TÍTULO: EXPRESSÃO PROTEICA DE CATEPSINA B EM FIBROBLASTOS DE CAMUNDONGOS COM DEFICIÊNCIA DE NEURAMINIDASE 1
TÍTULO:
CATEGORIA: CONCLUÍDO CATEGORIA:
ÁREA: CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E SAÚDE ÁREA:
SUBÁREA: Biomedicina SUBÁREA:
INSTITUIÇÃO(ÕES): CENTRO UNIVERSITÁRIO DAS FACULDADES METROPOLITANAS UNIDAS -FMU
INSTITUIÇÃO(ÕES):
AUTOR(ES): SARA BORGES VIANA AUTOR(ES):
ORIENTADOR(ES): JULIANA DE CARVALHO NEVES ORIENTADOR(ES):
COLABORADOR(ES): EDMAR ZANOTELI COLABORADOR(ES):
Ácidos siálicos são substâncias encontradas nas porções terminais de grupos carboidratos de glicolipídeos e glicoproteínas. As neuraminidases são enzimas que clivam e controlam a quantidade de ácido siálico, regulando assim diversos processos celulares. A neuraminidase 1 (Neu1) está localizada nos lisossomos e a sua deficiência acarreta a hipersialilação de catepsinas. A hipótese deste estudo foi que deficiência de Neu 1 alteraria o metabolismo da catepsina B, a qual teria expressão aumentada no citosol de fibroblastos de camundongos nocauteados para o gene de Neu1 (Neu1-/-). Como consequência, a catepsina B poderia permanecer ativa nos fibroblastos do tecido conjuntivo da musculatura esquelética, promovendo a degradação de componentes musculares. Isso poderia explicar em parte o mecanismo da degeneração muscular observada nos camundongos com deficiência de (Neu1-/-).
2.INTRODUÇÃO
Ácidos siálicos são substâncias encontradas nas porções terminais de grupos carboidratos de glicolipídeos e glicoproteínas. Estas moléculas têm sido relacionadas com importantes processos biológicos, tais como mudanças conformacionais de glicoproteínas e reconhecimento e marcação de sítios biológicos. As sialidases são enzimas que clivam e controlam a quantidade de ácido siálico em nível proteico e celular, em cooperação com as sialiltransferases. Em células animais, foram identificados quatro tipos geneticamente distintos de sialidases, a neuramidase-1 localizada nos lisossomos (NEU1), a NEU2 no citoplasma, a NEU3 na membrana plasmática e a NEU4 nas mitocôndrias (Monti et al., 2002; Miyagi e Yamaguchi, 2007).
A N-acetil-α-neuraminidase 1 (Neu1) adquire conformação ativa e estável nos lisossomos através da associação com a PPCA (serina carboxypeptidase protective protein/cathepsin A) e faz parte de um complexo proteico de alto peso molecular, composto pela PPCA, β-galactosidase (β-gal) e a sulfatase N-acetilgalactosamina-6-sulfato (Bonten et al., 1996). A formação desse complexo protege a NEU1 contra proteólise e mantém sua conformação cataliticamente ativa.
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A deficiência da NEU1 em humanos está associada a duas doenças lisossomais de depósito geneticamente distintas: a sialidose, causada por mutações no gene NEU1, localizado no cromossomo 6p21 (Thomas, 2001); e a galactosialidose (GS), causada por deficiência primária da PPCA, acarretando instabilidade do complexo proteico e deficiência secundária da NEU1 e da β-gal (d'Azzo et al., 2001). Pacientes com sialidose desenvolvem um amplo espectro de manifestações clínicas, variando de acordo com a época do início e com a gravidade dos sinais e sintomas, frequentemente correlacionando-se com os níveis de atividade enzimática residual da NEU1 (Bonten et al., 2000). A sialidose do tipo 1 é a forma mais branda da doença, ocorre na segunda década de vida e resulta em perda progressiva de visão, associada à degeneração macular (cherry-red spots), nistagmo, ataxia e síndrome mioclônica, porém sem alterações dismórficas significativas (Thomas, 2001). Já a sialidose tipo 2 é a forma grave da doença, com manifestações no período perinatal, caracterizada por hidropsia fetal, ascite neonatal, alterações dismórficas, aspecto Hurler-like, disostose multiplexa, hepatoesplenomegalia e grave comprometimento neurológico. Um subgrupo de pacientes com sialidose desenvolve sintomas de envolvimento muscular, incluindo hipotonia, atrofia e deformidades osteoesqueléticas (Bonten et al., 2000).
