• Nenhum resultado encontrado

TESTES BOOTSTRAP PARA A FRAÇÃO DE NÃO DISJUNÇÃO MEIÓTICA

N/A
N/A
Protected

Academic year: 2021

Share "TESTES BOOTSTRAP PARA A FRAÇÃO DE NÃO DISJUNÇÃO MEIÓTICA"

Copied!
9
0
0

Texto

(1)

TESTES BOOTSTRAP PARA A FRAÇÃO DE NÃO DISJUNÇÃO

MEIÓTICA

Gustavo Henrique Mitraud Assis Rocha Departamento de Estatística, ICEx, UFMG Av. Antônio Carlos, 6627, Campus Pampulha

ghmar@est.grad.ufmg.br Rosangela Helena Loschi

Departamento de Estatística, ICEx, UFMG Av. Antônio Carlos, 6627, Campus Pampulha

loschi@est.ufmg.br

RESUMO

Aneuploidias, tais como a trissomia do cromossomo 21 (Síndrome de Down), ocorrem como erros esporádicos na segregação do cromossomo durante o processo meiótico. As não disjunções cromossômicas podem ocorrer na primeira (meiose I) ou segunda divisão do processo meiótico. A determinação da fração de não disjunção na meiose I é útil para identificar possíveis fatores (geografia, nutrição, idade, etc.) que geram tais anomalias. Nesse trabalho nós introduzimos alguns procedimentos bootstrap para testar hipóteses precisas sobre a fração de não disjunção na meiose I, estendendo trabalhos anteriores. Os testes são executados considerando os valores, que são obtidos assumindo a hipótese nula verdadeira. Assim, para calcular os p-valores, duas transformações nos dados originais são consideradas. Os testes são comparados através de simulação Monte Carlo. Eles apresentam um bom desempenho.

PALAVRAS CHAVE. Simulação Monte Carlo. Distribuição multinomial. P-valor. Estatística

ABSTRACT

Aneuploidies, such as the trisomy of chromosomal 21 (Down Syndrome), occurs as sporadic error in the chromosomal segregation during the meiotic process. The chromosomal non-disjunction can occur in the first (meiosis I) or second division in the meiotic process. The determination of the rate of non disjunction in meiosis I is useful to identify possible factor (geography, nutrition, age, etc) which generate such anomaly. In this paper we introduce some bootstrap procedures for testing precise hypothesis on the fraction of non-disjunction in Meiosis I, extending previous works. The tests are performed considering the p-value, which are obtained assuming as true the null hypothesis. Thus, in order to calculate the p-value, two transformations in the original data are considered. The test procedures are compared through Monte Carlo simulation. They present a good performance.

KEYWORDS. Monte Carlo simulation. Multinomial distribution. P-value. Applied Statistics.

(2)

1. Introdução

Anomalias cromossômicas podem ser estruturais ou numéricas. Em humanos, as anomalias cromossômicas numéricas, chamadas aneuploidias, são causas comuns de retardamento mental, aborto e doenças fetais. Uma das aneuploidias mais conhecidas é a trissomia do cromossomo 21, que produz um fenótipo conhecido como síndrome de Down. Aneuploidias, em geral, surgem de um erro esporádico na segregação do cromossomo durante o processo meiótico, chamado não disjunção. As não disjunções podem acontecer na primeira (meiose I) ou segunda (meiose II) divisão do processo meiótico. Apesar de sua importância, pouco se sabe sobre as causas genéticas e ambientais das aneuploidias. De acordo com Parra (1999), a determinação da fração de não disjunção na separação do cromossomo que acontece na meiose I (ou, similarmente, na meiose II) é útil para identificar possíveis fatores (como, por exemplo, geografia, nutrição, idade, práticas reprodutivas, etc.) que geram tais anomalias cromossômicas numéricas. Por exemplo, na trissomia do cromossomo 21, há evidência que a taxa de não disjunção aumenta com a idade da mãe (veja Pena, 1998). Além disso, o aumento na taxa de não disjunção na meiose II é mais alto se a idade da mãe está entre 35 e 39 anos. Para cromossomos sexuais, porém, a alta idade da mãe influencia apenas a fração de não disjunção na meiose I. Veja Franco et al. (2003) para detalhes.

