UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
Instituto de Ciências Biológicas (ICB)
Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas (PPGCB)
Efeitos da manipulação farmacológica dos receptores de grelina do
núcleo dorsal da rafe de ratos sobre a expressão de
comportamentos associados à ansiedade generalizada e ao pânico
DANIEL PEREIRA CAVALCANTE
Orientador: Prof. Dr. Roger Luís Henschel Pobbe
Pesquisador Colaborador: Prof. Dr. Carlos Henrique Xavier Custódio
Goiânia
2018
DANIEL PEREIRA CAVALCANTE
Efeitos da manipulação farmacológica dos receptores de grelina do
núcleo dorsal da rafe de ratos sobre a expressão de
comportamentos associados à ansiedade generalizada e ao pânico
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Goiás, como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Ciências Biológicas.
Área de Concentração: Farmacologia e Fisiologia
Orientador: Prof. Dr. Roger Pobbe
Co orientador: Prof. Dr. Carlos Henrique Xavier Custódio
GOIÂNIA-GO 2018
DEDICATÓRIA
Em primeiro lugar agradeço e dedico a Deus que, sem dúvida alguma foi quem me guiou, me guardou e me deu forças para lutar. Foi meu escudo em meio às batalhas e meu acalento nos momentos mais desgastantes e desesperadores.
Dedico a minha família, pai, mãe e irmão que fizeram parte de cada passo da minha caminhada, me presenteando sempre com bons conselhos, ponderando e amenizando meus momentos de ansiedade e sofrimento.
AGRADECIMENTOS
Em primeiro lugar agradeço a Deus que, sem dúvida alguma foi quem me guiou, me guardou e me deu forças para lutar. Foi meu escudo em meio às batalhas e meu acalento nos momentos mais desgastantes e desesperadores.
Agradeço a minha família, pai, mãe e irmão que fizeram parte de cada passo da minha caminhada, me presenteando sempre com bons conselhos, ponderando e amenizando meus momentos de ansiedade e sofrimento.
Aos meus parceiros Urleis Junior, Romário Santos e Tiago Garcia, o trio que foi exemplo de companheirismo, dedicação, união e amizade. Agradeço a vocês pelas brincadeiras e amizade.
Agradeço aos meus amigos Leonardo Rocha, Guilherme Mendes e Gabriel Mendes por sempre grandes amigos e estarem comigo nas horas boas e ruins, provando serem leais.
Agradeço a CAPES por todo apoio e ajuda financeira com a concessão da bolsa de estudos.
Ao professor Prof. Dr. Roger Pobbe que sempre esteve disposto a ajudar em diversas situações, além de ser uma pessoa excepcional e ótima profissional.
Ao co-orientador, prof. Dr. Carlos Henrique Xavier Custódio, pela oportunidade cedendo o espaço em seu laboratório para que eu e o professor Roger realizássemos a nossa pesquisa.
À Profa. Dra. Aline Pansani, pela disponibilização do laboratório para utilização do estereotáxico e realização das cirurgias do presente estudo.
A todos os meus AMIGOS do Laboratório de Fisiologia e Terapêutica Cardiovascular, que me apoiaram e estiveram sempre dispostos a me ajudar. Amigos e colaboradores que NUNCA mediram esforços para me ajudar na realização dos experimentos e na vida cotidiana.
Sumário
RESUMO ... 1
ABSTRACT ... 2
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS ... 3
LISTA DE FIGURAS ... 4
LISTA DE TABELAS ... 5
1. Introdução ... 6
1.1. Ansiedade ... 6
1.2. Transtorno de ansiedade generalizada ... 6
1.3. Transtorno do pânico ... 7
1.4. Comportamentos defensivos ... 8
1.5. Serotonina, NDR e o papel dual da serotonina na ansiedade. ... 9
1.6. Grelina e seu envolvimento na ansiedade... 11
2. Objetivos ... 15 3. Materiais e métodos ... 16 3.1. Animais ... 16 3.2. Aparato experimental ... 16 3.2.1. Labirinto em T elevado ... 16 3.2.2. Campo Aberto ... 17 3.3. Drogas ... 18 3.4. Cirurgia estereotáxica ... 18
3.5. Administração intra-encefálica das drogas... 19
3.6. Análises Comportamentais e Experimentais ... 19
3.7. Histologia ... 22 3.8. Análise Estatística ... 23 4. Resultados ... 24 5. Discussão ... 37 6. Conclusão ... 43 7. Referências Bibliográficas ... 44
1 RESUMO
A grelina é um peptídeo recentemente descoberto, produzido principalmente no estômago e envolvido nos processos de manutenção de energia do organismo. A grelina exerce suas ações ao ativar o receptor secretagogo do hormônio do crescimento (GHS-R). Uma série de estudos tem investigado o envolvimento da grelina na modulação de comportamentos emocionais. Neste contexto, evidências mostram a presença de receptores GHS-R no núcleo dorsal da rafe (NDR), principal fonte de neurônios serotonérgicos que inervam estruturas encefálicas envolvidas no controle emocional. O objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos obtidos com a manipulação farmacológica dos receptores de grelina localizados no NDR sobre a expressão das respostas comportamentais de esquiva inibitória e fuga de ratos. Tais respostas foram avaliadas no labirinto em T elevado (LTE), modelo experimental que possibilita a medida, em um mesmo animal, de duas estratégias comportamentais defensivas, a esquiva inibitória e a fuga. Os dados de nosso estudo mostraram que a infusão intra-NDR de grelina prejudicou a aquisição da resposta de esquiva inibitória, um efeito ansiolítico, e facilitou a expressão da resposta de fuga dos animais no LTE, um efeito panicogênico. A administração intra-NDR do antagonista de receptores de grelina (GHS-R1a) PF-04628935 não modificou as respostas comportamentais defensivas avaliadas no LTE. Por fim, nossos dados mostraram que a infusão de PF-04628935 previamente à injeção de grelina no NDR foi capaz de bloquear os efeitos comportamentais obtidos no LTE. Tomadas em conjunto, as evidências obtidas em nosso estudo apontam para um importante envolvimento do sistema central de sinalização do peptídeo grelina na mediação de respostas comportamentais defensivas que têm sido associadas aos transtornos de ansiedade generalizada e do pânico.
2 ABSTRACT
Ghrelin is a recently discovered peptide, mainly produced in the stomach and involved in body's energy-maintenance processes. Ghrelin exerts its actions by activating the growth hormone secretagogue receptor (GHS-R). A number of studies have investigated the involvement of ghrelin in the modulation of emotional behavior. In this context, evidence shows the presence of GHS-R receptors in the dorsal raphe nucleus (DRN), the main source of serotonergic neurons that innervate encephalic structures involved in emotional control. Our study aims to evaluate the effects of the pharmacological manipulation of ghrelin receptors located in the DRN on the expression of the behavioral responses of Wistar rats. Such responses were assessed in the elevated T maze (ETM), an experimental model that allows the measurement, in the same animal, of two defensive behavioral strategies, inhibitory avoidance and escape. Our results showed that the intra-DRN infusion of ghrelin impaired the acquisition of inhibitory avoidance, an anxiolytic-like effect, and facilitated the expression of escape response in the ETM, indicating a panicogenic-like effect. The intra-DRN administration of the ghrelin receptor (GHS-R1a) antagonist PF-04628935 did not alter the behavioral tasks assessed in the ETM. Finally, our results revealed that intra-DRN infusions of PF-04628935 prior to the administration of ghrelin into this area neutralized the behavioral effects obtained in the ETM. Taken together, our data reveal an important involvement of the ghrelin central signaling system in the mediation of defensive behavioral responses that have been associated with generalized anxiety and panic disorders.
3 LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
5-HT – Serotonina Ghr – Grelina
Ghr - R – Receptor de grelina
GHS-R – Receptor secretagogo do hormônio do crescimento LTE – Labirinto em T elevado
LTC – Labirinto em cruz elevado LB – Linha de base
NDR – Núcleo dorsal da rafe NMR – Núcleo mediano da rafe SNC – Sistema nervoso central
SCPD – Substância cinzenta periaquedutal dorsal SCPV – Substância cinzenta periaquedutal ventral TAG – Transtorno de ansiedade generalizada TP – Transtorno de pânico
4 LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Expressão do receptor secretagogo do hormônio do crescimento (GHS-R) em diversas regiões extra-hipotalâmicas como amígdala, hipocampo, substância nigra, área tegmentar ventral e núcleo dorsal da rafe, entre outras regiões envolvidas no comportamento.
