Multiresistência em infecções provocadas por leveduras do género Candida: o papel de proteínas que catalizam o efluxo de fármacos

Multiresistência em infecções provocadas por leveduras do

género Candida: o papel de proteínas que catalizam o efluxo de

fármacos

Catarina Costa e Miguel C. Teixeira

iBB – Instituto de Bioengenharia e Biociências e Departamento de Bioengenharia, Instituto Superior Técnico, Universidade de Lisboa, Lisboa, Portugal

*correspondência: mnpct@ist.utl.pt

A prevalência de infecções provocadas por agentes patogénicos secundários tem

aumentado consideravelmente nos últimos anos, facto este que está directamente

relacionado com o aumento do número de indivíduos imunocomprometidos. Em particular,

as infecções provocadas por leveduras do género Candida (Candida spp.), nestes

indivíduos, podem resultar num problema clínico grave, cuja persistência e recorrência

está normalmente associada à aquisição de resistência a múltiplos fármacos.

Principais espécies patogénicas do género Candida

Algumas leveduras do género Candida são agentes patogénicos secundários (também denominados por oportunistas), ou seja, são organismos que podem viver de forma completamente inócua como colonizadores habituais do corpo humano saudável, mas que, num hospedeiro com o sistema imunitário debilitado, são capazes de causar doença. Estas leveduras colonizam cerca de 30% dos indivíduos saudáveis, em particular nas suas superfícies mucosas. No entanto, em indivíduos imunocomprometidos, estes microrganismos têm a capacidade de causar infecções superficiais (pele, epitélio, etc.) ou disseminadas (penetração invasiva de órgãos vitais) que, em último caso, podem resultar na morte. Por exemplo, nos Estados Unidos da América, 11,5% das 80000 infecções sanguíneas detectadas por ano são provocadas por espécies do género

Candida (Candida spp.) e a sua taxa de

mortalidade ultrapassa os 30% (Schulze e Sonnenborn, 2009).

As espécies de Candida patogénicas mais relevantes sob o ponto de vista clínico são, por ordem de importância, Candida albicans,

Candida parapsilosis, Candida glabrata, Candida tropicalis e Candida krusei (Hobson,

2003). Actualmente, as infecções provocadas

por C. albicans continuam a ser as mais frequentes, mas a sua incidência tem diminuído para dar lugar a um aumento de infecções provocadas por C. glabrata e C.

krusei. Pensa-se que este facto possa estar

relacionado com uma menor susceptibilidade destas espécies aos fármacos usados em contexto clínico (Lin et al., 2005).

Epidemiologia

As espécies patogénicas de Candida são comummente isoladas da cavidade oral e da região vulvovaginal e do tracto urinário, e se, inicialmente, a espécie isolada mais frequentemente era Candida albicans, correspondendo a 70-80% dos isolados clínicos, nas últimas décadas outras espécies de Candida têm sido isoladas com cada vez maior frequência, tornando-se agentes patogénicos oportunistas de crescente relevância clínica. Actualmente, as infecções provocadas por C. albicans continuam a ser as mais frequentes, mas a sua incidência tem diminuído para dar lugar a um aumento de infecções provocadas por C. glabrata, C.

tropicalis e C. parapsilosis.

Num estudo epidemiológico levado a cabo por Pfaller and Diekema (2007), observou-se que as infecções provocadas por estas quatro espécies de Candida eram responsáveis por cerca de 95% de todas as infecções associadas a este agente patogénico.

A incidência das infecções provocadas pelas diversas espécies de Candida varia consoante a região geográfica e o local afectado. A incidência das infecções provocadas por C. glabrata é maior em adultos do que em crianças e ainda menor em recém-nascidos (Krcmery e Barnes, 2002).

Fig

.

.

Por outro lado, a incidência de infecções provocadas por C. parapsilosis é muito maior em recém-nascidos, bem como em pacientes

transplantados ou pacientes que estão a receber alimentação parenteral (Trofa et al., 2008). As infecções provocadas por C.

glabrata, de todas as espécies de Candida

não-albicans, são as que têm maior taxa de mortalidade associada e são as segundas mais frequentes na América do Norte (Messer et al., 2006). É interessante referir que C. albicans e C. glabrata têm sido isoladas conjuntamente em cerca de 70% dos doentes que sofrem de candidíase oral, o que sugere que as duas espécies possam ter um efeito sinérgico nas infecções deste nicho (Redding et al., 2002).

