-se o desenvolvim ento sustentado do espaço rural, tendo-se em vista as exigências de m ercado, dos produtores e dos órgãos ambientais em reduzir-se o im pacto am biental da atividade produtiva.
E neste contexto que o controle biológico se insere. Ao m axim izar o uso de organism os naturais no m anejo de pragas e doenças, esta tecnologia contribui decisivam ente para que a produção se dê com reduzido im pacto, em benefício da alm ejada sustentabilidade. Esta publicação é resultante de estudos de pesquisadores da Embrapa Uva e Vinho e de outras Unidades da Embrapa, além de essenciais parceiros, os quais, em parceria, tê m contribuído para a m elhoria do conhecim ento sobre esta im portante área.
Temos certeza que as inform ações aqui divulgadas servirão para o m aior conhecim ento e uso do controle biológico, bem com o de estím ulo e suporte para novas ações de pesquisa que resultem em tecnologias am bientalm ente lim pas e tecnicam ente viáveis.
Alexandre H offm ann Chefe-Geral Embrapa Uva e Vinho
S u m á rio
Isolam ento de antagonistas a pató ge n os que colonizam ferim entos de plantas
Rosa M aria Valdebenito Sanhueza e Ita m ar Soares de M elo ... 9 O btenção de epífitas de frutos e seleção de antagonistas no controle de podridões de pós-colheita
Rosa M aria Valdebenito Sanhueza e Ita m ar Soares de M elo ... 13 Isolam ento de colonizadores de clam idosporos de Fusarium oxysporum
Ita m a r Soares de M e lo e Rosa M aria Valdebenito Sanhueza ... 17 Isolam ento de bactérias do rizoplano e endorizosfera e seu efeito na colonização de raízes e na p ro m o ção do crescim ento de plantas
Ita m a r Soares de M e lo e Rosa M aria Valdebenito Sanhueza ... 21 Isolam ento de antagonistas para controle de doenças vasculares
Rosa M aria V aldebenito Sanhueza e Ita m a r Soares de M elo ... 27 A valiação do efeito p ro te to r e curativo de antagonistas a patógenos que colonizam folhas
Rosa M aria V aldebenito Sanhueza, M argareth Z am b on i-P in otti e A n a Elisa S ilveira Perez ... 31
M ultiplica ção de C lonostachys rosea
Rosa M aria Valdebenito Sanhueza e Gilberto D all Onder ... 35
Seleção de fungos e nd ofíticos em fruteiras e flores
Rosa M aria Valdebenito Sanhueza e M argareth Zam boni-Pinoti ... 39
Isolam ento seletivo de bactérias ativas para nucleação de gelo
Isolam ento de fungos m icorrízicos
Ita m ar Soares de M elo e Rosa M aria Valdebenito Sanhueza ... 45 Isolam ento seletivo de Bacillus
W agner B e ttio l ... 49
O btenção de m utantes e co m p etitivid ad e de isolados de bactérias resistentes a antibióticos
Ita m ar Soares de M elo e Rosa M aria Valdebenito Sanhueza ... 53 O btenção de m utantes de Trichoderma spp. resistentes a fungicidas
Ita m ar Soares de M elo e Rosa M aria Valdebenito Sanhueza ... 55 Identificação de bactérias por análise dos ácidos graxos
Ita m ar Soares de M elo e Rosa M aria Valdebenito Sanhueza ... 59 Identificação de bactérias pelo seqüenciam ento de genes 16S ribossôm ico (16S rDNA)
Fernando D in i A n d re o te ... 67 Identificação e diferenciação de linhagens de leveduras antagônicas a fito pa tó ge no s utilizando sondas convencionais com o indicadores na reação de polim erização em cadeia
Luis Fernando Revers e Rosa M aria Valdebenito Sanhueza ... 75 Produção de sideróforos por rizobactérias
Ita m a r Soares de M elo e Rosa M aria Valdebenito Sanhueza ... 79 Produção de a ntibióticos por m icrorganism os
Produção de bactérias para uso no controle biológico
Deise M aria Fontana C apalbo ... 97 Encapsulam ento de m icrorganism os
Rosa M aria Valdebenito Sanhueza e Ita m ar Soares de M elo ... 103 Roteiro para form ulação experim ental pó m olhável de biopesticida (sigla internacional WP)
Cláudia M ed ug no ... 109
Isolam ento de actinom icetos visando ao controle biológico de fitopatógenos
Joelm a M arcon, Jose A n to n io da S i Iva e M aria Ca rolina Quecine ... 117
