Cuiabá - MT 2014
UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO
FACULDADE DE AGRONOMIA, MEDICINA VETERINÁRIA E
ZOOTECNIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
DETECÇÃO DE Theileria equi E Babesia caballi E ANTICORPOS
ANTI-EHRLICHIA SPP. EM EQUÍDEOS DO PANTANAL
MATOGROSSENSE, BRASIL.
Cuiabá – MT 2014
DETECÇÃO DE Theileria equi E Babesia caballi E ANTICORPOS
ANTI-EHRLICHIA SPP. EM EQUÍDEOS DO PANTANAL
MATOGROSSENSE, BRASIL.
Autor (a): Elenice Marta de Barros Orientador Prof. Dr. Daniel Moura de Aguiar Co-Orientador Prof. Dr. Richard Campos Pacheco
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias, área de concentração: Medicina Veterinária, da Faculdade de Agronomia, Medicina Veterinária e Zootecnia, da Universidade Federal de Mato Grosso para a obtenção do título de Mestre em Ciências Veterinárias.
UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO
FACULDADE DE AGRONOMIA, MEDICINA VETERINÁRIA E
ZOOTECNIA
Dados Internacionais de Catalogação na Fonte.
B277d Barros, Elenice Marta de.
DETECÇÃO DE Theileria equi E Babesia caballi E ANTICORPOS ANTI-EHRLICHIA SPP. EM EQUÍDEOS DO PANTANAL MATOGROSSENSE, BRASIL. / Elenice Marta de Barros. -- 2014
49 f. ; 30 cm.
Orientador: Daniel Moura de Aguiar. Co-orientador: Richard Campos Pacheco.
Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Mato Grosso, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal, Cuiabá, 2014.
Inclui bibliografia.
1. carrapatos. 2. PCR. 3. IFAT. 4. cavalos. 5. muares. I. Título.
Ficha catalográfica elaborada automaticamente de acordo com os dados fornecidos pelo(a) autor(a).
FOLHA DE APROVAÇÃO
AUTOR (A): BARROS, Elenice Marta de.
TITULO: DETECÇÃO DE Theileria equi E Babesia caballi E ANTICORPOS
ANTI-EHRLICHIA SPP EM EQUÍDEOS DO PANTANAL
MATOGROSSENSE, BRASIL.
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias, da Universidade Federal de Mato Grosso para a obtenção do título de Mestre em Ciências Veterinárias.
Aprovada em 04 de Abril de 2014
BANCA EXAMINADORA
_________________________________________ Prof. Dr. Daniel Moura de Aguiar
_________________________________________ Profa. Dra. Carolina Pescador
_________________________________________ Profa. Dra. Michelle Igarashi
DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho a você minha alma, você que deu-me a vida, fez de mim o que hoje sou. Mãe, obrigada por confiar em mim, quando nem eu mesma confiei. Obrigada por me levantar de todas as vezes que cai. E mais uma vez obrigada por não me deixar desistir deste que era um dos meus sonhos. Te amo.
Agradecimento Especial
A você meu orientador quero agradecer de imenso coração, primeiramente por me aceitar como sua aluna de mestrado, pois ajudou a realizar um sonho, depois pela imensa ajuda e paciência que teve durante esta jornada, grata eternamente.
AGRADECIMENTO
Agradeço a Deus por sempre estar comigo, me fazendo acreditar que cada coisa vem a seu tempo.
Nestes dois anos de mestrado conheci muita gente, dos quais alguns se tornaram grandes amigos, que irei levar em meu coração eternamente.
Quero agradecer em especial Luana, minha mestre de extração de DNA, que me ensinou a realizar as extrações e as PCRs, que me fez acreditar que mesmo que eu não visse, ele estava ali. Pode acreditar dizia ela. E a partir daí comecei a acreditar que mesmo que você não veja, mesmo que você não sinta, está ali.
A você Isis, também por me ensinar nas extrações e PCRs, por me mostrar onde cada coisa do laboratório estava como cada coisa funcionava, por tantas vezes me ensinar a procurar artigos, por algumas noites acordada para me ajudar a escrever para os seminários, por tantas e tantas vezes me aconselhar a não desistir, por secar minhas lágrimas algumas dezenas de vezes, por várias gargalhadas que me alegraram e por vários momentos difíceis que passei durante essa etapa, por ser minha confidente, meu muito obrigado.
A Thaysa por ter me ajudado com as extrações, pois sem você não teria conseguido terminar a tempo, agradeço de coração.
A você Felipe também meu muito obrigado por ter me ajudado nesta reta final com as RIFIs.
A você Andréia por me receber tão carinhosamente no laboratório logo no primeiro dia, por ter paciência com minhas dúvidas, e muitíssimo obrigada por ter realizado a leitura das läminas de RIFI, grata, ah e também por ter nos apresentado a erliquinha, adorei conhecê-la antes de ter terminado o mestrado.
Vavá você me fazia rir demais, momentos de descontração para aliviar a tensão, Dirceu obrigada pelas palavras e conselhos de amigo naqueles momentos em que mais precisei.
Enfim a todos do laboratório, Thabata, Rute, Leticia, Rafael, Leodil, Cris, obrigada pela companhia e pelos almoços no RU.
Ao meu amigo professor Benedito Figueiredo, do Biotério da UFMT, que me incentivou muito a perseguir o meu sonho, e me deu todo seu apoio.
Aos meus amigos que não fazem parte nesta área de pesquisa em que gostamos de viver, que para eles é de outro mundo… segundo eles vivemos em outro plano, meu muito obrigado.
Minha família, mãe, irmã, filha, primos, primas,tios,tias que por algumas vezes simplesmente desaparecia, meu muito obrigado pela paciência e pela espera.
A minha amiga Rejane, que me fez e faz até hoje ver a vida e os problemas com outros olhos, por outros angulas e enxergar que minha grama é tão verde quanto a do vizinho, por muitas vezes fazer acreditar em mim, muito obrigada, Deus coloca pessoas especiais em nossa caminhada.
Ao meu chefe Dr. Luiz, pela imensa paciência por me deixar por esse tempo, realizar meu sonho e pela grande ajuda nas coletas dos materiais.
Ao meu amigo e agora companheiro, Duda, por essa longa jornada que passamos, temos história para contar, meu mais sincero agradecimento.
A você mãe mais uma vez obrigada, a você irmã Paty, por todas as vezes que você passou a frente do computador ajudando a fazer minhas apresentações, obrigada. A você prof. Richard, obrigada pelas orientações e contribuições nesta reta final. A todos os animais, por eu ter essa paixão por vocês e pela minha profissão. Aos equinos que foram coletados tanto pela Alice como pelo Luiz, obrigada. Ao CNPq, pelo fomento financeiro.
