PHẠM LUẬN
■ ■PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH
SẮC KÝ VÀ CHIÉT TÁCH
NHÀ XUẤT BẢN BÁCH KHOA HÀ NỘI
Bản quyền thuộc về Nhà xuất bản Bách Khoa Hà Nội.
Mọi hình thức xuất bản, sao chép mà không có sự cho phép bằng văn bản của nhà xuất bản là vi phạm pháp luật.
Mã sổ: 546 - 2014/CXB/04 - 07/BKHN
Biên mực trên xuất bản phẩm của Thư viện Quốc gia Việt Nam
Phạm Luận
Phương pháp phân tích sắc ký và chiết tách / Phạm Luận. - H. : Bách khoa Hà Nội, 2014. - 796tr.: hình vẽ, bảng ; 27cm
Thư mục cuối mỗi phần ISBN 978-604-911-987-3
1. Hoá phân tích 2. sắc ký 3. Chiết tách 543.8 -dc23
LỜI TựA
Hóa học phân tích là ngành khoa học có sự tích họp cao của nhiều ngành khoa học tự nhiên như: hóa học, vật lý, toán học, tin học, sinh học, môi trường,... Nhiệm vụ cơ bản của hóa học phân tích bao gồm phân tích ñịnh tính ñể xác ñịnh thành phần hay cấu trúc của mẫu, phân tích ñịnh lượng hay ñể phân tách các chất và ñiều chế các họp chất siêu tinh khiết... Vì thế hóa học phân tích luôn ñóng vai trò quan trọng trong khoa học, kỹ thuật, trong nghiên cứu, trong xã hội như công tác ñiều tra, phát triển tiềm năng, khai thác tài nguyên khoáng sản, ñánh giá chất lượng sản phẩm,...
Các phương pháp và kỹ thuật trong hóa học phân tích ở nước ta ñã ñược phát triển và ứng dụng từ nhiều năm nay. Tại các phòng thí nghiệm của các ñơn vị ñào tạo, viện nghiên cứu và nhà máy sản xuất ñều ñược trang bị các hệ thống thiết bị phân tích trong và ngoài nước, tò cổ ñiển ñến hiện ñại, từ ñơn giản ñến phức tạp. Tuy nhiên các tài liệu tiếng Việt giới thiệu ñầy ñủ về cơ sở lý thuyết của các phương pháp phân tích vậ hướng dẫn cụ thể về từng kỹ thuật phân tích thì vẫn chưa có hoặc chưa ñầy ñủ nên là một thực tế khó khăn cho việc ñào tạo, ứng dụng và phát triển ngành hóa học phân tích hiện nay ở nước ta.
Xuất phát tò thực tế ñó, Nhà xuất bản Bách khoa Hà Nội xin giới thiệu cùng bạn ñọc Bộ sách
chuyên ngành về “HÓA HỌC PHÂN TÍCH HIỆN ðẠI” gồm 6 cuốn:
1. Phương pháp phân tích phổ nguyên tò. 2. Phương pháp phân tích phổ phân tô. 3. Phương pháp phân tích sắc ký và chiết tách. 4. Phương pháp xử lý và chuẩn bị mẫu phân tích. 5. Hóa học phân tích cơ sở. 6. Phương pháp phân tích ñiện hóa.
Tác giả của bộ sách này là Nhà giáo Ưu tú - GS. TS. Phạm Luận, người ñã nhiều năm giảng dạy, nghiên cứu và làm việc trong lĩnh vực Hóa học phân tích. Bộ sách là một phần thành tựu của tác giả - người luôn tâm huyết với việc biên soạn các cuốn sách chuyên ngành ñể lưu truyền lại cho xã hội những kiến thức và kinh nghiệm quý báu ñã ñược ñúc kết trong sự nghiệp của ông. Tôi tin rằng Bộ sách này sẽ là công cụ ñặc biệt hữu ỉ’ch, là cẩm nang kiến thức về lý thuyết và thực hành “HÓA HỌC PHÂN TÍCH HIỆN ðẠI” cho các sinh viên, giảng viên, nghiên cứu viên và các cán bộ làm việc liên quan ñến lĩnh vực phân tích.
Nhân dịp ra mắt 3 cuốn ñầu tiên của Bộ sách, trước tiên tôi xin trân trọng cảm ơn tác giả - NGƯT. GS. TS. Phạm Luận tuy ñã ở tuổi 76 nhưng vẫn dành toàn bộ tâm huyết và công sức ñể hoàn thiện bản thảo của Bộ sách này. Tôi cũng xin cảm ơn các cán bộ của Nhà xuất bản Bách khoa Hà Nội ñã rất nỗ lực và tận tâm ñế thực hiện xuất bản Bộ sách. ðặc biệt tôi xin chân thành cảm ơn ông Hoàng Anh Tuấn - Phó Chủ tịch Hội ñồng các Phòng thử nghiệm Việt Nam - VINALAB, ñã giúp ñỡ và ñóng góp kinh phí ñể biến các ý tưởng, kế hoạch ban ñầu của chúng tôi thành những cuốn sách ñược xuất bản rất ñẹp và có giá trị khoa học - xã hội cao.
Bộ sách có thể còn có thiếu sót hay hạn chế nào ñó, chúng tôi rất mong nhận ñược sự góp ý từ bạn ñọc ñể tác giả và Nhà xuất bản tiếp thu và bổ sung cho những lần xuất bản tiếp theo.
Xin trân trọng giới thiệu cùng bạn ñọc!
GIÁM ðỐC - TỔNG BIÊN TẬP NHÀ XUẤT BẢN BÁCH KHOA HÀ NỘI
TS. PHÙNG LAN HƯƠNG
LỜI NÓI ðÀU
Sắc ký và tách chiết là các kỹ thuật tách và xác ñịnh các chất trong Hóa học phân tích hiện ñại, nó bao gồm sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), ñiện di mao quản hiệu năng cao (HPCE), sắc ký khí (GC) và các kỹ thuật chiết lỏng - lỏng (LLEx), chiết pha rắn (SPE). Các kỹ thuật sắc ký và tách chiết này là một phần quan trọng của Hóa học phân tích hiện ñại, ñặc biệt là trong phân tích lượng nhỏ và lượng vết các chất.
Sắc ký lỏng hiệu năng cao, sắc ký khí, ñiện di mao quản là những kỹ thuật tách và xác ñịnh ñồng thời các chất trong một hỗn hợp mẫu.
Trong khoảng 20 năm qua, HPLC, HPCE, GC và các kỹ thuật chiết tách ñã và ñang ñược phát triển rất nhanh và ứng dụng ñạt hiệu quả cao trong việc tách, phân tích ñịnh tính và ñịnh lượng các chất khác nhau từ vô cơ ñến hữu cơ, mà sắc ký cổ ñiển không ñáp ứng ñược, như ñộ nhạy cao, tốc ñộ phân tích cao, cần ít mẫu, tách và xác ñịnh ñồng thời ñược nhiều chất trong một hỗn hợp mẫu.
Ngày nay, tổ hợp cả sắc ký khí (GC), sắc ký lỏng áp suất cao (HPLC), ñiện di mao quản hiệu năng cao (HPCE) ñã cho phép chúng ta giải quyết ñược nhiều vấn ñề thực tế của phân tích. Nhất là trong khoảng 15 năm trở lại ñây, sự phát triển và ứng dụng của kỹ thuật phân tích HPLC, GC và HPCE ñã ñi vào mọi lĩnh vực của Hoá học phân tích, từ ña lượng ñến vi lượng, cũng như ñiều chế.
Ở các nước tiêĩl tiến, nhiều phòng thí nghiệm HPLC, HPCE, GC ñã ñược xây dựng ñể phục vụ thực tế nghiên cứu và sản xuất công nông nghiệp, ñịa chất, y dược học và phân tích môi trường. Nhiều sách chuyên sâu về kỹ thụật phân tích này ñã ñược biên soạn. Nhiều hội nghị khoa học quốc tế ñã ñược tổ chức hằng năm. Phải nói rằng, kỹ thuật phân tích HPLC, GC và HPCẸ ñã trở thành một nhóm trong các kỹ thuật phân tích hiện ñại quan trọng, có hiệu quả cao ñể xác ñịnh các chất hàm lượng nhỏ và vết.
Ở nước ta, kỹ thuật phân tích GC, HPLC và HPCE cũng ñã và ñang ñược nghiên cứu và phát triển cũng như ứng dụng trong một số lĩnh vực khác nhau của nghiên cứu khoa học và sản xuất. Một số viện nghiên cứu khoa học, trường ñại học, trung tâm ñã có các hệ thống trang bị về kỹ thuật phân tích GC, HPLC và HPCE hoặc do nước ta tự ñầu tư, hoặc ñược sự viện trợ của nước ngoài theo các chương trình hợp tác nghiên cứu khoa học và ñào tạo. Một số cán bộ khoa học và kỹ thuật viên của ta cũng ñã ñược ñến các nước tiên tiến ñể học tập, tu nghiệp hay trao ñổi nghiên cứu về các kỹ thuật phân tích này. Song hiện nay còn rất nhiều cán bộ chưa ñược ñào tạo học tập một cách có hệ thống, họ muốn tìm hiểu và học tập cũng như sử dụng kỹ thuật phân tích GC, HPLC hay HPCE cho công việc của mình, nhưng lại bị hạn chế về ngoại ngữ hoặc không có ñiều kiện ra nước ngoài tu nghiệp. Các tài liệu về kỹ thuật này lại quá hiếm, chưa có bằng tiếng Việt, mà chủ yếu là bằng tiếng Anh, ðức, Pháp và Nga. ðây là một thực tế khó khăn cho việc ứng dụng và phát triển kỹ thuật GC, HPLC và HPCE hiện nay ở nước ta của nhiều cán bộ và kỹ thuật viên phân tỉch, mặc dù nhiều cơ sở ñã có trang bị ñầy ñủ các loại máy móc, song sự hiểu biết cơ sở lý thuyết của kỹ thuật phân tích GC, HPLC và HPCE còn bị hạn chế.