A divisão celular meiótica consiste na replicação do DNA seguida por duas divisões celulares gerando células haplóides. Na meiose I, aneuploidias são devidas à não disjunção de cromossomos homólogos que permanecem unidos e migram para a mesma célula. Nesses casos, quando a célula anormal cruza com um gameta normal, pode-se observar um, dois ou três alelos diferentes, dependendo das características genéticas dos pais. Na meiose II, aneuploidias são conseqüências da não disjunção de cromátides irmãs que permanecem unidas e migram para a mesma célula. Neste caso, os dois alelos serão iguais e, após o processo de fertilização, recebe-se do pai um alelo igual a estes ou não sendo, portanto, impossível ter três picos. Para facilitar a compreensão da não disjunção no processo meiótico, Franco et al. (2003) apresentam o esquema representado pela Figura 1, onde A e B denotam os alelos de um microssatélite particular presentes no pai 1 e C é o alelo do pai 2 que se juntará aos alelos do pai 1 no processo de fertilização.

(3)

O diagnóstico da síndrome é feito empregando a técnica PCR (Polymerase Chain Reaction – Reação em cadeia da Polimerase). É possível classificar os microssatélites localizados próximos ao centrômero cromossômico com a PCR seguida de uma análise quantitativa por densitometria laser (Pena, 1998). Um microssatélite será informativo sempre que apresentar mais que um pico. Pacientes trissômicos exibirão, num loco de microssatélite informativo, três picos de mesma intensidade, dois picos com uma dosagem relativa 2:1 ou apenas um pico. Para um padrão de três picos ocorrer é necessário que a não disjunção aconteça na primeira divisão meiótica, a mãe seja heterozigota no loco relevante e o alelo carregado pelo esperma seja diferente dos dois alelos maternais (isto é, A, B e C na Figura 1 são todos alelos diferentes). O padrão de dois picos é observado na primeira ou na segunda divisão meiótica, dependendo da combinação dos cromossomos transmitidos pelos pais. O padrão de um pico ocorre se os pais são homozigotos para o alelo herdado. Veja detalhes em Hassold e Jacobs (1984).

Muitos métodos propostos para estimar  (dado que uma não disjunção ocorreu,  denota a probabilidade condicional que a não disjunção ocorra na primeira divisão da meiose) em trissomias levam em conta estudos comparativos de polimorfismos de DNA de crianças afetadas e seus pais (Hassold e Hunt, 2001). Mais recentemente algumas estimativas de  foram obtidas considerando somente as informações extraídas do DNA de crianças afetadas através da PCR (veja Franco et al. (2003), Nicolaidis e Petersen (1998), Savage et al. (1998), Yoon et al. (1996), Koehler et al. (1996), Griffin (1996), Petersen et al. (1992), Zaragosa et al. (1994) e muitos outros). Para trissomias, Franco et al. (2003) propuseram um modelo para o número de picos em um loco polimórfico que depende da fração  da não disjunção na meiose I. Esse modelo não leva em conta a informação dos pais. O modelo proposto por Franco et al.(2003) é muito útil pois a necessidade de usar a informação dos pais pode tornar a pesquisa mais difícil e impossibilita o uso de material arquivado, o que pode ser um problema em aneuploidias raras. Assumindo que a freqüência relativa de cada alelo na população é conhecida e que a hipótese do equilíbrio de Hardy-Weinberg (Hartl e Clark, 1997) é verificada para a população, Franco et al. (2003) estabelecem que o número de indivíduos com um, dois ou três picos, dado , pode ser modelado por uma distribuição multinomial. Franco et al. (2003) apresentam o estimador de máxima verossimilhança (EMV) e os intervalos bootstrap para . Loschi e Franco (2006) estenderam tal análise incluindo informações a priori no problema. Essas autoras compararam os estimadores de Bayes e o EMV através de estudos Monte Carlo, concluindo, como esperado, que as modas a posteriori e as estimativas do EMV são similares se a distribuição a priori uniforme é assumida para descrever a incerteza inicial sobre . Loschi e Franco (2006) também concluíram que os estimadores de Bayes provêm melhores estimativas que o EMV se distribuições a priori informativas justas para  são consideradas.

