Óleos essenciais no controle do fungo Sclerotinia sclerotiorum (LIB.) de Bary in vitro

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PROGRAMA DE P ´

OS-GRADUAC

¸ ˜

AO EM AGRONOMIA

THAYLLANE DE CAMPOS SIEGA

´

OLEOS ESSENCIAIS NO CONTROLE DO FUNGO Sclerotinia

sclerotiorum

(LIB.) DE BARY IN VITRO

DISSERTAC

¸ ˜

AO

PATO BRANCO 2018

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´

OLEOS ESSENCIAIS NO CONTROLE DO FUNGO Sclerotinia

sclerotiorum

(LIB.) DE BARY IN VITRO

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Agronomia da Universidade Tecnológica Federal do Paraná como requisito parcial para obtenção t´ıtulo de “Mestre em Agronomia” – Área de Concentração: Produção Vegetal.

Orientador: Prof. Dr. S´ergio Miguel Mazaro

Co-orientadora: Prof. Dra.. Maristela Rey Borin

PATO BRANCO 2018

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Ficha catalográfica elaborada por Rosana Silva CRB: 9/1745 Biblioteca da UTFPR-Dois Vizinhos

S571o Siega, Thayllane de Campos

Óleos essenciais no controle do fungo Sclerotinia

sclerotiorum (LIB.) de Bary in vitro / Thayllane de

Campos Siega – Pato Branco, 2018. 95 f.:il.

Orientador: Prof. Dr. Sérgio Miguel Mazaro. Coorientadora: Prof. Dra. Maristela Rey Borin. Dissertação (Mestrado) - Universidade Tecnológica Federal do Paraná, Programa de pós-graduação em Agronomia, Pato Branco, 2018.

Bibliografia p. 83-95

1. Fungos do solo. 2. Essências e óleos essenciais. 3. Pragas - Controle. I. Mazaro, Sérgio Miguel, orient. II. Borin, Maristela Rey, coorient. III. Universidade

Tecnológica Federal do Paraná – Pato Branco. IIII.Título

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Ministério da Educação

Universidade Tecnológica Federal do Paraná Câmpus Pato Branco

Diretoria de Pesquisa e Pós-Graduação Programa de Pós-Graduação em Agronomia

TERMO DE APROVAÇÃO Título do Dissertação no ₁₆₀

ÓLEOS ESSENCIAIS NO CONTROLE ALTERNATIVO DO FUNGO Sclerotinia sclerotiorum (lib.) DE BARY

por

THAYLLANE DE CAMPOS SIEGA

Dissertação apresentada às 9 horas do dia 15 de fevereiro de 2018 como requisito parcial para obtenção do título de MESTRE EM AGRONOMIA, Linha de Pesquisa – Sistemas de Produção Vegetal, Programa de Pós-Graduação em Agronomia (Área de Concentração: Produção vegetal) da Universidade Tecnológica Federal do Paraná, Câmpus Pato Branco. A candidata foi arguida pela Banca Examinadora composta pelos membros abaixo designados. Após deliberação, a Banca Examinadora considerou o trabalho APROVADO.

Banca examinadora:

“A Folha de Aprovação assinada encontra-se na Coordenação do Programa” Prof. Dr. Álvaro Rodrigo Freddo

UNISEP/DV

Prof. Dr. Cleverson Busso

UTFPR/DV

Prof. Dr. Sérgio Miguel Mazaro

UTFPR/DV Orientador

Prof. Dr. Moeses Andrigo Danner

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Agradeço a Deus pelo dom da vida e por ter me dado saúde e força para superar dificuldades;

Ao meu esposo, Emerson Luis Siega, pelo companheirismo, compreens˜ao, fidelidade, incentivo e amizade, pois acredito que sem ele seria muito dif´ıcil vencer esse desafio;

Aos meus pais, Jurandir de Campos e Loana Mendes da Silva de Campos, sinˆonimos de sabedoria, humildade e dignidade, pelo amor, incentivo e apoio incondicional;

Aos meus irm˜aos Thallana de Campos e Gabriel Athaur de Campos, por acreditarem em minha capacidade – assim como eu acredito na de vocˆes – e pela amizade de sempre;

Aos meus professores Dra.. Maristela Rey Borin e Dr. Sergio Miguel Mazaro pela experiência, dedicação, paciência, correções, incentivo, suporte, desafios propostos, pela orientação e amizade; por meio deles, eu me reporto a toda a comunidade da Universidade Tecnológica Federal do Paraná (UTFPR) Câmpus Pato Branco e Câmpus Dois Vizinhos, direção e administração, que oportunizaram a janela pela qual vislumbro um horizonte superior;

A todos os colegas de trabalho do laboratório de fitopatologia, gostaria de externar minha satisfação de poder conviver com eles durante a realização do meu mestrado;

A minha amiga Caliandra Bernardi, por toda ajuda, apoio e amizade durante o desenvolvimento desse trabalho;

`

A fam´ılia Siega, que foram e s˜ao muito importantes para que eu conseguisse chegar at´e aqui;

Agradec¸o tamb´em a todos os meus amigos, em especial Cleiton Nicaretta, Edson Bertoldo e Lilian de Souza Vismara, pela companhia nas viagens a Pato Branco e estudo nas disciplinas cursadas;

A equipe da Central de Análises e dos Laboratórios de Qu´ımica da UTFPR, em especial a Dra. C´ıntia Boeira Batista Lafay, pelo fornecimento de espaço, equipamentos, materiais e aux´ılio necessário para a conclusão da etapa experimental;

Agradec¸o a CAPES pelo suporte financeiro atrav´es da bolsa de mestrado. E a todos que direta ou indiretamente fizeram parte do mestrado, o meu muito obrigado.

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SIEGA, Thayllane de Campos. OLEOS ESSENCIAIS NO CONTROLE DO FUNGO´ Sclerotinia sclerotiorum(LIB.) DE BARY IN VITRO. 95 f. Dissertação – Programa de Pós-graduação em Agronomia, Universidade Tecnológica Federal do Paraná. Pato Branco, 2018. A Sclerotinia sclerotiorum é um fungo que causa a doença conhecida por podridão branca da haste ou mofo branco. Em função da capacidade de sobrevivência do fungo no solo através de estruturas especializadas denominadas escleródios e das condições ambientais favoráveis à sua germinação, é indispensável a utilização de medidas integradas considerando o controle qu´ımico e manejo cultural em seu controle. O objetivo do trabalho foi verificar através do tratamento (efeito volátil e tratado) de escleródios com 17 diferentes óleos essenciais, sobre a germinação miceliogênica e carpogênica de S. sclerotiorum, bem como avaliar de maneira mais especializada os óleos de Melaleuca alternifolia, Eugenia uniflora e Casearia sylvestris frente à poss´ıveis alterações morfológicas ocorridas nas hifas através do uso de microscopia eletrônica de varredura (MEV), microscopia óptica (MO) e análise por cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (CG/EM). A germinação miceliogênica foi feita em meio BDA e a incubação em câmara de crescimento do tipo BOD a 18◦C e fotoper´ıodo de 12 horas. Os óleos essenciais (15 µl) foram aplicados em papel filtro autoclavado (1 cm2), fixado na tampa superior da placa de Petri R_{, e os escleródios no centro da placa contendo BDA. Para}

o efeito tratado com 15 µl + 2 ml de ´agua e 1 gota de Tween R

por 2 minutos, dispostos da mesma forma que o tratamento volátil. As avaliações das germinações foram realizadas às 24, 48, 72 e 96 horas após o in´ıcio da incubação. A germinação carpogênica foi induzida em solo esterilizado acondicionado em Gerbox R

e a incubação em câmara de crescimento com temperatura de 18◦C ± 2◦C, fotoper´ıodo de 12 horas e umidade do solo a 100% da capacidade de campo, utilizando dosagem de 30 µl de óleo essencial efeito volátil no papel filtro para 15 escleródios e efeito tratado com 30 µl+ 2 ml de água e 1 gota de Tween R

80 por 2 minutos para 60 escleródios. O delineamento experimental para os dois experimentos, foi o inteiramente casualizado com quatro repetições por tratamento. As análises cromatográficas foram realizadas pela Embrapa Floresta utilizando injeção automática. Foram feitas as imagens no microscópio eletrônico de varredura Hitachi TM 3000, operando em 15 kV, com ampliações de 200, 800 e 1000x. Em microscópio ótico Zeiss modelo Primo Star, acoplado a câmera Axiocam 105 color e ao Software Zen 2.0 lite (blue edition) foram realizadas as imagens das estruturas do fungo. A produção de enzimas extracelulares do fungo também foram realizadas, para amilase, protease, celulase e esterase. Conclui-se que os 17 óleos essenciais utilizados nesse estudo, apresentam potencial de controle do fungo S. sclerotiorum, e sugere-se que a ação fungicida desses óleos essenciais pode estar ligada aos seus componentes majoritários, causando um est´ımulo agressor nas estruturas do fungo, dessa forma as células romperam seu equil´ıbrio homeostático e sofrem um processo regressivo que pode levando a morte celular.

Palavras-chave: escleródios, germinação miceliogênica, germinação carpogênica, mofo branco.