Todos vocês e alguns que não foram citados por nome, fazem parte desta conquista. Muito Obrigada!
Quero, um dia, dizer as pessoas que nada foi em vão….
Que o amor existe, que vale a pena se doar as amizades e as pessoas, que a vida é bela sim e que eu sempre dei o melhor de mim….
E que valeu a pena…
RESUMO
O presente estudo avaliou equídeos de 26 fazendas da região do pantanal matogrossense, sendo 122 equídeos testados pela Reação em Cadeia pela Polimerase (PCR) para detectar os genes de Babesia, Theileria, Anaplasma, Ehrlichia e Neorickettsia e 109 pela Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI) frente a antígenos de Ehrlichia canis. Das amostras testadas na PCR, 17 (14,0%) animais foram positivos. Das amostras positivas 16 foram 100% idênticas a sequencias de Theileria equi e uma foi 99% similar a sequência de Babesia caballi disponível no GenBank. Das 26 fazendas amostradas, 14 (53,8%) apresentaram equídeos positivos. Pela RIFI, 42 (38,5%) equídeos foram soropositivos para antígenos de Ehrlichia spp. sendo 27 amostras (64,3%) com títulos de 40 e 15 (35,7%) com títulos de 320. Das 25 fazendas do município de Poconé avaliadas, 18 (52,0%) apresentaram equídeos soropositivos. Os resultados do presente estudo demonstram que T. equi e B. caballi infectam equinos nos municípios de Poconé e Barra do Bugre e a presença de anticorpos anti-Ehrlichia spp. sugere a circulação entre os equídeos de espécies antigenicamente relacionadas aos gêneros Ehrlichia e Anaplasma, entretanto a negatividade nos exames de PCR pode indicar provável processo crônico desses agentes.
ABSTRACT
The present study evaluated equids from 26 ranches in the Pantanal region of Mato Grosso State. One hundred and twenty two equides were evaluated by means the Polimerase Chain Raction (PCR) to detect genes of Babesia, Theileria, Anaplasma, Ehrlichia and Neorickettsia and 109 were tested by means the Imunofluorescent Antibodie Test (IFAT) against Ehrlichia canis antigens. From the total tested in PCR, 17 (14.0%) equids were positive, and 16 yielded amplicons 100% identical to Theileria equi and one presented 99% of similarity to Babesia caballi available on GenBank. Positive equids were from 14 ranches (53.8%). Forty two (38.5%) equids were positive by IFAT and 27 showed titres of 40 (64.3%) and 15 showed titers of 320 (35.7%). From the total of 25 ranches evaluated in IFAT, 18 (52.0%) presented seropositive equids. Our results showed that T. equi and B. caballi are infecting equids in the municipalities of Poconé and Barra do Bugres and the presence of anti-Ehrlichia antibodies suggests that specie closed related to the genera anti-Ehrlichia and Anaplasma are circulating among the equid local population. Moreover, the negative results in PCR possible is related to the chronic infection phase.
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Tabela 1: Oligonucleotideos iniciadores usados em estudo de Ehrlichia spp., Anaplasma spp. Neorickettsia risticii e Babesia spp. em cavalos do pantanal. Cuiabá, MT. 2014 ... 244 Tabela 2. Tabela 2. Frequência de equinos e muares testados e positivos na Reação em Cadeia pela Polimerase (PCR) para Babesia spp. e Theileria spp. e Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI) para Ehrlichia spp. Cuiabá, MT. 2014 ... 266 Tabela 3. Frequência e número de animais testados e positivos pela Reação em Cadeia pela Polimerase (PCR) para Babesia spp. e Theileria spp. segundo a faixa etária (anos). Cuiabá, MT. 2014 ... 277 Tabela 4. Tabela 4. Frequência e número de animais testados e positivos pela Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI) para Ehrlichia spp. segundo a faixa etária (anos). Cuiabá, MT. 2014 ... 277
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ... 12
2. Revisão Bibliográfica ... 13
2.1. Piroplasmose equina ... 13
2.2. Anaplasma Phagocytophilum ou Anaplasma Granulocítica Equina ... 15
2.3. Ehrlichia spp ... 17 2.4. Neorickettsia risticii ... 19 3. OBJETIVO……….21 1 4. MATERIAIS E MÉTODOS 4.1. Animais ... 21
4.2. Reação em Cadeia pela Polimerase. ... 23
4.3. Purificação e Sequenciamento ... 24
4.4. Reação de Imunofluorescência Indireta para Ehrlichia spp. ... 24
4.5. Analise estatística ... 25
5. RESULTADOS ... 25
6. DISCUSSÃO ... 28
7. CONCLUSÃO ... 30
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1 INTRODUÇÃO
Os carrapatos são importantes vetores de patógenos para animais domésticos e silvestres (MASSARD & FONSECA, 2004). Na espécie eqüina os carrapatos Dermacentor nitens, Amblyomma cajennense e Rhipicephalus microplus são associados à transmissão dos protozoários Babesia caballi e Theileria equi, agentes etiológicos da piroplasmose eqüina (WISE et al., 2013). A piroplasmose se manifesta clinicamente desde uma forma aguda apresentando anemia hemolítica aguda, formação de trombos e coagulação intravascular disseminada seguida de morte, até uma forma crônica onde os animais apresentam sinais inespecíficos que incluem letargia, anorexia e perda de peso Em áreas endêmicas, equinos em fase crônica podem se tornar portadores inaparentes e servem como reservatório para transmitir os patógenos via carrapatos ou pelas vias transplacentária ou iatrogênica (CHHABRA et al., 2012, RIBEIRO et al., 2013). Dados soroepidemiológicos e a detecção direta de ambos agentes vêm sendo descritos com altas taxas de prevalência em diversas regiões do Brasil e do mundo
Além dos agentes supracitados, a família Anaplasmataceae agrupa importantes patógenos de equinos sendo alguns deles transmitidos por carrapatos (DUMLER et al., 2001). Ixodes scapularis são vetores de Anaplasma phagocytophilum, o agente etiológico da Erliquiose Granulocítica Equina (EGE). As manifestações clínicas da EGE incluem febre, apatia, anorexia, edemas e relutância em locomoção decorrente do envolvimento de artropatias Além do gênero Anaplasma, diferentes espécies do gênero Ehrlichia vem sendo observadas em animais domésticos e silvestres no Brasil, especialmente no pantanal mato-grossense, dentre eles a Ehrlichia canis e os genótipos Ehrlichia sp. cepa jaguar e Ehrlichia sp. cepa UFMT (WIDMER et al., 2009, MELO et al., 2011, ZILIANI et al., 2013).
