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2 O grupo de E. coli verotoxigênica (VTEC) produtora de verotoxinas (VTs), toxinas citotóxicas para células Vero (células epiteliais renais de

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1. INTRODUÇÃO

Os microrganismos têm grande importância na saúde humana ou animal, como componentes da microbiota, uma vez que podem beneficiar o hospedeiro realizando antibiose, produzindo vitaminas ou mesmo substâncias antagônicas, as quais controlam o crescimento de outros microrganismos. Possuem um papel importante no meio ambiente, através da manutenção do equilíbrio entre os seres vivos e os compostos químicos, na produção de alimentos, de produtos industriais ou mesmo de medicamentos. Embora menos de 1% dos microrganismos causem doença, é importante que se conheçam os fatores que determinam sua patogenicidade e como estes agentes infecciosos são transmitidos.

Dentre os diversos agentes patogênicos, Escherichia coli é um dos bacilos Gram-negativos pertencentes à família Enterobacteriacea encontrado compondo a microbiota intestinal humana e animal. Este microrganismo coloniza o trato intestinal do hospedeiro já a partir das primeiras horas de vida e, em seguida, estabelece uma relação de simbiose com o hospedeiro permanecendo confinado ao intestino grosso. Entretanto, em indivíduos debilitados, imunossuprimidos ou ainda, quando as barreiras gastrintestinais são vencidas, mesmo as cepas de E.

coli consideradas não patogênicas, são responsáveis por um espectro amplo de

infecções tanto em humanos quanto em animais (Paton & Paton,1998).

As infecções causadas por E. coli podem ser limitadas à superfície da mucosa intestinal ou se disseminar pelo organismo do hospedeiro. Três síndromes clínicas resultam da infecção causada por E. coli patogênica: infecções do trato urinário, septicemias seguidas de meningites e gastrenterites (Trabulsi, 2004).

As diversas classes de E. coli envolvidas em diarréia são identificadas e classificadas com base em seus fatores de patogenicidade. Este gênero bacteriano inclui cepas toxigênicas como E. coli enterotoxigênica (ETEC) e E.

coli verotoxigênica (VTEC), cepas invasoras como E. coli enteroinvasora (EIEC)

e cepas associadas à diarréia aquosa como E. coli enteropatogênica clássica (EPEC), E. coli enteroagregativa (EAEC), E. coli de aderência difusa (DAEC) e

(2)

O grupo de E. coli verotoxigênica (VTEC) produtora de verotoxinas (VTs), toxinas citotóxicas para células Vero (células epiteliais renais de macaco) também pode ser denominada E. coli produtora de toxina Shiga (STEC) o que significa que uma das citotoxinas produzidas por este microrganismo é idêntica à toxina Shiga (Stx) produzida por Shigella dysenteriae tipo 1. STEC e VTEC são termos equivalentes e ambos se referem a cepas produtoras de uma ou mais toxinas da família das Stxs (Karmali, 1989).

As VTEC são implicadas como causa de uma variedade ampla de doenças em humanos, incluindo diarréia branda, Colite Hemorrágica (CH) (Nataro & Kaper,1998) e Síndrome da Uremia Hemolítica (SUH), (Karmali,1989). Diversos sorotipos específicos de VTEC como O157:H7 e O26:H11, estão associados a estas enfermidades e são classificados como E. coli enterohemorrágica (EHEC). Este termo é usado para classificar aquele subgrupo de VTEC associada com a produção de Stx, lesões tipo A/E

(attaching-and-effacing) e possuir um plasmídeo de 60 MDa, incluindo a conotação clínica com

SUH e CH (Nataro & Kaper,1998).

Nos animais, VTEC está associada à diarréia em bovinos, disenteria em bezerros e doença do edema em suínos. Os sorotipos envolvidos em doenças em humanos já foram isolados de bovinos e suínos sadios, de leite, carne moída de bovinos, de suínos e de aves. Portanto, animais e seus subprodutos podem servir de fontes de infecção importantes deste patógeno para o homem (Read et al.1992).

Em nosso país, é rara a presença desses patógenos nos alimentos e pouco se sabe da freqüência dos mesmos em animais domésticos. Sendo assim, buscou-se caracterizar geneticamente, através da técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR), fatores de patogenicidade como intimina (eae), verotoxina 1 (VT1) e verotoxina 2 (VT2) em isolados provenientes de bovinos sadios no município de Pelotas, RS, bem como verificar o polimorfismo molecular desses

isolados, através da análise do DNA por amplificação aleatória (RAPD).

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2. REVISÃO DE LITERATURA

Escherichia coli é um importante componente da microbiota intestinal de

animais e do homem. Porém, algumas cepas possuem fatores de patogenicidade e podem causar infecções intestinais e extraintestinais em humanos e animais. Cepas de E. coli que produzem verotoxinas (VT) e o subgrupo de EHEC tornaram-se bem conhecidas nos Estados Unidos como causa de vários surtos de doença associada à ingestão de hambúrguer mal-cozido ou mesmo de leite cru. Estes microrganismos produzem toxinas semelhantes à toxina Shiga, que são responsáveis pela Colite Hemorrágica (CH), uma inflamação do cólon com sangramento, citada pela primeira vez em 1983 por Riley et al. (apud Nataro & Kaper,1998). Especialmente em crianças, pode apresentar dores abdominais, diarréia aquosa seguida de diarréia sanguinolenta com pouca ou nenhuma febre.

Este quadro está associado a quadros mais graves como Síndrome Urêmica Hemolítica (SUH), que se caracteriza pela presença de sangue na urina, trombocitopenia e insuficiência renal grave devido à ação da toxina quando os rins são afetados (Karmali,1989). Vários sorotipos de VTEC são classificados como EHEC destacando-se 026:H11, 0111:H8, 0118:H16; 0145:H28; 055:H7, 0113:H21 e principalmente 0157:H7 (Nataro & Kaper,1998).