Figura 2 – Labirinto em T elevado. Figura 3 – Campo Aberto.
Figura 4 - Representação esquemática da sequência experimental.
Figura 5 – Tempo gasto para a saída do braço fechado e de um dos braços
abertos de animais submetidos ao labirinto em T elevado após a infusão de diferentes doses de grelina no NDR.
Figura 6 – Número total de cruzamentos obtidos no teste do campo aberto em animais após a infusão de diferentes doses de grelina no NDR.
Figura 7 – Tempo gasto para a saída do braço fechado (esquiva inibitória, painel A) e de um dos braços abertos (fuga, painel B) de animais submetidos ao labirinto em T elevado após a infusão de diversas doses do antagonista do receptor da grelina PF-04628935.
Figura 8 – Número total de cruzamentos obtidos no teste do campo aberto em animais após a infusão de diferentes doses do antagonista de grelina no NDR. Figura 9 – Tempo gasto para a saída do braço fechado (esquiva inibitória, painel A) e de um dos braços abertos (fuga, painel B) de animais submetidos ao labirinto em T elevado após o bloqueio do receptor da grelina.
Figura 10 – Número total de cruzamentos obtidos no teste do campo aberto nos grupos do experimento 3.
Figura 11 – Diagramas de secções coronais do encéfalo de camundongos mostrando a localização dos sítios de injeção no NDR.
5 LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Tempo e cruzamentos obtidos no teste do campo aberto em animais após a infusão de diferentes doses de grelina no NDR.
Tabela 2 – Tempo e cruzamentos obtidos no teste do campo aberto em animais após a infusão de diferentes doses de antagonista da grelina no NDR. Tabela 3 - Tempo e cruzamentos obtidos no teste do campo aberto em animais após o bloqueio da sinalização de grelina no NDR.
6 1. Introdução
1.1. Ansiedade
A ansiedade pode ser caracterizada como uma experiência de caráter desagradável, estressante e não prazeroso acompanhada por diversas alterações de comportamento, fisiológicas e cognitivas, como taquicardia, tensão muscular, sudorese, dificuldade de concentração, insônia, entre outros sintomas (1, 2, 3). A ansiedade é considerada importante para o desenvolvimento do desempenho do indivíduo, pois ativa e mobiliza o corpo e o organismo a se adaptar, por exemplo, a ambientes considerados aversivos contribuindo para sua sobrevivência, ou seja, até certo ponto ou nível a ansiedade é necessária para o indivíduo, pois atua como um modo de defesa a situações aversivas, estressantes ou de perigo (4, 5). No entanto, quando os níveis de ansiedade começam a ser excessivos, ela começa a ser considerada patológica atrapalhando o modo de vida do indivíduo e até mesmo suas funções básicas e essenciais (3, 4, 6).
Os transtornos de ansiedade podem ser englobados dentro de um conjunto de patologias como, por exemplo, transtorno do pânico, transtorno de ansiedade generalizada, transtorno de ansiedade social, transtorno de ansiedade devido a uma condição médica geral, transtorno de ansiedade induzido por substâncias químicas, entre diversas fobias como fobia social ou agorafobia (7). Essas diversas formas de ansiedade não têm a mesma fisiopatologia, sendo desencadeadas de modo diferente e geralmente com abordagens terapêuticas distintas, motivando a contínua realização de investigações experimentais nesta importante área da pesquisa científica. Desta forma, levando em consideração os objetivos do presente estudo, descreveremos brevemente os transtornos de ansiedade generalizada e do pânico (8, 9, 10).
1.2. Transtorno de ansiedade generalizada
Segundo a 5ª edição do Manual Diagnóstico e Estatístico dos Transtornos Mentais (DSM-V) (7), o transtorno de ansiedade generalizada (TAG) é caracterizado quando o indivíduo apresenta preocupações excessivas e persistentes em relação a questões cotidianas e circunstanciais da vida durante mais de 6 meses. No TAG, a ansiedade e as preocupações são
7 desproporcionais em relação à realidade do problema desencadeante e o indivíduo é muitas vezes incapaz de descontrair e há uma dificuldade de controlar essa preocupação. Este estado de ansiedade pode ser acompanhado por tensão muscular, dificuldade de concentração e distúrbios do sono.
1.3. Transtorno do pânico
De acordo com a DSM-V (7), o transtorno do pânico (TP) tem como característica essencial a ocorrência súbita e inesperada de ataques de pânico. Os ataques de pânico são definidos como um medo intenso, apreensão, sensação de temor ou um mal-estar acompanhado por alguns sintomas como taquicardia, palpitações, tremores, dispneia, sudorese, sensação de estar sufocando, medo de morrer ou de perder o controle, entre outros e esses sintomas podem durar em média 30 minutos tendo seu auge com 10 minutos (11, 12).
Estudos mostram que os transtornos de ansiedade atingem mais de 25% da população mundial em algum momento da vida (13, 14). Segundo a Organização Mundial de Saúde (15), os transtornos de ansiedade constituem uma das maiores causas de anos perdidos por incapacitação e ocupam um espaço grande e preocupante na saúde pública. Evidências prévias corroboram os dados da OMS e mostram que esses transtornos prejudicam muito a qualidade de vida das pessoas causando problemas tanto no âmbito pessoal quanto no social; podem ocorrer associações entre os transtornos e uma série de problemas, tais como mal desempenho acadêmico de estudantes, desemprego, instabilidade mental e financeira e tentativas de suicídio (16, 17, 18). Atualmente, há várias formas de tratamento desses transtornos de ansiedade com o emprego de fármacos que atuam sobre os sistemas de neurotransmissão gabaérgico, dopaminérgico e serotoninérgico, por exemplo. No presente estudo, ênfase especial será dada ao sistema serotoninérgico que é um dos mais importantes na neurobiologia da ansiedade e constitui assim um sistema fundamental no que diz respeito à abordagem terapêutica destes transtornos.
8 1.4. Comportamentos defensivos
A ansiedade e o medo são emoções semelhantes e estão inseridas entre os principais mecanismos de defesa do organismo. Uma série de estudos já foi realizada e muitos ainda são conduzidos com o propósito de entender as bases neurobiológicas da ansiedade e de seus transtornos. Neste contexto, evidências indicam que uma parcela importante dos conhecimentos sobre as bases neurais e da farmacoterapia da ansiedade adquiridos até hoje foi possível devido à utilização de modelos animais de ansiedade (19, 20, 21, 22, 23).
De acordo com Charles Darwin em suas teses e pesquisas publicadas originalmente no livro The Expression of Emotions in Man and Animals (1872), a expressão da emoção dos humanos e de outros mamíferos foi preservada filogeneticamente. Segundo Darwin, por razões adaptativas, várias características físicas e também o comportamento emocional e defensivo foram preservados e mantidos ao longo das gerações. Tal proposta evolutiva foi utilizada como base para correlacionar os estados emocionais de medo e ansiedade com as respostas comportamentais de defesa emitidas pelos animais. De forma sucinta, existe uma correspondência direta entre determinados estados emocionais e respostas defensivas no que diz respeito aos mecanismos neurais e funções comportamentais, como, por exemplo, na percepção de situações aversivas e na subsequente organização das reações de defesa favoráveis em cada situação (23, 24, 25).
Os comportamentos de defesa podem ser definidos como um conjunto de respostas que são eliciadas por situações e/ou estímulos que geram algum tipo de ameaça (26). Os perigos ou ameaças apresentam-se de várias formas em diferentes espécies animais. Os exemplos de estímulos aversivos mais comuns incluem a presença de predadores ou de estímulos associados a estes, estímulos ambientais como altura e iluminação, alterações no ambiente natural (tempestades, incêndios), exposição a lugares e/ou objetos novos e o confronto ou competição com animais da mesma espécie. Em resposta à presença de estímulos aversivos, os animais expressam diferentes respostas comportamentais, tais como avaliação de risco, esquiva, imobilidade, fuga, ataque defensivo ou submissão (19, 27, 28, 29).