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SIEGA, Thayllane de Campos. ESSENTIAL OILS IN THE CONTROL OF FUNGUS Sclerotinia sclerotiorum(LIB.) DE BARY IN VITRO. 95 f. Dissertação – Programa de Pós-graduação em Agronomia, Universidade Tecnológica Federal do Paraná. Pato Branco, 2018. Sclerotinia sclerotiorumis a fungus that causes the disease known as white stem rot or white mold. Due to the survival capacity of the fungus in the soil through specialized structures called sclerotia and the environmental conditions favorable to its germination, it is indispensable to use integrated measures considering the chemical control and cultural management in its control. The goal of this work was to verify the treatment (volatile and treated efects) of sclerotia with 17 different essential oils, on the myceliogenic and carpogenic germination of S. sclerotiorum, as well as to evaluate in a more specialized way the oils of Melaleuca alternifolia, Eugenia uniflora and Casearia sylvestris in the face of possible morphological changes in the hyphae through the use of scanning electron microscopy (SEM), optical microscopy (OM) and gas chromatography coupled to mass spectrometry (GC/MS). Myceliogenic germination was done in PDA medium and incubation in a BOD type growth chamber at 18◦C and 12 hour photoperiod. The essential oils (15 µl/mL) were applied on autoclaved filter paper (1 cm2), attached to the top lid of the Petri R

plate, and sclerotia in the center of the PDA - containing plate. For the treated effect with 15 µl/ml + 2 ml of water and 1 drop of Tween R _{for 2 minutes, arranged in the same}

manner as the volatile treatment. Germination assays were performed at 24, 48, 72 and 96 hours after the start of incubation. Carpogenic germination was induced in sterilized conditioned soil in Gerbox R _{and incubation in a growth chamber with a temperature of 18} ◦_{C ± 2} ◦_{C, 12} hour photoperiod and soil moisture at 100% field capacity, using dosage of 30 µl/ml essential oil on volatile effect on filter paper for 15 sclerotia and treated effect with 30 µl/ml + 2 ml of water and 1 drop of Tween R _{for 2 minutes for 60 sclerotia. The experimental design for}

the two experiments was the completely randomized with four replicates per treatment. The chromatographic analyzes were performed by Embrapa Floresta using automatic injection. The images were taken on the Hitachi TM 3000 scanning electron microscope, operating at 15 kV, with magnifications of 200, 800 and 1000x on Zeiss optical microscope Primo Star model, coupled with Axiocam 105 color camera and the software Zen 2.0 lite (blue edition) the images of the structures of the fungus were carried out. The production of extracellular enzymes from the fungus was also performed, for anda amilase, protease, celulase e esterase. It is concluded that the 17 essential oils used in this study have potential control of the fungus S. sclerotiorum, and it is suggested that the fungicidal action of these essential oils may be linked to its major components, causing an aggressive stimulus in the structures of the fungus, in this way the cells broke their homeostatic equilibrium and undergo a regressive process that can leading to cell death.

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–

FIGURA 1 Estágios de desenvolvimento do apotécio, iniciação, melanização e alongamento inicial do estipe, diferenciação e maturação do apotécio. . . . 20 –

FIGURA 2 Ciclo de vida da S. sclerotiorum . . . 21 –

FIGURA 4 Cultura pura de Sclerotinia sclerotiorum em placa de Petri R

. . . 34 –

FIGURA 5 Escler´odios de Sclerotinia sclerotiorum . . . 34 –

FIGURA 6 Montagem do experimento em caixa Gerbox . . . 37R –

FIGURA 7 Tratamentos do experimento de germinação carpogênica . . . 38 –

FIGURA 8 Preparação e execução da Microscopia eletrônica de varredura . . . 39 –

FIGURA 9 Discos de mic´elio sendo transferidos em placas de Petri . . . 40R –

FIGURA 10 Meio m´ınimo acrescido de substrato das enzimas a serem avaliadas . . . 41 –

FIGURA 11 Adição de Lugol à placa de Petri R _{. . . 42}

–

FIGURA 12 Extração do corante para revelação da celulase . . . 43 –

FIGURA 13 Germinação miceliogênica (efeito volátil) de escleródios tratados com óleos essenciais . . . 47 –

FIGURA 14 Germinação miceliogênica (efeito tratado) de escleródios tratados com óleos essenciais . . . 49 –

FIGURA 15 Germinação carpogênica (efeito tratado) de escleródios tratados com óleos essenciais . . . 57 –

FIGURA 16 Cromatografia gasosa do ´oleo essencial de Guac¸atonga . . . 58 –

FIGURA 17 Cromatografia gasosa do ´oleo essencial de Pitanga . . . 60 –

FIGURA 18 Cromatografia gasosa do ´oleo essencial de Melaleuca . . . 61 –

FIGURA 19 Microscopia eletrônica de varredura - Tratamento com óleo essencial de Guaçatonga . . . 63 –

FIGURA 20 Microscopia eletrˆonica de varredura - Tratamento com ´oleo essencial de Pitanga . . . 64 –

FIGURA 21 Microscopia eletrˆonica de varredura - Tratamento com ´oleo essencial de Melaleuca . . . 65 –

FIGURA 22 Microscopia óptica - Tratamento com óleo essencial de Guaçatonga . . . 67 –

FIGURA 23 Microscopia ´optica - Tratamento com ´oleo essencial de Pitanga . . . 69 –

FIGURA 24 Microscopia ´optica - Tratamento com ´oleo essencial de Melaleuca . . . 70 –

FIGURA 25 Placas tratadas com óleos essenciais e testemunha, após 48 h de incubação 72 –

FIGURA 26 Placas tratadas com óleos essenciais e testemunha, após 7 dias de incubação 73 –

FIGURA 27 Halos de repelência formados nas placas de S. sclerotiorum após 7 dias de incubação . . . 74 –

FIGURA 28 Comparação entre placas tratadas com óleos de Casearia sylvestris, Eugenia uniflorae Melaleuca alternifolia . . . 74 –

FIGURA 29 Halo de celulase formado em placa de Sclerotinia sclerotiorum . . . 76 –

FIGURA 30 Halo de amilase formado em placa de Sclerotinia sclerotiorum . . . 77 –

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–

TABELA 1 Meio m´ınimo para Amilase, Protease, Celulase e Esterase . . . 41 –

TABELA 2 Percentual médio de germinação miceliogênica: Efeito Volátil . . . 46 –

TABELA 3 Equações de regressão linear para germinação miceliogênica, efeito volátil 48 –

TABELA 4 Percentual médio de germinação miceliogênica: Efeito Tratado . . . 50 –

TABELA 5 Equações de regressão linear para germinação miceliogênica, efeito tratado 52 –

TABELA 6 Dados obtidos 40 dias após aplicação dos óleos essenciais: Efeito Volátil . 54 –

TABELA 7 Dados obtidos 40 dias após aplicação dos óleos essenciais: Efeito Tratado 56 –

TABELA 8 Resultados de diferentes tratamentos de S. sclerotiorum com óleos essenciais para a produção de celulases. . . 75 –

TABELA 9 Resultados de diferentes tratamentos de Sclerotinia sclerotiorum com óleos essenciais para a produção de amilases. . . 77 –

TABELA 10 Resultados de diferentes tratamentos de Sclerotinia sclerotiorum com óleos essenciais para a produção de esterases . . . 78

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CAPES Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de N´ıvel Superior MO Microscopia óptica

CG/EM Cromatografia gasosa acoplada `a Espectrometria de Massas

kV Quilovolt

ppm Partes por milh˜ao BDA Batata, dextrose e ´agar

BOD Biochemical Oxygen Demand

DIC Delineamento inteiramente casualizado MEV Microscopia Eletrˆonica de Varredura

H Halo

C Colˆonia

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g Grama

cm Cent´ımetro

± Variac¸˜ao maior ou menor

µ m Micrômetro mm Mil´ımetro cm2 Cent´ımetro ao quadrado R Marca registrada cm2 Cent´ımetro ao quadrado L Litro ◦ _Grau Kgf Quilograma-força µ l Microlitro ◦_C _{Grau Celsius} eV Elétron-volt kV Quilovolt

NaCl Fórmula qu´ımica do Cloreto de Sódio (NH4)2SO4 Fórmula qu´ımica do Sulfato de Amônio

γ Gama σ Sigma β Beta γ Gama σ Sigma α Alfa

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1 INTRODUÇ ÃO . . . 15 2 OBJETIVOS . . . 17 2.1 OBJETIVO GERAL . . . 17 2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS . . . 17 3 JUSTIFICATIVA . . . 18 4 REFERENCIAL TE ÓRICO . . . 19

4.1 CARACTERIZAC¸ ˜AO DO FUNGO S. sclerotiorum . . . 19

4.2 OLEOS ESSENCIAIS NO CONTROLE ALTERNATIVO DE PAT ´´ OGENOS . . . 22

4.2.1 ´Oleo essencial de Citrus sinensis (L.) Osbeck . . . 23

4.2.2 ´Oleo essencial de Syzygium aromaticum (L.) Merr. & L.M.Perry . . . 23

4.2.3 ´Oleo essencial de Corymbia citriodora (Hook.) K.D. Hill & L.A.S. Johnson . . . 23