Os modelos animais para estudo da sialidose foram os camundongos Neu1-/-, que possuem o gene Neu1 nocauteado pela inserção de um cassete β-geo (lacZ-PGK-neoR) no éxon 1. Como resultado, uma forma truncada não funcional de Neu1 é traduzida (de Geest et al., 2002). Os camundongos Neu1-/- são menores que seus controles normais desde o período perinatal. No primeiro mês de vida já excretam oligossacarídeos sialilados, quando também surgem os primeiros sinais da doença, como o edema subcutâneo. Em estágios mais avançados, os animais estão debilitados e apresentam tremores e dificuldade na locomoção. Com idade de 6 a 9 meses morrem devido à anorexia, causada por hiperqueratose do aparelho digestivo (de Geest et al., 2002).
Os mecanismos pelos quais a deficiência da NEU1 acarreta comprometimento de vários tecidos têm sido investigados há vários anos e ainda não estão totalmente esclarecidos. A principal alteração histológica inclui vacuolização do citoplasma de vários tipos celulares, tais como fibroblastos, linfócitos, células de Kupffer, hepatócitos, células renais, neurônios, músculo cardíaco e esquelético, tanto em pacientes com sialidose quanto em camundongos Neu1-/- (Lowden e O'Brien, 1979;
de Geest et al., 2002). A falha no controle da quantidade de ácido siálico em diversas moléculas parece ser um dos fatores básicos da fisiopatogenia na sialidose (Hinek et al., 2008; Yogalingam et al., 2008). A Neu1 participa do processo de exocitose lisossomal através da regulação da quantidade de ácido siálico da proteína Lamp-1, a qual seria um de seus substratos (Yogalingam et al., 2008). Haveria uma relação inversa entre a gravidade da doença, os níveis de Lamp-1 na superfície celular e de exocitose lisossomal. Portanto, a indução anormal de exocitose lisossomal pode estar diretamente implicada na patogênese das manifestações sistêmicas características da doença.
Em estudo prévio realizado por nosso grupo, demonstramos que a deficiência de Neu1 leva a hipersialilação de catepsina B, e que esta alteração é corrigida pela administração de neuraminidase (Zanoteli et al., 2010). A hipótese é de que a hipersialilação de catepsinas afetaria sua atividade e sua compartimentalização nos lisossomos. Assim, as catepsinas hipersialiladas permaneceriam no citosol, de forma ativa, promovendo agressão a componentes celulares (aumento da degradação). Isto poderia explicar em parte a importante atrofia muscular que ocorre nos animais com deficiência de Neu1.
3. OBJETIVOS
Investigar a expressão de catepsina B em fibroblastos de camundongos com deficiência de Neu1, bem como nas frações lisossomal e no citosólica.
4. METODOLOGIA
Pesquisa experimental.
5. DESENVOLVIMENTO
Animais
Camundongos Neu1+/- (de Geest et al., 2002) de linhagem FVB isogênica foram cruzados e mantidos no Centro de Bioterismo da FMUSP em temperatura e umidade controladas, com ciclos de 12 horas de luz e escuro alternados, comida e
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água ad libitum. Neste estudo, foram utilizados 5 camundongos Neu1-/- (nocautes) e 5 Neu1+/+ (normais) com um mês de idade. Os experimentos descritos abaixo foram realizados de acordo com as normas que estabelecem os procedimentos para o uso científico de animais no país (Lei 11.794 de 8 de outubro de 2008), no Laboratório de Investigação em Medicina 45 (LIM45) da FMUSP.
