Avaliação da Atividade Anti-inflamatória e Antinociceptiva de Extratos
da casca de Hitamanthus Bracteatus (SPRUCE) Woodson.
Rafael Barreto Vieira Valois (PIBIC/CNPq-Unit), e-mail: rafaelvalois.csl@hotmail.com;
Bernadeth Moda de Almeida(Doutoranda),email:dethmoda@hotmail.com
Ricardo Luiz Cavalcanti de Albuquerque Júnior (Orientador), e-mail:
ricardo.patologia@uol.com.br
Universidade Tiradentes/Odontologia/Aracaju, SE.
Ciências da Saúde - 4.00.00.00-1 Odontologia - 4.02.00.00-0.
Pesquisa executada com recursos do Conselho Nacional de Pesquisa(CNPq) RESUMO: Estudos etnofarmacológicos realizados
no Brasil têm mostrado que, um grande número de espécies de plantas é utilizado pela população local para tratar doenças, particularmente a família
Apocynaceae, com destaque para o uso medicinal,
bem como o gênero Himatanthus. As cascas do caule de H. bracteatus, foram secas em estufa com circulação de ar, 40°C por 24hs. As cascas secas foram trituradas em moinho de facas e posteriormente as partículas foram classificadas quanto ao tamanho, utilizando, peneiras da série Tyler.O procedimento para cálculo do rendimento foi a partir da pesagem dos frascos de vidros vazios, seguido da pesagem após evaporação do solvente quantificando com isso, a massa seca do extrato bruto e frações obtidas. A atividade antioxidante foi determinada com algumas adaptações. Para tanto foi determinada a partir do preparo da solução estoque de 24 mg de DPPH dissolvidos em 100 mL de metanol. A atividade antioxidante foi determinada a partir da proposta metodológica de Re et al. (1999) com algumas adaptações. A atividade antioxidante foi medida através da captura do radical 2,2´- azinobis (3- etilbenzotiazolina-6-ácido sulfônico) – ABTS.
Palavras-chaves: Fitoterápico,Hitamanthus,Swiss INTRODUÇÃO
A inflamação e a dor estão presentes em praticamente todas as doenças humanas e animais, motivo pelo qual, estas têm sido o foco principal de muitas pesquisas científicas em todo mundo. Pesquisas etnofarmacológicas realizados no Brasil têm mostrado que, um grande número de espécies de plantas é utilizado pela população local para tratar doenças, particularmente a família
Apocynaceae, com destaque para o uso medicinal,
bem como o gênero Himatanthus frequentemente citados, concentrada na América tropical, quase exclusivamente no norte e nordeste do Brasil (MOUSINHO et al., 2011; LUCETTI et al., 2010; FERREIRA et al., 2009). Entre as espécies deste gênero, merece destaque está a H. bracteatus
(Spruce) Woodson, frequentemente encontrada nas
florestas tropicais da região norte, com os nomes populares de bracteatus, janaguba e bracteatus verdadeira, comumente utilizado para a cura de processos inflamatórios, tumores e feridas. Contudo, ainda são deficientes os estudos voltados para elucidação dos seus potenciais farmacológicos, principalmente em relação à atividade anti- inflamatória e antinociceptiva (FAKHRUDIN et al., 2014; MIRANDA et al, 2000).
MATERIAL E MÉTODOS
As amostras das cascas do caule de
Himatanthus bracteatus (A. DC.) Woodson
(H.bracteatus) foram coletadas por nosso grupo de
pesquisa na cidade de Óbidos (PA), na comunidade Cipoal, na Fazenda Piquiá no mês de fevereiro de 2013, Após a coleta, as cascas do caule de H.