Já C. tropicalis é frequentemente isolada de

pacientes com neutropenia (número

anormalmente baixo de neutrófilos no sangue) ou com doenças malignas (Colombo

et al., 2007). Os pacientes necessitam,

normalmente, de períodos de hospitalização mais prolongados do que aqueles requeridos para pacientes infectados por C. albicans. Tal pode dever-se a um maior nível de virulência e de resistência aos antifúngicos utilizados na prática clínica. Num estudo efectuado em 12 hospitais brasileiros, C. tropicalis foi a segunda espécie mais isolada, com uma frequência de 33-48% (Colombo et al., 2007; Miranda et al., 2009).

Por outro lado, C. parapsilosis é, em muitos casos, a segunda espécie de Candida mais isolada em culturas sanguíneas, logo após C.

albicans (Costa-de-Oliveira et al., 2008),

nomeadamente na Europa e na América Latina (Silva et al., 2011).

Resistência à terapia antifúngica

As infecções provocadas por Candida spp. são, muitas vezes, recorrentes e difíceis de tratar. As elevadas taxas de mortalidade associadas muitas vezes a estes agentes patogénicos estão muitas vezes relacionadas com o diagnóstico tardio tardio da doença e com a aquisição de resistência por parte destes agentes patogénicos a múltiplos fármacos.

Dentre as famílias de fármacos antifúngicos utilizados comummente na prática clínica encontram-se, como terapia de primeira linha e, muitas vezes, também como profilaxia, os azóis (ex.: imidazóis – clotrimazole, cetoconazole –, e os triazóis – fluconazole,

posaconazole), e as equinocandinas (ex.: caspofungina, a micafungina e a anidulafungina). Em terapia combinada, e quase sempre como segundo recurso, estão disponíveis ainda os polienos (ex.: anfotericina B) e as fluoropirimidinas (ex.: flucitosina). Os azóis actuam ao nível da membrana plasmática, inibindo a síntese do ergosterol, especificamente a 14α-demetilase, levando à diminuição do ergosterol na membrana plasmática e à acumulação de precursores tóxicos. Os polienos, actuam igualmente ao nível da membrana plasmática, mas pela interação directa com o ergosterol, levando à formação de poros na membrana. As equinocandinas actuam inibindo a síntese dos β-glucanos presentes na parede celular e os polienos actuam pela inibição da síntese de ácidos nucleicos (ARN e ADN) e de proteínas. O desenvolvimento destas quatro famílias de fármacos foi feito ao longo das últimas décadas, no ímpeto de dar uma resposta eficaz ao aumento dos isolados clínicos do género Candida resistentes aos antifúngicos. No entanto, o desenvolvimento de resistência tem acontecido de forma muito mais rápida, quando comparado com o desenvolvimento e implementação da utilização de novos fármacos, sendo, por isso, fundamental entender os mecanismos por detrás deste fenómeno.

Há essencialmente quatro formas pelas quais um microrganismo pode adquirir resistência a um fármaco, sendo elas i) a sua inactivação; ii) a alteração do seu alvo; iii) a diminuição da sua importação para dentro da célula e iv) o seu transporte activo para fora do microrganismo (Anderson, 2005; Ernst et al., 2010).

Multiresistência: o papel de transportadores de múltiplos fármacos

A aquisição de resistência a fármacos torna-se mais séria, e de difícil tratamento, quando se desenvolve não apenas em relação ao fármaco que está a ser administrado, mas também a outros fármacos não relacionados.

Este fenómeno de multirresistência

observado em Candida spp. envolve proteínas que podem funcionar como bombas de efluxo de fármacos e que

pertencem a duas superfamílias, a

ATP-binding cassette superfamily (ABC) – cujos

transportadores são energizados pela hidrólise de ATP – e a Major Facilitator

Superfamily (MFS) – cujos transportadores

são energizados pelo gradiente de protões que existe na membrana celular.

A acção destes transportadores está fortemente ligada à aquisição de resistência a azóis em todas as espécies patogénicas de

Candida, incluindo C. glabrata e C. krusei,

que apresentam uma diminuição intrínseca da susceptibilidade a estes antifúngicos quando comparados com C. albicans.