9 Em relação aos comportamentos de defesa, nas últimas décadas vários estudos e pesquisas foram realizados para analisar, por exemplo, as interações presa-predador e alguns transtornos de ansiedade (9,21,30). Os principais estudos foram realizados pelo casal Blanchard na Universidade do Havaí. A partir da observação sistemática do comportamento de roedores frente a predadores, Robert e Caroline Blanchard fizeram uma classificação da estratégia de defesa de acordo com o nível de ameaça ao qual o animal é exposto; tais análises experimentais resultaram na teoria dos três níveis de defesa: o potencial, distal e proximal (19, 31). O primeiro nível de defesa é caracterizado por um perigo incerto ou potencial responsável por gerar um comportamento de exploração cautelosa, avaliação de risco e esquiva estando relacionado ao estado emocional de ansiedade; estruturas encefálicas como a amígdala, o sistema septo-hipocampal e o córtex pré-frontal estariam relacionadas a esses comportamentos. O segundo nível é quando o perigo é real, porém se encontra a certa distância (distal); em tal situação, o animal pode apresentar comportamento de fuga e quando não há possibilidade de fuga, o animal tende e ficar imóvel em um comportamento de congelamento relacionado com o estado de medo sendo modulado a partir de uma via que parte do núcleo central da amígdala para a parte ventral da substância cinzenta periaquedutal (SCPV). Por fim, o terceiro nível de defesa ocorre quando a fonte de perigo ou ameaça é real e está próxima (nível proximal); em tal situação, o animal emite respostas comportamentais explosivas de fuga ou de ataque defensivo relacionadas ao estado de pânico com ativação predominante de núcleos hipotalâmicos e da substância cinzenta periaqueadutal dorsal (SCPd) (21, 32, 33, 34, 35, 36).
1.5. Serotonina, NDR e o papel dual da serotonina na ansiedade.
A 5-HT é um importante neurotransmissor e desenvolve diversas funções; sua importância na fisiopatologia e tratamento dos transtornos de ansiedade generalizada e do pânico tem sido há muito reconhecida (para revisão, ver 37). O núcleo dorsal da rafe (NDR) está localizado na linha média do mesencéfalo e juntamente com o núcleo mediano da rafe (NMR) representa a principal fonte de neurônios serotoninérgicos que se projetam ao encéfalo anterior por vias ascendentes (38). O NMR projeta suas fibras para o
10 hipocampo estando associadas com processos emocionais e cognitivos, ao passo que a projeção de fibras serotoninérgicas do NDR atinge diversas regiões encefálicas, tais como córtex pré-frontal, estriado, amígdala e substância cinzenta periaquedutal atuando em várias funções fisiológicas, como, por exemplo, funções motoras e sensoriais além do controle de comportamentos e emoções (39, 40). Está bem estabelecido na literatura científica o importante papel exercido pelas vias serotoninérgicas que se originam nestes núcleos mesencefálicos no controle de comportamentos emocionais, bem como na regulação de outras funções do organismo como, por exemplo, manutenção do ciclo sono-vigília e regulação de funções sensoriais (41, 42, 43).
Segundo a teoria dual da 5-HT na modulação da ansiedade proposta pelos pesquisadores Deakin e Graeff (1991), há duas vias serotoninérgicas originando-se no NDR, uma prosencefálica e outra periventricular, inervando a amígdala e a substância cinzenta periaquedutal dorsal (SCPD), respectivamente. Segundo estes autores, diante de perigo ou ameaça potencial, essas duas vias seriam ativadas culminando com um aumento na liberação de 5-HT em ambas as estruturas. A ativação da via serotoninérgica prosencefálica que inerva a amígdala e o córtex frontal facilitaria a expressão de respostas defensivas frente a estímulos ameaçadores potenciais ou distais, tais como a esquiva inibitória e os comportamentos de avaliação de risco. Tais estratégias comportamentais têm sido relacionadas, em termos clínicos, ao transtorno de ansiedade generalizada (2, 9, 22, 44, 45, 46, 47, 48). Por outro lado, a ativação da via serotoninérgica periventricular, que inerva a SCPD, inibiria reações de luta e/ou fuga em resposta ao perigo proximal. Tais respostas comportamentais têm sido associadas ao transtorno do pânico (22, 46, 48, 49).
Para testar em animais de laboratório a hipótese do papel dual da 5-HT na ansiedade, Graeff e colaboradores desenvolveram o modelo do labirinto em T elevado (LTE) (50). O LTE é derivado do labirinto em cruz elevado e ambos os modelos baseiam-se no fato de os roedores possuírem aversão natural a locais elevados do solo e desprovidos de proteção; nestes locais, a aversão nesses animais pode ocorrer pelo fato de não ser possível realizar o comportamento de tigmotaxia (50, 51, 52, 53, 54). O LTE é constituído por um
11 braço fechado e dois braços abertos elevados do solo permitindo observar de forma separada as repostas de esquiva inibitória e fuga de um mesmo animal. A avaliação do comportamento de esquiva inibitória é realizada colocando o animal por três vezes consecutivas no braço fechado e, em cada uma das tentativas, é verificado o tempo gasto para que o animal saia deste braço com as quatro patas. A diminuição da latência de esquiva indica um efeito do tipo ansiolítico enquanto o aumento indica um efeito do tipo ansiogênico. Em seguida, é realizada a verificação do comportamento de fuga; para tal, o animal é colocado em um dos braços abertos e é registrado o tempo gasto por este para sair deste braço com as quatro patas; a redução da latência de fuga indica um efeito do tipo panicogênico ao passo que o aumento indica um efeito do tipo panicolítico. Os dados obtidos em uma série de estudos realizados para validar farmacologicamente o LTE corroboram a associação da resposta de esquiva inibitória com o TAG e da resposta de fuga com o TP (10, 37, 53, 55). Nosso estudo foi realizado com a finalidade de analisar os efeitos da manipulação farmacológica dos receptores de grelina presentes no NDR em relação à expressão das respostas comportamentais de esquiva inibitória e fuga de ratos obtidas no teste do LTE e entender melhor a função da sinalização da grelina e sua interação com o sistema serotoninérgico na modulação dos comportamentos de TAG e TP.
1.6. Grelina e seu envolvimento na ansiedade
A grelina (Ghr) descrita primeiramente em 1999 como um peptídeo de 28 aminoácidos é um hormônio produzido e secretado principalmente no estômago tendo uma ampla variedade de funções tanto no sistema nervoso central como perifericamente (56, 57). A grelina é um peptídeo importante nos processos de regulação da ingestão de alimentos e metabolismo sendo sintetizada principalmente pelas células da camada mucosa da região fúndica do estômago e atua através do receptor de grelina (Ghr-R), anteriormente conhecido como receptor secretagogo do hormônio do crescimento (GHS-R) ligando-se especificamente ao subtipo 1a (GHS-R1a) sendo este o único receptor funcional de grelina caracterizado até o presente momento. Inicialmente, este receptor foi encontrado principalmente no hipotálamo que é uma das estruturas mais importantes na regulação da ingestão alimentar e do
12 controle do peso corporal (58, 59, 60). Desta forma, estudos iniciais demostraram que a grelina age principalmente no hipotálamo para a manutenção da homeostase do peso corporal e que os níveis de grelina estão anormais em seres humanos com distúrbios alimentares, tais como anorexia e obesidade (58, 59, 61, 62, 63). Desde a descoberta da grelina, pesquisas têm sido realizadas atribuindo uma variedade de funções adicionais a este peptídeo revelando sua presença em alvos extra-hipotalâmicos e sugerindo que seus efeitos neurobiológicos vão muito além de um balanço energético e ingestão de alimentos (58, 64, 65). No sistema nervoso central, a presença do receptor GHS-R que foi inicialmente detectado abundantemente em diversos núcleos hipotalâmicos se revelou também em diversas regiões extra-hipotalâmicas tais como NDR, amígdala, hipocampo, substância nigra e área tegmentar ventral (Figura 1) (58, 66, 67).