Genotipagem
Os filhotes com 21 dias de vida foram desmamados e genotipados por meio de PCR multiplex, a partir do DNA extraído de um fragmento da cauda, incubado em tampão de lise (Tris 1M pH 7.5, NaCl 5M, EDTA 0.5M, SDS 20% e proteinase K). Na PCR, as amostras passaram por um ciclo inicial de desnaturação (98oC por 3 minutos); seguido por 35 ciclos a 98oC por 30 segundos, 70oC por 30 segundos e 72oC por 90 segundos; com um passo final de extensão a 72oC por 10 minutos. Os oligonucleotídeos usados para genotipagem foram: MNTG1-sense (5’ – GACAGGGATCGCCGGGAGCTATGG- 3’), MNTG2-antisense (5’ – CACCAGGCTGAAGTCATCCTCTGC- 3’), e LacZ-Lac3KO (5’ – GATAGGTCACGTTGGTGTAGATGGGCG- 3’). Os produtos da PCR foram submetidos à eletroforese em gel de agarose 2%, contendo brometo de etídio para visualização em luz de ultravioleta.
Cultura de fibroblastos
O cultivo de fibroblastos foi estabelecido a partir de fragmentos de pele coletados após a eutanásia dos camundongos não submetidos a nenhum tratamento. As peles foram tricotomizadas, dissecadas, lavadas em PBS e o excesso de tecido subcutâneo foi removido. Após 3 lavagens em meio L15, foram incubadas com dispase II 0,5% (Boehringer-Mannheim) por 1 hora em banho úmido a 37ºC. Em seguida, a epiderme foi removida mecanicamente utilizando uma pinça curva. As peles foram lavadas em L15 e fragmentadas para dissociação enzimática com colagenase I 1000U/mL (Worthington Biochemical) durante 1 hora em banho úmido a 37ºC. Foram adicionados 3mL de D20 gelado, os lisados foram vortexados vigorosamente, centrifugados durante 10 minutos a 1500rpm a 4ºC e
ressuspendidos em 3mL de D20. O meio D20 foi trocado após 24, 48 e 72 horas para remoção dos debris e depois a cada dois dias.
Fracionamento celular
As frações citosólica e lisossomal de fibroblastos Neu1-/- e Neu1+/+ foram separadas utilizando o Lysosome Isolation Kit (Sigma-Aldrich, LYSISO1), sendo 2.108 fibroblastos por amostra. As células foram lisadas por maceração na presença de Extraction Buffer e centrifugadas a 1000g por 10 minutos a 4ºC. O sobrenadante foi coletado e novamente centrifugado a 16100g por 25 minutos. A fração citosólica presente no sobrenadante desta centrifugação foi coletada, e o pellet contendo a fração lisossomal ressuspendido em 400µL de Extraction Buffer.
Western blotting
Para a extração de proteínas dos fibroblastos, as placas de petri de 100mm foram lavadas duas vezes com PBS gelado, e adicionaram 300µL de RIPA gelado (tris - HCl 50mM, EDTA 1mM; EGTA 1mM; tergitol NP-40 1%; SDS 0,1%; deoxicolato de sódio 0,5%; inibidor de proteases: Sigma P8340 1%; inibidores de fosfatase: ortovanadato de sódio 10mM; fluoreto de sódio 50mM; pirofosfato de sódio 10mM diluídos em PBS pH7,4) em cada uma. As células foram removidas utilizando raspador gelado, transferidas para tubo de microcentrífuga gelado e mantidas em agitação por 30 minutos a 4ºC. Os lisados foram sonicados 3 vezes por 10 segundos, centrifugados a 12 000 rpm por 20 minutos a 4ºC, e os debris descartados. A concentração proteica das amostras foi determinada pelo método de Bradford utilizando BSA na curva padrão.