DIỄN ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN
Xuất phát từ thực tế ñó, tác giả mạnh dạn biên soạn cuốn sách cơ sở “Phương pháp phân tích sắc ký và chiết tách” ñể góp phần phục vụ công tác ñào tạo sinh viên ñại học, thạc sỹ, tiến sỹ về chuyên ngành Hoá phân tích và ñáp ứng một phần nào nhu cầu của nhiều cán bộ ñang muốn tìm hiếu vê kỹ thuật phân tích GC, HPLC, HPCE và các kỹ thuật chiết tách trong phân tích, cũng như một số bạn ñọc cần tìm hiểu và học hỏi về các kỹ thuật phân tích này. Nội dung cuốn sách gồm những chương chính như sau:
1. Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC); 2. ðiện di mao quản hiệu năng cao (HPCE); 3. Sắc ký khí (GC);
4. Các kỹ thuật chiết tách (LLEx, SPE, GCEx). '
Vì ñây là cuốn sách ñầu tiên về lĩnh vực này ñược biên soạn bằng tiếng Việt nên chắc chắn không thể tránh khỏi những thiếu sót nhất ñịnh. Tác giả rất mong nhận ñược những ý kiến ñóng góp của tất cả các bạn ñọc, các bạn ñồng nghiệp xa gần ñể có thể bổ sung hoàn thiện nội dung sách cho những lần xuất bản sau.
Nhân dịp xuất bản sách, tác giả xin chân thành cảm ơn GS. TS. H. Poppe, GS. TS. J.C. Kraak, PGS. TS. Phạm Gia Huệ, GS. TS. Nguyễn ðức Huệ, PGS. TS. Nguyễn Văn Ri, TS. W.Th. Kook, KS.
w.
J. Elgersma, KS. R. Oster Vink,... ñã có ĩửiiều ý kiến ñóng góp cho việc xây dựng nội dung cuốn sách này.Tác giả
GS. TS. PHẠM LUẬN
MỤC LỤC
Lời tựa...3
Lời nói ñầu... 5
Bảng các chữ viết tắ t... ... 13
Chương 1. c ơ s ở LÝ THUYẾT SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO... 21
1.1. Những khái niệm về kỹ thuật tách sắc k ý ...21
1.1.1. Những khái niệm về kỹ thuật sắc ký... ...21
1.1.2. Nguyên tắc cấu tạo của hệ thống HPLC... ...23
1.1.3. Phân loại mức ñộ tách của HPLC... 25
1.1.4. Nguyên tắc của quá trình sắc ký trong cột tách... 25
1.2. Cơ s ở lý thuyết của kỹ thuật HPLC.... ... 28
1.2.1. Khái quát quá trình tách sắc k ý ... ... 28
1.2.2. Các ñại lượng ñặc trưng của HPLC...28
1.2.3. Pha tĩnh trong HPLC... 48
1.2.4. Pha ñộng trong HPLC... 64
1.2.5. Lực rửa giải và thành phần pha ñộng... ... 72
1.2.6. Các cân bằng ñộng học trong cột tách HPLC... 77
1.2.7. Ảnh hưởng của cấu trúc phân tử chất tan... ... ... 82
1:2.8. Ảnh hưởng của thể tích mẫu nạp vào cột tách... 85
1.2.9. Rửa giải có gradient thành phần pha ñộng... ... 87
1.2.10. Ảnh hưởng của nhiệt ñộ... 89
1.2.11. ðộ chọn lọc của hệ pha HPLC.... ... ... 91
1.2.12. Tách trên hai cột kế tiếp nhau... ...93
1.2.13. Tối ưu hóa các ñiều kiện cho quá trình sắc k ý ...95
1.2.14. Chế tạo cột tách và kiểm tra cột tách...99
1.3. Trang thiết bị của kỹ thuật HPLC... ... ... ... 102
1.3.1. Khái quát chung... ... 102
1.3.2. Bơm cao áp trong HPLC... 104
1.3.3. Van bơm mẫu trong HPLC... 108
1.3.4. Cột tách sắc ký... ... ... 109
1.3.5. Các loại detector trong HPLC... 111
1.4. Phân tích ñịnh tính và ñịnh lượng bằng HPLC... 134
1.4.1. Phân tích ñịnh tính... ... ... 134
1.4.2. Phân tích ñịnh lượng...136
1.4.3. Phân tích bán ñịnh lượng... 141
1.4.4. Một số kỹ thuật phụ trợ trong HPLC...143
1.5. Sự phát triển của HPLC lên UHPLC...146
1.5.1. Yêu cầu thực tế của tách và phân tích HPLC...146
1.5.2. Sự phát triển HPLC lên UHPLC... 147
1.5.3. Phần mềm (chương trình) ñiều khiển...153
1.5.4. Ví dụ các sản phẩm mới của UHPLC... ...153
1.5.5. Các ưu nhược ñiểm và phạm vi ứng dụng UHPLC... ... 154
1.6. Kỹ thuật HPLC trong phân tích ñịnh dạng...156
1.7. Một số ví dụ ứng dụng HPLC và UHPLC...166
1.8. Ví dụ một số máy HPLC và UHPLC... ... 177
Tài liệu tham khảo.... ... 183
Chương 2. c ơ SỞ LÝ THUYẾT ðIỆN DI MAO QUẢN HÍÊU NĂNG CAO... ...185
2.1. ðại cương về ñiện di mao quản...185
2.1.1. Sự ra ñời và phát triển của kỹ thuật ñiện d i... 185
2.1.2. ðặc ñiểm của HPCE... ... 186
2.1.3. Tình hình hiện nay của HPCE... 187
2.1.4. Nguyên tắc của sắc ký ñiện di mao quản...187
2.1.5. Sự phân loại hay các kiểu (mode) của HPCE...192
2.2. Cơ sở lý thuyết của ñiện di mao quản.... ... 193
2.2.1. Sự ñiện di của chất tan trong mao quản... ... 193
2.2.2. Thế ñiện di V và lực ñiện di E...197
2.2.3. Dụng dịch ñệm pH và pha ñộng trong HPCE... ...199
2.2.4. Mao quản (cột tách) trong HPCE... ... 210
2.2.5. Lớp ñiện kép trên thành mao quản... 214
2.2.6. Dòng ñiện thẩm (EOF)...216
2.2.7. Các thông số phân tích của HPCE...231
2.2.8. Hiệu ứng nhiệt và sự Gradient nhiệt ñộ trong mao quản... 252
2.2.9. Sự tương tác của chất tan với thành mao quản... ... 261
2.2.10. Sự phân tán vùng chất mẫu do ñiện tích gây ra ... 269
2.2.11. Chất hoạt ñộng bề mặt dùng trong HPCE...271
2.2.12. ðộ chọn lọc trong HPCE... 275
2.2.14. Nạp mẫu và vùng mẫu trong mao quản...276
2.2.15. Các kiểu ñiện di mao quản... 281
2.2.16. Khái quát các yếu tố ảnh hưởng trong HPCE...310
2.2.17. Tối ưu hóa các ñiều kiện cho HPCE...314
2.3. Các trang bị máy móc của HPCE... 315
2.3.1. Nguyên tắc cấu tạo của một hệ HPCE...316
2.3.2. Các bộ phận và nhiệm vụ của n ó... 317 2.4. Phân tích ñịnh tính bằng HPCE... 329 2.4.1. Nguyên tắc của phân tích ñịnh tính... 329 2.4\2. Cách tiến hành phân tích ñịnh tính... ... 329 2.5. Phân tích ñịnh lượng bằng HPCE...331 2.5.1. Nguyên tắc và phương trình cơ bản... 331 2.5.2. Các phương pháp ñịnh lượng... ... 333
2.5.3. Phân tích bán lượng theo cách ño tổng diện tích s của p ic ... .337
2.6. Một số ví dụ của HPCE... 339
Tài liệu tham khảo...349
Chương 3. NHỮNG VÁN ðÈ c ơ SỞ CỦA KỸ THUẬT PHÂN TÍCH SẮC KÝ KHÍ...351
3.1. ðại cương về sắc ký khí, GC...351
3.1.1. Các ñịnh nghĩa và khái niệm về sắc k ý ... 351
3.1.2. Cột tách sắc ký khí và pha tĩnh... 354
3.1.3. Pha ñộng (MP) của G C ... 355
3.1.4. Thực hiện quá trình tách sắc k ý ... ...355
3.1.5. Hệ thống máy (trang bị) của GC... ... 356
3.1.6. Phát hiện cáò chất trong GC... 358 3.1.7. Các ñặc trưng của GC... 360 3.1.8. Sự phát triển của GC... ...361 3.2. Các quá trình tách trong cột sắc kỷ khí... 364 3.2.1. Các tương tác trong cột tách GC... 364 3.2.2. Cân bằng ñộng học trong cột tách G C ... 365 3.2.3. Các loại cân bằng ñộng học trong cột tá ch ... ... ... 367 3.3. Các ñại lượng ñặc trưng của GC... ... 369
3.3.1. Thời gian lưu (Retention Time)... ...369
3.3.2. Hệ số tách của hai chất kề nhau... ... 370
3.3.3. Sự phân bố và hệ số phân bố Kpb của chất tan X i... ... 372
3.3.4. Hệ số dung lượng kị' (Capacity Factor)... 374
3.3.5. Tốc ñộ pha ñộng... ... 377
3.3.6. ðộ phân giải trong GC, R ... 380
3.3.7. Nồng ñộ chất trên pic sắc k ý ... 382
3.3.8. Chiều cao ñĩa (H) và số ñĩa (N) của cột tách G C ...384
3.3.9. ðiều khiển nhiệt ñộ trong kỹ thuật tách G C...391
3.4. Pha tĩnh của GC...397
3.4.1. Pha tĩnh và cột tách của GC... 397
3.4.2. Chất nền ñể chế tạo pha tĩnh trong GC... 402
3.4.3. Các loại cột tách của GC... 403
3.4.4. Phương pháp tẩm pha tĩnh lỏng lên chất mang...409
3.4.5. Các phương pháp nhòi pha tĩnh vào cột tách... ... 412
3.5. Pha ñộng trong GC... 415
3.5.1. Yêu cầu của pha ñộng trong GC ... ... 415