Avaliação in vitro da colonização de raízes por rizobactérias
B rigida P. Vi la r Queiroz e Ita m a r Soares de M elo ... 121 Seleção de rizobactérias capazes de form arem biofilm es
Francisco Eduardo de C. Costa e Ita m a r Soares de M elo ... 125 Avaliação ecotoxicológica de m icrorganism os em organism os não-alvo,
organism os aquáticos e mamíferos
Vera Lúcia de Castro e Cláudio Jonsson ... 129 Apêndice
M étodos usados no Biocontrole de Fitopatógenos - 97
Produção de bactérias para
uso no c o n tro le biológico
Deise Maria Fontana Capalho’
M uita s bactérias produzem m oléculas im portantes para a indústria e para a saúde hum ana (antibióticos e enzimas entre outros), enquanto outra fração representa problem a por produzir toxinas e apresentar um endosporo dorm ente e a ltam en te resistente, que sob condições favoráveis pode germ inar e se tra n s fo rm a r num a célula vegetativa.
As bactérias form adoras de esporos pertencem em sua m aioria à família Bacillaceae, sendo que o gênero aeróbio Bacillus inclui as bactérias form adoras de esporos de m aior potencial para o controle biológico pelas m esmas características que lhes conferem resistência às condições adversas ambientais e de processam ento industrial.
A aplicação destas bactérias com o geradoras de m oléculas com ação de controle sobre outros m icrorganism os requer grandes quantidades do agente ativo, que só é interessante se esta bactéria se desenvolver em m eio a rtificial (in vitro), utilizando-se de m odernas técnicas e equipam entos de ferm entação.
O desenvolvim ento de m icrorganism os em m eio a rtificial sob condições controladas de tem peratura, agitação e aeração é norm alm ente denom inado processo fe rm entativo. A especificidade de ação ou produção de m etabólitos em cada espécie e sub-espécie de Bacillus está relacionada às características intrínsecas àquela espécie, e ta m b ém à com posição do m eio de cultivo e parâm etros sob os quais tal m icrorganism o se desenvolve, com o com posição do m eio de cultura, tem peratura, pH e outros. A com paração da velocidade de crescim ento e produção de esporos de diferentes cepas de Bacillus será assunto desta prática.
O b je tiv o
0 o bjetivo desta prática é observar o efeito das condições do processo fe rm e n ta tivo sobre o crescim ento e esporulação de diferentes cepas de Bacillus em m eio n utritivo líquido. Cada cepa te m especificidade característica para uso no controle biológico e seu desenvolvim ento é afetado pela com posição do m eio de c u ltiv o e os parâm etros de ferm entação.
' Engenheira de Alimentos, Doutora. Embrapa Meio Ambiente, Caixa Postal 69. 13820-000 Jaguariúna, SP.
98 - M étodos usados no Biocontrole de Fitopatógenos
P ro c e d im e n to
1.
P ré -fe rm e n ta ç ã o
Para garantir uma boa atividade e velocidade de crescim ento, as culturas oriundas do tubo ou placa-estoque (meio ágar nutriente) passam pela etapa de "pré-ferm entação":
• distribuir 100 m L de m eio de pré-fermentação em cada frasco erlenm eyer de 250 mL. Fechar com tam pa de algodão e autoclavar a 121 °C por 20 m inutos;
• retirar uma alçada da cultura estoque e inocular em cada frasco de pré- ferm entação previam ente preparado:
• m anter os frascos sob agitação em agitador orbital por 12-24 horas (geralm ente 120 rpm; 30 ± 2°C). 0 período deve ser estabelecido para cada caso, acom panhando as etapas de desenvolvim ento ao m icroscópio;
• a pré-ferm entação deve ser finalizada quando a m aioria das células estiverem na fase de crescim ento vegetativo, que garante a m elhor co nd içã o de desenvolvim ento na etapa de ferm entação;
• ao final do período de pré-ferm entação é feita contagem de células em câmara de Neubauer e este núm ero é ajustado (diluições sucessivas) para que o inóculo tenha entre 1 e 5 x 10® células vegetativas/m L.