4.2.4 ´Oleo essencial de Thymus vulgaris L. . . 24

4.2.5 ´Oleo essencial de Cinnamomum canphora (L.) J. Presl . . . 24

4.2.6 ´Oleo essencial de Citrus reticulata Blanco . . . 24

4.2.7 ´Oleo essencial de Melaleuca alternifolia (Maiden & Betche) Cheel . . . 25

4.2.8 ´Oleo essencial de Cymbopogon citratus (DC.) Stapf . . . 25

4.2.9 ´Oleo essencial de Schinus terebenthifolia Raddi . . . 25

4.2.10 ´Oleo essencial de Psidium guajava L. . . 26

4.2.11 ´Oleo essencial de Eugenia uniflora L. . . 26

4.2.12 ´Oleo essencial de Casearia sylvestris Sw. . . 27

4.2.13 ´Oleo essencial de Artemisia vulgaris L. . . 27

4.2.14 ´Oleo essencial de Citrus latifolia Tanaka . . . 27

4.2.15 ´Oleo essencial de Cyperus articulatus L. . . 28

4.2.16 ´Oleo essencial de Cinnamomum zeylanicum Blume . . . 28

4.2.17 ´Oleo essencial de Zingiber officinale Roscoe . . . 28

4.3 CROMATOGRAFIA GASOSA ACOPLADA `A ESPECTROMETRIA DE MASSAS (CG/EM) . . . 29

4.4 MICROSCOPIA ELETR ˆONICA DE VARREDURA E MISCROSCOPIA ´OPTICA 30 4.5 ENZIMAS EXTRACELULARES . . . 32

5 MATERIAIS E M ´ETODOS . . . 33

5.1 LOCAL DOS EXPERIMENTOS . . . 33

5.2 OBTENÇ ÃO E PRODUÇ ÃO DE ESTRUTURAS DE RESIST ÊNCIA . . . 33

5.2.1 Padronização no tamanho dos escleródios . . . 34

5.2.2 Viabilidade dos escler´odios . . . 35

5.3 OLEOS ESSENCIAIS . . . 35´

5.4 OLEOS ESSENCIAIS COMO CONTROLE ALTERNATIVO NA GERMINAC´ ¸ ˜AO MICELIOG ˆENICA . . . 36

5.5 OLEOS ESSENCIAIS COMO CONTROLE ALTERNATIVO NA GERMINAC´ ¸ ÃO CARPOG ÊNICA DE APOT ÉCIOS . . . 36

(16)

sylvestris, Eugenia uniflora E Melaleuca alternifolia . . . 38

5.6.1 An´alise por CG/EM . . . 38

5.6.2 Microscopia eletrˆonica de varredura (MEV) . . . 39

5.6.3 Microscopia ´optica . . . 40

5.6.4 Potencial de ´oleos essenciais no controle alternativo de Sclerotinia sclerotiorum . . . 40

5.7 PRODUC¸ ˜AO DE ENZIMAS EXTRACELULARES . . . 41

5.7.1 Amilases . . . 42

5.7.2 Celulase . . . 42

5.7.3 Protease . . . 43

5.7.4 Esterases . . . 43

5.8 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL E AN ´ALISES ESTAT´ISTICAS . . . 43

6 RESULTADOS E DISCUSS ˜AO . . . 45

6.1 OLEOS ESSENCIAIS COMO CONTROLE ALTERNATIVO NA GERMINAC´ ¸ ˜AO MICELIOG ˆENICA . . . 45

6.1.1 Avaliação da germinação miceliogênica: Efeito Volátil . . . 45

6.1.2 Avaliação da germinação miceliogênica: Efeito Tratado . . . 48

6.2 OLEOS ESSENCIAIS COMO CONTROLE ALTERNATIVO NA GERMINAC´ ¸ ˜AO CARPOG ˆENICA . . . 52

6.2.1 Avaliação da germinação carpogênica: Efeito Volátil . . . 52

6.2.2 Avaliação da germinação carpogênica: Efeito Tratado . . . 55

6.3 INVESTIGAÇ ÃO DA ATIVIDADE ANTIF ÚNGICA DOS ÓLEOS DE Casearia sylvestris, Eugenia uniflora E Melaleuca alternifolia . . . 58

6.3.1 Avaliação da composição qu´ımica dos principais óleos através de CG/EM . . . 58

6.3.2 Microscopia eletrˆonica de varredura (MEV) . . . 62

6.3.3 Microscopia ´optica . . . 66

6.3.4 Potencial de ´oleos essenciais no controle alternativo do crescimento vegetativo de Sclerotinia sclerotiorum . . . 71

6.4 PRODUÇ ÃO ENZIM ÁTICA . . . 75

7 CONCLUS ˜OES . . . 80

8 CONSIDERAC¸ ˜OES FINAIS . . . 82

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1 INTRODUC¸ ˜AO

O fungo Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary é um fungo que causa a doença conhecida como mofo branco ou podridão branca da haste da soja. Os danos causados são severos e podem acometer uma vasta lista de espécies hospedeiras, fazendo com que se torne um patógeno de grande importância econômica, devido às perdas que pode ocasionar nas culturas atacadas.

Os sintomas caracter´ısticos dessa doença são a podridão úmida coberta por um micélio branco, que pode ser encontrado na superf´ıcie do solo e/ou tecido da cultura atacada (CARDOSO, 1990). Com o avanço da doença, escleródios são formados e estes retornam ao solo com os restos culturais e são responsáveis pela sobrevivência do fitopatógeno (GARCIA et al., 2012).

Através dos escleródios, pode se ter a germinação miceliogênica, onde ocorrerá infecção da planta através das hifas e/ou germinação carpogênica, precursora de apotécios responsáveis pela produção e liberação de milhões de ascósporos na área infectada (GORGEN et al., 2010).

As medidas de controle por serem limitadas, devem ser tomados em conjunto, para se tornarem mais eficientes, visando não permitir a entrada do patógeno ou ao menos reduzir o potencial de inóculo, pois uma vez presente, é dif´ıcil erradicá-lo (BARBOSA; GONZAGA, 2012). Mais comumente, os agricultores fazem o uso de fungicidas qu´ımicos em larga escala, entretanto, por se tratar de um fungo de solo, com estrutura de resistência, o uso desses fungicidas, além de dispendiosos, em muitas situações não apresentam resultados satisfatórios. Os agrotóxicos, estão diretamente ligados à necessidade de maiores n´ıveis de produtividade, por tanto tem um papel importante na cadeia alimentar e na economia, porém seu uso indiscriminado e massivo pode causar graves ricos a saúde humana e ao meio ambiente, devido seus efeitos nocivos. Predominantemente a contaminação por agrotóxicos se dá devido a manipulação imprópria desses produtos, por uma porção de trabalhadores rurais (BARROS, 2010). O uso de agrotóxicos, pode ocasionar outra malfeitoria, a poluição ambiental, que se dá

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por meio da contaminação do sistema hidrológico (RIBEIRO; VIEIRA, 2010).

A demanda por plantas livres de agrotóxicos é crescente, motivando a procura por novas medidas de proteção das plantas contra as doenças. Por tanto, pesquisas relacionadas ao potencial fungicida de substâncias naturais são relevantes, pois podem contribuir no controle alternativo de doenças das plantas de importância agr´ıcola, bem como reduzir as contaminações ambientais e os problemas relacionados à saúde humana, ocasionados pela utilização de fungicidas sintéticos (DE SOUZA ZANELLA et al., 2015).

As substâncias produzidas por algumas plantas atuam como agentes fungistáticos ou fungicidas (ANTUNES; CAVACO, 2010). Alguns trabalhos já demonstraram o potencial de óleos essenciais sobre S. sclerotiorum, sendo assim, alguns estudos utilizando óleos essenciais de plantas medicinais, aromáticas e condimentares vêm sendo realizados com o objetivo de verificar o potencial destas substâncias no controle de fungos fitopatogênicos (SILVA et al., 2009), além disso, o rápido aumento da demanda de frutas e vegetais produzidos organicamente, aumentará a demanda de pesticidas naturais, como óleos essenciais (DE SOUZA ZANELLA et al., 2015). No entanto, trabalhos existentes não contemplam um estudo aprofundado considerando a ação dos óleos sobre as hifas.

Quando S. sclerotiorum infecta a planta, o pH neutro ou ligeiramente alcalino do tecido vegetal estimula a s´ıntese de oxalato, resultando em uma acidificação do meio extracelular. A acidificação do meio induz a atividade de muitas enzimas l´ıticas (ROLLINS; DICKMAN, 1998). A degradação de componentes da parede celular da planta, está ligada à produção de uma ampla e complexa variedade de enzimas hidrol´ıticas, como celulases, hemicelulases, pectinases e proteases. Sequencialmente à secreção pelo fungo, estas enzimas facilitam a penetração, colonização e maceração, mas também geram uma importante fonte de nutrientes (BOLTON et al., 2006).

Microrganismos que utilizam os tecidos das plantas para colonização produzem enzimas extracelulares como forma de mecanismo de resistência do hospedeiro contra invasão microbiana (TAN; ZOU, 2001). E como forma de estabelecimento do papel destes fungos, faz-se necessário a detecção destas enzimas (CARROLL; PETRINI, 1983), como a pectinase, esterases e celulases (PETRINI et al., 1982).

Nesse sentido, um estudo avaliando de forma mais aprofundada a s´ıntese dessas enzimas permite apontar os mecanismos utilizados no processo de infecc¸˜ao.

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2 OBJETIVOS

2.1 OBJETIVO GERAL

Avaliar o potencial dos ´oleos essenciais no controle alternativo do fungo S. sclerotiorum.

2.2 OBJETIVOS ESPEC´IFICOS

• Avaliar o efeito dos óleos essenciais de Zingiber officinale Roscoe, Laurus nobilis L., Citrus reticulata Blanco, Artemisia vulgaris L., Corymbia citriodora (Hook.) K.D. Hill & L.A.S. Johnson, Syzygium aromaticum (L.) Merrill & Perry, Melaleuca alternifolia (Maiden & Betche) Cheel, Thymus vulgaris (L), Citrus sinensis L, Citrus latifolia Tanaka, Psidium guajava Linn., Cyperus articulatus L., Cymbopogon citratus (DC) Stapf, Eugenia uniflora L, Casearia sylvestris Sw., Schinus terbinthifolius Raddi e Cinnamomum zeylanicum Blume com poss´ıvel potencial antifúngico, contra o patógeno Sclerotinia sclerotiorum;

• Avaliar, sob condições controladas, o efeito de diferentes óleos essenciais sobre a germinação miceliogênica e carpogênica de S. sclerotiorum;

• Realizar cromatografia gasosa dos óleos que apresentarem potencial, com poss´ıveis alterações morfológicas ocorridas nas hifas;

• Obter imagens em Microscopia Eletrˆonica de Varredura (MEV), do efeito dos principais ´oleos nas hifas;

• Obter imagens em microscópio óptico para observar poss´ıveis alterações no conteúdo celular e; Realizar teste enzimático no fungo em estudo, tratado com óleos essenciais de, Melaleuca alternifolia, Casearia sylvestris e Eugenia uniflora.