3.5.2. Các loại pha ñộng (khí mang) của G C ... 415
3.6. Các loại DETECTOR dùng trong GC... 419
3.6.1. Detector ño ñộ dẫn nhiệt, TCD... ...420
3.6.2. Detector ion hóa ngọn lửa... ...-422
3.6.3. Detector bắt ñiện tử, ECD... ...423
3.6.4. Detector khối phổ, MMD... 424
3.6.5. Các loại detector khác...434
3.6.6. Sự ghép nối GC với các detectór khác nhau... 435
3.7. Phương pháp nạp mẫu vào cột tách GC... 437
3.7.1. Khái quát chung...437
3.7.2. Các yêu cầu của việc nạp mẫu vào cột tách GC...438
3.7.3. Các phương pháp nạp mẫu... ...439
3.8. Những yếu tố ảnh hưởng trong GC... 445
3.9. Tối ưu hóa các ñiều kiện cho hệ tách G C ... 449
3.9.1. Chọn cột loại pha tĩnh... 449
3.9.2. Chọn chiều dài cột tách... ... ....449
3.9.3. Chọn pha ñộng (khí mang)... ...450
3.9.4. Chọn phương pháp và các ñiều kiện nạp mẫu... 450 i* 3.9.5. Chọn chế ñộ chạy sắc k ý ... ... 450
3.9.6. Chọn các ñiều kiện và trang bị phát hiện chất...451
3.9.7. Xem xét các yếu tố ảnh hưởng khác có thể c ó ... ...451
3.9.8. Phương pháp và ñiều kiện xử lý chuẩn bị mẫu... 451
3.10. Phân tích ñịnh tính... ... ... 451
3.10.1. Nguyên tắc chung... ...i...451
3.10.2. Phương pháp ñịnh tính... 452
3.11. Phân tích bán ñịnh lượng theo diện tích PIC, s ... 453
3.11.1. Nguyên tắc chung... 453
3.11.2. Cách tiến hành... 454
3.11.3. ðịnh lượng theo phép ño tổng diện tích pic,
s
... 4553.12. Phân tích ñịnh lượng... 455
3.12.1. Phương trình ñịnh lượng và nguyên tắc...455
3.12.2. Các phương pháp ñịnh lượng...456
3.13. Một số kỹ thuật phụ trợ trong GC... 462
3.13.1. Kỹ thuật GC ña chiều... 462
3.13.2. Kỹ thuật GC có thế hóa... ... 463
3.13.3. Các kỹ thuật dẫn xuất hóa trong phân tích GC... ... 465
3.14. Ghép nối hệ GC với các DETECTOR ñể ñịnh dạng...468
3.15. Chuẩn bị mẫu cho G C ... ... ... 471
3.15.1. Kỹ thuật chiết lỏng - lỏng ... ... 471 3.15.2. Làm sạch và làm giàu chất phân tíc h.... ... ...479 3.16. Sắc ký khí khối phổ phân tích các HCBVTV... ...481 3.16.1. Xác ñịnh các HCBVTV trong dược liệu...482 3.16.2. Xác ñịnh các HCBVTV trong mẫu ñ ấ t... 491 3.17. Một số ví dụ khác về phân tích G C ... 497 3.18. Ví dụ một số hệ máy GC và các ñặc trưng của nó...504
Tài liệu tham khảo...513
Chương 4. MỘT s ổ VÁN ðÈ c ơ s ở CỬA sự CHIÉT TRONG PHÂN TÍCH... 515
4.1. Những vấn ñề cơ bản của sự chiết... 515
4.1.1. Khái niệm về sự chiết... 515
4.1.2. Hằng số phân bố và hệ số chiết... ...515
4.1.3. Phân loại các hệ ch iế t... 528
4.1.4. Quy luật phân bố và cân bằng chiết... 530
4.1.5. Giải chiết (giải hấp) chất phân tích Xi ra khỏi pha chiết...542
4.2. Các kỹ thuật và phương pháp cách chiết... ... 545
4.2.1. Các cách chiết... ... 545
4.2.2. Các dạng hợp chất chiết ñược... 548
4.3. Trang thiết bị của các kỹ thuật chiết... ...549
4.4. Các kỹ thuật chiết trong phân tích... ...555
4.4.1. Kỹ thuật chiết lỏng - lỏng...555
4.4.2. Kỹ thuật chiết pha rắn (chiết lỏng - rắn)... 572
4.4.3. Kỹ thuật vi chiết pha rắn...609
4.4.4. Kỹ thuật chiết pha khí, hệ chiết khí - rắn... 630
4.4.5. Chiết pha rắn (SPE và SPME) trong phân tích môi trường... 634
4.5. Các yếu tố ảnh hưởng ñến quá trình chiết... 636
; 4.5.1. Hệ số phân bố và nồng ñộ chất cần chiết... 636
4.5.2. Môi trường pH của mẫu chiết...638
4.5.3. Nhiệt ñộ chiết... 641
4.5.4. Tốc ñộ nạp mẫu và giải chiết...642
4.5.5. Dung môi giải chiết... ...643
4.5.6. Chất tạo phức và nồng ñộ của n ó ...644
4.5.7. Chất nền của mẫu... ... 644
4.5.8. Nồng ñộ muối tan trong mẫu...645
4.5.9. Thời gian chiết...646
4.5.10. Các chất khác có trong mẫu và sự chiết cạnh tranh... 648
4.6. Các cách nâng cao ñộ chọn lọc và hiệu suất chiết...649
4.6.1. Chọn hệ dung môi chiết hay chất chiết pha rắ n ...649
4.6.2. Sử dụng phản ứng xúc tá c...651
4.6.3. Dùng phương pháp cộng chiết... ... 651
4.6.4. Thay ñổi dạng hợp chất của chất cần chiết...651
4.6.5. Dùng cơ chế chiết liên hợp... ...652
4.6.6. Dùng hiệu ứng trợ chiết của muối ñiện ly... ... 652
Tài liệu tham khảo... 653
PHỤ LỤ C ... ... ... 655
MỌT SỐ THIẾT BỊ MINH HỌA... 779
CHỈ MỤC... ...787
$
BẢNG CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Viết tắt LC HPLC SHPLC UHPLC GC CaGC PC NP NP-HPLC RP RP-HPLC IE (hay IEx) IEx-HPLC IC IExC IP-C GF GFC GF-HPLCMEC, hay MEHPLC MEC
Viết ñầy ñủ tiếng Việt (tiếng Anh) Sắc ký lỏng (Liquid Chromatography)
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography) hay (High Pressure Liquid Chromatography)
Sac ký lỏng super hiệu năng cao
(Super High Performance Liquid Chromatography) Sắc ký lỏng siêu hiệu năng cao
(Ultra High Performance Liquid Chromatography) Sac ký khí (Gas Chromatography)
Sac ký khí cột mao quản (Capillary Column Gas Chromatography) Sắc ký phân bố (Partition Chromatography)
Pha thường (Normal Phase)
Sac ký lỏng hiệu năng cao pha thường
(Normal Phase High Performance Liquid Chromatography) Pha ngược (Reversed Phase)
Sạc ký lỏng hiệu năng cao pha ngược
(Reversed Phase High Performance Liquid Chromatography) Trao ñổi Ion (Ion Exchange)
Sac ký lỏng hiệu năng cao trao ñổi ion
(Ion-Exchange High Performance Liquid Chromatography) Sắc ký ion (Ion Chromatography)
Sac ký trao ñổi ion (Ion Exchange Chromatography) Săc ký cặp ion (Ion-Pair Chromatography)
Rây, sàng lọc (Gel Filtration)
Sac ký rây, sàng lọc phân tử (Gel Fittration Chromatography) Sắc ký lỏng hiệu năng cao rây phân tử
(Molecular Exclusion High Performance Liquid Chromatography) Sac ký rây, sàng lọc phân tử (Molecular Exclution Chromatography)
HPTLC Sắc ký lớp mỏng, bản mỏng hiệu năng cao
(High Performance Thin-layer Liquid Chromatography )
PC Sắc ký phân bố (Partition Chromatography)
LLC Sắc ký lỏng - lỏng (Liquid Liquid Chromatography)
LSC Sắc ký rắn - lỏng (Liquid Solid Chromatography)
MP Pha ñộng (Mobile Phase)
SP Pha tĩnh (Stationary Phase)
u v Tử ngoại (Ultraviolet)
VIS Khả kiến (Visible)
AES Phổ phát xạ nguyên tử (Atomic Emission spectrography)
AFS Phổ huỳnh quang nguyên tử (Atomic Fluorescence spectrography)
AFSD Detector phổ huỳnh quang nguyên tử
(Atomic Fluorescence Spectrography Detector)
AESD Detector phổ phát xạ nguyên tử (Atomic Emission spectrography Detector)
F-AAS Phổ hấp thụ nguyên tử ngọn lửa (Flame Atomic Absorption Spectrography)
GF-AAS Phổ hấp thụ nguyên tử không ngọn lửa (lò graphit)
(Flameless Atomic Absorption spectrography)
hay (Graphite Furnace Atomic Absorption Spectrography)
MF Huỳnh quang phân tò (Molecular Fluorescence)
MFS Phổ huỳnh quang phân tử (Molecular Fluorescence spectrography)
PDA Mảng diot quang (Photo Diod Array)
EI lon hóa bằng Electron (Electron Ionization)
ESI lon hóa bằng phun mù Electron (Electro-Spray Ionization)
EI-MMS Phổ khối lượng phân tứ nguồn EI
(Electron Ionization Molecular Mass Spectrography)
ESI-MMS Phổ khối lượng phân tử nguồn ESI
(Electro-Spray Ionization Molecular Mass Spectrography)
ICP Inductivity Coupled Plasma
ICP-MS Phổ khối nguyên tử nguồn cao tần cảm ứng
(Inductivity Coupled Plasma Atomic Mass spectrography)