FIGURA 1: Expressão do receptor secretagogo do hormônio do crescimento (GHS-R) em diversas regiões extra-hipotalâmicas como, amígdala, hipocampo, substância nigra, área tegmentar ventral e núcleo dorsal da rafe entre outras regiões envolvidas no comportamento. As áreas indicadas em azul são as regiões do cérebro relacionadas com o humor: CA1-3, hipocampo, RN, núcleos da rafe, BLA, amigdala basolateral, CeA, amigdala central, CoA, amigadala cortical, MeA, amigdala medial, DMH, núcleo hipotalâmico dorso-medial, LC, locus coerulus, LM, núcleo mamilar
13 lateral, PVN, núcleo hipotalâmico paraventricular, POA, área preoptica, VMH, núcleo hipotalâmico ventro medial, VLPO, núcleo preoptico ventrolateral, VTA, área tegmentar ventral, NTS, núcleo do trato solitário (67).
Análises experimentais mostram que tais estruturas encefálicas constituem alvo dos efeitos centrais da grelina evidenciando a sugestão de que este peptídeo tem importantes efeitos fisiológicos além da ingestão de alimentos e metabolismo, incluindo também a regulação da memória, comportamentos de recompensa e humor (58, 68, 69). Dentre esses efeitos, um dos mais estudados é a ação da grelina sobre estados emocionais de humor e comportamentos de ansiedade (58, 65, 67). O debate sobre a real atuação da grelina na ansiedade é muito forte e gera muitas pesquisas, pois não existe um consenso se a grelina atua diminuindo ou aumentando a ansiedade (70).
Estudos indicam que a administração aguda de grelina perifericamente e em estruturas centrais de camundongos e ratos promove efeitos ansiogênicos no labirinto em cruz elevado (56, 71, 72). Um estudo com administração intracerebroventricular (ICV) de grelina em galinhas também reportou um aumento na ansiedade nesta espécie (73). Análises experimentais recentes mostram que há uma diminuição na expressão de comportamentos de ansiedade e depressão em ratos submetidos à gastrectomia (procedimento que promove uma redução significativa nos níveis de grelina) e em ratos knockout para a produção da grelina (74, 75). Por fim, os dados obtidos em uma análise experimental que empregou injeções de grelina diretamente na amígdala basolateral ou em regiões do hipotálamo mostraram haver um aumento da ansiedade por este procedimento (76, 77).
Em contrapartida aos estudos até aqui detalhados, uma série de análises experimentais revelou efeitos ansiolíticos e antidepressivos da grelina (63, 78, 79, 80, 81, 82). Lutter e colaboradores (2008) mostraram que o aumento nos níveis de grelina por meio da restrição calórica ou por injeção subcutânea da grelina diminui os comportamentos de ansiedade e depressão avaliados no labirinto em cruz elevado e teste de nado forçado. Esses efeitos foram específicos para a sinalização GHS-R1a, pois estavam ausentes no knockout GHS-R1a o qual não apresentou nenhum efeito significativo; neste
14 estudo, também se associou o estresse crônico ao aumento nos níveis de grelina e, desta forma, a sinalização deste sistema teria um importante papel na regulação de comportamentos relacionados ao humor. Outro estudo realizado por Spencer e colaboradores (2012) mostrou que os camundongos knockout para grelina estavam mais ansiosos após o estresse agudo de restrição. Além disso, os autores encontraram evidências de que a grelina reduz a ansiedade após o estresse agudo estimulando o eixo HPA ao nível da pituitária anterior (81). Alvarez-Crespo e colaboradores mostraram que a injeção direta de grelina na amígdala de ratos promove efeito ansiolítico apenas se o animal for restrito a alimento por 1 hora entre a injeção de grelina e os testes comportamentais (78).
A maior parte desses estudos mostrou que diversas regiões encefálicas constituem alvo da grelina, especialmente vários núcleos do hipotálamo e a amígdala. Ainda neste contexto, Carlini e colaboradores (2004) mostraram que a grelina atua fortemente no NDR para promover aumento na expressão de comportamentos associados à ansiedade sugerindo que grelina modula o sistema serotoninérgico. Interessantemente, análises experimentais recentes evidenciam a interação que ocorre entre os sistemas de sinalização central para grelina e serotonina (65, 83, 84). Mais especificamente, Hansson e colaboradores (2011) mostraram que a administração crônica e central (icv) de grelina em ratos favorece a expressão de comportamentos de ansiedade e depressão, e tal fato é acompanhado por um aumento na expressão do receptor 5-HT1A na amígdala. Dados obtidos no recente estudo de Hansson e colaboradores (2014) mostram que a administração central (i.c.v.) de grelina aumenta a expressão de receptores serotoninérgicos no NDR e amígdala e pode influenciar a liberação de 5-HT na amígdala mostrando que há um potencial envolvimento dos efeitos da grelina com o sistema serotoninérgico. Em conjunto, tais evidências revelam que o sistema serotoninérgico do NDR funciona como alvo para as ações da grelina, atuando como importante substrato neuroquímico para os efeitos deste peptídeo sobre respostas emocionais.
15 2. Objetivos
O presente trabalho teve como objetivo principal investigar a atuação da grellina no NDR em comportamentos relacionados a transtornos de ansiedade, assim analisando os efeitos obtidos com a manipulação farmacológica dos receptores de grelina localizados no NDR sobre a expressão das respostas comportamentais de esquiva inibitória e fuga de ratos, medidas no teste do LTE. De maneira geral, as análises experimentais aqui propostas possibilitaram ampliar o conhecimento a respeito do envolvimento do sistema de sinalização de grelina e de sua interação com o sistema de neurotransmissão serotonérgico na modulação de comportamentos que têm sido associados aos transtornos de ansiedade generalizada e do pânico.
Objetivos específicos:
- Experimento 1: analisar os efeitos comportamentais obtidos no LTE após a
administração de diferentes doses de grelina no NDR de ratos;
- Experimento 2: verificar os efeitos comportamentais obtidos no LTE
posteriormente à infusão de diferentes doses do antagonista de receptores para grelina no NDR de ratos.
- Experimento 3: investigar se o bloqueio prévio dos receptores para grelina
localizados no NDR de ratos é capaz de neutralizar os efeitos comportamentais obtidos com a administração de grelina neste núcleo mesencefálico.
16 3. Materiais e métodos
3.1. Animais
Foram utilizados ratos da linhagem Wistar, provenientes do Biotério Central da Universidade Federal de Goiás (UFG), pesando numa media entre 280kg – 330kg no início das análises experimentais. Os animais foram mantidos em grupos (5 por grupo) em caixas de polipropileno no Biotério do Departamento de Ciências Fisiológicas (DCiF) (ICB2-UFG), com livre acesso à água e alimento, sob um ciclo de luz claro/escuro de 12 x 12 horas (período claro das 7 às 19 horas) e temperatura controlada em 23±1°C. Os procedimentos experimentais deste projeto estão de acordo com as recomendações da SBNec (Sociedade Brasileira de Neurociências e Comportamento), as quais baseiam-se na US National Institutes of Health Guide for Care and Use of Laboratory Animals. Os procedimentos experimentais deste projeto foram registrados no Comitê de Ética e Uso de Animais de Experimentação da UFG (Protocolo CEUA 035/2016).
3.2. Aparato experimental
3.2.1. Labirinto em T elevado
O labirinto em T elevado (LTE) (figura 1) foi utilizado para testar os comportamentos defensivos de esquiva inibitória e fuga que estão relacionados à ansiedade e ao pânico, respectivamente, este aparato experimental é constituído por três braços de madeira de mesmas dimensões (50 x 12 cm), elevados 50 cm em relação ao solo. Um dos braços é circundado por paredes laterais (40 cm de altura) e está disposto perpendicularmente aos dois outros braços desprovidos de paredes. Para evitar a queda dos animais, os braços abertos são delimitados por uma tira de acrílico transparente de 1 cm de altura.
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Figura 2 - Labirinto em T elevado. Fonte: Acervo próprio
3.2.2. Campo Aberto
O campo aberto (figura 3) foi utilizado para verificar se o procedimento realizado (injeção central de drogas) altera a atividade locomotora dos animais e ansiedade por meio da análise dos cruzamentos e do tempo dos animais no centro e na periferia do aparato. O campo aberto é constituído por uma arena circular de madeira dividida em quadrantes (23 cm x 15,5 cm), com paredes de 40 cm de altura.