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3 JUSTIFICATIVA

O patógeno S. sclerotiorum é um fungo que sobrevive no solo, produz escleródios e causa a doença conhecida como mofo branco em diversas culturas, dessa forma tornam-se necessárias medidas de controle da doença. Por ser um fungo de dif´ıcil controle, bem como o seu manejo é realizado através do controle qu´ımico e cultural, métodos alternativos que possam contribuir em seu manejo são de grande interesse. Seja para o manejo agroecológico ou em associação com fungicidas, haja visto que os mesmos estão perdendo sua eficiência, considerando a seletividade dos patógenos.

(21)

4 REFERENCIAL TE ´ORICO

4.1 CARACTERIZAC¸ ˜AO DO FUNGO S. sclerotiorum

O fungo Sclerotinia sclerotiorum foi relatado pela primeira vez por De Bary, em 1884, no entanto no Brasil, o primeiro registro dessa doenc¸a foi no estado do S˜ao Paulo em 1921, na cultura da batata (Solanum tuberosum L.) (PURDY et al., 1979; CHAVES, 1964). Pertence taxonomicante ao Reino Fungi, Filo Ascomycota, Classe Discomycetes, Ordem Helotiales e Fam´ılia Sclerotiniaceae (AGRIOS, 1997; HAWKSWORTH et al., 1995).

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E um fungo que causa a doença conhecida por mofo-branco e ataca inúmeras culturas. No Brasil, a lista de espécies hospedeiras é bastante extensa, acometendo mais de 75 fam´ılias botânicas, 278 gêneros e 408 espécies de plantas (DEMANT, 2010; JULIATTI et al., 2010), incluindo um grande número de hortaliças, tais como cenoura, batata, tomate, pimentão, berinjela e algumas folhosas (MENDES et al., 1998), causando perdas de até 100% (SAHARAN; MEHTA, 2008).

O fungo é considerado um dos patógenos mais importantes no mundo e está distribu´ıdo em todas as regiões produtoras, sejam elas temperadas, subtropicais ou tropicais (LEITE, 2005). Os sintomas causados por S. sclerotiorum são murcha, tombamento, escurecimento da região do colo da planta e podridão de ra´ızes. As partes afetadas podem exibir um micélio branco de aspecto cotonoso, junto à superf´ıcie do solo.

Com o avanço da doença, escleródios são formados, estes retornam ao solo com restos culturais e são responsáveis pela sobrevivência do fitopatógeno (GARCIA et al., 2012). Ximenes (2013) descreve que o escleródio é uma estrutura de resistência de cor enegrecida (1 cm ou mais de comprimento), que é composto por uma massa de hifas, que por terém uma consistência firme, são responsáveis pela sobrevivência do fungo no solo durante a entressafra. Através dos escleródios, pode se ter a germinação miceliogênica, onde hifas vão infectar a planta, e/ou germinação carpogênica, precursora de apotécios responsáveis pela produção e liberação de milhões de ascósporos na área infectada (GORGEN et al., 2010).

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Vários fatores influenciam a germinação dos escleródios desse mircrorganismo, tais como: os nutrientes do substrato no qual o escleródio é formado, a idade dos mesmos, os fatores ambientais como umidade, temperatura, luz, pH do solo, aeração e a profundidade na qual o escleródio se encontra no solo (WILLETTS; WONG, 1980; PHILLIPS, 1987). Segundo Turkington et al. (1993) a umidade é importante para colonização da flor e infecção do tecido sadio, sendo que 90% do seu ciclo de vida, ocorre no solo (ADAMS; AYERS, 1979).

Na reprodução sexuada o apotécio libera ascósporos continuamente por 2 a 17 dias, com uma média de 9 dias, sendo que a produção máxima de ascósporos ocorre num intervalo de 2 a 3 dias entre o quarto e nono dia de vida ativa do apotécio (no campo), (CARNEIRO, 2009). Na Figura 1, é poss´ıvel observar os estágios de desenvolvimento do apotécio, iniciação, melanização e alongamento inicial do estipe, diferenciação e maturação do apotécio. Rocha et al. (2007) descreve a capacidade desse fungo de formar escleródio, garante a sobrevivência do mesmo perante condições adversas.

Figura 1: (a) Escleródios com estipes iniciais, (b) Melanização e alongamento das estipes iniciais, (c) Iniciação da diferenciação do estipe, (d) Apotécio crescente e (e) Apotécio Completamente amadurecido, disco apotecial carregado com ascósporos.

Fonte: Selvaraj et al. (2015).

O total de ascósporos produzidos por um apotécio atinge ao redor de dois milhões (SCHWARTZ; STEADMAN, 1978), existem controvérsias quanto ao per´ıodo de viabilidade dos escleródios no solo. Segundo Rocha et al. (2007), tais estruturas podem permanecer por até 11 anos no solo, sustentando seu poder patogênico. Na Figura 2 é poss´ıvel observar o ciclo de vida da S. sclerotiorum.

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Figura 2: Ciclo de vida da S. sclerotiorum Fonte: Heffer e Johnson (2007).

Como a dispersão de S. sclerotiorum ocorre por meio de escleródios misturados às sementes ou através de micélio dormente (KIMATI; BERGAMIN FILHO, 1995), o controle de mofo-branco é muito dif´ıcil, pois essas estruturas de resistência podem permanecer no solo por mais de cinco anos (BARRETO, 1997), o controle tem como base o manejo cultural, de forma a reduzir o potencial de inóculo, uma vez que, por se tratar de um patógeno de solo, o uso de fungicidas qu´ımicos, além de dispendioso, não apresenta resultados satisfatórios.

O controle da podridão branca da haste é considerado dif´ıcil devido ao elevado número de ascósporos produzidos por apotécio e sua rápida e longa disseminação a partir da fonte produtora, sobrevivência em sementes na forma de micélio dormente ou escleródios aderidos as mesmas e a falta de informações sobre o controle biológico e qu´ımico para a cultura da soja (GARCIA, 2008).

Para o controle desta doença, os agricultores vêm utilizando vários fungicidas, sendo que ocorreu um aumento no consumo de agrotóxicos de 700% nos últimos quarenta anos, enquanto a área agr´ıcola aumentou 78% nesse per´ıodo. Como consequências deste aumento, temos a contaminação do solo, da água, dos alimentos e dos ecossistemas (CAMPAGNOLLA;

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BETTIOL, 2003). Uma alternativa para o manejo ecológico de doenças é a substituição dos agrotóxicos por compostos naturais obtidos de plantas (SCHWAN-ESTRADA et al., 2003). Os óleos essenciais e extratos vegetais atuam como fungicidas naturais inibindo a atividade fúngica (STANGARLIN et al., 1999; DOS SANTOS et al., 2010).

4.2 OLEOS ESSENCIAIS NO CONTROLE ALTERNATIVO DE PAT ´´ OGENOS

Os óleos essenciais são formados por um conjunto de compostos naturais, complexos, voláteis, lipof´ılicos, geralmente odor´ıferos e l´ıquidos determinados por um aroma forte, obtidos de plantas, na maior parte das vezes através da técnica de arraste a vapor (GONÇ ALVES, 2012). São organizados por compostos provenientes do metabolismo secundários, normalmente monoterpenos, sesquiterpenos e fenilpropanoides, podem ser obtidos nas flores, folhas, cascas, rizomas e frutos (CRAVEIRO; QUEIROZ, 1993; BIZZO et al., 2009; ABDOLAHI et al., 2010). De acordo com Simões et al. (2010), os óleos essenciais são gerados para funções espec´ıficas, como na atração de polinizadores, na proteção contra predadores, patógenos, perda de água, aumento de temperatura e também desempenhando funções ecológicas. Existem informações da atuação direta de extratos e óleos essenciais de plantas em bactérias, insetos, fungos, efeito alelopáticos, ou indireta, ativando mecanismos de defesa das plantas aos patógenos (ABDOLAHI et al., 2010; BASTOS; ALBUQUERQUE, 2004; CARNELOSSI et al., 2009; OOTANI, 2010).

Dessa forma, essas propriedades tornam as plantas que as produzem grandes originadores de agentes biocidas, sendo amplamente estudadas na agricultura, especialmente devido às atividades bactericidas, inseticidas e fungicidas. São considerados cerca de 3.000 óleos essenciais, dos quais 300 são comercialmente relevantes (BAKKALI et al., 2008).

Pelo fato das plantas medicinais apresentarem uma diversidade de substancias ativas, diversos estudos vêm sendo apresentados quanto a atividade antimicrobiana de óleos essenciais, e os frutos obtidos nessa linha de pesquisa têm-se mostrado favoráveis para uma aplicação prática no controle de fitopatógenos em diferentes culturas, no entanto a atividade dos óleos varia do tipo de microrganismo, do tipo do óleo, de sua concentração, forma de obtenção, caracter´ısticas bióticas e abióticas que interferem no organismo produtor e etc (GONÇ ALVES, 2012).

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4.2.1 Oleo essencial de Citrus sinensis (L.) Osbeck´

A composição do óleo essencial de laranja, é uma mistura complexa, de hidrocarbonetos terpênicos e compostos oxigenados, que são quimicamente variáveis, procedendo 5 a 10% do óleo, que pode conter até 300 diferentes compostos qu´ımicos, divididos em basicamente duas frações, a não volátil constitu´ıda especialmente por flavonoides, carotenóides, e coumarinas; e a volátil composta por alde´ıdos; cetonas; hidrocarbonetos terpênicos, como limoneno, mirceno e valenceno; álcoois, como linalol e ésteres (ASCHERI, 1999; MULLER, 2011).