Os primeiros estudos sobre VTEC, foram feitos em 1977 por Konowalchuk et. al. (apud Nataro & Kaper,1998) que descreveram um grupo de toxinas denominadas verotoxinas (VTs), por serem ativas em culturas Vero, produzidas por E. coli associada à diarréia em humanos e à doença do edema em suínos. O efeito citopático produzido por VT era totalmente diferente daquele produzido pela enterotoxina termolábil (LT) da ETEC. Neste ano, O’Brien et. al. (apud Nataro & Kaper,1998), descreveram a ação de uma toxina também em células HeLa (carcinoma epidermóide de cérvix humano) e verificaram que esta citotoxicidade era neutralizada por anti-soro específico para a toxina Shiga (Stx) de Shigella dysenteriae tipo I, que é conhecida como uma das mais potentes toxinas bacterianas com ação em células eucarióticas e, como eram biológica e estruturalmente semelhantes, foram chamadas de toxinas Shiga-Like (SLTs). A toxina purificada revelou então, ser citotóxica em cultivo celular de células HeLa (O’Loughlin & Robins-Browne, 2001), enterotóxica quando injetada em alça

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ligada de intestino de coelho e letal quando inoculada em coelho e camundongo (Mainil,1999).

2.1. Nomenclatura

A descoberta destas toxinas por diferentes grupos resultou em sistemas diferentes de nomenclatura, e os termos E. coli produtora de VT (VTEC) (Karmali,1989) ou E. coli produtora de toxina SLT (SLTEC) é usado por pesquisadores como Paton & Paton (1998). Mais recentemente, a expressão Stx foi adotada para designar estas citotoxinas (O’Loughlin & Robins-Browne, 2001) e o maior argumento para manutenção desta proposta é que VT/SLT são idênticas ou relacionadas com Stx da S. dysenteriae e que a descrição como Stx é anterior a VT/SLT. Entretanto, pesquisadores como Mainil, (1999) defende a manutenção da nomenclatura anterior como VT baseada no fato de que nem todas VTs são idênticas a Stx de S. dysenteriae (VT1 é, mas VT2 e suas variantes são diferentes (Mainil, 1999). Assim, VT/Stx são, portanto, sinônimos e a expressão E. coli produtora de toxina Shiga (STEC) é adotada para caracterizar este grupo de microrganismo, porém neste texto, será utilizada a nomenclatura VTEC para designar o microrganismo e VTs para as toxinas.

2.2. Patogênese

As diferentes cepas de E. coli podem produzir VT1 ou VT2 e suas variantes ou ambas as toxinas (Karmali,1989). O espectro da atividade biológica de VT/STx envolve citotoxicidade, neurotoxicidade e enterotoxicidade. A enterotoxicidade é representada pelo acúmulo de fluído em alça ligada de intestino de coelho (Karmali,1989), semelhante à ação das toxinas termolábil e termoestável de ETEC. Envolve a destruição das vilosidades dos enterócitos, inibição da absorção de NaCl, danos por efeito direto nas células endoteliais com perda de fluidos celulares. Segundo Mainil (1999), a neurotoxicidade foi observada após a inoculação de extratos de S. dysenteriae e de VTEC em camundongos e coelhos, por via parenteral, onde foi observada paralisia

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ascendente e morte desses animais, sendo provavelmente, uma conseqüência dos danos causados no endotélio vascular do sistema nervoso central. A mesma situação foi encontrada em suínos acometidos pela doença do edema (Marques et al.,1987).

A patogênese das infecções por este microrganismo envolve a sobrevivência no ambiente ácido do estômago, adesão à mucosa e colonização do cólon, produção e absorção das toxinas e lesão vascular.

2.2.1. Aderência

O mecanismo pelo qual VTEC produz lesão A/E vêm dos estudos realizados com a região LEE (Loccus of enterocite effacement), ilha de patogenicidade de 35 kb, do sorotipo 0157:H7. Esta região não está presente em

E. coli da microbiota ou em cepas de E. coli enterotoxigênica, mas é encontrada

em cepas de EPEC, VTEC, Hafnia alvei, Citrobacter rodentium capazes de produzir lesão A/E (Kaper et al. 1998).

Na região LEE encontram-se os genes eae (E. coli attaching and effacing) que codifica para intimina; o gene tir, que codifica para proteína Tir receptor de translocação da intimina; genes esc/sep (EPEC secreted proteins e secretion of

extracelular proteins), que codificam para o sistema de secreção tipo III, o qual

envolve a maquinaria de secreção celular de proteínas citoplasmáticas solúveis ou proteínas integrais de membrana e gene esp, que codifica para proteínas responsáveis pelos eventos na célula epitelial que leva a lesão A/E (Kaper et al. 1998).

Os estudos revelam que as regiões LEE de EHEC e de EPEC são muito semelhantes do ponto de vista funcional e estrutural, diferindo pela presença de um fago P4 numa das extremidades da região LEE de EHEC (Trabulsi, 2004).

O gene eae está presente em bactérias entéricas como EPEC e VTEC que apresentam a alteração histológica A/E (Kaper et al. 1998). Este gene codifica para a intimina proteína localizada na membrana externa da VTEC, que apresenta a região N-terminal altamente conservada e variações em sua porção C-terminal, que se liga aos receptores, sendo classificada em diferentes tipos imunológicos denominados alfa (

α

), beta (

β

), gama (

γ

1 e

γ

2),

δ

(delta)

(6)

(Adu-Bodie et al. 1998), epsilon (

ε

)

(Oswald et al.2000)

,

zeta (ζ), eta (

η

), teta (

θ

)

, iota (

ι

) e Kappa (

κ

) (Zhang et al., 2002).

O processo de adesão é então mediado pela intimina, uma proteína de 94 a 97kDa, que se liga ao seu receptor a proteína não fosforilada Tir (Translocated

intimin receptor) de 78kDa a qual é translocada na superfície do enterócito via

sistema de secreção tipo III, onde é fosforilada aumentando sua massa molecular para 90kDa e associada ao citoesqueleto da célula do hospedeiro, produzindo uma aderência íntima e irreversível à célula epitelial (Kaper et el., 1998). Da interação intimina/Tir resulta a lesão no enterócito chamada A/E (attaching and effacing) que envolve alterações estruturais incluindo perda das microvilosidades do enterócito. Logo abaixo da aderência bacteriana ocorre um rearranjo do citoesqueleto celular e dos microfilamentos de actina que se condensam resultando na formação de um “pedestal “ sobre o qual a bactéria se fixa ( Kaper et al. ,1998).

Vários pesquisadores, trabalhando com cepas mutantes, estudaram a função do gene eaeA da E. coli 0157:H7 e seu produto, a intimina, conforme relata Doyle et al. (1977), onde ficou evidenciado que o gene eaeA é necessário para a aderência deste microrganismo aos enterócitos e células de linhagens, e

está presente em várias cepas produtoras de VTs, particularmente naquelas associadas com doenças em humanos (Fukushima et al., 2000), mas

outros fatores de patogenicidade são também importantes para o desenvolvimento da doença (Nataro & Kaper,1998).