2. F e rm e n ta ç ã o e m fra s c o s E rle n m e y e r
• D istribuir 100 mL de m eio de ferm entação em cada frasco Erlenmeyer de 250 mL. Fechar com tam pa de algodão e autoclavar a 121 °C por 20 m inutos; • utilizar o inóculo já pré-ajustado para dar início ao processo de ferm entação.
Utilizar 5% do volum e de m eio contido no frasco de ferm entação com o volum e de inóculo. Nesta prática, o volum e de inóculo será então de 5 mL do caldo da pré-ferm entação utilizado para inocular cada frasco d e te rm ina do e previam ente preparado;
• m anter os frascos sob agitação em agitador orbital (geralm ente 150 rpm ; 30 ± 2°C);
M étodos usados no Biocontrole de Fitopatógenos - 99
• acom panhar o desenvolvim ento dos m icrorganism os até a obtenção de esporos ou o início da fase de lise celular (observação ao m icroscópio de contraste de fase) co nfo rm e estabelecido em cada grupo de trabalho. Esta finalização varia para cada produto desejado algum as vezes o controle de doenças se baseia na co m p etiçã o por espaço e nutrientes, o que exige uma grande quantidade de células vegetativas em fase logarítm ica de crescim ento (que é obtido nas etapas iniciais do processo de produção massal). Outras vezes a ação biocida é oriunda do desenvolvim ento de enzimas ou toxinas (m etabólitos) produzidas em diferentes fases do crescim ento celular, m otivo pelo qual a ferm entação deverá ser realizada de form a a o bter grande quantidade de células neste determ inado estágio de crescim ento. Em outros casos o controle é oriundo da presença de esporos, m otivo pelo qual a ferm entação deverá ser conduzida visando o b te r este estágio de desenvolvim ento da bactéria, mais longo do que os dois casos anteriores;
• quando o estágio determ inado para cada grupo fo r atingido, retirar os frascos e ce ntrifug a r (geralm ente 5 .0 0 0 a 1 0 .0 00 rpm por 10 m inutos), utilizando o centrifugado para determ inação de massa celular (quantificação de células viáveis, esporos viáveis, enzimas intracelulares) e ensaios de verificação da ação biocida. O sobrenadante é utilizado para determ inação da presença de enzim as e toxinas extracelulares, antibióticos ou outras m oléculas que sejam produzidas e excretadas durante o crescim ento celular. Geralmente o m aterial (centrifugado e sobrenadante separadam ente) pode ser guardado em geladeira por 1 a 3 dias.
3. F e rm e n ta ç ã o e m m in i-fe rm e n ta d o r
• D istribuir o volum e de m eio de ferm entação em cada frasco do ferm entador. 0 volum e a ser utilizado, se não fo r estabelecido pelo fabricante, não deve ultrapassar 80% do volum e total do frasco do ferm entador, uma vez que há necessidade de m anter um espaço para troca de gases e para eventual form ação de espuma;
• fechar a tam pa adequadam ente e autoclavar (condições estabelecidas pelo fabricante);
• após resfriam ento, conectar to do s os controles conform e orientação do fabricante e acionar os controles de form a a ajustar o reator para as condições de ferm entação necessárias. De form a geral, as condições são: Temperatura; 30 ±2°C; Aeração: 1 v / v / m (1 L a r/L m e io /m in u to ); Agitação: 2 0 0 -4 0 0 rpm;
100 - M étodos usados no Biocontrole de Fitopatógenos
• utilizar o resultado da pré-ferm entação para inóculo do frasco de ferm entação. Utilizar 5% do volum e final do frasco de ferm entação com o volum e de inóculo;
• coletar amostras periodicam ente para acom panhar o desenvolvim ento dos m icrorganism os até a obtenção da etapa de desenvolvim ento desejada; • para encerrar o processo, desligar o ferm entador (aeração e agitação); • filtra r ou centrifugar, conform e disponibilidade do laboratório. Geralmente a
centrifugação acontece utilizando 5 .0 0 0 a 10.0 00 rpm p or 10 m inutos; • para o caso em que o produto final é o esporo bacteriano, o caldo final pode
te r seu pH ajustado para pH 4 .0 com ácido acético, e o m aterial decantado pode ser guardado a tem peratura am biente ou refrigerador por vários dias.