Neorickettsia risticii agente etiológico da Erliquiose Monocítica Equina (EME) e também pertencente à família Anaplasmataceae, tem sido incriminado a quadros febris, depressão, anorexia, diarreia, cólica, laminite e aborto em cavalos na região sul do Brasil (PALMER,1993, DUTRA et al.,2001, COIMBRA et al., 2005). A transmissão da N. risticii não está envolvida com a presença de carrapatos, e sim com uma complexa cadeia epidemiológica envolvendo regiões úmidas ou alagadas,
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caramujos dos gêneros Heleobia e Juga, trematódeos dos gêneros Acanthatrium e Lecithodendrium, quirópteros e aves silvestres (SANTOS et al., 2013). Nota-se que alguns gêneros de caramujos são comuns nas diversas regiões do Brasil, inclusive no Pantanal mato-grossense (FELLERHOFF, 2002), tornando-o um ambiente propício para a ocorrência de N.risticii.
O objetivo deste estudo foi a avaliar a presença de anticorpos anti-Ehrlichia spp. pela Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI) em amostras de soro sanguíneo e presença de Anaplasma spp., N. risticii, Ehrlichia spp., Theileria spp. e Babesia spp. pela Reação em Cadeia pela Polimerase (PCR) em sangue de cavalos e muares do Pantanal mato-grossense.
2. Revisão Bibliográfica
2.1. Piroplasmose equina
Foi no final do século XIX, que Babes descobriu um microrganismo nos eritrócitos de bovinos na Romênia (BABES,1888). Mais tarde, também encontrados em ovelhas, organismos semelhantes em células vermelhas. Em 1893, cinco anos depois, o agente da febre do Texas de gado nos EUA foi nomeado como Pyrosoma bigemina por Smith e Kilborne, que mostraram que o agente seria transmitido por carrapatos (SMITH e KILBORNE, 1893). Este foi o primeiro relato da transmissão de um protozoário parasitando um artrópode. No mesmo ano, 1893, Starcovici deu nomes a estes parasitas, Babesia bovis, Babesia ovis e Babesia bigemina (STARCOVICI, 1983). Com o desuso do nome de Pyrosoma e alguns outros que vinham sendo sugeridos, mais o nome antigo Piroplasma ainda permanece, que vem originalmente da forma de pera que o parasita assume após a sua multiplicação.
As Babesias que parasitam equinos estão representadas por dois gêneros. O gênero Babesia pertence ao filo Apicomplexa e ordem Piroplasmidae e família Babesiidae. Baseado na presença extra-eritrocitária e também em células mononucleares sanguíneas, Babesia equi, foi reclassificada para a família
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Theileridae, designada desde então T. equi (MEHLHORN e SCHEIN 1998).
São parasitas intracelulares, que após a inoculação invadem os linfócitos nos quais se desenvolvem em macro e micro esquizontes, posteriormente originando-se em merozoitos os quais são novamente liberados na circulação onde parasitam os eritrócitos. Nos eritrócitos os parasitas se dividem em fusão binária, originando organismos piriformes, estruturas conhecidas como Cruz de Malta. (BRANDÃO e HAGIWARA, 2002; SÁ, 2007; PINTO,2009).
A piroplasmose equina, como também é conhecida a doença de equinos, é caracterizada por febre, anemia, icterícia, hepatoesplenomegalia, hemólise intravascular, hemoglobinúria em alguns casos morte, seu período de incubação de 7 a 30 dias, sua sintomatologia cursa entre aguda e crônica (SCHEIN, 1988). Apresenta distribuição mundial, sendo endêmica em áreas tropicais e subtropicais do mundo, bem como em zonas temperadas (SCHEIN, 1988; DE WAAL, 1992; BRUNING, 1996).
No Brasil a descrição da infecção por T. equi e B. caballi, vem sendo associada aos carrapatos D. nitens, A. cajennense e R. microplus. No entanto, somente o D. nitens e o R. microplus estão possivelmente envolvidos na transmissão desses protozoários no Brasil (BARBOSA et al., 1995; FALCE, 1999; HEUCHERT et al., 1999; LABRUNA et al., 2001; COSTA PEREIRA et al., 2005).
Nos vetores, B. caballi é transmitido por via transovariana podendo manter-se por até quatro gerações de tal forma que os carrapatos Dermacentor e Rhipicephalus permanecem como vetores da doença. Por outro lado, a transmissão de T.equi ocorre por transmissão transestadial, larva para ninfa e ninfa para a forma adulta. Também podendo ser transmitida iatrogenicamente e por materiais reutilizados entre os animais (TENTER e FRIEDHOFF, 1986).
A piroplasmose equina está diretamente relacionada à existência dos carrapatos vetores, onde estes adquirem a infecção em equinos infectados, ingerindo os merozoítos presentes na circulação proporcionando a continuidade do ciclo através da reprodução assexuada no intestino do carrapato e, posteriormente esporogoniza nas glândulas salivares (WISE et a., 2013).
Sendo assim animais portadores ficam são reservatórios, e representando riscos quando introduzidos em áreas livres da doença, por isso a detecção da doença tornou-se importante (RAMPERSAD et al., 2003). A piroplasmose equina causa grande impacto no comércio internacional, existindo restrições de importação
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para países livre da doença como Estados Unidos, Canadá, Japão, Austrália e Nova Zelândia (BRUNING, 1996).
Em animais levados ao stress sejam por treinamento, ou por transporte, pode ocorrer reagudização da infecção, principalmente em animais infectados cronicamente por T. equi (DE WAAL, 1992).
Para o diagnóstico da piroplasmose equina, tem sido desenvolvidas ferramentas de diagnóstico moleculares como pela Reação em Cadeia Polimerase (PCR), mostrando-se como útil na detecção da infecção em equinos. Os ensaios são baseados principalmente na sequência de RNA ribossomal 18S (CACCIO et al., 2000; NICOLAI EWSKY et al., 2001; HEIM et al., 2007; BALDANI et al., 2008; FRITZ, 2010). Por isso, este método de diagnóstico foi incorporado na rotina de diagnóstico, especialmente em associação com testes sorológicos, Reação de Imunofluorescência indireto (RIFI), Ensaio de Imunoadsorção Enzimática (ELISA).
Outra técnica que está disponível é a cultura in vitro do agente, que, embora confiável é uma técnica muito demorada para diagnostico de rotina (HOLMAN et al., 1997; BALDANI et al., 2008).