2.2.2. Estrutura e atividade biológica das Verotoxinas

Várias evidências (Karmali,1989) indicam que VTs consistem de duas famílias de citotoxinas chamadas VT1/VT2, são codificadas por bacteriófagos lisogênicos, estão associadas com doenças em humanos e possuem a mesma ação sobre células Vero, mas diferem em sua toxicidade em camundongos.

As toxinas apresentam estrutura básica de duas subunidades tipo A-B de aproximadamente 70 kDa, onde a subunidade A é composta de um monômero de 32 kDa sendo clivada em um peptídeo de 28 kDa (A1) e um de 4 kDa (A2). O

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em um pentâmero de cinco subunidades idênticas de 7,7 kDa , a subunidade B, o

qual liga à porção A um receptor glicolipídico específico presente nas células eucarióticas, como globotriaosilceramida (Gb3) para a VT1/VT2 e

globotetraosilceramida (Gb4), para VT2e e suas variantes (Paton & Paton,1998;

Agbodaze,1999).

Uma vez ligadas aos receptores da membrana celular, as toxinas podem ser internalizadas por um processo de endocitose mediada por receptor, onde são envolvidas por uma proteína chamada clatrina que auxilia no transporte através da membrana celular, formando uma vesícula dentro do citoplasma que poderá sofrer fusão com os lisossomos celulares sendo assim, inativadas. Em células sensíveis à ação das VTs, a vesícula contendo a toxina é transportada através do aparelho de Golgi até o retículo endoplasmático e durante este processo sofrerá ação de proteases gerando os dois fragmentos, A1 e A2, os

quais permanecem ligados por pontes dissulfeto, que ao se reduzirem, liberam o componente ativo A1 da toxina. O peptídeo A1 atua como uma N-glicosidase por

remoção de um resíduo de adenina da molécula do RNA ribossômico 28S da subunidade 60S do ribossomo eucariótico, impedindo sua ligação com o aminoacil-transportador, resultando em inibição da síntese protéica ocasionando a morte celular. As células alvo são principalmente células endoteliais dos rins, cérebro, estômago e submucosa do estômago e intestino, mas teoricamente todas as células que possuírem receptores específicos poderão se tornar alvo da

ação de VTs (Paton & Paton,1998).

A citotoxina VT1 (Stx1) é um grupo homogêneo de toxinas que foram originalmente descritas por Konolwalchuk et al. (1977), purificada por O’Brien et al. em 1983 (apud Karmali,1989) e codificadas por fagos lisogênicos (Nataro & Kaper,1998). São intimamente ligadas à toxina Shiga produzida por S.

dysenteriae tipo 1, possuem o mesmo ponto isoelétrico, termoestabilidade,

citotoxicidade, ações letais e paralisantes em camundongos e enterotoxicidade em alça ligada de intestino de coelhos (O’Loughlin & Robins-Browne, 2001). Apresentam a mesma natureza glicolipídica dos receptores nas células intestinais e em células de cultivo celular como célula Vero e HeLa, mostrando também reação cruzada imunologicamente uma vez que é neutralizada por anticorpos produzidos contra a toxina Shiga e apresentando atividade biológica semelhante (Karmali, 1989). Entretanto, as duas toxinas diferem aparentemente no peso molecular, onde a toxina Shiga apresenta peso molecular de

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aproximadamente 70 kDa e a toxina VT1, em torno de 48 kDa, mas a produção de ambas é inibida por níveis elevados de ferro e baixas temperaturas (O’Loughlin & Robins-Browne, 2001).

A citotoxina VT2 (Stx2) produzida originalmente pelas cepas de E. coli 933

e E32511, descrita por Konowalchuk em 1977 e purificada por Scotland et. al. 1985 (apud Nataro & Kaper,1998), consiste de um grupo bastante heterogêneo de toxinas, apresenta menos de 60% de homologia com VT1 e é distante imunologicamente da toxina Shiga, uma vez que esta não é neutralizada por anticorpos produzidos contra a VT2 Karmali, 1989). É menos ativa em células Vero e possui atividades biológicas diferentes, como diarréia sanguinolenta em coelhos em contraste à VT1 que produz diarréia aquosa; é responsável por severas lesões de necrose tubular renal e morte de camundongos. Esta diferença na toxicicidade é evidenciada também quando células do endotélio renal de humanos são tratadas com toxinas VT1 e VT2 purificadas, onde se verificou que VT2 é mais tóxica que VT1(O’Loughlin & Robins-Browne, 2001).

Além disso, evidências epidemiológicas indicam que EHEC 0157:H7 contendo genes que codificam para VT2 estão mais frequentemente associadas a SUH que cepas produtoras de VT1 (Mainil,1999). Uma possível justificativa para a diferença de toxicidade estaria no fato de que VT2 interage com menor avidez com receptores na membrana celular que VT1, podendo assim ligar-se ou liberar-se dos receptores Gb3 em várias células antes de sofrer endocitose. Outra

teoria é que o peptídeo A2 possui quatro aminoácidos a mais na VT2 que VT1

e/ou porque a seqüência dos aminoácidos difere no C terminal deste peptídeo. Tais diferenças na A2 poderiam afetar a interação do pentâmero B com os

receptores celulares, os quais por sua vez, poderiam alterar o trânsito intracelular da toxina (Melton-Celsa & O’Brien,1998).

Uma variante, VT2e, produzida originalmente por cepas E. coli E57, S1191 e 412, foi inicialmente associada com doença do edema em suínos (Marques et al.,1987).

Outras variantes de VT2, codificadas por genes cromossomais (O’Loughlin & Robins-Browne, 2001), são produzidas por outras cepas de E. coli e estão também envolvidas em enfermidades em outras espécies animais, além de seres humanos (Mainil,1999).

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2.3. Estrutura e organização dos genes de VTs

A seqüência de nucleotídeos dos genes que codificam para Stx de

Shigella dysenteriae, bem como para VT1/ VT2 de E. coli, foi determinada por

volta de 1980 (Karmali, 1989). E. coli produtora de VTs possui um operon (vt1 ou

vt2), e uma estrutura comum que consiste em uma unidade simples de

transcrição que codifica primeiro para a subunidade A e depois para a subunidade B da toxina (Paton & Paton, 1998). Estes pesquisadores identificaram um segundo promotor no operon da subunidade B, sugerindo que pode ocorrer a transcrição independente desta subunidade a uma proporção de 1:5 da holotoxina. A subunidade B da Stx liga-se mais avidamente ao ribossoma o que resulta em um aumento na tradução desta subunidade.