LOD Giới hạn phát hiện (Limit o f Detection)
LOQ Giới hạn ñịnh lượng (Limit o f Quantitative)
IEx-HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao trao ñổi ion
(Ion Exchange High Performance Liquid Chromatography)
CEx-HPLC AEx-HPLC NP-HPLC RP-HPLC P-HPLC IC I-HPLC PT HQNT HQNTD HQPT HQPTD PKNT hay AMS PKNTD PKPT hay MMS PKPTD TOF TOF-MS FC WE WR IE Au CE VHG-F-AAS
Sắc ký lỏng hiệu năng cao trao ñối cation
(Cation-Exchange High Performance Liquid Chromatography) Sac ký lỏng hiệu năng cao trao ñổi anion
(Anion-Exchange High Performance Liquid Chromatography) Sac ký lỏng hiệu năng cao pha thường
(Normal Phase High Performance Liquid Chromatography) Sắc ký lỏng hiệu năng cao pha ngược
(Reversed Phase High Performance Liquid Chromatography) Sắc ký lỏng phân bố hiệu năng cao
(Partition High Performance Liquid Chromatography) Sắc ký ion (Ion Chromatography)
Sac ký lỏng ion hiệu năng cao
(Ion High Performance Liquid Chromatography) Phân tích (Analysis, Analytical)
Phổ huỳnh quang nguyên tử (Atomic Fluorescence Spectrometry) Detector phổ huỳnh quang nguyên tử
(Atomic Fluorescence Spectrometry Detector)
Phố huỳnh quang phân tử (Molecular Fluorescence Spectrometry) Detector phổ huỳnh quang phân tò
(Molecular Fluorescence Specừometry Detector)
Phổ khối lượng nguyên tử (Atomic Mass Spectrography)
Detector phổ khối lượng nguyên tử (Atomic Mass spectrography Detector) Phổ khối lượng phân tử (Molecular Mass Spectrography)
Detector phổ khối phân tử (Molecular Mass Spectrography Detector) Thời gian bay (Time of Flight)
Máy phổ khối phân giải theo thời gian bay (Time o f Flight Mass spectrometer) Buồng ño ñộng, dòng chảy (FlowCell)
Cực làm việc (Working Electrode) Cực so sánh (Reference Electrode) Cực chỉ thị (Indication Electrode) Cực phụ trợ (Auxiliary Electrode)
Cực phụ trợ, kiểm tra (Counter Electrode)
Phổ hấp thụ nguyên tử với kỹ thuật hydrua hoá mẫu
Volatile hydride Compound Generation Flame Atomic Abssorption Spectrography
ECD Detector bat electron
AESD Detector phổ phát xạ nguyên tử
(Atomic Emission Spectrography Detector)
oc
Hóa chất bảo vệ thực vật cơ clo(-Organo-chlorine Pesticides)
OP Hóa chất bảo vệ thực vật cơ phospho
(-Organo-phosphoric Pesticides)
PAHs Hợp chất hydrocacbon ña vòng (Poly Acromatic Hydrocarbures)
CE ðiện di (Capillary Electrophoresis),,
HPCE ðiện di mao quản hiệu năng cao (High Performance Capillary Electrophoresis)
HVCE ðiện di mao quản thế cao (High Pressure Capillary Electrophoresis)
HPCEC Sắc ký ñiện di mao quản hiệu năng cao
(High Performance Capillary Electrophoresis Chromatogrphy)
HVCEC Sac ký ñiện di mao quản thế cao
(High Pressure Capillary Electrophoresis Chromatogrphy)
CZE ðiện di mao quản vùng (Capillary Zone Electrophoresis)
MCEK ðiện di mao quản ñiện ñộng học Micell
Hay MEKC (Micell Capillary Electro-Kinetic Electrophoresis)
Gel-HPCE ðiện di mao quản hiệụ năng cao sàng lọc phân tử
(Gel-Filter High Performance Capillary Electrophoresis)
CIEF ðiện di mao quản hội tụ ñẳng ñiện tích
(Capillary Iso-Focusing Electrophoresis)
CITP ðiện di mao quản ñẳng tốc ñộ (Capillary Iso-Tacho Elecừophoresis)
MP Pha ñộng (Mobile Phase)
EOF Dòng ñiện thẩm (Electro-Osmotic Flow)
EFF Lực ñiện trường (Electric Field Force)
IF Lực ion (Ion Force)
ID ðường kính trong (Inner Diameter, or Inside Diameter)
OD ðường kính ngoài (Outside Diameter)
R ðộ phân giải (Resolution)
PD ðiều khiển bằng áp lực (Pressure Drive)
ED ðiều khiển bằng ñiện lực (Electric Drive)
CMC Nồng ñộ giới hạn hình thành tiểu phân Micell
(Critial Micellary Concentration)
NP Pha thường (Normal Phase)
RP Pha ngược (Reversed Phase)
NTðH Nguyên tố ñất hiếm (Rare Eath Elements)
PAD Detector mảng diot phát quang (Photo array Diod Detector)
UVD Detector phổ hấp thụ tử ngoại (Ultraviolet Detector)
VISD Detector phổ hấp thụ khả kiến (Visible Detector)
EI/MMS Detector khối phổ phân tử nguồn ion hoá electron
(Electron Ionization Molecular Mass Spectrometer)
ESI-MMS Detector khối phổ phân tử nguồn ion hóa phun mù electron
(Electron-Spray Ionization Molecular Mass spectrometer)
ICP-MS, hay Phổ khối phổ nguyên tử nguồn cao tần cảm ứng
ICP-AMS (Inductivity Coupled Atomic Plasma Mass spectrometer)
ICP-OES Phổ phát xạ nguyên tử nguồn cao tần cảm ứng
(Inductivity Coupled Plasma Atomic Emision spectrometer)
F-AASD Detector phổ hấp thụ nguyên tử ngọn lửa
(Flame Atomic Absorption Spectrometer Detector)
MFD Detector phổ huỳnh quang phân tử (Molecular Fluorescene Detector)
DPSV Detector ñiện hóa Von-Ampe hòa tan xung vi phân
(Difference Pulse Stripling Voltammetry Detector)
TBE Tri-Butyl-Etanol
LE Chất ñiện dẫn (Leading electrolyte)
TE Chất giới hạn vùng mẫu
(Zone terminating electrolyte)
QC Kiểm tra chất lượng (Quality Control)
PVC Nhựa polyvinyl
HV ðiện thế cao (High Voltage)
GC Sắc ký khí (Gas Chromatography)
GC-MS Sắc ký khí khối phổ
(Gas Chromatography with Mass Spectrometer Detector)
GF-GC Sắc ký khí rây (sàng lọc) phân tử (Gel-Filter Gas Chromatography)
PC-GC Sắc ký khí phân bố (Partition Gas Chromatography)
NP-GC Sắc ký khí pha thường (Normal Phase Gas Chromatography)
RP-GC Sắc ký khí pha ngược (Reversed Phase Gas Chromatography)
QM Mao quản (Capillary)
SP Pha tĩnh (Stationary Phase)
MP Pha ñộng (Mobile Phase)
FID Detector ion hóa ngọn lửa (Flame Ionization Detector)
ECD Detector bắt (cộng họp) electron (Electron Capture Detector)
TCD Detector ño ñộ dẫn nhiệt (Thermal Conductivity Detector)
FPD Detector phát quang ngọn lửa (Flame Photometric Detector)
MMSD Detector phổ khối phân tô (Molecular Mass Spectrometer Detector)
ẼICD Detector ño ñộ dẫn ñiện (Electrolytic Conductivity Detector)
El Ion hóa bằng nguồn electron (Electron Ionization)
Cl Ion hóa bằng nguồn hóa học (Chemical Ionization)
PCI lon hóa hóa học ion dương (Positive Chemical Ionization)
NCI lon hóa hóa học ion âm (Negative Chemical Ionization)
ESI lon hóa bằng nguồn phun electron (Electro-Spray Ionization)
PID Detector ion hóa photon (Photon-Ionization Detector)
NPD Detector Nitơ-Phospho (Nitrogen-Phosphorus Detector)
Ft-IR Detector phổ hồng ngoại chuyển hóa Fourier
Hay FIR (Fourier transform Infrared Spectroscopy)
R ðộ phân giải (Resolution)
HCBVTV Hoá chất bảo vệ thực vật (Pesticides)
oc
Hoá chất bảo vệ thực vật họ họp chất cơ clo (Organo-chlorine Pesticides)OP Hoá chất bảo vệ thực vât họ hợp chất cơ phospho
(Organo-phosphorus Pesticides)
PY Hoá chất bảo vệ thực vật họ Pyred (Pyred Pesticides)
HS Bộ chuẩn bị mẫu dạng hơi (Head-Space)
HS-GC Sắc ký khí với bộ chuẩn bị mẫu dạng hơi (Head-Space Gas Chromatography)
LLEx Chiết lỏng - lỏng (Liquid-Liquid Extraction)
SLEx Chiết lỏng - rắn (Solid-Liquid Extraction)
SPE Chiết pha rắn (Solid Phase Exừaction)
SPME Vi chiết pha rắn (Solid Phase Micro-Extraction)
GPE Chiết pha khí (Gas Phase Extraction)
UEx Chiết siêu âm (Ultra-Sonic Extraction)
Dutch-EPA Cục bảo vệ môi trường Hà Lan (Dutch Enviromental Protection Agency)