O objetivo principal deste trabalho é realizar testes de hipóteses precisas sobre a fração de não disjunção meiótica na meiose I. Propõe-se procedimentos de teste bootstrap (Efron e Tibshirani, 1993 e Davison e Hinkley, 1997) para este fim, estendendo trabalhos anteriores. São sugeridas duas transformações nas amostras para aproximar um modelo nulo e, com isso, calcular a estatística de teste, que é o estimador de máxima verossimilhança, e os p-valores aproximados. Os resultados obtidos com cada transformação são comparados via simulação Monte Carlo. Embora a realização de testes sobre  seja um problema relevante, pouco se tem sobre isto na literatura. Franco e Barros (2001) propõem técnicas bootstrap para obter intervalos de confiança para , os quais podem ser utilizados para testes bilaterais. O teste bootstrap é recomendado pois

(4)

pode-se levar em conta amostras pequenas, que, em geral, é o caso, já que o número de indivíduos trissômicos freqüentemente não é grande.

Este trabalho está assim organizado. A Seção 2 apresenta a função de verossimilhança e o estimador de máxima verossimilhança para , introduzidos por Franco et al. (2003). Também são introduzidos os procedimentos para a construção do teste de hipóteses bootstrap. A Seção 3 mostra os estudos Monte Carlo para o procedimento de teste de hipóteses apresentado. A Seção 4 conclui o trabalho.

2. Modelo Estatístico

Nesta Seção é apresentado o modelo estatístico para pacientes com trissomia desenvolvido por Franco et al. (2003) e o estimador de máxima verossimilhança para . Também são apresentados os procedimentos da técnica bootstrap para realizar os testes de hipóteses precisas sobre .

2.1. Função de verossimilhança de 

Para construir a função de verossimilhança de , Franco et al. (2003) assumem que o equilíbrio de Hardy-Weinberg é verificado para a população.

Denote por  o número de indivíduos em uma amostra de  pacientes trissômicos que apresentam  picos (alelos),   1,2,3 e denote por o vetor aleatório , , . Seja ,

  1, . . . ,  as freqüências relativas do alelo  em um loco multialélico de microssatélites.

Denote por ,   0,1, a probabilidade condicional da não disjunção ocorrer na meiose I, dado que um erro de não disjunção ocorreu. Dado , Franco et al. (2003) mostram que o vetor aleatório tem distribuição multinomial com parâmetros , ,  e , ou seja,

|   !"#, , , , que tem função de probabilidade dada por:

$  %| ' ! ! '! '!  ()(*(+, 1 onde %  ', ', ', '  ,0, … , . para   1,2,3, ∑ '0    e    1 2 1 3  1  4 0 4 0 ;   3 1 1 62 1 3  1 1 6 4 60 4 0 4 60 4 0 , para  7 8;    1 1 1 69, para  7 8 7 : 4 90 4 60 4 0 .

Note que  pode ser interpretado como a probabilidade do loco de interesse apresentar  picos,   1,2,3. Também pode ser observado que ∑ 0  ∑ 40 2

1 3 ∑ 40  1.

Como |   !"#, , , , segue, como conseqüência, que

(5)

2.2. Estimador de máxima verossimilhança para 

O estimador de máxima verossimilhança (EMV) para  é obtido maximizando a função de probabilidade em (1) com respeito a . Franco et al. (2003) mostram que este estimador é dado por

< 3= > √=2A3 4AB, 2

onde para !  ∑ 40 ,  ∑ 40  e C  ∑ ∑40 4606,  7 8, temos

A  ! 3 3C 3 1 3 ;

=  ! 3 1 3  3 ' 2 3C 3 1 3  3 ';

B  '1 3  ,

se 0 D < D 1. Caso contrário, < assume um dos extremos 0 ou 1. 2.3. Teste bootstrap para hipóteses precisas sobre 

Muitas vezes, mais do que inferir sobre , o interesse está em decidir se  assume ou não um valor E, conhecido. Nesta Seção são introduzidos alguns procedimentos bootstrap para a realização de testes para hipóteses precisas sobre , isto é, assumem-se as seguintes hipóteses:

FE:   E CHIJ J F:  7 E,

onde E 0,1 é um valor conhecido.

Aqui, a técnica bootstrap é utilizada para obter os p-valores associados ao teste, os quais são utilizados para a tomada de decisão. O p-valor é a probabilidade de observar-se um valor tão extremo quanto o observado para a amostra de fato selecionada se a hipótese nula for verdadeira. Desta forma, um valor grande para o p-valor traria uma forte evidência da veracidade de FE.