As subunidades A da Stx, VT1 e VT2 são constituídas de 315, 315 e 318 aminoácidos respectivamente e 89 aminoácidos compõem as subunidades B das toxinas. Ambas as subunidades possuem seqüência sinal N-terminal hidrofóbica, característica de proteínas secretadas. VT2 apresenta 57% de identidade na seqüência de nucleotídios da subunidade A e 60% de identidade na B em relação à toxina Stx da Shigella, enquanto que VT1 e Stx apresentam 98% de homologia, diferindo em apenas um aminoácido na subunidade A (Melton-Celsa & O’Brien,1998; O’Loughlin & Robins-Browne, 2001).

2.4. Reservatórios de VTEC e fontes de contaminação

Diversos sorotipos de VTEC são relatados como componentes da microbiota intestinal de uma variedade de animais domésticos como ovinos (Kudva et al.,1996; Rey et al., 2003; Brett, et al., 2003; Blanco et al., 2003; Vettorato et al., 2003), suínos (DesRosiers, et al., 2001; Krause et al., 2005), cabras, cães (Holland et. al.,1999), gatos (Krause et al., 2005), pombos (Morabito et al., 2001) e bovinos sendo estes considerados como os principais reservatórios deste microrganismo e seus subprodutos envolvidos em surtos de infecção alimentar em humanos, CH ou mesmo SUH causados por diversos sorotipos de EHEC, como 0157:H7 (Wieler et al., 1996; Wieler et al., 1998; Blanco et al.,1997; Heuvelink et al., 1998; Cerqueira et al., 1999; Mainil et al.

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1999; Leomil et al., 2003; Moreira et al. 2003; Irino et al. 2005; Krause et al., 2005).

Este microrganismo também está associado a manifestações clínicas menos severas como diarréias brandas e é considerado uma das maiores causas de doenças de origem alimentar em países desenvolvidos, associadas ao consumo de alimentos de origem animal, principalmente leite não pasteurizado (Vernozy-Rozand,1997) e hambúrguer onde a carcaça pode sofrer contaminação durante o abate do animal no frigorífico (Radu et al., 1998; Silveira et al., 1999). Frutas e vegetais consumidos crus, como alface, podem ser veículos de contaminação, pois são muitas vezes fertilizados com esterco bovino estando aí, a possível origem da contaminação neste tipo de alimento (Doyle, 1989).

A transmissão pode ocorrer através de alimentos ou água contaminada, mas a transmissão pessoa-pessoa também é possível, pois casos de infecção por 0157:H7 foram associados a contaminação da água por fezes humanas em piscinas públicas (Russell et al., 2000). Alimentos de origem animal são,

portanto, a maior fonte de contaminação para infecção em humanos. Em países como EUA a ingestão de hambúrguer que não sofreu

tratamento térmico adequado, preparado em restaurantes ou mesmo nas residências, é uma causa importante no desenvolvimento de doença de origem alimentar (Cerqueira et al. 1997). Esta contaminação resulta em parte da falta de higiene das mãos do manipulador de alimento. Surtos já foram relatados devido ao consumo de maionese, sucos de frutas não-pasteurizados, carne moída, cachorro quente e suco de maçã (Nataro & Kaper, 1998; Gallas et al., 2002).

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3. MATERIAL E MÉTODOS

3.1 Isolados de Escherichia coli

Foram estudados 139 isolados de VTEC para a detecção de genes vt1,

vt2 e eae através da técnica de PCR, no laboratório de Biologia Molecular do

Centro de Biotecnologia (Cenbiot) da Universidade Federal de Pelotas. Esses isolados de Escherichia coli foram obtidos a partir de “swab” retal de 47 bovinos sadios oriundos de 22 propriedades distribuídas em oito localidades da zona rural da cidade de Pelotas (Moreira et al. 2003), conforme está demonstrado na figura 1 e tabela 1.

Estes isolados foram previamente caracterizados bioquímica e sorologicamente e também confirmados quanto à produção “in vitro” de VT em cultivo de célula Vero, no Laboratório de Imunologia Aplicada do Cenbiot Os sorotipos detectados foram 091:H - , 0112:H - , 0157:H- (Moreira et al. 2003).

FIGURA 1 – Mapa da região de Pelotas, RS, demonstrando a localização das propriedades que apresentaram isolados positivos para VTEC obtidos de bovinos sadios. Cascata PELOTAS Cerrito Alegre Corrientes Rnncão da Cruz Quilombo Arroio do Padre Monte Bonito Santa Silvana Colonia TURUÇU MORRO REDONDO CAPÃO DO LEÃO

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TABELA 1 - Propriedades com isolados de VTEC distribuídas por localidades dentro do município de Pelotas, RS.

NÚMERO DA PROPRIEDADE LOCALIDADE 22 Arroio do Padre 28 Arroio do Padre 38 Quilombo 44 Distrito Industrial 45 Monte Bonito 63 Rincão da Cruz 66 71 Santa Silvana Quilombo 72 Rincão da Cruz 73 Cascata 78 Arroio do Padre 90 Cascata 91 Cascata 93 Cascata 95 Cascata 97 Cascata 101 Monte Bonito 102 Monte Bonito 141 Quilombo 143 Cerrito Alegre 145 Monte Bonito 146 Monte Bonito

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3.2 Preparo dos isolados para extração do DNA

Para a extração do DNA, foi utilizada a metodologia segundo Birch et al. (1996), onde os isolados de VTEC foram cultivados em 2 mL de caldo Infuso de Cérebro e Coração (Difco) por 18 horas a 370C e após, 1 mL da cultura foi retirado, colocado em tubo de microcentrífuga e centrifugado a 12.000 x g por 1 min. O sobrenadante foi removido e o sedimento ressuspendido em 500 µL de água ultrapura (Milli-Q) esterilizada. A suspensão de células foi então aquecida a 1000C por 5 min e imediatamente congelada a –200C. O extrato contendo DNA total foi usado nas reações da polimerização em cadeia (PCR).