RSD ðộ lệch chuẩn tương ñối (Relative Standard Deviation)
RE Sai số tương ñối (Relative Error)
LLE Chiết lỏng - lỏng (Liquid-Liquid Exừaction)
SPE Chiết pha rắn (Solid Phase Extraction)
IPE Chiết kiểu cặp ion (Ion Pair Extraction)
GPE Chiết pha khí (Gas Phase Extraction)
SGE Chiết rắn - khí (Solid-Gas Extraction)
SPME Vi chiết pha rắn (Solid Phase Micro-Extraction)
Pest Các hóa chất bảo vệ thực vật, HCBVTV (Pesticides)
Herb Hoá chất diệt cỏ dại (Herbicides)
OCP, hay
oc
Hóa chất bảo vệ thực vật họ cơ clo (Organo-chlorine Pesticides)OPP, hay OP Hóa chất bảo vệ thực vật họ cơ phosphor
(Organo-phosphoras Pesticides)
PCBs Các hợp chất Biphenyl (Poly Carbure Biphenyls)
PHAs Các hydrocacbon thơm ña vòng (Poly Hydrocarbure Acromatics)
APDC Amonium Pyrolydin Dithiocarbamate
MIBK Metyl Iso Butyl Ketone
Me Kim loại (Metal)
Re Thuốc thử (Reagent)
ES Dung môi giải chiết (Elution Solvent)
Abs Sự hấp thụ (Absorption)
Abt ðộ hấp thụ, băng hấp thụ (Absorpbant)
MaT Chất nền của mẫu (Matrix)
Chương 1
C ơ SỞ LÝ THUYÉT
SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
1.1. NHỮNG KHÁI NIỆM VÈ KỸ THUẬT TÁCH SÂC KÝ 1.1.1. Những khái niệm về kỹ thuật sắc ký
Sắc ký là những kỹ thuật tách và phân tích (xác ñịnh) các chất trong một hỗn hợp mẫu dựa theo những tính chất hóa học, vật lý và hóa lý của các chất trong những ñiều kiện nhất ñịnh. Các tính chất ñó là:
+ Tính chất hấp phụ của chất rắn xốp; + Tính chất trao ñổi ion, tạo cặp ion;
+ Sự rây phân tử theo kích thước (ñộ lớn) phân tử của chúng; + Sự tạo phức và sự liên hợp phân tử;
+ Sự phân bố của các chất giữa hai pha không hòa tan vào nhau;
Kỹ thuật sắc ký có hai loại dựa theo trạng thái của chất mẫu và pha ñộng khi tiến hành tách (chạy) sắc ký. ðó là:
1. Kỹ thuật phân tích sắc ký khí (GC), pha ñộng là chất khí; 2. Kỹ thuật phân tích sắc ký lỏng (LC), pha ñộng là chất lỏng. Trong kỹ thuật sắc ký lỏng lại ñược chia thành hai nhóm, ñó là: + Sắc ký lỏng áp suất thường, LC (sắc ký cổ ñiển);
+ Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography, HPLC), làm việc với áp suất từ 150 - 250 bar.
Hiện nay (từ sau năm 1999) ñã có sắc ký lỏng siêu áp (Ultra High Performance Liquid Chromatography: UHPLC), loại này làm việc với áp suất cao từ 900 - 1300 bar.
Trong sắc ký cột (có dạng rắn - lỏng hay lỏng - lỏng), kỹ thuật sắc ký lỏng áp súất thường ñã ra ñời và ñược ứng dụng từ lâu (trên 80 năm), nhưng hiệu suất tách không cao, ñộ nhạy thấp và tốn nhiều thời gian cũng như dung môi ñể chạy sắc ký. Ngược lại, kỹ thuật HPLC tuy mới ra ñời và phát triển khoảng 30 năm trở lại ñây, nhưng hiện nay ñang ñược phát triển rất nhanh và ñã ñược ứng dụng rất rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau của nghiên cứu khoa học, sản xuất công nghệ, môi trường,..., vì kỹ thuật tách sắc ký HPLC này có ñộ nhạy cao, hiệu suất tách cao và tốn ít thời gian cũng như tốn ít mẫu. Nói chung, ừong khoảng 20 năm qua, kỹ thuật phân tích HPLC ñã chiếm gần 70% tổng số các công trình nghiên cứu và ứng dụng về sắc ký.
Kỹ thuật phân tích HPLC bao gồm hai nhóm:
+ Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC: High performance thin-layer liquid Chromatography). + Sắc ký cột lỏng hiệu năng cao hay sắc ký lỏng hiệu suất cao (HPLC: High performance liquid Chromatography).
Trong nhóm HPLC, tùy theo bản chất của các quá trình sắc ký của pha tĩnh (SP) xảy ra trong cột tách mà người ta chia thành các loại sau:
1. Sắc ký phân bố (PC) của chất tan giữa hai pha không tan vào nhau; 2. Sắc ký hấp phụ pha thường (NP-HPLC);
3. Sắc ký hấp phụ pha ngược hay pha ñảo (RP- HPLC); 4. Sắc ký trao ñổi ion (IEx-HPLC) và cặp ion (IP-HPLC); 5. Sắc ký rây (sàng lọc) phân tử (FG-HPLC).
Trong năm loại này, loại thứ năm chỉ ñể tách các chất có phân tử lượng lớn hơn 1000 ñvC (cao phân tử). Một cách tổng quát, chúng ta có thể minh họa khái quát sự phân chia này trong sơ ñồ hình 1.1. I Kỹ thuật HPLC ---HPLC PC NP RP ĨẼ ĩ»c NP RP IE FG Ị.---J—.— --- ———J L— —J —— L--- L— —1 ÍL HPTLC ■r
Hình 1.1. S phân loi ca các k thut HPLC.
HPLC: Sắc ký lỏng hiệu năng cao; HPTLC: Sắc ký lớp mỏng (phẳng) hiệu năng cao;
PC - Phân bố; NP - Pha thường, RP - Pha ngược; I E x - Trao ñổi ion; FG - Rây phân tử.
Sự phân chia trên ñây là dựa theo tính chất của quá trình sắc ký, tất nhiên ñó cũng chỉ là tương ñối. Vì trong nhiều trường hợp, quá trình tách sắc ký xảy ra trong cột tách không phải chỉ theo một tính chất (một cơ chế) duy nhất, mà ñồng thời có thể có hai cơ chế khác nhau cùng diễn biến trong cột tách. Ví dụ, trong sắc ký cặp ion dùng chất hấp phụ pha ngược Hypersil ODS ñể tách các nguyên tố ñất hiếm, với pha ñộng là methanol và nước, trong môi trường ñệm axetat (pH = 4,6), có chất tạo phức Ở-HIBA, thì sự tách xảy ra theo cả cơ chế trao ñổi ion và cơ chế hấp phụ của pha ngược.
Mặt khác, khi xem xét về trạng thái pha tĩnh, người ta lại chia thành: + Sắc ký lỏng - lỏng (LLC): pha tĩnh và pha ñộng ñều là chất lỏng. + Sắc ký lỏng - rắn (LSC): pha tĩnh là chất rắn, pha ñộng là chất lỏng.
Ở ñây, trong hệ LLC thì pha tĩnh là chất lỏng, nó ñược giữ ở trong cột tảch như một lớp màng nhờ một chất mang trơ. Chất mang trơ này thường là các hạt silicagen trơ, ví dụ như Kiselgure của hãng Merck. Còn trong hệ LSC thì pha tĩnh là một chất rắn, hạt xốp và có cỡ hạt từ 5 ñến 10 ịim
Cùng với pha tĩnh, trong kỹ thuật HPLC, các chất lỏng hay hỗn hợp các chất lỏng dùng ñể rửa giải các chất phân tích trong quá trình sắc ký ñược gọi là pha ñộng (MP). Pha ñộng có thể chỉ là một dung môi nước hay dung môi hữu cơ, như metanol, axetonitril, butanol; hay cũng có thể là hỗn hợp của hai dung môi, như metanol và nước hay axetonitril và nước trộn với nhau theo tỷ lệ nhất ñịnh. Hoặc cũng có thế là dung môi có thêm các chất ñệm, chất dẫn ñiện, chất tạo phức,...
Song song với kỹ thuật HPLC, kỹ thuật sắc ký khí cũng ñược phát triển và ứng dụng trong nhiều lĩnh vực. Kỹ thuật sắc ký khí sẽ ñược giới thiệu kỹ trong chương 3 của cuốn sách này.
1.1.2. Nguyên tắc cấu tạo của hệ thống HPLC
ðe thực hiện việc tách một hỗn hợp chất bằng kỹ thuật phân tích HPLC, chúng ta phải có các hệ thống trang thiết bị về kỹ thuật này. Hệ thống trang thiết bị của kỹ thuật HPLC, về cơ bản (ñơn giản và ñủ ñể làm việc) bao gồm 5 bộ phận chính sau ñây:
1. Bơm cao áp (High pressure Pump)
ðể bơm pha ñộng (MP) vào cột tách, thực hiện quá trình sắc ký, rửa giải chất tan ra khỏi cột sắc ký. Bơm này phải ñiều chỉnh ñược áp suất (0 - 400 bar) ñể tạo ra ñược những tốc ñộ nhất ñịnh của pha ñộng qua cột tách phù họp cho quá trình chạy sắc ký và phải khống chế ñược tốc ñộ MP nằm trong vùng 0,5 - 2,5 mL/phút.
2. Bộ van bơm m ẫu (Sample Injection System)
ðể bơm mẫu phân tích vào cột tách theo những lượng mẫu nhất ñịnh không ñổi trong một quá trình sắc ký. ðó là các van 6 chiều có chứa vòng mẫu có thể tích xác ñịnh (ví dụ 20, 50 hay 100 |iL).