18
3.3. Drogas
Foram utilizadas as seguintes drogas: o neuropeptídeo Grelina de ratos (Sigma-Aldrich, EUA) e o antagonista do receptor de grelina (GHS-R1a) PF-04628935 (Sigma-Aldrich, EUA). A grelina foi dissolvida em salina estéril; já o PF-04628935 foi dissolvido em DMSO, de acordo com as especificações do fabricante.
3.4. Cirurgia estereotáxica
Após anestesia com tribromoetanol (Aldrich, EUA) a 2,5% (10mL/kg, i.p.) ou ketamina (50-100 mg/kg IP)/ xilazina (1-5mg/kg IP/IM) (doses de 0,3/0,2 ml para animais com peso médio de 300g) e realização de tricotomia na região da cabeça, os animais foram fixados a um aparelho estereotáxico. Após indução anestésica, uma associação antibiótica de amplo espectro (Pentabiótico, Fontoura-Wyeth-Brasil) foi administrada (0,2mL/animal, i.m.), a fim de prevenir possíveis infecções. A seguir, foi realizada a limpeza do campo cirúrgico com uma solução hidroalcoólica contendo iodo a 2%. Na região da incisão foi administrado, por via subcutânea, o anestésico local cloridrato de lidocaína associado a um vasoconstritor (Novocol 100, S.S. White-Brasil). Poucos minutos depois, foi realizada uma incisão longitudinal dos tecidos cutâneos e subcutâneos a fim de expor a calvária e remover o periósteo por raspagem. Logo depois, após realização desses procedimentos, foram perfurados na calota craniana dois orifícios com o auxílio de uma broca dental: o primeiro para a fixação de um parafuso de aço inoxidável que serviu como âncora da prótese de acrílico a ser disposta no crânio do animal e o segundo para a fixação de uma cânula de aço inoxidável (12 mm de comprimento e 0,55 mm de diâmetro externo) que foi implantada 2 mm acima do NDR. As seguintes coordenadas foram utilizadas (83): AP = -7,80 mm (partindo de bregma); L = - 2,10 mm; P = -4,60 mm; inclinação da haste = 20 graus. A cânula foi fixada à calota craniana por meio de resina acrílica e parafusos de aço inoxidável. Por fim, os animais receberam administração de fluxinina meglumina (Banamine; Schering-Plough S/A-Brasil; 2,5 mg/mL/kg, s.c.), um agente analgésico com atividade anti-inflamatória e antipirética.
19 3.5. Administração intra-encefálica das drogas
Para a administração intra-encefálica de drogas, os animais permaneceram com livre movimentação em uma caixa-viveiro (39 x 32 x 16 cm) com serragem no assoalho. As drogas ou os seus respectivos veículos foram administrados por meio de uma agulha de injeção odontológica do tipo Mizzy (0,3 mm de diâmetro externo e 13/14 mm de comprimento) conectada a uma microsseringa (Hamilton 701-RN, EUA) de 5µL através de um tubo de polietileno (PE-10), o qual foi preenchido com água destilada. O deslocamento de uma bolha de ar no polietileno foi utilizado para verificar se a droga realmente foi administrada. Após a injeção, a agulha permaneceu no sítio de injeção por mais 1 minuto para evitar o refluxo da droga. Segundo alguns estudos prévios, dez minutos após o término das injeções, os animais foram testados no labirinto em T elevado. (56, 70, 71)
3.6. Análises Comportamentais e Experimentais
Exposição prévia a um dos braços abertos do labirinto em T elevado No quinto dia após a cirurgia, cada animal foi exposto previamente a um dos braços abertos do labirinto em T elevado durante 30 minutos. Para tal, cada animal foi colocado individualmente em um dos braços abertos do labirinto em T elevado que foi isolado dos demais braços por uma parede de madeira, disposta na linha de separação entre a área central do labirinto e a porção proximal dos braços abertos. A exposição prévia teve por objetivo potencializar a expressão do comportamento de fuga ao reduzir respostas comportamentais à novidade, tais como a exploração e a inibição do comportamento, durante a realização desta tarefa (37, 85).
Teste no labirinto em T elevado
Seis dias após a cirurgia estereotáxica para implantação da cânula direcionada ao NDR, os animais foram testados no labirinto em T elevado havendo a realização de três experimentos em grupos independentes de animais.
- Experimento 1: Análise dos efeitos comportamentais obtidos no LTE com a infusão de grelina no NDR.
20 Neste experimento, foi realizada a injeção de veículo ou de grelina (0,03; 0,15 ou 0,3 nmol / 0,2 µL) no NDR. Foi utilizado um número total de 55 animais, dentre os quais após a histologia 37 tiveram o sitio de injeção corretamente posicionado no NDR, havendo a formação de 4 grupos experimentais: Salina (n=9); Grelina 0,03 nmol (n=9); Grelina 0,15 nmol (n=10) e Grelina 0,3 nmol (n=9). As doses administradas foram escolhidas de acordo com parâmetros estabelecidos em análises experimentais prévias da literatura científica (56, 71, 72, 76) e estudos conduzidos no laboratório do Prof. Carlos H. Xavier (ICB-UFG). Dez minutos depois das injeções, os animais foram submetidos à avaliação comportamental no LTE e no campo aberto.
- Experimento 2: Análise dos efeitos comportamentais obtidos no LTE com a infusão do antagonista GHS-R1a PF-04628935 no NDR.
Nesta análise experimental, foi realizada a injeção de veículo ou do antagonista do receptor da grelina PF-04628935 (0,06; 0,3 ou 0,6 nmol / 0,2 µL) no NDR. Foi utilizado um número total de 56 animais, dentre os quais após a histologia 34 tiveram o sitio de injeção corretamente posicionado no NDR, havendo a formação de 4 grupos experimentais: Salina (n=9), PF-04628935 0,06 nmol (n=8), PF-04628935 0,3 nmol (n=9) e PF-04628935 0,6 nmol (n=8). As doses administradas foram escolhidas de acordo com parâmetros estabelecidos em estudos previamente conduzidos no laboratório do Prof. Dr. Carlos H. Xavier (ICB-UFG). Assim como no experimento anterior, os animais foram submetidos à avaliação comportamental no LTE e no campo aberto dez minutos após as injeções.
- Experimento 3: Bloqueio dos Ghr-R previamente à infusão de grelina nos neurônios do NDR.
No experimento 3 foi realizado o bloqueio dos Ghr-R previamente à infusão de grelina nos neurônios do NDR. Nesta análise, os animais (número total de animais utilizados=58, dentre os quais após a histologia 38 tiveram o sítio de injeção corretamente posicionado no NDR) foram submetidos à injeção do antagonista GHS-R1a PF-04628935 (0,3 nmol / 0,2 µL) ou de veículo no NDR. Dez minutos depois, metade dos animais de cada um destes grupos recebeu a infusão de salina no NDR, ao passo que a outra metade recebeu a
21 infusão intra-NDR da dose de grelina que modificou de forma significativa os comportamentos de Esquiva e Fuga no Experimento 1 (0,3 nmol / 0,2 µL). Dez minutos após esta última administração central, os animais foram submetidos ao teste comportamental no LTE. Desta forma, houve a formação dos seguintes grupos experimentais:
- Veículo NDR / Salina NDR (n=9); - Veículo NDR / Grelina NDR (n=9);
- PF-04628935 NDR / Salina NDR (n=10); - PF-04628935 NDR / Grelina NDR (n=10).
As doses administradas, assim como o período de intervalo entre a infusão e o teste comportamental, foram escolhidas de acordo com os parâmetros estabelecidos nos experimentos 1 e 2.