3.3 Detecção de genes vt1 e vt2

através da reação em cadeia da

polimerase (PCR)

Os isolados de VTEC foram testados para a pesquisa de genes que codificam para a verotoxinas VT1 e VT2 através da reação de PCR. Cada reação de 25 µL constava de 6 ng/µL de cada primer (Genosis); 1,5 mM de MgCl2

(Gibco BRL, Life Technologies); 0,2 mM de cada dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP, Amersham Pharmacia Biotech Inc); 10X tampão (Gibco BRL, Life Technologies); 1,0 µL da enzima Taq DNA polimerase 1 U (Gibco BRL,, Life Techonologies) e 1 µL de DNA bacteriano. O volume da reação foi completado com água ultrapura esterilizada. Um controle negativo, sem DNA bacteriano, foi incluído no ensaio. A seqüência de oligonucleotídeos 5’GAAGAGTCCGTGGGATTACG3’ e 5’AGCGATGCAGCTATTAATAA3’ foi utilizada para a amplificação do gene vt1, originando um produto de 130 pb. Para

a amplificação do gene vt2, foi utilizada a seqüência 5’CTTCGGTATCCTATTCCCGG3’ e 5’GGATGCATCTCTGGTCATTG3’, sendo o produto resultante da amplificação de 480 pb (Blanco et al. 1997a).

O ensaio foi realizado em um termociclador GeneAmp PCR System 2400 (Perkin-Elmer Applied Biosytems) com desnaturação inicial do DNA de 94oC por 3min, seguido de 30 ciclos de desnaturação a 94oC por 1 min, anelamento a 55oC por 1 min, polimerização a 72oC por 1 min e extensão final de 72oC por 7 min após o último ciclo. Na figura 3 está esquematizado o protocolo utilizado para a amplificação dos genes que codificam para VT1 e VT2.

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Após, 10 µL de cada amplificação foram submetidos à eletroforese em gel de agarose a 2% contendo brometo de etídio (Gibco BRL ) 10mg/mL em tampão de corrida Tris borato (TBE) 0,5 X, sendo misturados com 2 µL de tampão de amostra. Foi utilizado DNA ladder de 100 pb (Gibco BRL ) como marcador de peso molecular. A eletroforese foi desenvolvida durante 40 min a 140 V, visualizada através de um transiluminador de UV e posteriormente fotografada.

30 ciclos

940C 720C 720C 3 min 1min 550C 1min 7min 1min

40C

FIGURA 2 – Esquema demonstrando a programação utilizada para amplificação dos genes vt1 e vt2, pela técnica de PCR.

3.4 Detecção de genes eae através da reação em cadeia da

polimerase - PCR

A reação de amplificação do gene eae, constou de 6 ng/µL de cada primer (Genosis) ; 1,5 mM de MgCl2 ( Gibco BRL, Life Technologies); 0,2 mM de cada

dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP, Amersham Pharmacia Biotech Inc); 10X tampão (Gibco BRL, Life Technologies); 1,0 µL da enzima Taq DNA polimerase 1 U (Gibco BRL, Life Technologies), em um volume de 25 µL. Como primers, foram utilizados os oligonucleotídeos 5’ACGTTGCAGATGGGTAACTC3’ e 5’GATCGGAACAGTTTCACCTG3’ (Gannon et al., 1993) resultando em um produto de 815 pb. A reação foi submetida ao seguinte protocolo: 940C por 5 min; seguido por 35 ciclos de 940C por 1 min para a desnaturação do DNA; o

940C

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anelamento dos primers ocorreu a 600C por 1 min; extensão a 720C por 2 min e extensão final de 720C por 5 min. O produto da reação foi conservado a 40C até o momento da realização da eletroforese, a qual foi executada conforme descrito no item anterior.

Na figura 3 está esquematizado o programa utilizado na reação de PCR para a identificação do gen eae.

35 ciclos 940C 940C 720C 720C 5min 1min 600C 2min 5min 1min 40C

FIGURA 3 – Esquema demonstrando a programação utilizada para amplificação do gene eae pela técnica de PCR.

A tabela 2 está representando os primers utilizados nas reações de PCR para vt1, vt2 e eae, indicando o tamanho do fragmento obtido para os respectivos genes.

(16)

TABELA 2 – Primers usados no PCR para amplificação das seqüências dos genes para VT1, VT2 e intimina

3.5 Análise do polimorfismo do DNA por amplificação aleatória -

RAPD

3.5.1 Seleção dos primers

Foram testados 15 isolados para um grupo de 10 primers de seqüência arbitrárias sintetizados pelo projeto de Oligonucleotídeos Set 100/2 da Universirty of Britsh Columbia, foi testado para a análise do polimorfismo do DNA por amplificação aleatória (RAPD).

Após a avaliação do perfil eletroforético das bandas geradas por cada um dos primers com os genótipos vt1 e vt2, foi selecionado o de número 106, apresentando a seguinte seqüência de nucleotídeos 5’CGTCGTCCCG3’ uma vez que detectou maior polimorfismo genético entre as cepas, permitindo melhor avaliação da diversidade genética dos isolados.

Genes Seqüência do primer (5’-3’) Fragmento

amplificado (pb) Referências vt1 GAAGAGTCCGTGGGATTACG AGCGATGCAGCTATTAATAA 130 Blanco et al. 1997a vt2 CTTCGGTATCCTATTCCCGG GGATGCATCTCTGGTCATTG 480 Blanco et al. 1997a eae ACGTTGCAGCATGGGTAACTC GATCGCCAACAGTTTCACCTG 815 Gannon et al. 1993

(17)

3.5.2 Teste do polimorfismo do DNA por amplificação aleatória -

RAPD

Para a amplificação do DNA cromossômico foi utilizada a técnica de RAPD e o ensaio foi realizado em um termociclador GeneAmp PCR System 2400 (Perkin-Elmer Applied Biosytems), com o seguinte programa: desnaturação inicial a 940C por 5 min; seguido de 40 ciclos de 940 C/30 seg; 350C/1 min; 720C/1 min com uma extensão final de720C/7 min e mantidos a 40C até o momento da realização da eletroforese. Na figura 4 está esquematizado o protocolo utilizado para a reação de RAPD.