bracteatus, foram secas em estufa com circulação
de ar, 40°C por 24hs. As cascas secas foram trituradas em moinho de facas e posteriormente as partículas foram classificadas quanto ao tamanho, utilizando, peneiras da série Tyler. Os solventes utilizados nas extrações foram: hexano, diclorometano, acetato de etila e etanol, todos com 99% de pureza da marca VETEC.Para a obtenção dos extratos secos EBE e CLE (Bruto ou Clean up), foi utilizado o método de extração com líquidos
pressurizados (ELP). O procedimento experimental era iniciado carregando o extrator de aço inox com cerca de 10 g da casca do caule de H. bracteatus previamente tratada com granulometria conhecida. Amostras (10 g) dos extratos sólidos da casca do caule de H. bracteatus foram solubilizadas em uma mistura de água: metanol (20%)centrifugada por 10 minutos. Soluções de 1mg/mL de cada extrato foram injetadas e analisadas no sistema CLAE-DAD-EM. O procedimento para cálculo do rendimento foi a partir da pesagem dos frascos de vidros vazios, seguido da pesagem após evaporação do solvente quantificando com isso, a massa seca do extrato bruto e frações obtidas. A atividade antioxidante foi determinada utilizando a metodologia proposta por Brand-Willians; Cuvelier; Berset (1995) com algumas adaptações. Para tanto foi determinada a partir do preparo da solução estoque de 24 mg de DPPH dissolvidos em 100 mL de metanol. A atividade antioxidante foi determinada a partir da proposta metodológica de Re et al. (1999) com algumas adaptações. A atividade antioxidante foi medida através da captura do radical 2,2´- azinobis (3- etilbenzotiazolina-6-ácido sulfônico) – ABTS. Foram utilizados camundongos
Swisss machos (25-35g) e ratos Wistar machos e
fêmeas (150 – 250g) obtidos no Biotério da Universidade Tiradentes (Unit), mantidos a temperatura de 25ºC ± 2°C em ciclos claro-escuro de 12h e mantidos em biotério de experimentação com água e ração ad libitum, por pelo menos 7 dias antes dos experimentos. Toda a metodologia foi aprovada pela Comissão de Ética no Uso de Animais – CEUA, sob o protocolo 011114 , da Universidade Tiradentes/Sergipe.
Todos os extratos ou fármacos foram diluídos em solução salina (NaCl 0,9% em água destilada) ou Solução tampão (PBS) ou adição de 1% Polissorbato 80 (Tween 80®- Sigma-Aldrich, U.S.A). Para este ensaio biológico foram selecionados o EBE e CLE com maior rendimento e de melhor atividade antioxidante a partir das etapas anteriores. Os extratos EBE e CLE selecionados foram submetidos ao teste de avaliação da atividade anti-inflamatória, por meio da indução de pleurisia por
carragenina em camundongos. As amostras do lavado pleural foram centrifugadas (2000 rpm, 5 min), à temperatura ambiente. O sobrenadante foi descartado e cada amostra do líquido pleural foi inicialmente diluída em solução de Turk (1:20) para, posteriormente, serem recolhidas alíquotas de 10 μL da suspensão para realização da contagem total dos leucócitos em câmara de Neubauer utilizando microscópio óptico (CX31, Olympus, magnificação de 1000×).A quantidade de fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) e Interleucina 1 β (IL-1β) produzido na cavidade pleural foi avaliado 4 horas após a injeção de carragenina. O lavado pleural recuperado foi centrifugado a 770 rpm/ 10 min. As IL-1β e TNF-α foram estimadas usando níveis de imunoensaio disponível comercialmente kits de ELISA para camundongos (Sistema de P & D, Minneapolis, MN, EUA), de acordo com o as instruções do fabricante. O material foi processado