Van 6 chiều chỉ có một vòng mẫu, ñược dùng chủ yếu trong các hệ máy phân tích HPLC hiện nay.
3. Cột tách (Separation Column)
Cột tách là bộ phận chứa pha tĩnh (SP), trái tim của quá trình tách sắc ký, nó là một yếu tố quyết ñịnh hiệu quả sự tách sắc ký của một hỗn hợp chất mẫu. Cột tách có nhiều cỡ khác nhau, tùy thuộc vào mức ñộ sắc ký (bảng 1.1). Nói chung, các cột tách phân tích thường có kích thước chiều dài từ 15 - 25 cm; ñường kính trong từ 2,5 - 4,6 mm. Còn với UHPLC có cột tách chiều dài 5 - 7 cm và ñường kính trong
2 - 2,2 mm.
4. Trang bị phát hiện chất phân tích
ðây thường là các loại Detector dựa theo các tính chất của chất phân tích, ñể phát hiện và ño ñịnh lượng nó, ví dụ:
- Detector hấp thụ quang phân tử vùng phổ u v hay UV-VIS; - Detector phổ phát xạ nguyên tử (loại AES và ICP-AES); - Detector phổ hấp thụ nguyên tử (F-AAS và GF-AAS); - Detector phổ huỳnh quang phân tà (MFS);
- Detector ñiện hóa (ño dòng, cực phổ, ñộ dẫn, ñiện lượng); - Detector chiết suất;
- Detector ño ñộ dẫn nhiệt;
- Detecor mảng diot phát quang (PAD);
- Detector phổ khối lượng (khối phổ: EI-MMS và ICP-MS);
Tất nhiên phải tùy theo mỗi loại chất phân tích mà chọn loại detector nào cho phù hợp ñể ñạt ñược ñộ nhạy cao khi phát hiện ñược các chất, cũng như ño ñịnh lượng chúng tốt nhất. Trong các loại trên, detector phổ hấp phụ quang phân tử vùng phổ ƯV hay UV-VIS hiện ñang ñược dùng phố biến nhất, vì nó thích hợp cho nhiều loại chất và không quá ñắt. Song ñộ nhạy (LOD) chỉ ñạt mức 0,05 ppm. Sau ñó là detector PAD, MFS (có LOD cỡ 0,015 ppm), detector ICP-MS (có LOD cỡ 0,005 ppb) và EI-MMS với LOD 0,5 ppb.
5. Trang bị ghi và hiển thị kết quả
Trang bị chỉ thị (hiển thị) kết quả tách sắc ký có nhiều loại, nhưng ñơn giản và phổ biến nhất là các máy tự ghi (recorder) ñể ghi tín hiệu ño dưới dạng pic sắc ký của các chất, rồi ñến bộ tích phân kế (Intergrator), sau ñó là máy tính kèm theo bộ chương trình (software) ñể xử lý kết quả và máy in ñể in các kêt quả tách.
Trên ñây là 5 bộ phận chính cần thiết tối thiểu phải có của một hệ thống máy HPLC. Hình 1.2 là sơ ñồ khối về hệ thống này. Tất nhiên, những hệ thống máy HPLC hoàn chỉnh, hiện ñại ngày nay còn có thêm 4 bộ phận nữa, ñó là:
6. Bộ chương trình gradient dung môi (pha ñộng);
7. Bộ bơm mẫu tự ñộng và pha loãng mẫu;
8. Bộ gia nhiệt và ổn nhiệt ñộ cho cột tách sắc ký;
9. Máy tính và các chương trình (phần mềm) ñiều khiển, kiểm soát toàn bộ hệ thống HPLC và xử lý kết quả tách, lập báo cáo và in các kết quả tách sắc ký hỗn hợp chất.
Một cách tổng quát, chúng ta có thể mô phỏng cấu hình nguyên tắc của chúng theo hình 1.2.
a)
b)
Hình 1.2. S ñ! kh"i các ki#u h$ th"ng HPLC.
(a) - Hệ cơ bản; (b) - Hệ ñầy ñủ.
Sơ ñồ khối hệ thống HPLC ñơn giản có bộ phận gradient dung môi (Grad.). Các bộ phận như hình trên. I Bơm X— >— I Van 4— ►—Ị- Cột Ị ■
>Ị
Det ị,7
7—1 = —ỉ T
I Grad. I --- *— 1 ---* ---L--- --- i Bơm Ị Microcomputer --- * và xử lý sô liệuvà xử lý số liệuT
_Ị
IntỊ
PrintỊ
DigitỊ
Recj
Trong kỹ thuật tách HPLC, người ta cũng chia thành ba mức ñộ của quá trình tách sắc ký, tùy thuộc vào mục ñích và yêu cầu của người làm HPLC. Ba mức ñộ ñó là:
+ Mức ñộ tách phân tích (Analytical Level). + Mức ñộ tách bán ñiều chế (Semi-Preparative). + Mức ñộ tách ñiều chế, sản xuất (Preparative).
Bảng 1.1 là những tham số và các quy ñịnh về kích thước chiều dài, ñường kính cột tách, lượng mẫu nạp vào cột tách,... cho mỗi mức ñộ sắc ký trong kỹ thuật tách HPLC. Tất nhiên ñây cũng chỉ là những khái niệm phân chia có tính chất tương ñối.
1.1.3. Phân loại mức ñộ tách của HPLC Bảng 1.1. Phân loại mức ñộ sắc ký trong HPLC Các tham sổ Mức ñộ phân tích Mức ñộ bán ñiều chế Mức ñộ ñiều chế ðường kính cột (mm) 2 - 4 ,6 5 - 1 0 2 0 - 5 0 ðộ dài cột L (cm) 1 5 -2 5 2 5 - 5 0 5 0 -1 0 0 Cỡ hạt pha tĩnh (|nm <D) 5 -1 0 1 0 - 3 0 2 5 - 6 0 Tốc ñộ MP (mL/phút) 0 ,5 -2 ,5 5 - 1 5 tsJ © 1 o o Thể tích mẫu nạp Vs (|Li) 1 0 -5 0 5 0 0 -1 0 0 0 >5000 Lượng mẫu nạp Qi (mg.) 0,5 < 25 - 500 > 5 00 0
Số ñĩa của cột tách, Nef > 5 5 0 0 > 5 5 0 0 >5 50 0
ðộ nhạy detector Cao Trung bình Trung bình
Thời gian tách (phút) 40 < 120 < 250 <
1.1.4. Nguyên tắc của quá trình sắc ký trong cột tách
© ðe tiến hành tách sắc ký, pha tĩnh phải ñược nhồi vào cột tách theo một kỹ thuật nhất ñịnh phù hợp. Pha tĩnh là một yếu tố quan trọng quyết ñịnh bản chất của quá trình sắc ký và loại sắc ký. Nếu pha tĩnh:
+ Là chất hấp phụ thì ta có sắc ký hấp phụ pha thường hay pha ngược (hệ NP-H PLC hay RP-HPLC).
+ Là chất trao ñổi ion, ta có sắc ký ữao ñổi ion (IEx-HPLC). + Là chất lỏng thì ta có sắc ký chiết hay sắc ký phân bố (LLC). + Là chất rây phân tử, ta có sắc ký rây phân tử (GF-HPLC).
© Cùng với pha tĩnh, ñể thực hiện sắc ký, rửa giải chất phân tích ra khỏi cột tách, chúng ta phải cần một dung môi rửa giải. ðó là pha ñộng (mobile phase: MP). Như vậy, nếu ta nạp mẫu phân tích
gồm các chat A, B,
c
vào cột tách, thì khi bơm pha ñộng qua cột tách, các quá trình sắc ký của các chấtA, B và
c
sẽ xảy ra. Nghĩa là có sự tách của các chất A, B,c
khỏi nhau sau khi ñi qua cột tách. Quyết ñịnh hiệu quả của sự tách sắc ký ở ñây là tổng của các mối tương tác:DIỄN ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN
1. Giữa chất phân tích Xj và pha tĩnh SP, với lực F 1;
2. Giữa chất phân tích Xi và pha ñộng MP, với lực F2;
3. Giữa pha tĩnh SP và pha ñộng MP, với lực F3.
Tổng của ba lực tương tác (hình 1.3) trong ba tương tác này sẽ là yếu tố quyết ñịnh chất nào ñược rửa giải ra khỏi cột tách sắc ký trước tiên, nếu lực tương tác lưu giữ Ftot của nó là nhỏ nhất. Còn chất nào có lực tương tác lưu giữ lớn nhất thì nó sẽ ñược rửa giải ra khỏi cột tách sau cùng. Ta có thể minh
họa quá trình tách này của mẫu có hai chất A và B , theo sơ ñồ như trong hình 1.4.
MP MP MP MP MP MP
Nạp mẫu JÍ
--- ---4--- ;--- 4--- — -Hr--- í----
*-0 t! t2 t3 t4 (ph)
Thời gian lưu, ti (phút) •+ Hình 1.4. S ñ! minh h(a quá trình tách.
A và B là hai chất phận tích. MP là pha ñộng ñể rửa giải chất phân tích. Ví dụ trong hình 1.5.