Cada reação, num volume total de 25 µL, constava de 1,75 µL de tampão

Taq 10X (Gibco BRL, Life Technologies); 0,5 µL de dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP, Amersham Pharmacia Biotech Inc a 10 mM); 3,3 µL de primer a 0,2 µM; 0,75 µL de MgCl2 a 50 mM; 0,2 µL de Taq DNA polimerase 5U/ µL(Gibco BRL,

Life Technologies); 19,5 µL de água milli-Q e 1 µL de DNA bacteriano. Um controle negativo sem DNA foi incluído na reação. As amostras foram submetidas à eletroforese em gel de agarose 1,5% contendo 1µL de brometo de etídio (0,05 µ/mL), por 60 min a 140 V. O ladder de 100 pb (Gibco BRL ) foi incluído em cada gel. Após a eletroforese, as amostras foram observadas sob UV em um transiluminador e posteriormente fotografadas. As imagens obtidas pela técnica de RAPD foram digitalizadas e analisadas pelo programa GelCompar 4.1 (Applied Marths, Bélgica), utilizando o índice de 1,5% de tolerância entre as bandas e agrupamento por UPGMA. Este programa permite a comparação de todos os isolados testados indicando o grau de similaridade entre cada um deles, através da formação de um dendograma.

(18)

FIGURA 4 - Esquema demonstrando a programação utilizada para análise do polimorfismo genético utilizando a técnica de RAPD.

94oC 5min 94oC 30seg 35oC 1min 72oC 1min 72oC 7min 4oC

40 ciclos

(19)

4 . RESULTADOS

4.1. Detecção de genes vt1, vt2 de verotoxinas e eae da intimina por

PCR

A análise de PCR dos isolados de VTEC provenientes dos 47 bovinos revelou que 103 isolados (74%) dos 139 testados, distribuídos em oito propriedades, apresentaram genes que codificam para VT2, estando, portanto presente na maioria dos animais. O genótipo vt1 foi encontrado em apenas dois isolados (1,5%) de um mesmo animal, e 34 isolados (24,5%) apresentaram genes que codificam para ambas toxinas, VT1 e VT2.

O gene da eae foi encontrado em apenas quatro (2,9%) dos isolados testados, distribuídos em quatro propriedades, associado ao genótipo vt1vt2 em três desses isolados e ao vt2 em outro isolado de VTEC. Esse genótipo não foi encontrado em associação ao vt1. Os demais isolados apresentaram genótipos distribuídos entre vt1vt2/vt2, cujos animais eram oriundos de propriedades diferentes.

Na tabela 4 estão representados os isolados testados e o perfil genético, detectados pela reação de PCR, nos animais estudados.

(20)

TABELA 3 – Distribuição e marcadores de virulência de Escherichia coli verotoxigênica (VTEC) isoladas de bovinos sadios em Pelotas, RS

Perfil genético Número de animais positivos Número de isolamentos positivos (%) Número de propriedades vt1 1 2 (1,5) 1 vt2 37 103 (74) 8 vt1vt2 16 34 (24,5) 11 eae 4 4 (3) 4

Nas figuras 5, 6 e 7 observam-se resultados das amplificações pela reação de PCR dos isolados representativos para os genes vt1, vt2 e eae, respectivamente.

FIGURA 5 – Eletroforese representativa em gel de agarose a 2% corado com brometo de etídio, demonstrando produtos de 130 pb resultantes da amplificação por PCR com primers para VT1. 1 ladder 100 pb; 2 a 7 e 9 a 11 são isolados apresentando produto resultante da amplificação de vt1 (130 pb); 8 apresenta produto resultante da amplificação de vt2; 12 controle negativo.

130 pb 100 pb

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

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FIGURA 6 – Eletroforese representativa em gel de agarose a 2% corado com brometo de etídio, demonstrando produtos de 480 pb resultantes da amplificação por PCR com rimers para VT2. 1 ladder 100 pb; 2,4,5 isolados apresentando produto resultante da amplificação de vt (480pb); 3 controle negativo.

FIGURA 7 – Eletroforese representativa em gel de agarose a 1,2% corado com brometo de etídio, demonstrando produtos de 815 pb resultantes da amplificação por PCR com primers para eae. 1 ladder 100 pb; 2 e 3 isolados apresentando resultados positivos. 600 pb 480 pb 1 2 3 4 5 1 2 3 600pb 815pb 480 pb

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4.2 Análise do polimorfismo genético dos isolados

Através da triagem realizada com os 10 primes utilizados, selecionou-se o de número 106, em função do maior polimorfismo de bandas produzido, o que permitiu melhor discriminação entre os isolados.

Nas figuras 8 e 9 abaixo, estão representados os perfis de bandas produzidas através da triagem realizada entre os diversos primers utilizados.

FIGURA 8 – Eletroforese em gel de agarose a 1.2% corado com brometo de etídio, mostrando a triagem de dez primers (101 a 110) utilizados para avaliação do polimorfismo genético de isolado de VTEC portador de vt1;1 ladder 100pb.

(23)

FIGURA 9 – Eletroforese em gel de agarose a 1.2% corado com brometo de etídio, mostrando a triagem de dez primers (101 a 110) utilizados para avaliação do polimorfismo genético de isolado de VTEC portador de vt2. ; 1 ladder 100 pb.

Para avaliar os resultados e verificar a relação intraespecífica entre os isolados analisados, foram construídos dendogramas pelo método UPGMA, a partir do perfil gerado pela técnica de RAPD (Figura 10).

(24)

FIGURA 10 - Dendograma de 114 isolados de VTEC dos cento e trinta e nove isolados, mostrando os vinte “clusters” obtidos com 100% de identidade, gerados por RAPD após análise pelo programa Gelcompar 4.1 (Applied Marths, Bélgica). Foi utilizado índice de 1,5% de tolerância entre as bandas e a escala no topo do dendograma indica o nível de similaridade entre os isolados de VTEC.

A vt1vt2,vt2 B vt2 D vt2 E vt1vt2,vt2 F vt1 I vt1vt2/vt2 C vt2 G vt1vt2 H vt1vt2/vt2 14322 14145 14641 7822 7242 4541 4545 14644 14645 4421 14642 14143 4514 9715 9743 9722 9712 9713 14515 9711 9122 2234 2235 14523 14531 7314 2851 14343 14534 14533 14325 14341 14513 14514 9714 2855 2831 2843 2853 2854 6323 6322 2845 14323 14342 14532 14535 6325 14344 4515 eae eae

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FIGURA 10 – cont. Q K vt2 P vt2 7823 3845 9334 10214 9144 7322 6321 4512 4513 6612 6643 6641 6645 10243 14345 3822 3832 6611 14346 6613 3842 3843 3825 2215 3841 9511 9513 3844 6635 4415 4424 2213 4414 4423 9143 N vt2 L vt1vt2 M vt2 O vt2 J vt2 14155 14144 10151 14511 10215 14111 14112 10244 10245 eae 0157 0157 eae

(26)

FIGURA 10 – cont.