No tratamento desses animais infectados, estudos realizados por provas de PCR com 18 dias e com 6 semanas de tratamento com diproprionato de imidocarb (4,7 mg; kg em 72h sem cinco aplicações) mostrou que o tratamento foi ineficaz na tentativa de eliminar a infecção de cavalos (BRUNING, 1996). Como prevenção o mais indicado ainda é o controle dos carrapatos.
2.2. Anaplasma Phagocytophilum ou Anaplasmose Granulocítica Equina
Anaplasma phagocytophilum é uma bactéria gram negativa podendo ser, sua forma esferoide ou pleomórfica. Estão presentes no interior dos granulocitos sanguíneos (RIKIHISA, 1991; BJOERSDORFF et al., 2002). É classificada no gênero Anaplasma, e ordem Rickettsiales e agente etiológico da Anaplasmose Granulocítica Equina (AGE).
Baseada em estudos moleculares A. phagocytophilum inclui patógenos anteriormente designados Ehrlichia phagocytophila, Ehrlichia equi e agente da Erliquiose granulocítica humana (HGE) (DUMLER et al., 1995-2001).
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abrangentes. O primeiro caso de EGA em equinos foi descrito em 1969 na Califórnia, EUA (GRIBBLE, 1969; STANNARD et al., 1969). Na Alemanha foi somente diagnosticado em 1984 (BUSCHER et al., 1984), em 1985 na Suíça (HERMANN et al., 1985) em 1990 na Suécia (BJOERSDORFF et al., 1990).
A doença também tem sido relatada na Grã-Bretanha (KORBUTIAK e SCHNEIDERS, 1994), Dinamarca (ERIKSEN et al., 1997), Áustria (FROHLICH E EDELHOFER, 1998), República Checa (JAHN et al., 2010), Holanda (BUTLER et al., 2008), França (BERMANN et al., 2002), Itália (LILLINI et al., 2006) e na Polônia (ADSZEK et al., 2009). Além destes, dados bibliográficos relatam o aparecimento de anaplasmose equina na Ásia e África (MGHIRBI et al., 2012).
A. phagocytophilum e um patógeno emergente de equinos transmitido por carrapatos Ixodes spp., Dermacentor spp., Rhipicephalus spp., Hyalomma spp. e Haemaphysalis spp. Na Europa o principal vetor é o carrapato Ixodes ricinus (STUEN, 2007). Nas regiões endêmicas a doença geralmente vem associada com outras enfermidades como borreliose e piroplasmose (STANCZAK et al., 2004).
A transmissão no carrapato é transestadial, não ocorrendo a transovariana (BOWN et al., 2003; DUNNING e HOTOP et al., 2006) então para a doença ter continuidade é necessário ter animais infectados sejam eles domésticos, selvagens ou até mesmo roedores que são os reservatórios do agente na natureza (WAALS et al., 1997; NIETO e FOLEY, 2008, ADASZEK et al., 2012). A transmissão da doença do carrapato para o mamífero ocorre apenas quando carrapatos infectados alimentam se no hospedeiro susceptível entre 2 a 36hs (BAKKEN e DUMLER, 2008, ISMAIL et al., 2010).
O curso da AGE pode ser aguda ou subclínica. O período de incubação da forma aguda é de aproximadamente 10 dias (GRIBBLE, 1996; MANDIGAN, 1993; BARLOUGH et al., 1995). Os primeiros sinais e sintomas da doença são bem atípicos, inicialmente o animal infectado desenvolve apatia, enfraquecimento e aumento de temperatura corpórea, em seguida uma aversão a movimentos, marcha dura, edema, dores nas articulações do boleto e claudicação (ADASZEK et al., 2009; SILAGHI et al., 2011). Normalmente a doença cursa em animais acima de três anos de idade podendo persistir por 6 a 12 dias. Outros sintomas podem aparecer caso o animal não se recupere após tratamento. Febre, convulsão, sangramento nasal, aumento do baço e gânglios linfáticos, aumento da frequência cardíaca e respiratória e perda de peso foram relatados em casos crônicos.
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O diagnóstico de AGE é baseado na análise de dados a partir da anamnese, bem como resultados de testes laboratoriais. Como testes laboratoriais são utilizados esfregaço de sangue (SELLS et al., 1976, PUSTERLA et al., 1998) e PCR, sendo este cada vez mais aplicado (MADIGAN et al., 1996; ADASZEK et al., 2009, 2013).
Quanto ao tratamento o grupo de antibióticos usualmente utilizado em casos de anaplasmose são as tetraciclinas, na dose 8mg kg por sete dias associado com dexametasona na dose 20mg/ kg por três dias (MADIGAN, 1993; MAURIN et al., 2003).
2.3. Ehrlichia spp.
As erliquias pertencem a ordem Rickettsiales e família Anaplasmataceae. Atualmente, o gênero Ehrlichia é composto por seis espécies: E. canis, E. chaffeensis, E. ewingii, E. muris, E. ruminantium (DUMLER et al., 2001) e Ehrlichia IOE (Ixodes ovatus Ehrlichia) (SHIBATA et al., 2000). Estes organismos são pequenos (0,5 a 1,5 mm), gram-negativos, pleomórficos, que residem e replicam em vacúolos das células eucarióticas. As erliquias são parasitas intracelulares obrigatórios de diversas células hematopoiéticas animais, tais como monócitos, macrófagos, neutrófilos e células endoteliais (DUMLER et al., 2001). E. canis, E. chaffeensis e E. ewingii parasitam leucócitos de mamíferos, onde se multiplicam e através da ligação com a membrana lisossomal e formam as colônias intracitoplasmáticas denominadas mórulas.
Todas as espécies do gênero são transmitidas por carrapatos e três espécies de Ehrlichia (E. chaffeensis, E. ewingii e E. canis) causam doença em cães. Assim, os caninos podem contribuir para a transmissão desses patógenos para o homem (MURPHY et al., 1998).
Após infectar o carrapato, a bactéria se multiplica no intestino e nas glândulas salivares de onde será inoculada no individuo no momento de seu repasto sanguíneo (GROVES et al., 1975). No caso da E. canis, a transmissão da bactéria do carrapato para cães susceptíveis pode ser realizada em até 155 dias após a infecção do carrapato. Não há transmissão transovariana, por isso ninfas não podem
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transmitir a infecção. As erliquias são transmitidas transestadialmente e por isso as fases de ninfa e adultos do vetor transmitem a bactéria. Outra importante forma de transmissão é a transfusão sanguínea (LEWIS et al., 1977).