O teste no labirinto em T elevado foi iniciado pela tomada da esquiva inibitória. Para verificar este comportamento, cada animal foi colocado na extremidade distal do braço fechado e media-se a latência gasta por ele para sair deste braço com as quatro patas (LINHA DE BASE). A mesma medida foi tomada por mais duas vezes com intervalos de trinta segundos entre elas (ESQUIVA1 e ESQUIVA2). Entre as medidas repetidas das repostas de esquiva e fuga, o animal permanecia em uma caixa de acrílico. O tempo máximo de permanência do animal no braço fechado, em cada uma das tomadas de esquiva era de cinco minutos. Trinta segundos após o término da tomada da ESQUIVA2, avaliava-se o comportamento de fuga. Para isso, cada animal foi colocado na extremidade do mesmo braço aberto ao qual ele tinha sido exposto previamente no dia anterior (quinto dia), e media-se o tempo gasto para a saída deste braço com as quatro patas (FUGA1). A latência de saída de um dos braços abertos foi registrada por mais duas vezes (FUGA2 e FUGA3), com intervalos de trinta segundos entre elas. Posteriormente ao teste de cada animal, o labirinto foi limpo com álcool a 10%.
O teste no campo aberto foi realizado trinta segundos após a tomada da FUGA3, uma câmera de vídeo foi fixada acima do campo para filmar o comportamento do rato. Cada animal foi colocado individualmente no quadrante central do campo aberto e ficou livre para explorar o aparelho por 5 minutos. Após cada sessão o campo aberto foi limpo (álcool 10%) para evitar interferência de pistas olfativas. Posteriormente, os filmes foram analisados e
22 observados os parâmetros de locomoção, tempo no centro e tempo na periferia do campo aberto para observação da atividade locomotora.
3.7. Histologia
Após o término dos testes comportamentais, os animais foram anestesiados com uretana a 25% (10 ml/kg, i.p.; Sigma, EUA). Nos animais nos quais foram implantadas cânulas-guia no NDR foi inserida uma agulha odontológica do tipo Mizzy posicionada 2 mm abaixo da extremidade da cânula para injeção de 0,1 µL do corante azul de Evans a 1%. A seguir, os encéfalos foram então perfundidos por meio de infusão pelo ventrículo cardíaco esquerdo de solução salina (0,9%) seguida por formol a 10%. Logo depois, os encéfalos foram retirados e armazenados em formol a 10% até a data de confecção das lâminas histológicas. Para a histologia, os encéfalos foram cortados em secções coronais de 50 µm de espessura por meio de um criostato de congelamento (Leica CM-1850) para verificação por microscopia óptica da extensão das lesões e dos sítios de injeção, segundo as fotomicrografias do atlas de Paxinos e Watson (1997) (86). Foram incluídos na análise estatística somente os animais que tiveram os sítios de injeção localizados no NDR.
Figura 4: Representação esquemática da sequência experimental para avaliar os efeitos da grelina nos receptores de grelina presentes no NDR nos comportamentos relacionados ansiedade e pânico no LTE e campo aberto.
Quinto dia de pós-cirúrgico - exposição previa Cirurgia estereotáxica Sexto dia de pós-cirúrgico – realização do experimento Injeções dos experimentos 1,2 e 3 10 min Testes comportamentais do LTE e campo aberto
Retirada do cérebro dos ratos
23 3.8. Análise Estatística
Os dados comportamentais obtidos foram submetidos à uma análise de variância (ANOVA) de medidas repetidas, tendo como fator independente o tratamento com a injeção de drogas no NDR, e como medida repetida as diferentes tentativas efetuadas (Linha de base, Esquiva1 e Esquiva2 ou Fuga1, Fuga2 e Fuga3) (software utilizado: SPSS statistics). Quando apropriado, foram realizadas comparações múltiplas pelo teste post-hoc de Tukey. Os dados da distância percorrida no teste do campo aberto foram submetidos à ANOVA de uma via seguidos pelo teste de Tukey. Foram considerados significativos os valores de p menores ou iguais a 0,05.
24 4. Resultados
- Experimento 1: Análise dos efeitos comportamentais obtidos no LTE com a infusão de grelina no NDR.
A figura 5A mostra o efeito da injeção de doses diferentes de grelina no núcleo dorsal da rafe de ratos sobre o comportamento de esquiva inibitória. Na ANOVA de medidas repetidas do experimento 1 os resultados mostraram um efeito prejudicial da infusão da grelina sobre a aquisição da resposta de esquiva no LTE na dose maior (0,3 nmol), ou seja, os animais tratados com grelina saíram mais rápido do braço fechado em relação ao grupo controle indicando um efeito do tipo ansiolítico [fator tratamento – F(1,33)= 4,39 p<0.05]. Houve também um efeito decorrente da administração das doses de grelina ao longo de cada tentativa [fator tentativa – F(2,66)= 25,0 p<0,05]. A ANOVA revelou ainda uma interação significativa entre os fatores tratamento e tentativas [F(6,66)= 3,66 p<0,05]. O teste de Tukey mostrou que o efeito da grelina foi obtido na tentativa (ESQUIVA2) onde houve uma diminuição significativa na latência (tempo) da ESQUIVA2 (p<0,05) no grupo tratado com a maior dose de grelina (0,3 nmol) em relação ao grupo controle.
Na figura 5B podemos observar o efeito das doses de grelina injetadas no NDR sobre o comportamento de fuga dos ratos. Na ANOVA de medidas repetidas do experimento 1 os resultados mostram que infusão da grelina na dose maior (0,3 nmol) facilitou a fuga dos animais, ou seja, os animais saíram mais rápido do braço aberto em relação ao grupo controle indicando um efeito do tipo panicogênico [Fator tratamento - F(1,33)= 3,09; p<0,05]. A ANOVA não revelou um efeito significativo da infusão intra-NDR de grelina ao longo das tentativas [Fator tentativa – F(2,66)= 0,40; NS] nem interação significativa entre os fatores tratamento e tentativas [F(6,66)= 0,55; NS]. O teste de Tukey mostrou que o efeito da grelina foi na FUGA2 onde houve uma redução significativa na latência (tempo) da FUGA2 (p<0,05) no grupo tratado com a maior dose de grelina em relação ao grupo controle.
25 A
B
FIGURA 5: Média ± EPM do tempo gasto para a saída do braço fechado (esquiva inibitória, painel A) e de um dos braços abertos (fuga, painel B) de animais (N=37) submetidos ao labirinto em T elevado após a infusão de diferentes doses de grelina no NDR. * p<0,05 quando comparado ao grupo controle em uma mesma tentativa (esquiva 2 e fuga 2). LB = linha de base.
26 A tabela 1 mostra o efeito da administração intra-NDR de grelina sobre o comportamento exploratório dos animais no campo aberto. A ANOVA de uma via seguida pelo teste de Tukey mostrou um aumento significativo no número de cruzamentos no centro do campo aberto nos animais submetidos à infusão intra-NDR da dose de 0,3 nmol de grelina em relação ao controle [p<0,05].
Tabela 1: Média ± EPM do tempo e cruzamentos obtidos no teste do campo aberto em animais (N=37) após a infusão de diferentes doses de grelina no NDR. *mostra um maior número de cruzamentos no centro na dose maior (0,3 nmol) comparado ao grupo controle.
EXPERIMENTO 1
Cruzamentos - periferia Cruzamentos - centro
Salina 30,89 ± 3,88 0,67 ± 0.29
Grel 0,03 33,67 ± 6,54 1,56 ± 0,47
Grel 0,15 37,20 ± 7,15 1,70 ± 0,67
Grel 0,3 32,00 ± 4,72 2,89 ± 0,51
*
Tempo (s) – periferia Tempo (s) – centro
Salina 293,34 ± 2,15 5,81 ± 1,90
Grel 0,03 290,77 ± 1,81 9,65 ± 1,88
Grel 0,15 288,76 ± 2,34 11,24 ± 2,34
27 A figura 6 mostra o número total de cruzamentos dos animais no campo aberto. A análise estatística mostrou que não houve diferença significativa entre os grupos em relação ao número total de cruzamentos dos animais no campo aberto [F(3,36)=0,25; NS]. Tal resultado indica que a atividade locomotora não foi afetada pela infusão das diferentes doses de grelina no NDR.
FIGURA 6: Média ± EPM do número total de cruzamentos obtidos no teste do campo aberto em animais (N=37) após a infusão de diferentes doses de grelina no NDR.