No dendograma, dos 139 isolados de VTEC testados, 76 (55%) apresentaram perfis únicos, não agrupados, isto é, cada isolado apresentou um padrão de bandas distinto dos demais que apresentaram padrões agrupáveis. Dos isolados estudados, 63 originaram a formação de 20 “clusters”, os quais agruparam isolados oriundos de animais da mesma propriedade, de propriedades diferentes ou mesmo de localidades distantes geograficamente, com o mesmo perfil genético e contendo genes para os diferentes fatores de patogenicidade.

Os dados referentes à distribuição dos isolados de VTEC nos vinte “clusters” e a relação com as diferentes verotoxinas estão expressos na tabela 4.

R vt1vt2/vt2 S vt2 T vt2 Q vt2 4432 10214 10153 10211 10212 10213 14635 4433 4434 4435 4531 4543 4423 4431 7242 7231 4422 7232 7245 14632 0157 0157 0157

(27)

TABELA 4 – Distribuição dos isolados de VTEC nas localidades e em “clusters” gerados pela técnica de RAPD e padrão genético para VT

a

animal apresentando co-infecção por cepas distintas de VTEC

b

animais colonizados por cepas de VTEC pertencentes ao sorotipo 0157:H-

c animais colonizados por cepas de VTEC pertencentes ao sorotipo 091:H--

“Clusters” Número de

isolados

Número de

animais Localidades Genótipo

A 03 03 Cerrito Alegre, Quilombo,

Monte Bonito

vt1vt2/vt2

B 02 01 Monte Bonito vt2

C 03 03 Monte Bonito, Quilombo vt2

D 02 02 Cascata vt2

Ea 03 02 Cascata, Monte Bonito vt1vt2/vt2

F 02 01 Arroio do Padre vt1

G 02 02 Cerrito Alegre, Monte Bonito vt1vt2

H 10 07 Cerrito Alegre, Monte Bonito,

Cascata, Arroio do Padre, Rincão da Cruz

vt1vt2/vt2

I 08 05c Cerrito Alegre, Monte Bonito,

Rincão da Cruz

vt1vt2/vt2

J 02 01 Santa Silvana vt2

K 02 02 Santa Silvana, Cerrito Alegre vt2

L 02 01 Quilombo vt1vt2 M 02 01 Cascata vt2 N 02 01 Quilombo vt2 O 02 01 Quilombo vt2 P 02 01b Monte Bonito vt2 Q 03 02b Monte Bonito vt2

R 06 04b Monte Bonito, Distrito Industrial vt1vt2/vt2

S 03 03 Distrito Industrial, Rincão da Cruz vt2

(28)

Pode-se observar na Tabela 4, que a maioria dos “clusters” gerados (60%) foi formada por isolados bovinos de VTEC que carreavam genes para VT2 e que estavam distribuídos entre animais de propriedades distintas, mas de localidades geograficamente próximas.

Perfil indicando a presença de vt1vt2 e de vt2 nos isolados estudados, foi encontrado em 5 (25%) dos “clusters” (A, E, H, I e R) sendo que o gene vt2 estava presente em 67% dos isolados distribuídos em doze grupos. Este agrupamento revelou variabilidade genética entre os isolados de um mesmo animal, indicando co-infecção por cepas diferentes de VTEC. A variabilidade genética também esteve presente em isolados bacterianos obtidos a partir de animais de propriedades diferentes.

Isolado bacteriano portando o gene eae responsável pela alteração A/E em células da mucosa intestinal, foi encontrado em apenas um “cluster” ( I ), estava associado à VT1VT2 e pertencia ao sorogrupo 091, mas os demais animais da mesma propriedade não apresentaram essa característica genética. Os demais isolados de VTEC que carreavam o gene para intimina apresentaram perfis únicos, demonstrando diversidade genética entre as amostras de VTEC.

Apenas dois (10%) “clusters” (G e L) agruparam isolados bacterianos pertencentes ao genótipo vt1vt2, sendo que um “cluster” era constituído por dois isolados do mesmo animal, enquanto que o outro, continha dois isolados de animais de diferentes propriedades situadas em localidades vizinhas.

Os dois isolados com genótipo vt1 foram agrupados separadamente dos demais “clusters” gerados pelo RAPD, pertenciam ao mesmo animal de uma propriedade onde também foi encontrado um perfil genético diversificado, uma vez que foram detectados outros animais carreando vt2 e vt1vt2.

Três “clusters” (P, Q, R) agruparam quatro isolados de VTEC sorotipados como 0157, onde dois pertenciam a animais diferentes da mesma propriedade e os demais em localidades próximas geograficamente.

Na figura 11 está demonstrado o perfil gerado pela técnica de RAPD de alguns isolados de VTEC usando o primer 106 (CGT CTG CCC G).

(29)

FIGURA 11 – Eletroforese representativa em gel de agarose a 1.5% corado com brometo de etídio, mostrando o perfil genético de isolados de VTEC obtidos a partir de RAPD. 1 e 25 ladder 100 pb; 13 e 24 controles negativos; 12 e 16 isolados negativos e os demais representam o perfil de bandas gerado.

600pb

(30)

5. DISCUSSÃO

Foram testados 139 isolados de VTEC, onde a maioria destes possuía gene que codificava para VT2 apenas, ou seja, 74% (103) dos isolados obtidos de animais, distribuídos em oito propriedades diferentes, albergavam o gene

vt2. Um desses isolados também apresentava o gene eae que codifica para

intimina. Estudos realizados por Boerlin et al. (1999) demonstram uma forte associação entre a presença de genes para intimina e vt2 em sorotipos isolados de humanos associados com SUH ou CH.

A freqüência de eae foi baixa, pois foi encontrado em apenas 2,9% de todos os isolados, resultado que reforça dados da literatura onde foi evidenciado que em animais sadios, a presença de cepas de VTEC com este gene, é menos freqüente que em bovinos que apresentam diarréia (Gannon et al. 1993; Blanco et al., 1997; Cerqueira et al., 1999; Irino et al., 2005; Krause et al., 2005). Pesquisadores como Guth et al., (2003) estudando as características genotípicas de VTEC a partir de isolados obtidos de animais da Argentina e do Brasil, não encontraram nenhum bovino colonizado por E. coli carreando genes para intimina.