Os seres humanos são hospedeiros acidentais, que se tornam infectados após a picada do carrapato (fase de ninfa ou adulto). Machos adultos infectados podem transmitir a bactéria a diferentes cães de um mesmo lugar, desde que não haja a presença de fêmeas de carrapatos (BREMER et al., 2005; STICH et al., 2008).
As doenças causadas por esses patógenos já foram tradicionalmente categorizadas pelos tipos celulares que parasitam. Por exemplo, E. chaffeensis e E. canis parasitam principalmente em monócitos e a doença causada por esses agentes é frequentemente chamada erliquiose monocítica (ou monocitotrópica). E. ewingii parasita principalmente granulócitos e a doença causada por esse agente é frequentemente designada erliquiose granulocítica (ou granulocitotrópica). No entanto, algumas espécies de Ehrlichia e Anaplasma já foram encontradas em outras células. Além disso, mais de um gênero ou espécie pode ser responsável pela erliquiose monocítica e granulocítica. Assim, o sistema de classificação tradicional baseado nas células invadidas, não pode ser considerado como um caráter descritivo definitivo dessas doenças (MCQUISTON et al.,2003).
Estas doenças são consideradas emergentes, pois foram descritas nos últimos 20 anos e o número de casos vêm crescendo continuamente nas últimas duas décadas, devido a melhorias nas técnicas de diagnóstico empregadas e programas de vigilância (DOUDIER et al., 2010).
Recentemente no Brasil, Cabezas-cruz et al. (2013) relataram o isolamento
in vitro e caracterização molecular de uma nova espécie de Ehrlichia (Ehrlichia mineirensis) a partir da hemolinfa de R. microplus. Este isolado apresenta
características ultra-estruturais semelhantes aos demais membros do gênero
Ehrlichia (E. muris, E. canis e E. chaffeensis). Ziliani et al. (2013), relatou pela primeira vez nos municípios de Poconé, Santo Antônio de Leverger, Cáceres e Nossa Senhora do Livramento em Mato Grosso, uma espécie de erliquia idêntica a E. mineirensis cepa UFMG, infectando bovinos da região.
Anteriormente, E. canis foi isolada em cães, (AGUIAR et al., 2008), cujo principal vetor é o carrapato R. sanguineus (KEEFE et al., 1982; LABRUNA e PEREIRA, 2001). Outras espécies como E. chaffeensis, e E. ewingii já foram
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relatadas no país através de detecção molecular em cervos do pantanal e cães, respectivamente (MACHADO et al., 2006; OLIVEIRA et al., 2009). Além disso, foi descrita a presença de anticorpos anti-E. canis em onças-pintadas do Pantanal de Mato Grosso do Sul, bem como a detecção molecular de uma possível nova espécie de Ehrlichia spp. em carrapatos A. cajennense e A. triste que parasitavam estes carnívoros, cujo sequenciamento apontou 98% de similaridade com E. ruminantium (WIDMER, 2011). Também foram relatadas espécie de Ehrlichia em cervídeos do pantanal (Blastocerus dichotomus) relacionada a E. chaffeensis (MACHADO, et al., 2006).
2.4. Neorickettsia risticii
A Erliquiose Monocítica Equina (EME) é considerada uma doença infecciosa não contagiosa, conhecida como Febre do Rio Potomac, sendo denominada assim por ter sido detectada pela primeira vez em 1979 no Estado de Maryland, Estados Unidos, em cavalos ao longo do rio Potomac (RIKIHISA E PERRY, 1985). Posteriormente, evidências sorológicas da EME foram descritas no Canadá, França, Itália, Venezuela, Índia e Austrália (PALMER et al., 1986; BREIDER & HENTON, 1987; RIKIHISA, 1998).
A EME é causada pela N. risticii (anteriormente Ehrlichia risticii), bactéria Gram negativa, parasita intracelular obrigatória, a qual pertence à família Anaplasmataceae (DUMLER et al, 2011). A infecção pela N. risticii ocorre nas células monocítica dos equídeos, sendo transmitida via oral e veiculada por trematódeos aquáticos no momento em que os animais alimentam-se próximos aos banhados (HOLLAND et al., 1985; BARLOUGH et al., 1998; PUSTERLA et al., 2000).
Nos Estados Unidos, a enfermidade é reconhecida em 34 estados, (PALMER et al., 1986; BREIDER & HENTON, 1987). No Brasil, casos compatíveis com EME foram identificados no Rio Grande do Sul (COIMBRA et al., 1999). Em seguida, relatos de infecção baseados em testes moleculares e sorológicos foram realizados em animais sintomáticos de propriedades que fazem fronteira com o lago Mern e no município de Arroio Grande, Rio Grande do Sul (DUTRA et al., 2001; COIMBRA et al., 2006).
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A N. risticii é encontrada na natureza em ecossistema aquático complexo, uma extensa variedade de hospedeiros intermediários foi encontrada para os trematódeos, que são reservatórios da N. risticii. Um estudo realizado no Norte da Califórnia por BARLOUGH et al. (1998), caramujos operculados da família Pleuroceridae e gênero Juga, coletados em regiões de ocorrência de EME, foram indicados como vetores de trematódeos portadores de N. risticii.
Os estágios do trematódeo foram coletados, caracterizados como cercarias virguladas e testados por PCR, demonstrando a presença de DNA de N. risticii. No Estado de Ohio, Estados Unidos, foram encontrados caramujos Elimia livescens com presença de trematódeos identificada como Xhiphidio cercarias virguladas contendo N. risticii (KANTER et al., 2000).
No Brasil, COIMBRA et al. (2006), afirmou que a N. risticii é veiculada por caramujos do gênero Heleobia presentes em canais de irrigação de rios da região costeira da lagoa Mirim e em trematódeos na fase de esporocisto, rédeas e cercarias.