Theo sơ ñồ trên hình 1.3 thì lực tương tác lưu giữ của mỗi chất phân tích sẽ là:
Chất A: Fa = Fa(1) + Fa (2) + Fa(3)
Chất B: F b = Fa(1) + Fb (2) + Fb (3)
Chất C: Fc = Fa(1) + Fc (2) + Fc(3)
Ở ñây, ñối với mỗi chất, sự lưu giữ ñược xác ñịnh bởi ba lực thành phần là: F(l), F(2) và F(3). Trong ñó F (l) và F(2) là quyết ñịnh, còn F(3) là yếu tố ảnh hưởng. Trong ñó, Lực F (l) giữ chất phân tích Xi ở lại trên cột tách, tức là trên pha tĩnh (SP). Khi ñó lực thành phần F(2) lại kéo chất phân tích Xi ra khỏi pha tĩnh. Như vậy, với mỗi chất khác nhau thì thành phần F(l) và F(2) là khác nhau. Còn thành phần F(3) trong một hệ sắc ký mà chúng ta giữ thành phần pha ñộng và các ñiều kiện khác là không ñổi, thì F(3) của các chất là hầu như không khác nhau. Vì thế F(l) và F(2) là hai yếu tố quyết ñịnh sự lưu giữ của chất tail trong một hệ pha. Như thế cỏ nghĩa là pha tĩnh và pha ñộng là hai yếu tố chính quyết ñịnh chỉnh hiệu suất của quá trình sắc ký trong kỹ thuật HPLC.
Hình 1.5. Ví d/ tách HPLC ca 5 ch0t:
Butylbenzen (1); Hexylbenzen(2); Pentylbenzen (3); Octylbenzen (4) và Nonylbenzen (5).
Sơ ñồ trong hình 1.4 là một ví dụ ñơn giản ñể minh họa sự tách của hai chất A và B. Theo thời gian, kể từ lúc bắt ñầu nạp hỗn họp mẫu (AB) vào cột tách sắc ký cho ñến lúc hai chất A và B ñược rửa giải ra khỏi cột tách.
Hay như ví dụ cụ thể trong sắc ñồ hình 1.5, trong phần (b), chúng ta thấy hỗn hợp mẫu có 5 chất ñều ñã ñược tách hoàn toàn và ứng với mỗi chất chúng ta có một pic sắc ký riêng biệt nhất ñịnh. ðiều ñó có nghĩa là trong quá trình sắc ký, nếu các ñiều kiện tách sắc ký là tốt và phù hợp, thì mẫu có bao nhiêu chất cần phân tích, chúng ta phải có bấy nhiêu pic sắc ký tương ứng riêng biệt. Nhưng trong phần (a) thì hai chất 4 và 5 chưa ñược tách hoàn toàn khỏi nhau.
1.2. Cơ SỞ LÝ THUYẾT CỦA KỸ THUẬT HPLC 1.2.1. Khái quát quá trình tách sắc ký
Nói chung, quá trình tách trong kỹ thuật HPLC cũng là những quá trình tổ họp của nhiều quá trình vừa có tính chất hóa học, lại vừa có cả tính chất lý học. Nó là những cân bằng ñộng xảy ra và diễn biến liên tục trong cột sắc kỷ giữa pha tĩnh và pha ñộng trong những ñiều kiện nhất ñịnh. Nó là sự vận chuyển và phân bố lặp ñi lặp lại nhiều làn liên tục của các chất tan Xi (hỗn hợp mẫu phân tích) theo từng lớp qua chất nhồi cột (pha tĩnh) từ ñầu cột tách ñến cuối cột tách. Trong quá trình ñó, chất tan Xi luôn luôn ñược phân bố lại giữa hai pha, trong khi pha ñộng luôn luôn chảy qua cột tách với một tốc ñộ nhất ñịnh, hay gradient. Tất nhiên khái niệm vận chuyển chất mẫu theo từng lớp trong pha tĩnh chỉ là tương ñối trong một phạm vi nhất ñịnh nào ñó của quy luật phân bố. Vì thực tế khó có thể phân biệt ñược dứt khoát từng vùng, từng lớp ñộc lập nhau trong hẩi pha của quá trình chạy sắc ký. Song chắc chắn rằng, trong những ñiều kiện sắc ký nhất ñịnh, thì chất tan Xi luôn luôn phân bố trong hai pha theo những cân bằng ñộng học, từ lúc chất tan bắt ñầu ñược nạp vào cột tách (ở ñầu cột) cho ñến khi nó ñược rửa giải ra khỏi cột tách. Vì vậy, ở ñây, những quy luật cân bằng ñộng trong hóa học vẫn giúp chúng ta ñánh giá ñược phần nào của mỗi chất tan sẽ ñi vào pha tĩnh và phần nào ñi vào pha ñộng, cũng như sự tương tác và phân bố của chúng ra sao. ðồng thời cũng do có tính chất cân bằng ñộng mà luôn luôn có sự vận chuyển của chất tan từ pha này sang pha kia và ngược lại, không ngừng trong quá trình sắc ký. Nghĩa là ñối với một phân tò chất tan Xi, thì trong quá trình sắc ký, nó luôn luôn nhảy từ pha này sang pha kia nhiều lần từ ñầu cột ñến cuối cột sắc ký. Mặt khác, cũng vì cấu trúc và tính chất của mỗi phân tử của chất tan Xi là khác nhau, nên tốc ñộ dịch chuyển trung bình của mỗi chất tan cũng khác nhau trong quá trình di chuyển ñó. Khi ở trong pha ñộng, nó chuyển dịch theo tốc ñộ của dòng pha ñộng, còn khi ở trên pha tĩnh nó lại không chuyển dịch, mà bị pha tĩnh giữ lại. Như vậy là có một thời gian nhất ñịnh, chất tan bị giữ lại trên pha tĩnh trong cột sắc ký. Thời gian chất tan bị pha tĩnh lưu giữ ñược quyết ñịnh bởi bản chất sắc ký của pha tĩnh, cũng ’như cẩu trúc và tỉnh chất của mỗi chất tan khác nhau. ðồng thời cũng phụ thuộc vào bản chất và thành phần của pha ñộng dùng ñể rửa giải chất tan Xi ra khỏỉ cột sắc ký (pha tĩnh). Vì thế ừong quá trình sắc ký có chất tan bị lưu giữ lâu trong cột tách, có chất tan ít bị lưu giữ. ðiều ñó dẫn ñến kết quả là, có quá trình tách của các chất xảy ra trong cột sắc ký, khi chất tan ñi từ ñầu cột ñến cuối cột sắc ký. Nếu ghi lại quá trình tách sắc ký ñó của hỗn hợp chất mẫu phân tích ñi ra từ cột tách, chúng ta sẽ có một sắc ñồ gồm nhiều pic. Các pic của các chất trong hỗn hợp mẫu có thế tách nhau hoàn toàn, hoặc cũng có thể còn chập vào nhau một phần, hay còn hoàn toàn chập vào nhau (hình 1.5). sắc ñồ ñó phản ánh quá trình tách sắc ký trong cột có tốt hay không tốt. Nếu quá trình tách sắc kỷ là tốt, thì hỗn hợp mẫu có bao nhiêu chất, trong sẳc ñồ sẽ cỏ bẩy nhiêu p ỉc riêng biệt không chập nhau. Như vậy, trong quá trình sắc ký, chất nào bị lưu giữ mạnh nhất sẽ ñược rửa giải ra sau cùng, chất nào bị lưu giữ kém nhất sẽ ñược rửa giải ra trước tiên. Trong sắc ñồ ở hình 1.5, chúng ta thấy chất 1 bị lưu giữ kém nhất và chất 5 bị lưu giữ mạnh nhất. ðồng thời ở ñây hai chất 4 và 5 chưa ñược tách ra khỏi nhau hoàn toàn, hai pic của hai chất này còn ñè lên nhau một phần (phần dưới). Còn phần dưới 5 chất tách khỏi nhau hoàn toàn, ta có 5 pic riêng biệt ñặc trưng cho 5 chất tan Xi.
1.2 2. Các ñại lượng ñặc trưng của HPLC 1.2.2.1. Các ph2 ng trình l2u gi3
a) Thời gian lỉm giữ
Các chất tan Xi trong hỗn hợp mẫu phân tích, khi ñược nạp vào cột sắc ký, như chúng ta ñã biết, chúng sẽ bị lưu giữ ở trong cột tách (trên pha tĩnh) theo một thời gian nhất ñịnh, ÍRj. ðó là thời gian lưu
DIỄN ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN
của nó trong hệ cột tách ñã cho. Thời gian lưu này ñược tính tò lúc nạp mẫu vào cột tách sắc ký cho ñến lúc chất tan ñược rửa giải ra khỏi cột ở ñiểm có nồng ñộ cực ñại (hình 1.6). Như vậy nếu gọi ÍRi là thời gian lưu tổng cộng của chất tan Xi thì chúng ta luôn có:
ÍRi = ( t 0 + í'r ì ) ( 1 . 1 )
Trong ñó:
+ 10: Thời gian không lưu giữ (thời gian chất tan nằm trong pha ñộng); + t'Ri: Thời gian lưu giữ thực của chất Xi ở trong cột sắc ký (ở pha tĩnh).
Nếu t0 = 0 chúng ta sẽ có tRj = í'r ì. Trường hợp này chỉ có khi ÍRi là rất nhỏ (thường là khi ÍRi nhỏ hơn 4 phút). Còn nói chung, chúng ta luôn luôn có:
t'm = (ÍRi - t0) (1.2)
Với hai chất tan A và B kế tiếp nhau trong sắc ñồ thì chúng ta có:
a = ( t 'B/ t ' A) (1.3)
và a ñược gọi là thời gian lưu tương ñối của hai chat A và B, hay hệ số tách của hai chất ñó. ðại
lượng a này càng lớn thì sự tách của hai chất A và B càng rõ ràng. Còn khi ñại lượng này bằng 1, thì không có sự tách sắc ký của hai chất A và B, lúc này hai chất A và B nằm trong một pic sắc ký. Còn nếu a gần bằng 1, thì pic sắc ký của hai chất A và B có chung một vùng ñè lên nhau, nghĩa là chúng chập vào nhau không thể tách thành hai pic riêng biệt ñặc trưng cho hai chất ñó.
(A) (B)
Hình 1.6. S ñ! h$ th"ng HPLC (A) và s=c ñ! tách (B).