As espécies c´ıtricas produzem seu óleo essencial nas glândulas da superf´ıcie da casca de frutas e mais comumente são utilizados os processos de extração por arraste a vapor e prensagem a frio (SANTOS et al., 2003). Os mesmos autores explicam que vários fatores podem influir na constituição do óleo essencial, como por exemplo: a forma de cultivo, idade do material, época e local de coleta, condições climáticas e condições de armazenamento.

4.2.2 Oleo essencial de Syzygium aromaticum (L.) Merr. & L.M.Perry´

Segundo Raina et al. (2001) 95% do óleo essencial de cravo da ´ındia é extra´ıdo das folhas. O principal componente do óleo essencial de cravo é o egenol, que possui menores proporções de acetato de eugenol, β -cariofileno, entre outros compostos com proporções pouco representativas (DA GRAÇ A CARDOSO et al., 2007). Diversos autores vem estudando a atividade do eugenol, algumas pesquisas apontam que ele é um composto com potencial bactericida, nematicida e fungicida (DORMAN; DEANS, 2000; TSAO; YU, 2000; DELESPAUL et al., 2000). Em trabalhos de Raina et al. (2001) foi constado que o óleo essencial de Syzygium aromaticum, na concentração de 500 mg Kg-1, viabilizou a inibição de 100% do ´ındice de crescimento micelial para o fungo Rhizoctonia solani e para Fusarium oxysporum.

4.2.3 Oleo essencial de Corymbia citriodora (Hook.) K.D. Hill & L.A.S. Johnson´

A principal matéria prima para a extração do óleo essencial de eucalipto, são as folhas, onde são produzidos em pequenas cavidades globulares, chamadas glândulas, estas encontram-se distribu´ıdas em todo parênquima foliar da maioria de suas espécies (VITTI; BRITO, 2003). Seu óleo é formado por uma complexa mistura de componentes, que envolvem de 50 a 100 ou até mais compostos orgânicos voláteis, dentre os quais destacam-se hidrocarbonetos, álcoois, alde´ıdos, cetonas, ácidos e esters (DORAN, 1991).

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do óleo essencial estaria ligada com a defesa da planta a fatores bióticos e abióticos. Vitti e Brito (2003) evidenciam ainda que a origem biossintética dos óleos essenciais de eucalipto, está ligada com o seu metabolismo secundário, pois o mesmo não é apontado como essencial para a continuidade da vida do organismo, no entanto, confere às plantas a habilidade de aclimação às exigências do meio em que vive.

4.2.4 Oleo essencial de Thymus vulgaris L.´

O óleo essencial de tomilho é produzido a partir da destilação das folhas, atuando em orgismos como antiespasmódico (PEREIRA, 1995). Zambonelli et al. (1996), observaram que este óleo, quando testado em Colletotrichum lindemuthianum e Pythium ultimum, reduziu o crescimento micelial desses fungos, a 800 ppm, causando degeneração das hifas e extravasamento do citoplasma celular.

O seu óleo essencial apresenta composição de ativos reconhecidos, como o timol (40%), carvacrol, 1-8 cineol, borneol, linalol e tanino com caracter´ısticas parecidas a de bactericidas e de fungicidas (PINTO et al., 2001; SCHAUENBERG; PARIS, 1974), sendo de 2 a 5% de sua massa seca como óleo essencial.

4.2.5 Oleo essencial de Cinnamomum canphora (L.) J. Presl´

As espécies da fam´ılia Lauraceae utilizadas para produção de óleos essenciais possuem alto valor econômico, pois são muito requisitadas pelas industrias como fontes de matéria prima (MARQUES, 2001).

De acordo com Frizzo et al. (2000), o óleo essencial do louro, é extra´ıdo principalmente de suas folhas e contém cerca de 90 a 95% de linalol, estando esses valores bem acimas dos encontrados em erva-cidreira e em pau-rosa. Em trabalho de Cansian et al. (2010), o uso do óleo essencial de louro, apresentou atividade antibacteriana principalmente sobre bactérias Gram-positivas.

4.2.6 Oleo essencial de Citrus reticulata Blanco´

A espécie Citrus reticulata Blanco, originária da Ásia, é largamente cultivada no Brasil, muito conhecida popularmente como tangerina, mexerica, bergamota, mandarina e laranja-cravo (MAIA; ZOGHBI, 2001). São escassos os trabalhos de composição qu´ımica do óleo essencial dessa planta.

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Lota et al. (2000), observaram uma grande variabilidade no óleo essencial de tangerina-cravo, com presenças de γ-terpineno (0,2-61,3%), sabineno (0,2-59,4%), N-metilantranilato de metilo (tr-58,0%), linalol (0,2-54,3%) e limoneno (1,5-44,3%) e em uma moderada concentração na maioria dos óleos encontratam p-Cymeno (tr-20,4%), (E)-β -ocimeno (0,6-13,7%), β -pineno (0,1-10,7%) e terpinen-4-ol (0,1-10,6%), também encontram-se dois sesquiterpenos oxigenados ac´ıclicos, α-sinensais e β -sinensais que foram identificados em quase todas as amostras () 1,8%).

4.2.7 Oleo essencial de Melaleuca alternifolia (Maiden & Betche) Cheel´

Melaleuca, é o nome popular da espécie Melaleuca alternifolia, internacionalmente conhecida como Tea Tree, é uma espécie arbórea da fam´ılia Myrtaceae. O óleo essencial é o principal produto dessa planta, tendo grande importância medicinal, é rico em terpinen-4-ol, possui comprovada ação bactericida e antifúngica contra vários patógenos humanos, sendo utilizado em muitas formulações tópicas (RIEDL, 1997; GUSTAFSON et al., 1998). Ele é extra´ıdo das folhas de Melaleuca, através de hidrodestilação ou destilação por arraste a vapor e possui sua composição qu´ımica bem conhecida, garantindo-lhe importância comercial há mais de 60 anos (RUSSELL; SOUTHWELL, 2002; CABOI et al., 2002).

4.2.8 Oleo essencial de Cymbopogon citratus (DC.) Stapf´

Cymbopogon citratus é uma planta de origem asiática, conhecida vulgarmente como capim limão, tem sua ocorrência no Rio Grande do Sul. Pertence ao gênero Cymbopogon da fam´ılia Poaceae (CRONQUIST, 1988). O capim limão manifesta grande produção de massa e, portanto, maior produção de óleo essencial, além de ser mais resistente a doenças que outras espécies (MAY et al., 2008). Da planta é poss´ıvel obter os óleos essenciais mirceno, geraniol e citral. Este último, usado industrialmente como flavorizante, além de ser matéria-prima na s´ıntese de iononas e vitamina A (SIMõES et al., 1998).

4.2.9 Oleo essencial de Schinus terebenthifolia Raddi´

Schinus terebenthifolia Raddi, (Anacardiaceae), popularmente conhecida como aroeira-vermelha, é uma árvore de folhas perenes, originária da América do Sul, especialmente do Brasil, Paraguai e Argentina (DOS SANTOS et al., 2010). Siddiqui et al. (1996), descrevem que o óleo essencial de pimenta rosa tem potencial antimicrobiano e fungistático, outros estudos corroboram com esses autores, pois confirmaram a atividade antifúngica desse óleo

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com resultados positivos para os testes com os fungos de Aspergillus niger, A. flavus, A. parasiticus, A. fumigatus e Trichoderma spp (Scrivanti, Zunino e Zygadlo 2003). Diversas substâncias também foram observadas como a terebinthona, o ácido hidroximasticadienóico, o ácido terebinthifólico e o ácido ursólico (MARTINEZ, 2002).

4.2.10 Oleo essencial de Psidium guajava L.´

A goiabeira tem como origem regiões tropicais da América Central e América do Sul, pertence à fam´ılia das Myrtaceae (PEREIRA, 1995). No gênero Psidium, a que mais se sobressai é a goiabeira, classificada como Psidium guajava L. (ACCORSI et al., 1960; MANICA et al., 2000). Possui grande poder antioxidante devido à presença de vitaminas, carotenóides polifenóis e, particularmente, de ácido ascórbico (NOGUEIRA et al., 1978; QIAN; NIHORIMBERE, 2004).

Alguns trabalhos relatam que nas folhas da goiaba além de ácidos voláteis também estão presentes (E)-ácido cinâmico, (Z)-3-ácido hexenóico, ácidos graxos, α-pineno, p-menten-9-ol, trans-cariofileno, β -bisaboleno, α-humuleno, α-santaleno, d-limoneno, óxido de cariofileno, eugenol, mirceno, β -bisaboleno, aromadendreno, β -selineno e 1,8-cineol (IDSTEIN et al., 1985; OPUTE, 1978; CRAVEIRO et al., 1981; CU ÉLLAR et al., 1984; PINO et al., 2001).

4.2.11 Oleo essencial de Eugenia uniflora L.´

A Eugenia uniflora L., popularmente conhecida como pitanga comum, pitanga verdadeira, pertence `a fam´ılia Myrtaceae, sendo uma das esp´ecies mais estudadas desta fam´ılia (AURICCHIO; BACCHI, 2003).

Em trabalho de Seshadri e Vasishta (1965), isolaram-se de folhas frescas os seguintes compostos: a quercetina e seu derivado 3-arabino-piranósido (guaijaverina) e um glicósido do ácido elágico (4-gentiobiósido).