O bootstrap é um método computacionalmente intensivo introduzido por Efron em 1979. É usado principalmente para avaliar a precisão das estimativas estatísticas para casos em que a distribuição exata é desconhecida ou de difícil derivação. Também é útil quando a amostra disponível é pequena, impossibilitando o uso de resultados assintóticos. Essa técnica é essencialmente não-paramétrica, já que não requer quaisquer suposições sobre a forma da distribuição dos dados. Baseia-se na reamostragem da amostra original e a distribuição desconhecida de interesse é aproximada pela distribuição empírica, a qual é construída a partir das amostras bootstrap.

A idéia básica de um teste bootstrap é a seguinte: retira-se um grande número de amostras bootstrap, diga-se ; amostras, obedecendo à hipótese nula e que, tanto quanto possível, se assemelhem à amostra real. Para cada uma destas ; amostras calcula-se o valor da estatística de teste <, gerando uma amostra <, … , <K da distribuição desta estatística. Percebe-se que desta amostra tem-se a distribuição empírica de <.

É possível, a partir desta distribuição empírica, determinar tanto os valores críticos para a estatística de teste, quanto calcular a probabilidade de significância, ou p-valor. Neste

(6)

trabalho considera-se o p-valor que, para o caso de teste de hipóteses precisas, é definido por:

  minO$P< D <QRS| FET, $P< U <QRS| FETV,

onde <QRS é o valor observado para a estatística de teste na amostra original.

Neste trabalho, a estatística de teste a ser considerada é o estimador de máxima verossimilhança dado em (2). Como na determinação do p-valor necessita-se construir a distribuição empírica do EMV assumindo FE verdadeira, duas transformações nos dados serão consideradas.

Na primeira delas assume-se que a amostra utilizada é W, … , WX, onde W indica o número de picos observados para o indivíduo ,   1, … , . Na segunda transformação considera-se que a amostra é o vetor %  ', ', ', definido na Seção 2.1. A variável Y assume os valores 1, 2 e 3 com probabilidades iguais a, respectivamente, ,  e

.

A primeira transformação na amostra é feita em W, … , WX e é tal que

WZ W3 W[ 2 \Y|E, 3

onde W[ é a média amostral e \Y|E  ∑ 0 E. Essa transformação faz com que a nova amostra WZ, … , WXZ tenha média amostral igual ao valor esperado de Y determinado sob

FE.

A segunda transformação é realizada no vetor da amostra observada %  ', ', ', cuja distribuição é a multinomial dada em (1). Neste caso, o valor transformado de ' é:

'Z ]'3  ̂J 

_`a b cB|E 2 \|E  \|E  E, 4

onde ̂ é a proporção de indivíduos com  picos na amostra de tamanho  e J_`a é o desvio-padrão de tal proporção,   1,2,3. Como pode ser visto %Z não depende da amostra original

%.

Se $P< D <QRS| FET ou $P< U <QRS| FET não podem ser calculadas exatamente ou se não existem aproximações satisfatórias (normal ou outra) que permitam determinar tais probabilidades, estas podem ser aproximadas por:

RQQd min e∑ fOgha Zigh jklV K 0 ; , ∑ fK0 OghaZmghjklV ; n,

em que f,o. denota a função indicadora de p. 3. Estudos de simulação para teste de 

Nesta seção são realizados estudos Monte Carlo para calcular as proporções de casos em que a hipótese nula é aceita. Seguindo Franco et al. (2006), é avaliado um microssatélite que apresenta seis alelos com freqüências  0,12,   0,45,  0,09, s 0,31, t  0,01 e

(7)

Foram consideradas 500 réplicas da distribuição multinomial dada em (1) com parâmetros  iguais a 0,01, 0,10, 0,50, 0,90 e 0,99 e assumidos dois tamanhos de amostras:   10 e 100. Também foram considerados diferentes valores para E.

Para cada réplica Monte Carlo foram feitas as transformações dadas em (3) e (4). Foram geradas 500 réplicas bootstrap a partir das amostras transformadas e calculados os p-valores para cada caso. Após gerar as 500 amostras Monte Carlo tomou-se a porcentagem de p-valores maior que 0,05, ou seja, a proporção de amostras em que não se rejeitava a hipótese nula. Tais porcentagens podem ser vistas na Tabela 1. É desejável que esse valor seja maior ou igual a 95% nos casos em que   E e menores que isso para os outros casos.