(A): Nguyên lý chung; (B): Giản ñồ sắc ký 4 chất A, B, c và D. ở ñây: - G: Manometer ño áp suất pha ñộng;
- 10: Thời gian không lưu giữ;
- tA, te, tc, tD: Thời gian lưu giữ của các chất A, B, c, D;
- Wa , Wb: Chiều rộng ñáy của pic sắc ký của chất A và B.
Thời gian lưu t'Ri của một chất tan trong cột sắc ký của quá trình sắc ký phụ thuộc vào nhiều yếu tố, ví dụ như:
+ Bản chất sắc ký của pha tĩnh, kích thước, ñộ xốp, cấu trúc xốp; + Bản chất, thành phần, pH, tốc ñộ của pha ñộng;
+ Cấu tạo và bản chất của phân tó chất tan Xi, các nhóm thế;
+ Trong một số trường hợp còn phụ thuộc cả vào pH của pha ñộng, nồng ñộ chất tạo phức, nếu các yếu tố này có ảnh hưởng ñến các cân bằng ñộng trong quá trình sắc ký. Trong sắc ký các chất ion và cặp ion thì yếu tố này thế hiện rõ nét.
Giá trị thời gian lưu t'Ri có ý nghĩa rất lớn trong thực tế của kỹ thuật sắc ký. Vì nó cho ta biết các chất tan Xi (chất phân tích) trong hỗn hợp mẫu ñược rửa giải ra như thế nào trong các ñiều kiện thí nghiệm và một hệ pha ñã chọn. ðồng thời ñó cũng là ñại lượng ñể chúng ta phát hiện (ñịnh tính) các chất trong hỗn hợp mẫu phân tích.
Mặt khác, trong một hệ pha sắc ký chúng ta còn có:
ÍRi = L / U i (1.4)
to = L / u 0 (1.5)
ÍRi = t0 ( l + k'i) (1.6)
Trong ñó Ui và u0 là tốc ñộ tuyến tính của pha ñộng (cm/s); còn ki' là hệ số dung lượng của chất tan Xì; L là chiều dài của cột sắc ký.
Ở ñây, phương trình (1.6) cho phép ta xác ñịnh ñược hệ số dung lượng kị’ của một chất tan i qua
sắc ñồ, nghĩa là biết to và ÍRi thì tính ñược kị’. Ngược lại, nếu biết ki’ thì chúng ta cũng dự ñoán ñược thời gian lưu ÍRi của chất tan Xi, vì hiện nay hằng số dung lượng ki’ của nhiều chất ñã ñược nghiên cứu và công bố trong các tài liệu tham khảo (Handbook).
b) Thế tích lưu giữ
Thể tích lưu của một chất là thể tích của pha ñộng chảy qua cột sắc ký trong khoảng thời gian kể từ lúc mẫu ñược bơm vào cột cho ñến lúc chất tan ñươc rửa giải ra ở thời ñiểm có nồng ñộ cực ñại (ñỉnh pic), nghĩa là tương ứng với thời gian lưu tRj. Nếu chất tan không bị lưu giữ trong cột tách, thì thể tích lưu của nó sẽ bằng thể tích VMp (Vo) của pha ñộng chảy qua cột. Như vậy, nếu gọi F (mL/ph) là tốc ñộ của pha ñộng ñược bơm qua cột sắc ký, thì chúng ta có:
+ Chất không lưu giữ: VRo = Vmp = tRo-F (1.7)
+ Chất có lưu giữ: Vr ì = Vmp = F.tRi (1.8)
Hay: Vr ì = VRo (1 + ki') (1.9)
Như vậy, từ phương trình (1.7) ta tính ñược Vro, rồi từ phương trình (1.8) ta lại tính ñược Vrì
theo F và thời gian lưu ÍRi thu ñược trên sắc ñồ sắc ký (Vmp thể tích pha ñộng trong cột tách).
Mặt khác, chúng ta cũng còn có thể tích cột Vo:
v „ = ( V s p + V m p) ( 1 . 1 0 )
Trong ñó Vo là thể tích trống toàn phần của cột sắc ký, VSp là thể tích thực của pha tĩnh trong cột.
Vsp = (Vo - F.tRo) (1.11)
Như vậy, nhờ công thức (1.11) này chúng ta có thế tính ñược thể tích thực Vsp của pha tĩnh ở trong cột sắc ký.
1.2.2.2. H$ s" phân b" Ki và h$ s" dung l2@ng, kA’
Hệ số phân bố Kị
Quá tìn h tách sắc ký của các chất tan Xj là dựa trên cơ sở sự phân bố của chất tan giữa pha ñộng (MP) và pha tĩnh (SP) xảy ra liên tục trong cột tách sắc ký. Sự phân bố này ñược ñặc trưng bởi một ñại lượng gọi là hệ số phân bố Ki của chất Xj. Hệ số này ñược ñịnh nghĩa là tỷ số nồng ñộ của chất tan Xi ở trong pha tĩnh và pha ñộng và ñược tính theo công thức:
Ki = C i(SP)/C i(MP) (1.12)
Trong ñó Ci(sp) và Ci(MP) là nồng ñộ của chất tan Xi trong pha tĩnh và trong pha ñộng.
Hệ số phân bố Ki này cho ta biết khả năng phân bố của chất tan Xi như thế nào trong mỗi pha (pha ñộng và pha tĩnh).
Hệ số dung lượng, ki’
Hệ số phân bố Ki chưa nói lên ñược sức chứa (dung lượng) của cột tách sắc ký. Vì thế người ta phải ñưa thêm vào hệ số dung lượng kị’. Hệ số dung lượng (Capacity coefficient) sẽ chỉ cho ta biết tỷ số khối lượng của chất tan Xi phân bố vào trong mỗi pha là bao nhiêu; nghĩa là chúng ta có:
k i' = H1(SP)/ 1I1(MP) ( 1 . 1 3 )
Neu gọi tỷ số v s/ v m = q, là tỷ số pha của hệ sắc ký HPLC, thì chúng ta sẽ có mối quan hệ sau:
ki' = K i.q (1 .14 )
Vì ĨĨ1(SP) = Cs.Vs, ni(MP) = c m.v m, và trong một hệ pha thì q = const, nên có thể coi hệ số dung lượng ki’ như là hàm số của hệ số phân bố Ki có dạng hàm y = ax.
ðó là mối quan hệ giữa hệ số dung lượng ki' và hệ số phân bố Kj. ðồng thời ñiều này cũng nói lên rằng, hệ số phân bố Ki là hệ số góc của phương trình (1.14), nó nêu lên mối liên hệ của ki' với tỷ số pha q.
Mặt khác, từ các ñại lượng VSp, Vmp ñã biết ở trên, chúng ta lại có:
ki' = (ÍRi - tRo)/tRo (1-15)
và q .K i = (ÍRi - tRo) / t Ro (1 .1 6)
ðến ñây, nhờ sắc ñồ sắc ký và tỷ số pha q, chúng ta lại có thể dự tính ñược hệ số phân bố Ki của chất tan Xi trong mỗi pha của ñiều kiện sắc ký ñã chọn.
Neu trong hỗn hợp mẫu có hai chất A và B thì tương tự như ừong khái niệm lưu giữ, chúng ta cũng có hệ số tách a của hai chất A và B:
a = k'fi / k A = (tB - t0)/(tA - t0) (1.17)
Như vậy, từ tỷ số của hệ số dung lượng (a) của hai chất cũng cho ta biết khả năng tách của hai
chất kề nhau trong một hệ pha sắc ký ñã chọn là thế nào. Ở ñây khi a khác 1 càng nhiều thì sự tách của
hai chất càng rõ ràng.
1.2.2.3. T"c ñE pha ñEng
a) Tốc ñộ thế tích, F(mL/phút)
Tốc ñộ thể tích F ñược ñịnh nghĩa là số mL dung dịch pha ñộng chảy qua cột tách trong một ñơn vị thời gian, tức là số mL/phút của MP. Tốc ñộ thể tích F (mL/phút) của pha ñộng luôn có liên quan ñến tiết diện của cột tách. Mặt khác tốc ñộ F này không cho ta biết ñược sự di chuyển của một ñĩa (lóp) chất Xi trong cột tách. Vì thế người ta ít dùng khái niệm này khi xem xét sự di chuyển của một ñĩa (lớp) chất tàn trong cột tách sắc ký, mà thường dùng tốc ñộ tuyến tính u (cm/s).
b) Tốc ñộ tuyến tính của pha ñộng, u (mm/s)
Trong kỹ thuật tách HPLC, khái niệm tốc ñộ này cho ta biết trong một ñơn vị thời gian (1 giây hay 1 phút), thì pha ñộng, hay một ñĩa sắc ký của chất tan Xj trong cột tách dịch chuyển ñược bao nhiêu cm. Tốc ñộ này không phụ thuộc vào tiết diện của cột tách và cũng không phụ thuộc vào ñộ giảm áp trong cột tách theo chiều dài từ ñầu cột ñến cuối cột. Tốc ñộ u trung bình này ñược tính theo công thức:
Utb = L/ t ò (1.18)
hay ta có:
Utb = F /(r2.ET.7c) (1 .1 9)
Trong ñó L là chiều dài (cm), r là bán kính của cột sắc ký (mm). ET là hệ số về ñộ xốp của pha tĩnh. Trong thực tế của các loại pha tĩnh (chất nhồi cột) hiện nay ñược các hãng sản xuất cung cấp, nó
chỉ thuộc một trong hai nhóm giá trị sau ñây: Et bằng 0,41 hoặc bằng 0,82.
Hình 1.7. S cân ñ"i ca pic HPLC.
( G i á t r Ị A Sy s = b/a).
Như vậy, từ hai công thức trên, chúng ta có thế tính ñược giá trị của tốc ñộ tuyến tính Utb trong
ñiều kiện sắc ký ñã chọn, hay giá trị Et v ì:
E t = F /(u tb.r2.rc) (1.20a)
Et = (F.to)/(L.r2. = F .( W .) (1.20b)