28 - Experimento 2: Análise dos efeitos comportamentais obtidos no LTE com a infusão do antagonista GHS-R1a PF-04628935 no NDR.
A figura 7A mostra o efeito da injeção de doses diferentes do antagonista do receptor da grelina PF-04628935 no NDR de ratos sobre o comportamento de esquiva inibitória. Na ANOVA de medidas repetidas mostrou efeito significativo do fator tentativa [F(2,60)=47,43; p<0,05] indicando que houve aquisição da resposta de esquiva pelos animais ao longo das tentativas. No entanto, a ANOVA revelou que não houve efeito da administração intra-NDR de PF-04628935 sobre a resposta de esquiva [fator tratamento - F(1,30)=0,29; NS] nem interação entre os fatores tratamento e tentativa [F(6,60)=0,56; NS]. Os resultados obtidos no experimento 2 não demonstraram nenhum efeito da injeção do antagonista da grelina na esquiva inibitória.
Na figura 7B podemos observar o efeito das doses do antagonista do receptor da grelina PF-04628935 injetadas no NDR sobre o comportamento de fuga dos ratos. A ANOVA de medidas repetidas não revelou efeito significativo da infusão intra-NDR de PF-04628935 sobre a expressão da resposta de fuga [fator tratamento - F(1,30)=1,14; NS]. Adicionalmente, a ANOVA não mostrou alteração significativa nas latências de fuga ao longo das tentativas [fator tentativa - F(2,60)=1,14; NS] nem interação entre os fatores tratamento e tentativa [F(6,60)=1,09; NS] ou seja os resultados do experimento 2 não mostrou nenhum efeito significativo da injeção do antagonista na fuga
29 A
B
FIGURA 7: Média ± EPM do tempo gasto para a saída do braço fechado (esquiva inibitória, painel A) e de um dos braços abertos (fuga, painel B) de animais (N=34) submetidos ao labirinto em T elevado após a infusão de diversas doses do antagonista do receptor da grelina PF-04628935 no NDR. LB = linha de base.
30 A tabela 2 mostra o efeito da administração intra-NDR do antagonista de grelina PF-04628935 sobre o comportamento exploratório dos animais no campo aberto. A ANOVA de uma via não revelou efeito significativo deste procedimento sobre as variáveis analisadas no campo aberto.
Tabela 2: Média ± EPM do tempo e cruzamentos obtidos no teste do campo aberto em animais (N=34) após a infusão de diferentes doses de antagonista da grelina no NDR.
EXPERIMENTO 2
Cruzamentos - periferia Cruzamentos - centro
Salina 27,7 ± 3,2 0,9 ± 0,57
PF 0,06 33,25 ± 6,13 1,62 ± 0,86
PF 0,3 27,22 ± 3,95 1,44 ± 0,49
PF 0,6 27,5 ± 4,74 0,25 ± 0,23
Tempo - periferia Tempo - centro
Salina 292,29 ± 3,07 8 ± 1,46
PF 0,06 289,21 ± 3,8 19,33 ± 4,1
PF 0,3 290,86 ± 2,33 9,04 ± 2,34
31 A figura 8 mostra o número total de cruzamentos no campo aberto nos animais submetidos à infusão intra-NDR do antagonista de receptores de grelina PF-04628935. A análise estatística mostrou que não houve diferença significativa entre os grupos no número total de cruzamentos dos animais [F(3,34)=0,42; NS] indicando que a atividade locomotora não foi afetada pela injeção intra-NDR de PF-04628935.
FIGURA 8: Média ± EPM do número total de cruzamentos obtidos no teste do campo aberto em animais (N=34) após a infusão de diferentes doses do antagonista de grelina no NDR.
32 - Experimento 3: Bloqueio dos Ghr-R previamente à infusão de grelina nos neurônios do NDR.
Na figura 9A, podemos observar o efeito do bloqueio da sinalização da grelina no NDR de ratos sobre a aquisição da resposta de esquiva inibitória. A ANOVA de medidas repetidas mostrou um efeito significativo dos fatores tratamento [F(1,34)=4,00; p<0.05] e tentativa [F(2,68)=34,66;p<0,05]. A análise estatística empregada revelou ainda uma interação significativa entre os fatores tratamento e tentativa [F(6,68)= 3,64; p<0,05]. O teste de Tukey mostrou que houve uma diminuição significativa na latência de ESQUIVA2 (p<0,05) no grupo que recebeu a infusão de veículo seguida por administração de grelina (0,3 nmol) nos neurônios do NDR, quando comparado aos outros grupos testados (Veículo NDR/Salina NDR; 04628935 NDR/Salina NDR; PF-04628935 NDR/Grelina NDR). Os resultados obtidos mostraram a grelina prejudicando a esquiva inibitória corroborando com o exp. 1 e um bloqueio eficaz dos efeitos da grelina na esquiva com a injeção previa do antagonista da grelina.
A figura 9B mostra o efeito do bloqueio da sinalização de grelina no NDR dos ratos sobre a expressão da resposta de fuga. A ANOVA de medidas repetidas mostrou um efeito significativo do fator tratamento sobre a resposta de fuga [F(1,34)=5,30; p<0.05]. A análise estatística empregada não mostrou alteração significativa nas latências de fuga ao longo das tentativas [fator tentativa - F(2,68)=1,11; NS] nem interação entre os fatores tratamento e tentativa [F(6,68)=0,57; NS]. O teste de Tukey mostrou que houve uma redução significativa na latência de FUGA2 (p<0,05) no grupo que recebeu a infusão de veículo seguida por administração de grelina (0,3 nmol) nos neurônios do NDR, quando comparado aos outros grupos testados (Veículo NDR/Salina NDR; PF-04628935 NDR/Salina NDR; PF-04628935 NDR/Grelina NDR). Os resultados obtidos no experimento 3 mostraram a grelina facilitando fuga corroborando o exp. 1 e um bloqueio eficaz dos efeitos da grelina na fuga com a injeção previa do antagonista da grelina.
33 A
B
FIGURA 9: Média ± EPM do tempo gasto para a saída do braço fechado (esquiva inibitória, painel A) e de um dos braços abertos (fuga, painel B) de animais (N=38) submetidos ao labirinto em T elevado após o bloqueio do receptor da grelina no NDR. * p<0,05 quando comparado aos outros grupos testados em uma mesma tentativa (esquiva 2 e fuga 2). LB = linha de base.
34 A tabela 3 mostra os efeitos do bloqueio da grelina nos animais sobre o comportamento no campo aberto. A análise estatística mostrou que não houve diferença significativa entre os grupos no que diz respeito às variáveis comportamentais exploratórias analisadas no teste do campo aberto.
Tabela 3: Média ± EPM do tempo e cruzamentos obtidos no teste do campo aberto em animais (N=38) após o bloqueio da sinalização de grelina no NDR.
EXPERIMENTO 3
Cruzamentos - periferia Cruzamentos - centro
Veíc NDR/Sal NDR 33,56 ± 4,58 2,22 ± 0,43
Veíc NDR/Grel NDR 32,67 ± 4,40 2,44 ± 0,69
PF NDR/Sal NDR 38,70 ± 2,56 1,70 ± 0,42
PF NDR/Grel NDR 30,60 ± 4,74 1,20 ± 0,39
Tempo - periferia Tempo - centro
Veíc NDR/Sal NDR 287,94 ± 2,59 12,06 ± 2,59
Veíc NDR/Grel NDR 276,42 ± 4,48 18,59 ± 1,77
PF NDR/Sal NDR 287,72 ± 2,18 12,35 ± 2,23
35 A figura 10 mostra o número total de cruzamentos dos animais no campo aberto. A análise estatística mostrou que não houve diferença significativa entre os grupos no que diz respeito ao número total de cruzamentos dos animais [F(3,37) = 0,706 NS]. Este resultado indica que a atividade locomotora não foi alterada pelos procedimentos realizados nesta análise (infusão de grelina e de seu antagonista no NDR e bloqueio de Ghr-R previamente à infusão do peptídeo grelina).
FIGURA 10: Média ± EPM do número total de cruzamentos obtidos no teste do campo aberto no Experimento 3 (N=38).
36 A figura 11 representa um diagrama esquemático com os sítios de injeção intra-NDR dos animais testados nos Experimentos 1, 2 e 3.