Transportadores de fármacos da superfamília ABC

Os transportadores da superfamília ABC são os mais bem estudados no contexto da resistência a múltiplos fármacos, em particular os transportadores Cdr1 e Cdr2 de

C. albicans. Estes transportadores têm

homólogos noutras espécies de Candida, como C. dubliniensis (Wirsching et al., 2001),

C. glabrata (Vermitsky e Edlind, 2004), C. krusei (Katiyar e Edlind, 2001) e C. tropicalis

(Barchiesi et al., 2000), e a sua presença esta associada, em particular, com um aumento da resistência aos antifúngicos da classe dos azóis (Sanglard et al., 1997; Barchiesi et al., 2000; Wirsching et al., 2001; Vermitsky e Edlind, 2004; Lamping et al., 2009; Ricardo et al., 2014), contribuindo assim para uma maior dificuldade no tratamento de infecções provocadas por estes fungos patogénicos. Também o transportador Snq2 de C. glabrata foi descrito como estando associado à aquisição de resistência a azóis, pois a sua eliminação em estirpes resistentes leva a um aumento da susceptibilidade relativamente a esta classe de antifúngicos (Torelli et al., 2008).

Apesar de serem mais bem estudados que os transportadores MFS, os mecanismos envolvidos na regulação dos transportadores ABC só foram estudados com profundidade em C. albicans. Neste organismo, a expressão de ambos os transportadores é regulada pelo factor de transcrição Tac1 (Coste et al., 2006), enquanto no caso de C.

glabrata, os diferentes transportadores ABC

conhecidos (Cdr1, Pdh1/Cdr2 e Snq2) têm a sua expressão controlada pelo factor de transcrição Pdr1, o principal regulador

transcricional responsável pela resistência a múltiplos fármacos em C. glabrata (Vermitsky e Edlind, 2004). Mutações num único nucleótido nos genes que codificam estes factores de transcrição têm-se mostrado suficientes para lhes atribuir ganho de função, com consequente activação dos transportadores de múltiplos fármacos e aquisição de resistência aos mesmos em isolados clínicos (Coste et al., 2006).

Transportadores de fármacos da superfamília MFS

Em comparação com os transportadores da superfamília ABC, muito menos é conhecido relativamente aos transportadores MFS que participam no efluxo de fármacos. Estes

pertencem a duas famílias, cujos

transportadores diferem entre si no número de domínios transmembranares, sendo que os da DHA1 (drug:H+ _{antiporter family 1) têm} 12 e os da DHA2 (drug:H+ _{antiporter family 2)} têm 14.

O primeiro transportador de múltiplos fármacos da superfamília MFS a ser identificado em fungos patogénicos foi o Mdr1 de C. albicans. Este transportador, que tem homólogos em várias outras espécies de

Candida, é regulado pelo factor de

transcrição Mrr1 e está envolvido

especificamente na resistência a fluconazole, promovendo a redução da sua acumulação dentro da célula (Sanglard et al., 1996).

Existem também homólogos deste

transportador em C. dubliniensis (Wirsching

et al., 2001) e em C. tropicalis (Torelli et al., 2008) e verificou-se que ambos estavam

sobre-expressos em isolados resistentes ao fluconazole (Wirsching et al., 2001; Torelli et

al., 2008).

Em C. glabrata foram estudados outros transportadores desta família, como o Aqr1, o Qdr2 e o Tpo3, que se verificou estarem envolvidos na resistência a múltiplos fármacos, como a flucitosina e o clotrimazole no caso do Aqr1 (Costa et al., 2013a), várias imidazóis no caso do Qdr2 (Costa et al., 2013b) e a imidazóis e triazóis no caso do Tpo3 (Costa et al., 2014a). Verificou-se ainda que a expressão do transportador Qdr2 na presença de clotrimazole era regulada pelo factor de transcrição Pdr1, o principal regulador transcricional na aquisição de resistência a múltiplos fármacos em C.

glabrata (Costa et al., 2013b). Para além da

aquisição de resistência a fármacos, os transportadores Aqr1 e Tpo3 conferem ainda resistência ao ácido acético (Costa et al., 2013a) – presente frequentemente na mucosa vaginal – e à poliamina espermina (Costa et al., 2014a) – encontrada frequentemente no tracto urogenital –, respectivamente.