histologicamente e avalaiado por características morfológicas. Na análise estatística Foi utilizado o nível de significância de 5% para todas as análises, de modo que as diferenças observadas foram consideradas significativas quando p<0,05. A hiperalgesia mecânica induzida por CFA avaliada durante oito dias revelou que um único tratamento diário com extratos de H. bracteatus reduz significativamente a resposta de retirada da pata (p<0,001). Quando o tratamento foi suspenso no dia 7, as atividades antinociceptiva não foram observadas. Quando o tratamento com os extratos de H. bracteatus foi reiniciado no dia 8, a mesma resposta anti-hiperalgésica estava presente Os animais tratados com o veículo não interferiram na hiperalgesia, enquanto a indometacina (10mg/kgi.p.) controle positivo inibiu notavelmente a hiperalgesia induzida por CFA (p<0,001).A pleurisia induzida por carragenina demonstrou que o ECE inibiu a migração leucocitária nas três doses testadas (10, 30 e 100 mg/kg, v.o). O índice de inibição para as doses testadas foram respectivamente 37 ± 2,2%; 49 ± 1,0% e 46 ± 1,5%. Já o grupo controle positivo indometacina apresentou inibição de 50,6 ±1,6% quando comparado ao grupo controle negativo veículo . As doses de ECE quando comparadas
entre si apresentaram diferenças estatística (p<0,01) em relação a dose de 10 mg/kg. Não houve diferença significativa entre as doses dos extratos ECE (30 e 100mg/kg) e a droga de referência Indometacina (p<0,001).A avaliação da resposta da migração leucocitária na pleurisia após o tratamento dos animais com o extrato ECLE apresentou resultados superiores quando comparado ao ECE. O extrato inibiu significativamente o total de leucócitos que migraram para a cavidade, nas três doses respectivamente (10, 30 e 100 mg/kg, v.o.), em 90 ± 0,3%; 77 ± 1,1% e 55 ± 0,74%.
RESULTADOSEDISCUSSÃO
O maior rendimento obtido nos extratos resultantes da extração clean up foi do Hex, na temperatura de 50ºC (p<0,01),independente do fluxo. O extrato Eth obteve o segundo melhor rendimento, especialmente sob as condições de 50ºC e fluxo de 1 mL/min (p<0,05). O rendimento das demais partições foi considerado baixo. Na metodologia CLE, os extratos de EHex, EDic e EAc não apresentaram atividade antioxidante. Os resultados obtidos pelo ensaio a partir do ABTS foram superiores quando comparados ao DPPH , demonstrando um melhor desempenho do ensaio de ABTS (p<0,001) em todas as amostras. A atividade antioxidante pelo método ABTS do EBE em temperatura de 25°C foi significativamente maior que em 50°C, independente do fluxo (p<0,001).A temperatura de 50°C influenciou significativamente no potencial antioxidante do extrato Eth no método de ABTS independente do fluxo, apresentando valores superiores que a 25°C (p<0,001). Quanto a atividade anti-inflamatória, a administração de carragenina na cavidade pleural induziu um aumento no número de leucócitos 4 h após a injeção. O tratamento com EBE e Eth (10, 30 e 100 mg/kg, v.o.) inibiu significativamente (p<0,01 e p< 0,001) a migração leucocitária .Não houve diferença significativa entre as doses dos extratos EBE e Eth (30 e 100mg/kg) e a droga de referência
Indometacina (p<0,001). A dose de 10mg/Kg de Eth foi significativamente superior à indometacina (p<0,05). Após a comprovação do potencial anti-inflamatório dos extratos EBE e ECLE das cascas de H.bracteatus, optou-se por investigar o potencial antinociceptivo desses extratos, baseado no fato de não terem sido ainda relatados esses efeitos na espécie aqui investigada.