O gene vt1 foi encontrado em apenas dois (1,5%) dos isolados estudados, sendo que estes pertenciam ao mesmo animal, o qual apresentou co-infecção por cepas geneticamente distintas uma vez que a outra cepa de VTEC possuía também gene vt2. Esta baixa freqüência também foi encontrada em estudos realizados em São Paulo por Irino et al. (2005), os quais demonstraram que 3% dos bovinos sadios estudados apresentavam cepas de

E. coli com este gene. Estes resultados diferem dos encontrados por Fagan et.

al. (1999), em cujo trabalho foi detectado vt1 em 56,5 % das amostras de fezes de VTEC provenientes de bovinos sadios.

A presença do gene vt1 em VTEC colonizando bovinos com diarréia e que também apresentam lesão A/E em células epiteliais, é encontrada com muita freqüência, o que parece ter uma forte associação entre estes fatores de patogenicidade com o desenvolvimento da doença, situação esta também encontrada em casos de doença humana (Wieller et al., 1998; Eklund et al., 2002; Bettelheim et al., 2003). Em bovinos de corte, Cerqueira et al. (1999), encontraram alta ocorrência de genes vt1 em isolados obtidos a partir de

(31)

animais de fazendas do Rio de Janeiro. Neste estudo nenhum animal demonstrou estar colonizado por cepas de VTEC que apresentassem genótipo

vt1 e eae concomitantemente. Estes resultados estão em desacordo com

aqueles obtidos em São Paulo por Leomil et al. (2003), os quais demonstraram que o genótipo vt1 foi predominante em isolados bovinos com alta freqüência de gene eae.

Em trinta e quatro isolados (24,5%) de animais de 11 propriedades diferentes, foram detectados os gene vt1vt2, sendo que em três destes, pertencentes a animais de propriedades de mesma área geográfica, também foi encontrado o gene eae. Os estudos de Cerqueira et al. (1999), também revelaram a presença deste perfil genético em VTEC obtidas de bovinos de leite.

Foi observado que a presença de animais apresentando co-infecção por VTEC contendo vt2 e vt1vt2 ocorreu em nove propriedades e que na mesma propriedade, animais diferentes eram colonizados por VTEC com perfil genético diferenciado, mostrando a alta diversidade genética que ocorre entre isolamentos obtidos dos animais.

Os isolados bacterianos estudados neste trabalho, previamente sorotipados como 0157, estavam associados a vt2 e vários estudos indicam que cepas de E. coli produtoras de VT2 estão mais freqüentemente envolvidos com doenças em humanos, como SUH e CH (Karmali, 1989; Paton & Paton,1998; Nataro & Kaper,1998; Boerlin et al.,1999; Pradel et al., 2001; Eklund et al., 2002; Ritchie et al., 2003). Além disso, o sorotipo 0157:H- de Escherichia coli um patógeno emergente, sendo classificado como enterohemorrágico, pois também está associado à quadro de diarréia sanguinolenta. Sua vinculação com casos de SUH em adultos foi evidenciada por Bonnet et al. (1998) e Karch & Bielaszewska (2001), dentre outros. Já foi recuperado de carcaças em plantas de processamento por BarKocy-Gallagher et al. (2001), sendo também isolado de bovinos sadios em 2000, por Bielaszewska et al., ou ainda, de bovinos com diarréia, em trabalho realizado por Kang et al. (2004).

Os resultados deste trabalho são importantes, pois identificam animais domésticos, como os bovinos, como reservatórios de cepas potencialmente patogênicas para humanos, o que representa um perigo à saúde pública, pois podem contaminar os alimentos de origem animal. Os hambúrgueres preparados em casa ou em lanchonetes, assim como a carne fresca comercializada em

(32)

açougues, é um dos veículos mais comuns de infecção alimentar, devido ao processo de fabricação que facilita a contaminação, uma vez que são preparados a partir de carnes provenientes de muitos frigoríficos onde, uma amostra que esteja contaminada pode transferir esta contaminação às demais no momento em que são misturadas.

A diversidade genética foi investigada através da técnica RAPD a qual gerou informações sobre a variabilidade dos diversos isolados testados. Dos 139 isolados investigados, 62 foram agrupados em 20 “clusters” demonstrando que as cepas de VTEC mesmo oriundas de animais pertencentes a regiões distantes apresentaram perfil genético semelhante, sugerindo a habilidade destes microrganismos em se dispersar para diferentes regiões. Em um estudo realizado por Birch et al. (1996), utilizando RAPD, foi demonstrado que através desta técnica foi possível fazer distinção entre isolados de Escherichia coli 0157 e outras cepas deste microrganismo que não pertenciam a este sorotipo, mas eram idênticos pela fagotipagem e produção de toxinas.

Foi possível associar dentro do mesmo “cluster”, isolados bacterianos oriundos de animais de propriedades distintas com diferentes perfis para toxina Shiga. Demonstrou-se também que cepas pertencentes ao mesmo sorotipo podem apresentar perfis moleculares distintos. O sorotipo 0157 foi identificado em isolados que possuíam perfil genético vt2 e também em isolados que apresentavam vt1 e vt2 concomitantemente.

A diversidade genética observada entre as cepas de VTEC pelo uso de métodos de tipagem molecular introduz estratégias precisas e confiáveis dentro da investigação epidemiológica dos problemas causados por este patógeno. Conhecer os subtipos dos isolados facilita o estudo da contaminação em indústrias de alimentos, por exemplo. A análise por RAPD oferece as vantagens da simplicidade e da rapidez conferidas pelos procedimentos que utilizam PCR para caracterização de isolados. Além disso, RAPD elimina a necessidade de se trabalhar com DNA puro e pequena quantidade de amostra é suficiente para a reação de amplificação.

Este estudo mostrou assim, diversidade genética na população de VTEC em bovinos sadios na região de Pelotas, demonstrando que esta espécie doméstica pode ser colonizada por diferentes subtipos e constitui um importante reservatório natural de cepas de VTEC, aumentando assim o risco de transmissão de cepas patogênicas ao homem e a outros animais.

(33)

6. CONCLUSÕES

1. O genótipo vt2 é o prevalente em VTEC isoladas de bovinos sadios na região

de Pelotas – RS. Porém há presença dos genótipos vt1vt2 e vt1.

2. Há uma grande diversidade genética entre os isolados de VTEC em bovinos

de uma mesma propriedade e em um mesmo animal indicando co-infecção por cepas diferentes.

3. Os bovinos na região de Pelotas são importantes reservatórios naturais de

cepas de VTEC, constituindo assim um risco de transmissão destas cepas patogênicas ao homem.

(34)

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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