O facto destes transportadores conferirem resistência a compostos encontrados em ambientes propícios a infecções causadas por C. glabrata demonstra uma grande adaptação deste patogénio ao hospedeiro, podendo constituir um factor importante para a persistência nestes nichos.

É ainda importante referir que os transportadores MFS poderão ter um papel bastante importante no metabolismo e virulência dos fungos Candida. Numa compilação recente e exaustiva do número de transportadores desta família existentes em oito espécies de fungos patogénicos com relevância clínica (Candida albicans, C.

glabrata, C. guilliermondii, C. parapsilosis, C. lusitaniae, C. tropicalis, Cryptococcus neoformans e Aspergillus fumigatus) mostrou-se que os seus genomas codificam cerca de 300 presumíveis transportadores DHA e que apenas 14 deles foram caracterizados até ao momento. Este valor corresponde apenas a cerca de 5% do valor total de transportadores previstos (Costa et

al., 2014b), realçando a importância de os

estudar para obter uma compreensão global dos mecanismos por detrás da aquisição de resistência a múltiplas drogas nestes fungos patogénicos.

Como vencer a multiresistência?

Os actuais tratamentos antifúngicos estão bastante limitados na sua capacidade para tratar infecções provocadas por espécies do género Candida e outros fungos patogénicos. Neste sentido, o desenvolvimento de novos antifúngicos é imperativo. Investigadores, um pouco por todo o mundo, têm testado novos compostos, muitos de origem natural, ou testado vários medicamentos já existentes no mercado, em relação à sua capacidade antifúngica. No entanto, estes avanços no conhecimento têm sido lentos.

Fig. 2. Transportadores ABC (verdes) e MFS (azuis) envolvidos na resistência a fármacos,

presentes em C. albicans, C. glabrata, C. tropicalis e C. krusei. A laranja estão representados os factores de transcrição envolvidos na regulação da sua expressão

.

Dado que a resistência que tem sido verificada em relação ao fluconazole derivou de um uso excessivo deste antifúngico como

agente profiláctico, será necessário

desenvolver novas formas de profilaxia que não resultem num contacto directo entre o fungo patogénico e o agente terapêutico que é usado posteriormente para o tratamento das infecções causadas por ele. Esta poderá ser uma lição valiosa para uma utilização mais cuidadosa dos fármacos com propriedades antifúngicas que forem desenvolvidos no futuro.

É, também, essencial que se compreendam os mecanismos que levam estes organismos a adquirir resistência, para assim ser possível encontrar novos alvos para fármacos. Estudos ao nível do genoma, como, por exemplo, análise transcritómica e análise de expressão proteómica, podem ajudar neste sentido, uma vez que proporcionam uma visão global do problema que é a aquisição

de resistência, e que se sabe ser um fenómeno de natureza multifactorial. Tendo em conta que a actuação de transportadores de resistência a múltiplos fármacos é igualmente um problema complexo e difícil de contornar, a descoberta e desenvolvimento de compostos que permitam o bloqueio da sua acção poderá ser uma forma de ultrapassar este problema, uma vez que os transportadores MFS não têm homólogos em humanos.

Da mesma forma, será necessário desenvolver novos métodos de diagnóstico, que sejam mais eficientes, rápidos e que permitam saber de forma inequívoca qual a estirpe (ou estirpes) que está a provocar a infecção, assim como a que compostos esta(s) estirpe(s) é resistente ou mais propensa a desenvolver resistência. Uma compreensão abrangente do historial do paciente e da estirpe específica que provoca a infecção, será determinante para a escolha

da opção terapêutica mais eficaz em cada caso.

Agradecimentos

Agradecimentos são prestados à Professora Isabel Sá Correia, responsável pelo grupo BSRG do iBB-IST, pelo seu papel pioneiro na análise funcional de transportadores de múltiplos fármacos na levedura modelo

Saccharomyces cerevisiae, bem como à

Fundação para a Ciência e Tecnologia pelo financiamento do trabalho de investigação realizado pelos autores deste artigo, conducente à obtenção de parte dos resultados aqui descritos, através da bolsa SFRH/BD/69809/2010 e do projecto PTDC/EBB-BIO/119356/2010.

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