CONCLUSÕES
Foi comprovada a ação anti-hiperalgésica dos extratos EBE(Extrato bruto) e Eth(Extrato limpo) neste estudo, estando de acordo com relatado por Choudhary et al. (2014), que avaliaram o potencial anti-artritico da fração n- butanol (200mg/kg v.o.) do extrato hidroalcóolico de Plumeria alba, e identificaram o iridóide plumierideo como componente majoritário, através do modelo de inflamação agudo e crônico induzido por CFA e formaldeído. A ação anti-hiperalgésica do (s) princípio(s) ativo(s) presentes nos extratos etanólicos de H. braceatus provavelmente está associado com a sua ação anti-inflamatória. Esta hipótese é reforçada pelos resultados observados na administração oral desses extratos de H. bracteatus que causou uma inibição pronunciada da migração de leucócitos na indução da pleurisia em camundongos. A partir da confirmação de que os extratos das cascas de H. bracteatus possuem atividade anti-inflamatória e antinociceptiva, foi decidido incorporar o extrato que apresentou maior potencial nesses testes, a uma formulação contendo um polímero fotoreticulável a base de gelatina metacrilada, e foi submetido a um ensaio de cicatrização de feridas abertas em modelo murino.
REFERÊNCIAS
BRAND-WILLIAMS, W., CUVELIER, M. E., & BERSET, C. Use of a free radical method to evaluate antioxidant activity. LWT - Food Science and Technology, 28 (1): 25 - 30, 1995.
CHOUDHARY, M.; KUMAR, V.; SINGH, S. Phytochemical and Pharmacological activity of Genus Plumeria: An
updated review. International Journal of Biomedical And Advance Research (Online), 5(6): 266 – 271, 2014. FAKHRUDIN, N.; WALTENBERGER, B.; CABARAVDIC, M.; ATANASOV, A.G.; MALAINER, C.; SCHACHNER, D.; HEISS, E.H; LIU, R.; NOHA, S.M; GRZYWACZ, A.M,; MIHALY-BISON, J.; AWAD, E.M.; SCHUSTER, D.; BREUSS, J.M.; ROLLINGER, J.M.; BOCHKOV, V.; STUPPNER, H.; DIRSCH, V.M. Identification of plumericin as a potent new inhibitor of the NF-κB pathway with anti-inflammatory activity in vitro and in vivo. British Journal
of Pharmacology. 171(7):1676-86, 2014.
FERREIRA, J.L.P.; AMARAL, A.C.F.; ARAÚJO, R.B.; CARVALHO, J.R.; PROENÇA, C.E.B.; FRAGA, S.A.P.M.; SILVA, J.R.A. Pharmacognostical Comparasion of three species of Himatanthus. International Journal of
Botany. 5(2): 171-75, 2009.
LUCETTI, D.L.; LUCETTI, E.C.P.; BANDEIRA, M.AM.; VERAS, H.N.H; SILA, H. A.; LEAL, L.K.A.M.; LOPES, A.A.; ALVES, U.C.C; SILVA, G.S.; BRITO, G.A.; VIANA, G.B. Anti-inflamatory effects and possible mecanismo of action of lupeol acetate isolated from Himatanthus drsticus (Mart.) Plumel. Journal of inflamation, v. 7, p.60, 2010. MIRANDA, A.L.P.; SILVA, J.R.A.; REZENDE, C.M.; NEVES, J.S.; PARRINI, S. C.; PINHEIRO, M.L.B.; CORDEIRO, M.C.; TAMBORINI, E.; PINTO, A.C. Anti-inflammatory and analgesic activities of the látex containing triterpenes from Himatanthus sucuuba. Planta
Médica, 66 (3): 284-286, 2000.
MOUSINHO, K.C.; OLIVEIRA, C. C.; FERREIRA, J. R. O.; CARVALHO, A. A.; MAGALHÃES, H. I. F.; BEZERRA, D. P.; ALVES, A. P. N. N.; LOTUFO, L. V. C.; PESSOA, C.; MATOS, M. P. V.; RAMOS, M. V.; MORAES, M. O. Antitumor effect of laticifer proteins of
Himatanthus drasticus (Mart.) Plumel – Apocynaceae.
Journal of Ethnopharmacology 137, 421– 426, 2011.
RE, R.; PELLEGRINI, N.; PROTEGGENTE, A.;
PANNALA, A.; YANG, M.; RICE-EVANS, C. Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation descolorization assay. Free Radic Biol Med, v.26, p.1231-1237, 1999.