A diversidade de metabólitos secundários presentes na pitangueira podem apresentar potencial para utilização de compostos da planta na agricultura para ativação de rotas de defesa, com ativação de metabólitos como as fitoalexinas, assim sendo, podem apresentar potencial de utilização no controle alternativo de patógenos em plantas (MAZARO et al., 2008).

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4.2.12 Oleo essencial de Casearia sylvestris Sw.´

Casearia sylvestrisé uma árvore que possui altura de 4-6 metros, com tronco de 20-30 cm de diâmetro, pertence ao gênero Casearia que é reconhecido pela ocorrência de substâncias de interesse, como as cumarinas, flavonoides, lignanas e diversos diterpenos, especialmente clerodânicos. (TALAPATRA et al., 1983; SCHENKEL et al., 1985; SCAVONE et al., 1979; LORENZI; MATOS, 2002).

Sobre a constituição do óleo essencial de folhas de Casearia sylvestris, há relato descrevendo a presença de biciclogermacreno, germacreno-D, β -cariofileno, σ -elemeno como componentes principais (SERTIé et al., 2001). Estudos demonstraram que um de seus compostos secundários mais importantes tem atividade antitumoral e citotóxica (BASILE et al., 1990; RUGGIERO et al., 2002).

4.2.13 Oleo essencial de Artemisia vulgaris L.´

A Artemisia vulgaris, pertence à fam´ılia Asteraceae, popularmente é chamada de absinto, artem´ısia-comum, artem´ısia-verdadeira (LORENZI; MATOS, 2002), cerca de 0,8% de óleo essencial dessa planta é extra´ıdo das suas folhas, que possuem mais de 60% de compostos terpenóide linalol (MARTINS et al., 1995).

Os trabalhos de Soares et al. (1998) e Stangarlin et al. (1997), demonstram que o extrato bruto e óleo essencial de cânfora têm mostrado resultados satisfatórios na inibição do crescimento micelial de alguns fungos e também indução de fitoalexinas em sorgo e soja (SCHWAN-ESTRADA et al., 1997). Na composição qu´ımica desse óleo, se destacam os terpenos (cineol e tuiona), flavonóides, taninos, saponinas, resinas e artemisina (LORENZI; MATOS, 2002).

4.2.14 Oleo essencial de Citrus latifolia Tanaka´

O limão-thaiti é o nome popular dado a espécie Citrus latifolia, tem origem na Índia e no sul da Ásia. É uma espécie rústica, que se desenvolve bem em solos pobres, porém pouco em climas frios (CORR ÊA, 1984). É uma espécie utilizada em casos de febres, infecções, friagens e dores de garganta (LAWLESS, 1995).

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E composta de duas frações, o “flavedo” ou epicarpo e o “albedo” ou mesocarpo. No “flavedo” encontram-se substâncias qu´ımicas como os carotenóides, vitaminas e óleo essencial (MENDONÇ A et al., 2006). Os óleos essências de citrus são misturas de componentes voláteis,

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como terpenos e compostos oxigenados (SATO et al., 1996). O principal componente do óleo essencial é Limoneno, um monoterpeno (LANÇ AS; CAVICCHIOLI, 1990). A qualidade do seu óleo está ligada ao valor dos alde´ıdos totais, essencialmente o conteúdo de citral, que está entre 4-5% (SHAW, 1979).

4.2.15 Oleo essencial de Cyperus articulatus L.´

Vários autores já estudaram o óleo essencial de priprioca, dentre eles, Couchman et al. (1964) e Nyasse et al. (1988) relataram que o aroma da Cyperus articulatus tem despertado interesse da indústria de cosméticos.

O óleo de priprioca é uma exceção com relação à demanda mundial de óleos essenciais, isso é o resultado dessa planta ser pouco conhecida mundialmente e seu aproveitamento ser quase restrito a escala artesanal (DA SILVA, 2012). De acordo com Zoghbi et al. (2008) o óleo essencial da C. articulatus é identificado pela maior porcentagem de αpineno e β -pineno, quando comparado aos óleos das espécies C. prolixus e C. rotundus e pela presença de mustacona.

4.2.16 Oleo essencial de Cinnamomum zeylanicum Blume´

Na literatura, foram encontrados alguns trabalhos que analisaram a composição do óleo essencial de canela. Estes indicam uma grande variedade da constituição qu´ımica, com relatos de pelo menos quatro quimiotipos: eugenol, (E)-cinamalde´ıdo, benzoato de metila, linalole cânfora (THOMAS et al., 1987; SENANAYAKE et al., 1978; VARIYAR; BANDYOPADHYAY, 1989).

A canela e o seu óleo essencial são empregados como corretivos do odor e do sabor na preparação de alguns medicamentos (COSTA, 1975). Os ramos e a parte interna da casca do tronco da árvore de canela, faz com que se tenha um vasto comércio, tanto na parte de perfumes quanto na culinária, devido a ter propriedades aromáticas e condimentares. Também é muito utilizada como carminativa, antiespasmódica e estimulante (CORR ÊA, 1984; COSTA, 1975; ALMEIDA, 1993).

4.2.17 Oleo essencial de Zingiber officinale Roscoe´

O Zingiber officinale Roscoe, conhecido popularmente como gengibre, contém um rizoma ramificado, com aroma e gosto picante e agradável (LORENZI; MATOS, 2002). É

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amplamente utilizado na culin´aria e muito conhecido na medicina tradicional, al´em disso, estudos demonstram que ele apresenta forte atividade antimicrobiana (YADAV et al., 2012).

Tendo em vista o melhor aproveitamento do gengibre, estudou-se a sua capacidade como matéria-prima para produção de óleo essencial de boa qualidade (MAIA et al., 1991). Outros estudos também foram realizados com os extratos e óleos essenciais do gengibre, verificando excelente atividade antimicrobiana, incluindo atividade contra diferentes sorovares de Salmonella (YOUSUFI, 2012).

4.3 CROMATOGRAFIA GASOSA ACOPLADA `A ESPECTROMETRIA DE MASSAS

(CG/EM)

A cromatografia pode ser definida por distintos métodos de detecção, sendo uma técnica que representa o melhor desempenho dentre as técnicas anal´ıticas (CHIARADIA et al., 2008).

Através da combinação de um cromatógrafo com o espectrômetro de massas, unem-se as vantagens da cromatografia (competência da separação com o aumento da seletividade) com as vantagens da espectrometria de massas (aquisição de informação estrutural, massa molar e aumento extra da seletividade) (V ÉKEY, 2001). Segundo Ardrey (2003), é relativamente simples o acoplamento da cromatografia gasosa com a espectrometria de massas.

Flake e Turner (2013) conclu´ıram que através da a cromatografia gasosa de alta resolução acoplada ao espectrômetro de massa juntamente com avanços tecnológicos, contribuem para a análise da composição qu´ımica dos óleos. Kitson et al. (1996) descrevem que as colunas capilares em CG quando são utilizadas, se tornam poss´ıveis de se acoplarem na sa´ıda da coluna diretamente à fonte do espectrômetro, visto que, em situações usuais de operação, o conjunto de bombeamento do espectrômetro de massas é apto a recolher todo o eluente da coluna

Na Cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (CG-EM) é cab´ıvel a compostos voláteis e termicamente estáveis nas temperaturas relativamente elevadas utilizadas al longo da técnica de separação cromatográfica (CHIARADIA et al., 2008). De acordo com Ardrey (2003) estes quesitos são equivalentes àqueles fundamentais para que compostos sejam ionizados.

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4.4 MICROSCOPIA ELETR ˆONICA DE VARREDURA E MISCROSCOPIA ´OPTICA

De acordo com Montanari (2016, p. 2) “os microscópios permitem a observação da célula e da sua estrutura pelo aumento proporcionado através das suas lentes”. Castro (2002) descreve as aplicabilidades do microscópio eletrônico de varredura (MEV), segundo esse autor essa ferramente compreende desde o conhecimento de organismos inteiros, tecidos e órgãos, até em certas circunstâncias, visualização in loco de organelas subcelulares. Castro (2002) ainda relata que

o MEV usa elétrons que se dispersam ou são emitidos a partir da superf´ıcie da amostra. O feixe de elétrons é localizado dentro de uma pequena sonda que passa rapidamente para frente e para trás sobre a amostra. O rastreamento completo de cima abaixo geralmente leva apenas alguns segundos. As diferenças na superf´ıcie da amostra afetam o padrão com o qual os elétrons são dispersos a partir deste. Buracos ou fissuras aparecem escuros, as protuberâncias e saliências aparecem claras, resultando em uma imagem tridimensional (p. 10).

De acordo com Montanari (2016, p. 2) “o microscópio de luz [...] é composto por uma parte mecânica, que serve de suporte; uma parte óptica, que amplia o objeto visualizado, e uma fonte de iluminação, que consiste na luz comum, o que justifica o seu nome”.

Na Figura 3, é poss´ıvel observar as principais diferenças dos microscópio óptico do microscópio eletrônico de varredura, sendo que neste último não é utilizada a luz, mas sim feixes de elétrons, no eletrônico não existe lentes de cristal, mas sim bobinas, que são conhecidas como lentes eletromagnéticas.

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Figura 3: Esquema comparativo entre microscópio óptico e microscópio eletrônico de varredura Fonte: Castro (2002).

Na literatura existem vários trabalhos que utilizam o MEV para estudar o modo de ação de fungos, exemplo esse que pode ser citado em trabalho realizado por Pala Martinelli e dos Santos (2010), onde através de dados adquiridos no estudo comprovam que a microscopia eletrônica de varredura é um instrumento eficiente para contribuir na compreensão do modo de ação dos fungos nematófagos, bem como revelou detalhes de suas estruturas reprodutivas e de captura, confirmando a patogenicidade dos isolados a Tylenchulus semipenetrans e Pratylenchus jaehni.