Tabela 1 - Porcentagem de amostras em que wx não é rejeitada.

 10 100 Transformação WZ %Z WZ %Z E  %RQQd U 0,05 %RQQd U 0,05 0,01 0,01 100,0 97,0 100,0 73,0 0,10 99,8 76,0 100,0 4,4 0,50 88,8 20,6 100,0 0,0 0,90 59,6 5,6 86,0 0,0 0,99 47,2 3,6 69,2 0,0 0,10 0,01 100,0 97,0 100,0 61,0 0,10 99,8 76,0 100,0 92,6 0,50 95,2 20,6 100,0 0,8 0,90 76,0 5,6 97,8 0,0 0,99 66,4 3,6 87,8 0,0 0,50 0,01 95,2 100,0 100,0 0,0 0,10 97,2 99,8 100,0 0,4 0,50 99,0 95,0 100,0 90,0 0,90 95,8 83,8 100,0 3,8 0,99 93,4 80,4 100,0 1,8 0,90 0,01 59,6 2,2 92,8 0,0 0,10 66,6 13,0 99,0 0,0 0,50 93,2 66,0 100,0 7,4 0,90 99,8 90,4 100,0 96,6 0,99 98,4 92,8 100,0 98,4 0,99 0,01 59,6 2,2 75,4 0,0 0,10 66,6 13,0 91,4 0,0 0,50 93,2 66,0 100,0 1,4 0,90 99,8 90,4 100,0 86,2 0,99 98,4 92,8 100,0 96,8

Da Tabela 1 nota-se que, para  10, quando a transformação realizada em foi considerada, melhores resultados são obtidos nos casos em que 7 0, exceto quando 0

0,50 e  0,01 e 0,10. Para os casos em que  0 as porcentagens de amostras em que a , … ,

(8)

maiores do que aquelas obtidas se a transformação em é considerada. Percebe-se que, quando

 0 e a transformação em é considerada, o percentual de vezes em que 0 não é rejeitada

é mais próximo de 95%, exceto quando 0 0,10. Isto é desejável, uma vez que o nível de

significância escolhido é 5%.

Para  100, nota-se que, quando  0 e a transformação em é utilizada, o

percentual de vezes em que 0 não é rejeitada é, em geral, mais próxima de 95%, exceto se 0 0,01, onde o percentual de acerto é de 73% e se 0  0,50, onde o percentual de acerto

usando as transformações em 1, … , (100%) e % (90%) distam igualmente de 95%. É

notável, para este tamanho amostral, a piora do teste realizado usando a transformação em

W1, … , WX quando  7 0. Neste caso, o percentual de vezes em que a hipótese nula é rejeitada

erroneamente é superior a 69% para todos os casos. Também nota-se uma grande melhora no desempenho do teste construído usando a transformação em %.

Em resumo, pode-se dizer que o teste construído usando a transformação em % gerou, em geral, melhores resultados para ambos tamanhos amostrais.

4. Conclusão

Nesse trabalho propõem-se testes bootstrap para a fração de não disjunção na meiose I considerando-se duas transformações nos dados com o intuito de ajustar um modelo nulo e, assim, estimar o p-valor. Um estudo Monte Carlo foi feito para calcular as proporções de amostras em que a hipótese nula não é rejeitada, considerando um nível de significância de 5%.

Para testar hipóteses precisas sobre  notou-se que, tanto para amostras pequenas quanto para amostras grandes, a transformação feita em % gerou melhores resultados do que para a transformação realizada em W1, … , WX, especialmente nos casos em que   0.

Como extensão deste trabalho os testes propostos serão comparados com procedimentos existentes na literatura como, por exemplo, os procedimentos bayesianos, FBST (teste de significância bayesiano completo) e FB (fator de Bayes). Uma aplicação a dados reais também será feita.

Referências

Davison, A. C. e Hinkley, D. V., (1997). Bootstrap Methods and their Application. New York: Cambridge University Press.

Efron, B. (1979). Bootstrap Methods: Another Look at the Jackknife. The Annals of Statistics 7 (1), 1-26.

Efron, B. e Tibshirani, R. J. (1993). An Introduction to the Bootstrap. Chapman and Hall. Franco, G. C., Lucio, P. S., Parra, F. C. e Pena, S. D. J. (2003). A probability model for the meiosis I nondisjunction fraction in numerical chromosomal anomalies. Statistics in Medicine 22 (12), 2015–2024.