Insetos aquáticos, incluindo os voadores, podem desempenhar importante papel na epidemiologia da EME, tais como Trichoptera, Ephemeroptera, Odonata, Zygoptera e Plecoptera (CHAE et al., 2000). Estudos experimentais revelam que a EME também pode ser transmitida através de transfusão sanguínea, subcutânea e intradérmica (HOLLAND et al., 1985; DUTTA et al., 1988; PALMER & BENSON, 1988)
Todos os equinos são susceptíveis a infecção sendo que animais transportados para áreas endêmicas são mais susceptíveis a infecções severas que aqueles nascidos em áreas alagadas (ATWIIL et al., 1992, DUTRA et al., 2001). A doença é caracterizada por febre, depressão, anorexia, diarreia, desidratação, letargia, leucopenia, e em alguns casos, cólica, edema, laminite e abortos. As taxas de mortalidade em casos confirmados podem variar de 5 a 30% (PALMER, 1993). Cicuttin et al (2013) relataram a primeira deteção molecular de N. risticii em órgãos internos de morcegos insetívoro (Tadarida brasiliensis) na Argentina, associando essa espécie como reservatórios destes patógenos. No Brasil, surtos espontâneos de EME já foram descritos na região sul. Santos et al (2013), através da ausência de detecção molecular em aves e morcegos, sugeriram que estes animais não devem estar relacionados a manutenção e transmissão desses agentes para os equinos da região do Pantanal. Anteriormente, Machado et al. (2012) relataram também a
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ausência de DNA de N. risticii em amostras de sangue de aves de diversas partes do Brasil, inclusive do Pantanal mato-grossense.
3.OBJETIVO
O objetivo deste estudo foi a avaliar a presença de anticorpos anti-Ehrlichia spp. pela Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI) em amostras de soro e sangue total e presença de Anaplasma spp., N. risticii, Ehrlichia spp., Theileria spp.e Babesia spp. pela Reação em Cadeia pela Polimerase (PCR) em sangue de cavalos e muares do Pantanal mato-grossense.
4. MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 Animais
Foram avaliadas amostras de soro sanguíneo e sangue total de 220 equídeos de dois municípios pertencentes à bacia do rio Paraguai, que são Poconé e Barra do Bugre, localizados na região sudoeste mato-grossense. O município de Poconé (16°15’12’’ Sul 56°22’12’’ oeste; figura 01) está inserido no ecossistema do pantanal mato-grossense e foi contemplado com 180 eqüídeos (148 equinos e 32 muares) provenientes de 25 propriedades rurais coletados entre janeiro a julho de 2010. O município de Barra do Bugre (15º04’21’’ Sul e 57º10’52’’ Oeste) está inserido em zona de transição dos biomas amazônicos e cerrado e foi contemplado com 40 amostras de equinos de uma propriedade rural visitada em outubro de 2011. Como as fazendas estudadas estão inseridas no complexo pantanal/ bacia do alto paraguai, a variável inundação foi avaliada entre as propriedades, desta forma 14 (54%) estavam inseridas em áreas alagáveis e 12 (46%) em áreas que não sofrem inundações.
Dentre os 220 animais avaliados, as amostras foram divididas em dois grupos: o primeiro (grupo PCR) grupo contou com 122 (82 de Poconé e 40 de Barra
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do Bugre) amostras de sangue total que foram testadas pela PCR para avaliar a presença de DNA circulante de Babesia spp, Theileria spp, Anaplasma spp, Ehrlichia spp e N. risticii. O segundo grupo foi composto por 109 (grupo RIFI) amostras de soro que foram analisados por RIFI para a pesquisa de anticorpos anti-Ehrlichia spp. Do total de animais testados, de 11 foram obtidos amostras de sangue e soro e foram testadas para ambas as reações.
Figura 1: Propriedades participantes do estudo referente à detecção de Babesia spp., Theileria spp., e de anticorpos anti-Ehrlichia spp. em equídeos do município de Poconé, MT. Cuiabá, MT. 2014
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4.2 Reação em Cadeia pela Polimerase.
As amostras de sangue foram submetidas a protocolo de extração de DNA genômico com kit comercial (Wizard Genomic DNA Purification Kit, Promega), seguindo as instruções do fabricante. As amostras foram testadas individualmente para Babesia spp., Ehrlichia spp., Anaplasma spp. e N. risticii segundo Almeida et al. (2013), Massung et al. (1998) e Chae et al. (2003) respectivamente. Com exceção da reação para detectar DNA dos gêneros Babesia/Theileria, as outras reações consistiam em nestedPCR. Os respectivos oligonucleotídeos iniciadores e o tamanho do produto amplificado estão apresentados na Tabela 1.Todos os produtos obtidos nas reações foram submetidos a eletroforese em gel de agarose 1,5% corado em brometo de etidio, e tampão TEB 1X de corrida de ph 8,0 a 110v, 50mA com visualização subsequente com luz ultravioleta (UV) em câmara escura. A fim de evitar contaminações, a extração de DNA, a amplificação da PCR e eletroforese foram realizadas em salas separadas. O DNA de cepa São Paulo de E. canis, A. Platys e B. canis oriundos de cães naturalmente infectados (Spolidorio et al., 2011; Witter et al., 2013) e a cepa Illinois de N. risticii (gentilmente cedida por R.Z. Machado da UNESP campus Jaboticabal, SP) foram utilizadas como controle positivo em todas as reações.
4.3. Purificação e Sequenciamento
As amostras que apresentaram fragmentos amplificados de mesmo tamanho desejado foram selecionadas para o seqüenciamento. O material amplificado foi purificado usando o kit Illustra GFX PCR DNA and Gel Band Purification (GE Healthcare Bio-Sciences) segundo instruções do fabricante e em seguida, submetidos ao seqüenciamento genético (ACTGene Análises Moleculares, Alvorada-RS) utilizando Big Dye Kit (Applied Biosystems), de acordo com as instruções do fabricante, em seqüenciador automático (ABI PRISM-3100 Genetic Analyzer). As seqüências obtidas foram editadas no software BioEdit (Ibis Biosciences, Carlsband, CA.) e posteriormente, a similaridade foi analisada através do programa Basic Local Alignment Search Tool (BLAST two sequences analysis) (Altschul et al.,1990) a fim
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de verificar a identidade com demais seqüências correspondentes disponíveis no GenBank.
Tabela 1: Oligonucleotideos iniciadores usados em estudo de Ehrlichia spp., Anaplasma spp. Neorickettsia risticii e Babesia spp. em cavalos do pantanal. Cuiabá, MT. 2014
Patógenos Primer* Sequencia(5’ - 3’) Pares de bases Referencias Ehrlichia spp. dsb 330 (1a) dsb 720 (1a,2 a ) dsb 380 (2a) GATGATGTTTGAAGATATSAAACAAAT CTATTTTACTTCTTAAAGTTGATAWATC ATTTTTAGRGATTTTCCAATACTTGG 349 ALMEIDA et al., 2013 Anaplasma spp gE3a (1a) gE10R (1a) gE2 (2a) gE9F (2a) CACATGCAAGTCGAACGGATTATTC TTCCGTTAAGAAGGATCTAATCTCC GGCAGTATTAAAAGCAGCTCCAGG AACGGATTATTCTTTATAGCTTGCT 360 MASSUNG, et al. 1998 Neorickettsia risticii ER3(1a) ER2(1a) ER3a (2a) ER2a (2a) ATTTGAGAGTTTGATCCTGG GTTTTAAATGCAGTTCTTGG CTAGCGGTAGGCTTAAC CACACCTAACTTACGGG 529 CHAE, et al, 2003 Babesia spp Theileriaspp BAB 143-167 BAB 694-667 CCGTGCTAATTGTAGGGCTAATACA GCTTGAAACACTCTARTTTTCTCAAAG 551 SPOLIDORIO et al., 2011 *1a = primeira reação (PCR), 2a = segunda reação (nPCR).