Segundo Souza et al. (2010) a microscopia óptica foi eficiente quanto a resposta do efeito fumigante, dos óleos essenciais do estudo, pois o mesmo mostrou-se que um poss´ıvel mecanismo de ação destes óleos essenciais acontece por interferir na formação da parede celular. E Zacchino et al. (2003) relatam ainda, que a morfologia das células têm sido utilizada como uma ferramente para apontar novos antifúngicos inibidores de parede celular (ZACCHINO et al., 2003).

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4.5 ENZIMAS EXTRACELULARES

Pascholati e Filho (1995), descrevem que para infectar um hospedeiro, o patógeno necessita penetrar e colonizar os tecidos da planta, assim retirando os nutrientes necessários para sua sobrevivência, para neutralizar as reações de defesa da planta. Para este fim, o patógeno usa substâncias, tais como enzimas, toxinas e hormônios.

Ao longo da união das hifas, ocorre uma desestruturação das paredes celulares, resultado da ação de enzimas hidrol´ıticas no local de encontro das mesmas, no entanto após o contato, o citoplasma e os núcleos se misturam (GLASS et al., 2000).

A análise da presença de enzimas com a capacidade de degradar a parede celular de plantas, animais e outros microrganismos, é um método extensivamente usado na caracterização da variabilidade em fungos fitopatogênicos. Neste processo, o patógeno é considerado um invasor passivo, incapaz de desenvolver força para romper as barreiras estruturais do hospedeiro. Desta forma, sendo o patógeno dependente de enzimas ou outros metabólitos para sua patogenicidade, uma adequada produção destes é requerida (POLONI, 2008).

O principal polissacar´ıdeo de reserva das células vegetais é o amido e as enzimas amilases são capazes e responsáveis pela sua degradação, esta ocorre devido a enzima converter em moléculas de glicose (PASCHOLATI; FILHO, 1995). Já as enzimas celulases, são as responsáveis por degradar a celulose, que é o principal componente da parede celular, hidrolisando as moléculas de glicose (PASCHOLATI; FILHO, 1995).

De acordo com Silva e Esposito (2004), as proteases são um dos principais grupos de enzimas exploradas industrialmente, estas realizam a clivagem hidrol´ıtica da ligação amida entre os grupos carboxila e amina dos aminoácidos formadores de ligação pept´ıdica (SILVA; ESPOSITO, 2004).

As substâncias pécticas por sua vez são polissacar´ıdeos ácido de alta massa molar, que nas plantas formam parte das paredes celulares e da lamela média. Estas enzimas atacam a pectina unida ao resto dos componentes da parede celular, liberando com isso pectina solúvel em alta massa molar (SILVA; ESPOSITO, 2004). As esterases assim como as pectinases atuam nas substâncias pécticas, desfazendo a formação de éster (desesterificação enzimática) dos grupos metoxila da pectina, liberando assim ácido péctico (SILVA; ESPOSITO, 2004).

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5 MATERIAIS E M ´ETODOS

5.1 LOCAL DOS EXPERIMENTOS

As avaliações do potencial miceliogênico e carpogênico foram realizadas no laboratório de Fitossanidade da UTFPR (câmpus Dois Vizinhos). A análise por CG/EM foi feita no laboratório da Embrapa Florestas Curitiba. O MEV foi realizado na central de análises das UTFPR (câmpus Pato Branco). A MO e a avaliação das Enzimas extracelulares, foram realizadas no laboratório do Fitossanidade da UTFPR, (câmpus Dois Vizinhos).

5.2 OBTENÇ ÃO E PRODUÇ ÃO DE ESTRUTURAS DE RESIST ÊNCIA

O isolado de S. sclerotiroum utilizado neste estudo foi obtido de colônia pura da micoteca do Laboratório de Fitossanidade da UTFPR - Dois Vizinhos (Figura 4). Em laboratório, a colônia do fungo foi repicada retirando um disco de BDA (1 L de água destilada para 200 g de batata, 20 g de dextrose e 20 g de ágar) com aproximadamente 0,6 cm de diâmetro, contendo micélio, da borda da colônia e transferida para placa de Petri R_{, incubando-o a 22 ±}

3o. C e fotoper´ıodo de 12 horas, sob luz fluorescente. Após a obtenção dos escleródios, os mesmos foram armazenados na geladeira a 2o.C para posteriormente serem utilizados. Quando se montou os experimentos os escleródios foram previamente desinfestados em álcool a 70% e hipoclorito de sódio a 0,5%, por 30 e 60 segundos, respectivamente. Em seguida, os escleródios foram enxaguados em água destilada estéril por três vezes e transferidos para placas de Petri R

contendo meio BDA, para que novamente nas mesmas condic¸˜oes descritas acima fossem incubados.

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Figura 4: Cultura pura de Sclerotinia sclerotiorum em placa de Petri R_{, proveniente do laborat´orio}

de fitopatologia da UTFPR.

Fonte: Arquivo pessoal (2018).

5.2.1 Padronização no tamanho dos escleródios

Com o objetivo de padronizar o tamanho dos escleródios para não tendenciar as avaliações, estes foram selecionados com paqu´ımetro em tamanho padrão, variando entre 1 a 2 cm, foram selecionados cerca de 4500 escleródios (Figura 5).

Figura 5: Escler´odios de Sclerotinia sclerotiorum selecionados com tamanho padr˜ao (entre 1 a 2 cm).

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5.2.2 Viabilidade dos escler´odios

A viabilidade dos escleródios foi realizada com a indução das germinações miceliogênica e carpogênica dos mesmos. Esse item será melhor descrito no tópico 5.5.2.

5.3 OLEOS ESSENCIAIS´

Os tratamentos referentes aos 17 óleos essenciais foram: Zingiber officinale Roscoe, Laurus nobilisL., Citrus reticulata Blanco, Artemisia vulgaris L., Corymbia citriodora (Hook.) K.D. Hill & L.A.S. Johnson, Syzygium aromaticum (L.) Merrill & Perry, Melaleuca alternifolia (Maiden & Betche) Cheel, Thymus vulgaris (L), Citrus sinensis L, Citrus latifolia Tanaka, Psidium guajava Linn., Cyperus articulatus L., Cymbopogon citratus (DC) Stapf, Eugenia unifloraL, Casearia sylvestris Sw., Schinus terbinthifolius Raddi e Cinnamomum zeylanicum Blume obtidos a partir do processo de hidrodestilação, provindos da empresa Garden city, industria de óleos essenciais Ibiúna-SP.

Os mesmos foram utilizados para os dois experimentos de viabilidade de germinação miceliogênica e carpogênica de escleródios de S. sclerotiorum, os óleos de Casearia sylvestris, Eugenia uniflora e Melaleuca alternifolia foram utilizados para o estudo nas hifas e para a produção enzimática. Os óleos foram filtrados em membrana com tamanho do poro de 0,45 µ m; diâmetro externo de 30 mm; área de filtração de 4; 3 cm2; reservados em micro tubos Eppendorf R_.

A germinação miceliogênica foi feita em meio BDA e a incubação em câmara de crescimento do tipo BOD a 18◦C e fotoper´ıodo de 12 horas. Os óleos essenciais (15 µl) foram aplicados em papel filtro autoclavado (1 cm2), fixado na tampa superior da placa de Petri R_{, e}

os cindo escler´odios no centro da placa contendo BDA. Para o efeito tratado com 15 µl + 2 ml de ´agua e 1 gota de Tween R

por 2 minutos, dispostos da mesma forma que o tratamento volátil. As avaliações das germinações foram realizadas às 24, 48, 72 e 96 horas após o in´ıcio da incubação.

A germinação carpogênica foi induzida em solo nitossolo vermelho distroférrico esterilizado, acondicionado em Gerbox R

e a incubação em câmara de crescimento com temperatura de 18◦C ± 2◦C, fotoper´ıodo de 12 horas e umidade do solo a 100% da capacidade de campo, utilizando dosagem de 30 µl de óleo essencial efeito volátil no papel filtro 1 cm2 para 15 escleródios e efeito tratado com 30 µl + 2 ml de água e 1 gota de Tween R _{80% por 2}

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5.4 OLEOS ESSENCIAIS COMO CONTROLE ALTERNATIVO NA GERMINAC´ ¸ ˜AO MICELIOG ˆENICA

A germinação miceliogênica foi realizada em meio de cultura BDA (batata, dextrose e ágar), contendo para cada 1 L: 200 g de batata, 20 g de dextrose, 20 g de ágar e 1000 mL de água destilada. O ensaio foi conduzido em delineamento inteiramente casualizado (DIC), o fator de sub-subparcela foram os quatro tempos de avaliação, em quatro repetições, sendo cada repetição representada por uma placa de Petri R _{contendo cinco escleródios.}

Os escleródios foram previamente desinfestados em álcool 70% por 2 minutos, hipoclorito de sódio a 1% por 3 minutos, lavados em água autoclavada por 1 minuto e secos ao ar em ambiente asséptico no interior de câmara de fluxo laminar. Foi utilizado o efeito volátil com a dosagem de 15 µl em papel filtro para 5 escleródios e para o efeito tratado, os 5 escleródios referentes a cada repetição, foram submergidos por 2 minutos em uma solução com 15 µl de óleo essencial + 2 ml de água e 1 gota de Tween R _{80% por 2 minutos.}

Posteriormente, em cada placa de Petri R _{foram depositados sobre o meio de cultura}

5 escleródios (unidade experimental) e colocados para germinar. A incubação foi realizada em câmara de crescimento do tipo BOD a 19 ± 1 ◦C e fotoper´ıodo de 12 horas. As avaliações foram às 24, 48, 72 e 96 horas após o in´ıcio da incubação. Em cada avaliação foi determinado o número de escleródios que apresentava germinação.