A B C
Figura 11. A e B: Diagramas de secções coronais do encéfalo de ratos (Atlas de Paxinos e Watson, 1997) mostrando a localização dos sítios de injeção dentro (círculo) e fora (asterisco) do NDR nos animais de todos os grupos experimentais. (A) (AP = -7,80 mm (partindo de bregma); L = - 2,10 mm; P = -4,60 mm), (B) (AP = -8,00 mm (partindo de bregma); L = - 2,10 mm; P = - 4,60 mm) C: Fotomicrografia mostrando um sítio de injeção típico no NDR. O número de pontos apresentados em A e B é menor do que o número total de ratos devido a sobreposições dos sítios de injeção. Aq- Aqueduto, DMPAG- substancia cinzenta periaquedutal dorso medial, DLPAG- substancia cinzenta periaquedutal dorso lateral, LPAG- substancia cinzenta periaquedutal lateral, VLPAG- substancia cinzenta periaquedutal ventral lateral, DRD- núcleo dorsal da rafe-parte dorsal, DRVL- núcleo dorsal da rafe-parte ventral lateral, DRV- núcleo dorsal da rafe-parte ventral.
37 5. Discussão
O presente trabalho investigou a manipulação dos receptores de grelina no NDR na mediação de comportamentos defensivos expressos no modelo do LTE. Os resultados de nosso estudo mostram que a grelina altera a expressão de respostas defensivas de esquiva inibitória e fuga que têm sido associadas aos transtornos ansiedade generalizada e do pânico demonstrando um efeito ansiolítico e panicogênico. Tais alterações ocorrem por meio da ativação do receptor GHS-R1a que é o único identificado para a grelina até o presente momento mostrando o fato de que há o envolvimento do sistema de sinalização de grelina e de sua interação com o sistema de neurotransmissão serotoninérgico na modulação desses comportamentos defensivos.
No primeiro experimento, investigamos os efeitos da administração de diferentes doses de grelina no NDR de ratos sobre a expressão das duas respostas defensivas avaliadas no LTE, esquiva inibitória e fuga. Os dados mostraram que a administração de grelina na dose maior (0,3 nmol) alterou a expressão das duas respostas. O procedimento prejudicou a aquisição da esquiva inibitória, o animal saiu de forma mais rápida do braço fechado sugerindo um efeito do tipo ansiolítico, e facilitou a expressão da resposta de fuga, o animal saiu mais rápido do braço aberto indicando um efeito do tipo panicogênico. No campo aberto, a infusão intra-NDR da maior dose (0,3 nmol) de grelina promoveu um aumento na exploração do centro do aparato por meio de um aumento no número de cruzamentos nesta região, indicativo de efeito do tipo ansiolítico. É importante comentar que os efeitos obtidos no LTE não ocorrem devido a interferências do procedimento na atividade locomotora dos animais, pois não foram constatadas alterações significativas na distância total percorrida por esses animais no campo aberto.
Os efeitos ansiolíticos desse estudo corroboram estudos prévios da literatura, como o de Alvarez-crespo e colaboradores (2012) que observou os efeitos neurobiológicos da infusão de grelina na amígdala. Uma das análises experimentais deste estudo investigou os efeitos comportamentais obtidos no LCE e campo aberto com a injeção de grelina na amígdala de ratos Sprague-Dawley, sendo levada em consideração a alimentação disponível imediatamente antes do teste. Desta forma, ratos com livre acesso à
38 alimentação pelo período de 1 hora antes do teste não demostraram alteração na expressão de comportamentos relacionados à ansiedade, ao passo que os ratos que tiveram restrição à alimentação antes do teste apresentaram efeitos ansiolíticos. Desta forma, estes autores levantaram a hipótese de que o aumento de grelina causado pela fome causa uma resposta alimentar e dependendo da situação, por exemplo, em uma situação de tensão e perigo onde o alimento não está disponível com muita facilidade isso seria importante para a sobrevivência, pois a grelina atuaria diminuindo a intensidade dos comportamentos emocionais como a ansiedade que poderiam limitar o animal na sua busca por alimentos. Ainda neste contexto, Jensen e colaboradores (2016) fizeram um estudo com a injeção periférica de grelina em ratos testados no LCE e campo aberto; tal procedimento promoveu um efeito do tipo ansiolítico. Neste último estudo, os autores levaram em consideração o fato de que testes comportamentais muitas vezes promovem um estresse que influencia a expressão de respostas defensivas. Assim, estes autores se valeram do uso de um sistema que permite analisar uma série de parâmetros comportamentais relacionados à ansiedade e estresse, os quais são avaliados em um ambiente social e familiar. Os dados obtidos neste estudo mostraram que a grelina injetada (IP) tem efeito ansiolítico durante uma condição estressante aguda. Já os animais knockout do GHS–R1a para a sinalização de grelina exibiram respostas de ansiedade aumentadas, sugerindo que a deficiência do receptor de grelina (Ghr-R) está associada a efeitos semelhantes à ansiogênicos. Em conjunto, tais dados obtidos neste estudo evidenciam que a grelina promove efeitos ansiolíticos durante condições basais e estes efeitos protegem contra os efeitos adversos do estresse. (63)
Na literatura científica, há outros estudos mostrando efeitos ansiolíticos promovidos pela administração de grelina. Neste contexto, Lutter e colaboradores (2008) mostraram que um aumento nos níveis de grelina causado pela injeção subcutânea deste peptídeo ou por uma restrição de alimentos produziu uma resposta ansiolítica no LCE (um derivado do LTE) e antidepressiva no teste do nado forçado, nenhum desses efeitos foi observado em animais knockout do GHSR-1a. Neste mesmo estudo, os autores mostraram haver um aumento nos níveis de grelina no teste de estresse crônico por derrota social, ao passo que ratos knockout para o receptor da
39 grelina (GHS-R1a) apresentaram um aumento significativo na expressão de efeitos nocivos do estresse. Tomadas em conjunto, as evidências obtidas neste estudo indicam que a grelina promove respostas comportamentais ansiolíticas e antidepressivas de forma adaptativa contra sintomas relacionados a transtornos emocionais e estresse crônico.
Outro estudo mostrando um efeito ansiolítico promovido pela administração de grelina foi realizado por Spencer e colaboradores (2012). A partir de evidências sugerindo que a grelina evita a ansiedade excessiva em condições de estresse crônico, este grupo de pesquisa usou ratos knockout para o receptor de grelina (GHS-R1a) e selvagens testados em condições basais e em condições de estresse agudo no LCE, campo aberto e caixa claro/escuro para investigar a relevância da grelina endógena no estresse e na ansiedade. As evidências obtidas por este grupo de pesquisa mostraram que a grelina endógena pode diminuir a ansiedade em resposta ao estresse agudo modulando o eixo HPA. De acordo com os autores, o estado ansiolítico promovido pela grelina em resposta ao estresse aconteceria para manter uma homeostase energética. Outra possibilidade importante sugerida por Spencer e colaboradores (2012) é a de um papel duplo da grelina na ansiedade, uma vez que neste estudo foi mostrado que a grelina aumenta a ansiedade em condições basais, mas diminui a ansiedade após o estresse agudo.
Ainda neste contexto, no estudo realizado por Carvalho (2014) o autor investigou os efeitos comportamentais obtidos no LCE, campo aberto e caixa claro-escuro em duas situações: 10 ou 45 min após a administração (IP) de grelina. Os dados deste estudo revelaram uma diminuição da ansiedade nos testes comportamentais em ambas as situações, o que de certa forma contradiz análises prévias mostrando um efeito ansiogênico da grelina administrada 10 min antes da realização dos testes comportamentais (56, 70, 71). Em termos gerais, podemos observar que análises experimentais recentes trazem uma nova perspectiva ao envolvimento da grelina na modulação de respostas comportamentais associadas à ansiedade (64). Outro estudo mostrou que uma administração crônica de grelina (2 semanas) aliviou a ansiedade e depressão causada por um teste de estresse crônico nos testes de LCE, campo aberto e nado forçado (86). É importante aqui constatar que mesmo com variações metodológicas entre os diferentes trabalhos, os dados