4.4 Reação de Imunofluorescência Indireta para Ehrlichia spp.
Amostras de soro foram testadas pela Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI) a partir antígenos da cepa Cuiabá #16 de E. canis cultivadas em células DH82 (Aguiar et al., 2007). Os soros foram testados nas diluições de 1:40 até 1:5120 em PBS (pH 7,2), e aplicadas em lâminas contendo antígeno previamente fixado. Em cada lâmina foram incluídos soros controles não reativo (controle negativo) e reativo (controle positivo gentilmente cedido por R. Vieira). Após aplicação das amostras, as lâminas foram incubadas por 30 minutos, a 37ºC, em câmara úmida, seguida por lavagem em solução salina tamponada - PBS (pH 7,2). Depois da secagem em temperatura ambiente, foi adicionado conjugado anti-IgG de equino (Sigma® Diagnostics, St. Louis, Mo) com diluição de 1:1000. As lâminas
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foram novamente incubadas a 37ºC, por 30 minutos, em câmara úmida, lavadas em PBS (pH 7,2) por 10 minutos e submetidas a secagem. Posteriormente, adicionou-se glicerina (pH 8,5) nas lâminas para então, serem examinadas em microscópio (objetiva de 40x) e epifluorescência.
4.5 Analise estatística
Os resultados foram analisados pelo teste do Qui-quadrado ou Exato de Fisher e as variáveis sexo, idade, espécie animal e localização da fazenda (áreas alagáveis e não alagáveis) foram comparados. Considerou-se como significante o valor de P ≤ 0,05.
5. RESULTADOS
O grupo da amostras testadas pela PCR (n=122) foi composto por 99 machos (81,14%) e 23 fêmeas (18,59%). Em relação à faixa etária 22 equídeos tinham até 4 anos (3,27%), 83 animais eram acima de 4 até 8 anos (68,0%), 15 estavam acima de 8 até 12 anos (12,3%), e dois equídeos tinham mais de 12 anos (1,64%). Dos animais, 29 eram muares (23,7%) e 93 (76,3%) eram equinos. Nenhuma amostra foi positiva na PCR para Anaplasma spp., Ehrlichia spp., e N. risticii. Para Babesia spp. 17 (14,0%) equídeos foram positivos (Tabela 2) e após sequenciamento dos produtos amplificados, uma amostra de equino do município de Poconé apresentou 99% similar à sequência de B. caballi (GenBank AB734392) enquanto amostras de 14 equinos e dois muares apresentaram-se idênticos (100%) entre si e com a sequência de T. equi disponível no Genbank (JX049129). As duas sequencias geradas no presente estudo foram depositadas no GenBank sob os números de acesso KJ549665 (B. caballi) e KJ549664 (T. equi). A positividade quando comparada por espécie animal (equino x muar) não apresentou diferença estatística (P > 0,05). Das 26 fazendas, 14 (53.8%) apresentaram pelo menos um animal positivo sendo sete (63,6%) em áreas inundáveis e seis (42,8%) de áreas não inundáveis (P > 0,05). A fazenda do município de Barra do Bugre apresentou dois animais positivos. Em relação a faixa etária, os resultados estão apresentados
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na Tabela 3. Entre os positivos, a amostra positiva para B. caballi foi de um equino macho de quatro anos de idade. Segundo o sexo, 14 (82,3%) animais eram machos e três eram fêmeas (17,7%) (P > 0,05).
O grupo de amostras testadas pela RIFI foi composto por 94 (86,2%) machos e 15 fêmeas (13,7%). Em relação à faixa etária 15 equídeos eram da faixa etária de até 4 anos (13,7%), 69 animais acima de 4 até 8 anos (63,3%), 17 estavam acima de 8 até 12 anos (15,6%), e dois equídeos tinham mais de 8 anos (1,83%). Dos animais, 06 eram muares (5,5%) e 103 (94,5%) eram equinos. Quarenta e dois animais (38,5%) (Tabela 2) foram positivos na RIFI com títulos de 40 (27 amostras; 64,3%) e 320 (15 amostras; 35,7%). Das 25 fazendas do município de Poconé, 18 (52.0%) apresentaram pelo menos um animal positivo sendo 10 (71,4%) em áreas inundáveis e oito (72,7%) de áreas não inundáveis (P > 0,05). Em relação a faixa etária, os resultados estão apresentados na Tabela 4. Segundo o sexo, dos animais positivos para o 36 (38,2%) animais eram machos e seis eram fêmeas (40,0%) (P > 0,05).
Tabela 2. Frequência de equinos e muares testados e positivos na Reação em Cadeia pela Polimerase (PCR) para Babesia spp. e Theileria spp. e Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI) para Ehrlichia spp. Cuiabá, MT. 2014
Animais Testados Babesia PCR % Equinos 93 15 16,3* Muares 29 2 6,9* Total 122 17 14,0 Testados Ehrlichia RIFI % Equinos 103 40 38,9* Muares 6 2 33,3* Total 109 42 38,5 * P > 0,05;
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Tabela 3. Frequência e número de animais testados e positivos pela Reação em Cadeia pela Polimerase (PCR) para Babesia spp. e Theileria spp. segundo a faixa etária (anos). Cuiabá, MT. 2014
Faixa etária (ano)
Número de animais Testados Positivos %* 0 a 4 22 3 13,6 >4 a 8 83 12 14,4 > 8 a 12 15 2 13,3 >12 2 0 0 * P > 0,05
Tabela 4. Frequência e número de animais testados e positivos pela Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI) para Ehrlichia spp. segundo a faixa etária (anos). Cuiabá, MT. 2014
Faixa etária (ano)
Número de animais Testados Positivos %* 0 a 4 15 6 40,0 >4 a 8 69 31 45,0 > 8 a 12 17 3 17,6 >12 8 2 25,0 * P > 0,05.