5.5 OLEOS ESSENCIAIS COMO CONTROLE ALTERNATIVO NA GERMINAC´ ¸ ÃO CARPOG ÊNICA DE APOT ÉCIOS

5.5.1 Autoclavagem do solo

O solo que foi obtido na estação experimental da UTFPR - Dois Vizinhos, sendo descrito como Nitossolo vermelho distroférrico t´ıpico de textura argilosa. Após a coleta o solo foi depositado em sacos de polipropileno (resistentes a altas temperaturas), com espessura de 30 micras e com capacidade de 4 Kg, fechado em sua porção superior com algodão hidrofóbico, e então, levado à autoclave a temperatura de 121◦C e pressão de trabalho de 1,2 Kgf cm-2. O tempo de exposição do solo à autoclave foi de 1 hora autoclavagem/intervalo de 24 h/1 hora autoclavagem, sendo esse processo repetido por 3 dias.

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5.5.2 Montagem do experimento

Amostras de 200 g de solo foram colocadas em caixas Gerbox R

(11 cm x 11 cm x 3,5 cm). Em seguida, os 15 escleródios foram depositados sobre o solo. Após, uma lâmina de água de 6,0 mm foi aplicada por caixa deixando a umidade do solo, durante todo o experimento a 100% da capacidade de campo (Figura 6) (CRATO et al., 2013).

Foram montados experimentos visando o efeito volátil dos óleos nos escleródios, a partir de fitas de papel filtro de 2 cm transferidas com 30 µl colocadas em cada uma das tampas das caixas Gerbox R _{para os 15 escleródios, para a testemunha foram colocadas as mesmas}

quantidades de ´agua destilada, e efeito tratado com 30 µl + 2 ml de ´agua e 1 gotas de Tween R

80% por 2 minutos para 60 escler´odios (Figura 7). Logo em seguida as caixas foram incubadas `a temperatura de 19 ± 1◦C, sob fotoper´ıodo de 12 h de luz e 12 h de escuro, por um per´ıodo de 30 dias.

As avaliações foram efetuadas de seguinte forma, a primeira contando o percentual médio de escleródios que emitiram estipes e o número total de estipes, o percentual médio de escleródios que germinaram apotécios e o número total de apotécios. A primeira avaliação foi efetuada após a emissão do primeiro estipe, até o momento de completarem 40 dias de incubação.

(a) Pesagem do solo. (b) Papel filtro tratado com ´oleo essencial, fixado na tampa da caixa Gerbox R_,

contendo 15 escler´odios. Figura 6: Montagem do experimento em caixa Gerbox R_.

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Figura 7: Tratamentos do experimento de germinação carpogênica, caixas Gerbox R _devidamente

vedadas, com 15 escleródios por repetição e umidade próxima à capacidade de campo. Fonte: Arquivo pessoal (2018).

5.6 INVESTIGAÇ ÃO DA ATIVIDADE ANTIF ÚNGICA DOS ÓLEOS DE Casearia sylvestris, Eugenia uniflora E Melaleuca alternifolia

5.6.1 An´alise por CG/EM

Amostras dos óleos essenciais de C. sylvestris, E. uniflora e M.alternifolia, foram submetidas a cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas. A comparação dos espectros de massa e ´ındices de retenção com os valores da literatura para os componentes mais comuns de óleos essenciais.

As análises cromatográficas foram realizadas utilizando injeção automática (TripPlus As, Thermo) em um cromatógrafo gasoso (Focus GC,Thermo) acoplado a um espectrômetro de massas de ´ıon trap (Polaris Q,Thermo). As amostras foram injetadas com divisão de fluxo (Split) 1:50 (1µL), e separadas através de coluna cromatográfica modelo DB-5 (30 m x 0,025 mm, Agilent). A separação dos compostos foi feita com temperatura do injetor a 230 ◦C, linha de transferência 250 ◦C, com fluxo constante e compensação a vácuo. Programação de temperatura do forno: 40◦C, isoterma de 6 min, aquecimento até 300◦C na taxa de 3◦ C.min-1, com isoterma final de 5 min. O espectrômetro de massas foi operado no modo positivo de ionização por impacto de elétrons a 70 eV, com temperatura da fonte de ´ıons em 200◦C.

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5.6.2 Microscopia eletrˆonica de varredura (MEV)

A microscopia eletrônica de varredura (MEV) foi realizada para avaliar a estrutura superficial das hifas do fungo em estudo submetido ao tratamento pelos óleos de C. sylvestris, E. uniflorae M. alternifolia. Foi realizado um estudo mais detalhado das poss´ıveis alterações morfológicas nas estruturas do fungo.

Para isso, o isolado puro da micoteca foi repicado em placa de Petri R_{, retirando discos}

do micélio que foram transferidos para o meio da placa devidamente esterilizadas com meio de cultura BDA. Após a repicagem na tampa da placa, foram colocadas os 15µl dos principais óleos, as placas foram vedadas e levadas para a BOD por 48 horas. Para as análises, as amostras utilizadas foram cuidadosamente fixadas através de uma fita adesiva de cobre sobre um suporte de alum´ınio e alocadas no equipamento, (Figura 8).

Foram feitas as imagens no microscópio eletrônico de varredura Hitachi TM 3000, operando em 15 kV, com ampliações de 200, 800 e 1000x. As alterações que foram observadas nas imagens foram devidamente descritas nos resultados. Foram observados a presença de vacúolos, desorganização dos conteúdos celulares, diminuição da nitidez da parede celular, fragmentação das hifas, turgência das hifas.

(a) Fita de cobre. (b) Preparo da amostra. (c) Amostra fixada.

(d) MEV sendo realizada no Hitachi TM 3000.

Figura 8: Preparação e execução da Microscopia eletrônica de varredura. Fonte: Arquivo pessoal (2018).

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5.6.3 Microscopia ´optica

Para investigar o efeito dos óleos essenciais de C. sylvestris, E. uniflora e M. alternifolia sobre o crescimento de S. sclerotiorum, foi realizada a raspagem do micélio do fungo tratado descrito no item 5.6.2 em uma gota de Lactofenol Amann sobre a lâmina. Com o aux´ılio de agulhas histológicas, dilacerou-se o micélio, que foram cobertos com lam´ınula e levados para exame em microscópio ótico Zeiss modelo Primo Star, acoplado a câmera Axiocam 105 color e ao Software Zen 2.0 lite (Blue Edition).

Foram examinadas 4 lâminas por tratamento. Simultaneamente foram feitos controles negativos (sem óleo). Após 24 horas de incubação, os discos foram levados ao microscópio óptico, para análise das alterações celulares das hifas.

5.6.4 Potencial de ´oleos essenciais no controle alternativo de Sclerotinia sclerotiorum

Para investigar o controle fungistático ou fungicida dos óleos essenciais, estes foram incubados novamente em placas de Petri R _{de 9 cm de diâmetro contendo meio BDA e mantidos}

a temperatura de 19± 1 ◦C por 7 dias, a fim de se observar se houve ou n˜ao crescimento radial das colˆonias dos fungos em estudo (Figura 9). Esses experimentos foram realizados em triplicata.

Figura 9: Discos de mic´elio do fungo em estudo sendo transferidos novamente em placas de Petri R

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5.7 PRODUC¸ ˜AO DE ENZIMAS EXTRACELULARES

Discos de 5 mm de diˆametro do mic´elio do isolado foram transferidos individualmente para placas de Petri R

, contendo meio m´ınimo (Tabela 1), acrescido do substrato das enzimas a serem avaliadas (Figura 10). As mesmas foram mantidas por 5 dias a 25◦C em estufa BOD, com fotoper´ıodo de 12 horas. Todos os experimentos foram realizados em triplicata.

A quantificação da atividade enzimática, foi realizada pela análise da relação H/C, obtida pela divisão da média do diâmetro do halo (H) nas repetições pela média do diâmetro da colônia (C).

Tabela 1: Meio m´ınimo para Amilase, Protease, Celulase e Esterase. Dois Vizinhos - PR, 2018.

Nutriente Sigla g/L

Nitrato de S´odio NaNo3 6,0 g

Fosfato Monopot´assico KH₂PO₄ 1,52 g

Sulfato de Magn´esio Heptahidratado MgSO₄.7H2O 0,52 g

Cloreto de Pot´assio KCl 0,52 g

Sulfato de Ferro FeSO4 0,01 g

Cloreto de Zinco ZnCl₄ 0,01 g

´

Agar - 15,0 g

´

Agua Destilada - 1000 mL

Fonte: Autoria pr´opria (2018).

(a) Meio m´ınimo com substrato das enzimas a serem avaliadas.

(b) Discos de mic´elio do fungo em placas de Petri .R

Figura 10: Meio m´ınimo acrescido de substrato das enzimas a serem avaliadas. Fonte: Arquivo pessoal (2018).

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5.7.1 Amilases

Para o substrato, foi acrescentado 1% de amido solúvel ao meio de cultura, a revelação foi feita através da adição de Lugol à placa de Petri R _{para ver o halo (Figura 11). Os resultados}

das reações enzimáticas positivas foram identificados pela formação do halo que é formado em contraste com o meio escurecido.

Figura 11: Adição de Lugol à placa de Petri R _{para a revelação do halo em contraste com o meio.}

Fonte: Arquivo pessoal (2017).

5.7.2 Celulase

O substrato foi acrescido 1% de carboximetilcelulose (CMC) ao meio m´ınimo e para a revelação utilizou-se a adição de uma solução de vermelho congo por 15 minutos, posteriormente o corante foi removido com solução de NaCl 4N. Os resultados das reações enzimáticas positivas foram observados com a formação de um halo alaranjado em contraste com o meio avermelhado.