4 . A c o m p a n h a m e n to do p ro ce sso f e r m e n ta tiv o
• Crescimento das células bacterianas (em quantidade e em estágio de desenvolvim ento) pode ser acom panhado por m etodologias básicas de contagem (plaqueam ento em meio de cultivo; câmara de contagem ou tam bém denom inada "de Neubauer") de uso corrente em laboratórios de m icrobiologia (m etodologias descritas em Alves (1998));
• baseado no conceito de que o desenvolvim ento celular m od ifica o índice de refração da luz no m eio de cultivo, pode-se acom panhar o crescim ento bacteriano pela leitura da absorbância (ou de seu inverso, a transm itância) em refratôm etro a 6 4 0 nm; por se tratar de leitura sim ples e rápida, carecendo apenas de uma curva de calibração previam ente estabelecida, é uma prática presuntiva bastante utilizada, com a única ressalva de que as diferentes etapas de desenvolvim ento interferem de fo rm a diferenciada na refração da luz, não sendo, portanto, uma m edida q u a ntita tiva adequada para o caso de esporos bacterianos (m etodologia referenciada em Capalbo e M orais (1984));
• outro parâm etro indicativo de desenvolvim ento bacteriano em m eio líquido, é a variação que se pode observar no pH do m eio de cultura. Ao longo do te m p o de ferm entação o pH, inicialm ente próxim o à neutralidade, cai a valores próxim os de 5,5; posteriorm ente, na etapa de esporulação celular, o pH retorna à neutralidade e se eleva a valores entre 8 e 9, indicando esporulação e início de lise celular.
M étodos usados no Biocontrole de Fitopatógenos - 101
P rá tic a 1 - P ro d u ção de B a c illu s sp. e m m e io g e n é ric o
Este tip o de m eio é indicado para etapas iniciais de estudo com m icrorganism os cuja fo rm a de ação de controle não está bem definida e pequenas quantidades de m eio de cu ltivo serão utilizadas.
M e io p a ra p r é -fe rm e n ta ç ã o e fe r m e n ta ç ã o
Para esta prática utilizar caldo nutriente com m eio de cultivo da pré ferm entação e da ferm entação. Preparar conform e orientação do rótulo da embalagem.
P rá tic a 2 - P ro d u ç ã o de B a c illu s sp . e m m e io d e e s p o ru la ç ã o
c o n te n d o re s íd u o s da a g ro in d ú s tria
Este m eio de cultura é mais indicado para casos onde se deseja o bter grande q uantidade de massa celular ou para obtenção de esporos. Neste caso a com posição do m eio de pré-ferm entação é mais rica em sais numa etapa em que pouca quantidade de m eio é utilizada. A utilização de resíduos agroindustriais (geralm ente contendo ainda açúcares, alguns am inoácidos e sais) é indicada para produção em m aior escala, pois reduz o custo de produção.
C o m p a ra ç ã o de re s u lta d o s
Os resultados obtid os pelos diferentes m étodos devem ser com parados para se observar as diferentes velocidades de crescim ento, com portam ento frente às condições de crescim ento em frascos agitados e m iniferm entador, bem com o as diferenças em rendim entos atingidos.
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