Griffin, D. K. (1996). The incidence, origin, and etiology of aneuploidy. International Review of Cytology 167, 64–70.

Hartl, D. L. e Clark, A. G. (1997). Principles of population in genetics (3rd. edition). Sunderland: Sinauer Associates.

Hassold, T. J. e Hunt, P. (2001). To er (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nature Reviews in Genetics 2, 280–291.

(9)

Hassold, T. J. e Jacobs, P. A. (1984). Trisomy in man. Annual Reviews in Genetics 18, 69–97. Koehler, K. E., Hawley, R. S., Sherman, S. e Hassold, T. (1996). Recombination and nondisjunction in human and flies. Human Molecular Genetics 5, –1505.

Loschi, R. H. e Franco, G. C. (2006). Bayesian analysis for the meiosis I non-disjunction fraction in numerical chromosomal anomalies. Biometrical Journal 48 (2),220–232.

Nicolaidis, P. e Petersen, M. B. (1998). Origin and mechanisms of non-disjunction in human autosomal trisomies. Human Reproduction 13, 313–319.

Parra, F. C. (1999) - Estudo da origem de não disjunção meiótica em indivíduos brasileiros com trissomia do cromossomo 21 utilizando um estimador de máxima verossimilhança. Dissertação de Mestrado, Departamento de Bioquímica e Imunologia, Universidade Federal de Minas Gerais. Pena, S. D. J. (1998). Molecular Cytogenetics I: PCR-based diagnosis of human trisomies using computerassisted laser densitometry. Genetic Molecules Biology 3 , 371–322.

Petersen, M. B., Schinzel, A. A., Binkert, F., Tranebjaerg, L., Mikkelsen, M., Collins, F. A., Economou, C.P. e Antonarakis, S.E. (1992). Comparative study of micosatellite and cytogeneticmarkers for detecting the origin of the nondisjoined chromosome 21 in Down syndrome. American Journal of Human Genetic 167, 263–296.

Savage, A. R., Petersen, M. B., Pettay, B., Taft, L., Allran, K., Freeman, S. B., Karadina, G., Avramopoulos, D., Tofs, C., Mikkelsen, M., Hassold, T. J. e Sherman, S. L. (1998). Elucidating the mechanisms of parental non-disjunction of chromosome 21 in humans. Human Molecular Genetics 7, 1221–1227.

Yoon, P. W., Freeman, S. B., Sherman, S. L., Taft, L. F., Gu, Y., Pettay, D., Flanders, W. D., Khoury, M. J. e Hassold, T. J. (1996). Advanced maternal age and the risk of Down syndrome characterized by the meiotic stage of the chromosomal error: a population based study. American Journal of Human Genetics 58, 628–633.

Zaragosa, M. V., Millie, E., Redline, R. W. e Hassold T. J. (1994). Studies of non-disjunction in trisomies 2, 7, 15 and 22: does the parental origin of trisomy influence placental morphology? Journal of Medical Genetics 35, 924–931.

Referências

Documentos relacionados

Para tanto, estamos encaminhando o(a) acadêmico(a) _________________ ___________________________________, aluno(a) regularmente matriculado(a) no ___º semestre do

Como ferramentas de apoio ao desenvolvimento de produtos nas fases iniciais, destacam-se o Desdobramento da Função Qualidade (QFD) para auxiliar no levantamento das necessidades dos

Para preparar a pimenta branca, as espigas são colhidas quando os frutos apresentam a coloração amarelada ou vermelha. As espigas são colocadas em sacos de plástico trançado sem

O objetivo do curso foi oportunizar aos participantes, um contato direto com as plantas nativas do Cerrado para identificação de espécies com potencial

O valor da reputação dos pseudônimos é igual a 0,8 devido aos fal- sos positivos do mecanismo auxiliar, que acabam por fazer com que a reputação mesmo dos usuários que enviam

-- A Alléém m ddooss bi bi op opol ol í ím mer eros  os  , moléculas menores como , moléculas menores como lipídios lipídios ,, água água ,, sais

servidores, software, equipamento de rede, etc, clientes da IaaS essencialmente alugam estes recursos como um serviço terceirizado completo...

Conter o produto vazado com terra ou areia, recolhendo para recipientes com tampa. Não fechar os