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6. DISCUSSÃO
O presente estudo relata pela primeira vez a detecção e ocorrência da infecção por B. caballi e T. equi em equídeos do Pantanal Mato-grossense. A PCR tem sido frequentemente utilizada na investigação e diagnóstico da piroplasmose equina (MONIS et al., 2005), inclusive em qualquer fase da infecção, seja ela aguda ou crônica da doença (POSNETT e AMBROSIO, 1991).
Os resultados reforçam estudos anteriores que consideram enzoótica a ocorrência desses parasitos em várias regiões do Brasil (BARBOSA et al., 1995, BITTENCOURT et al., 1997, KERBER et al., 1999, RIBEIRO et al., 1999, XUAN et al., 2001, BOTTEON et al., 2002, BALDANI et al., 2010, HEIM et al., 2007). Das propriedades avaliadas 53,8% apresentaram pelo menos um animal positivo, ou seja, mais da metade das fazendas, representados por 14% da população animal. T. equi e B. caballi tem sido relatado em outros estados do Brasil como São Paulo, Mato Grosso, Minas Gerais e Goiás (BATTSETSEG et al., 2002, HEIM et al., 2007, KERBER et al., 2009, BALDANI et al., 2010, SALVAGNI et al., 2010). Além disso, a maior frequência de T. equi observada no presente estudo quando comparado a B. caballi são similares a resultados de outros autores (HEUCHERT et al., 1999, KERBER et al., 1999).
Por outro lado, dados de soroprevalência para piroplasmose equina no estado de São Paulo demonstraram maior ocorrência da B. caballi, quando comparado a T. equi (KERBER et al., 2009). Neste mesmo trabalho, Kerber et al. (2009) associaram a presença de anticorpos anti-B. caballi com o parasitismo por D. nitens, enquanto anticorpos anti-T. equi foram associados com parasitismo por A. cajennense. Não foi objetivo do presente estudo identificar as espécies de carrapatos em fase de parasitismo nos animais, muito embora os gêneros Dermacentor e Amblyomma são frequentemente observados nos equinos da região (dados não apresentados).
Não houve reações positivas para N. risticii. A enfermidade é reconhecida em vários países. Nestes trabalhos, os animais detectados com o agente, apresentavam-se sintomáticos, provavelmente passando por curso agudo da doença (DUTRA et al.,2001; COIMBRA et al., 2006). Nas amostras do presente estudo nenhum animal apresentava-se doente no momento da coleta.
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N. risticii tem sido detectado por meios moleculares em caramujo do gênero Heleobia no Rio Grande do Sul (municípios de Arroio Grande e Rio Grande), onde foram diagnosticados três equinos também pela PCR. Por outro lado, caramujos do gênero Pomacea testados no mesmo local resultaram negativos. Este gênero de caramujo é relatado na planície do Pantanal (FELLERHOFF, 2002) e concorda com os resultados relatados por Machado et al., (2012) e Santos et al., (2013) que avaliando amostras de sangue de diferentes espécies de aves e morcegos no pantanal falharam em detectar a presença de DNA de N. risticii, pondo em dúvida a circulação deste patógeno na região, mesmo com a presença de outros potenciais hospedeiros do agente.
Anaplasma spp. e Ehrlichia spp. não foram detectados nas amostras testadas pela PCR. Ao contrário de N. risticii, espécies filogeneticamente próxima ou idêntica a A. phagocytophilum já fora detectado em cães, cervídeos e aves no Brasil (SANTOS et al., 2011; MACHADO et al., 2012; SANTOS et al., 2013). Entretanto não há disponível na literatura consultada relatos de infecção natural ou detecção de DNA erliquial em equinos, mesmo considerando os estudos anteriores a 2001, quando Dumler et al. (2001) reorganizaram a família Anaplasmataceae e as espécies do genogrupo das erliquias granulocíticas (E. equi, E. phagocitophila e Ehrlichia Granulocítica Humana) foram transferidas ao gênero Anaplasma.
Além dos métodos moleculares, a presença de anticorpos contra antígenos de A. phagocytophilum também já fora relatado em equinos da região centro oeste do Brasil (SALVAGNI et al., 2010). No presente estudo, 109 amostras de soro foram testadas pela RIFI utilizando como antígeno, um isolado de E. canis e 38% dos animais foram reagentes. Considerando os resultados negativos na PCR para Anaplasma, Ehrlichia e N. risticii, a presença de anticorpos sugere infecção anterior por qualquer um dos agentes supracitados uma vez que há reatividade cruzada entre ambos quando utilizada a RIFI com antígenos brutos de Ehrlichia (SHANKARAPPA et al., 1992). Neste estudo, os equinos apresentaram baixos títulos de anticorpos (40 e 320) que sugere início de infecção ou mesmo infecção tardia. Segundo Artursson et al. (1999) equinos naturalmente infectados por A. phagocytophilum apresentam queda nos títulos séricos de anticorpos após oito meses da fase aguda da infecção.
A presença de anticorpos anti-Ehrlichia em equinos já foi observado por Vieira et al. (2013) no estado do Paraná, entretanto seus resultados corroboram com
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os do presente estudo, e as reações apenas sugerem infecção passada frente a diferentes espécies da família Anaplasmataceae. Pelo menos três espécies de Ehrlichia circulam na região de estudo. E. canis foi relatada infectando cães das fazendas e também na área urbana de Poconé (SANTOS et al., 2013), além de duas espécies envolvendo onças de vida livre (Ehrlichia sp. cepa Jaguar) e bovinos (Ehrlichia sp. cepa UFMT) (WIDMER et al. 2011, ZILIANI et al., 2013).
A idade, o sexo dos animais e a localização das fazendas não foram associados à presença de equinos positivos pela PCR para T. equi e B. caballi, bem como a presença de anticorpos anti-Ehrlichia, significando que os agentes pesquisados não possuem predileção por essas variáveis, e o risco de infecção parece mesmo estar envolvido com a presença do vetor. As infecções estão diretamente relacionada à presença do carrapato vetor e a dinâmica de sua população, que são diretamente influenciada pelas condições climáticas.
7. CONCLUSÃO
A partir dos resultados do presente estudo concluímos que os protozoários T. equi e B. caballi infectam equinos da região do pantanal mato-grossense, nos municípios de Poconé e Barra do Bugre. A infecção por T. equi apresenta-se disseminada entre as fazendas avaliadas. A presença de anticorpos anti-Ehrlichia spp. sugere a circulação entre os eqüídeos de espécies antigenicamente relacionadas, como as pertencentes aos gêneros Ehrlichia e Anaplasma, entretanto a negatividade nos exames de PCR pode indicar provável processo crônico desses agentes.
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