Para a corrida eletroforética, foram utilizados 10 µg de proteínas, acrescidos de tampão marcador de corrida e β-mercaptoetanol. As amostras foram aquecidas a 95ºC por 5 minutos e mantidas no gelo pelo mesmo tempo. Em seguida, foram aplicadas em gel SDS-PAGE (acrilamida 10%) e submetidas à eletroforese com voltagem de 100V, por 1 hora, em aparato da marca BioRad. As proteínas foram transferidas para uma membrana de PVDF (50V por 45 minutos) e posteriormente incubadas em tampão de bloqueio contendo BSA 5% diluído em TBS-T (Tris 50mM pH 7,5, NaCl 150 mM e Tween 20 0,1%), durante 1 hora em temperatura ambiente.
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As membranas foram incubadas overnight a 4ºC com anticorpo primário (Tabela 1) diluído em BSA 5%. Após três lavagens de 10 minutos com TBS-T, as membranas foram incubadas no anticorpo secundário pertinente (Tabela 1) diluído em leite desnatado 1% por 1 hora em temperatura ambiente. Após nova série de três lavagens com TBS-T, as membranas foram expostas ao substrato quimioluminescente durante 3 minutos e reveladas no equipamento C-Digit Blot Scanner (LI-COR Biosciences). A homogeneidade das amostras foi conferida por coloração das membranas com Coomassie Brilliant Blue.
Tabela 1: Anticorpos utilizados no Western blotting. Peso molecular (kDa) Hospedeiro Clone Marca Código Diluição Anti - catepsina B 39/42 Coelho H190 Cell Signaling 3383 1: 2 000 Anti - catepsina L 25/42 Camundongo 33/2 Sigma C2970 1: 1 000 Anti - coelho (HRP) - - Abcam AB97051 1: 20 000 Anti - camundongo (HRP) - - Rockland 610-1319 1: 20 000 6. RESULTADOS Expressão proteica
O estudo realizado comparou por meio do western blotting a diferença entre a expressão de catepsina B dos camundongos Neu1+/+ eNeu1-/-. A expressão da pró-catepsina B não apresentou alterações quando comparados Neu1+/+ e Neu1-/-, sendo manifestada de forma semelhante nos dois genótipos animais. Entretanto, a respeito da análise da Catepsina B, foram observadas diferenças quanto ao peso molecular e a intensidade das bandas (Figura 1). A deficiência de Neu 1 acarreta o acúmulo de ácido siálico, que leva à alteração do metabolismo da catepsina B, ocasionando a hipersialilação da mesma (Zanoteli et al., 2010). Desta forma, o maior peso
molecular da catepsina B em fibroblastos Neu1-/- corresponderia ao ácido siálico ligado a ela, e a espessura da banda ao acúmulo de catepsina B.
Figura 1: Expressão proteica de catepsina B em fibroblastos normais (Neu1+/+) e com deficiência de neuraminidase 1 (Neu1-/-).
Fracionamento de catepsina B
Ao realizar o fracionamento celular para a separação do citosol dos lisossomos de fibroblastos Neu1+/+ e Neu1-/-, observa-se que a expressão de catepsina B em ambos os compartimentos celulares apresentou-se mais elevada nos camundongos Neu1-/- quando comparados com os camundongos Neu1+/+. Estando hipersialilada (hiperativada) e localizada no citosol pela compartimentalização inadequada devido à deficiência de Neu 1, a catepsina B torna-se potencialmente deletéria nos fibroblastos do tecido conjuntivo dos músculos esqueléticos.
Figura 2: Expressão proteica de catepsina B nas frações citosólicas e lisossomal de fibroblastos normais (Neu1+/+) e com deficiência de neuraminidase 1 (Neu1-/-).
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A expressão da catepsina B está aumentada nas culturas de fibroblastos de camundongos com deficiência de Neu1, assim como nas frações do citosol e lisossomos. Estudos adicionais já estão sendo conduzidos pelo nosso grupo de pesquisa no sentido de tentar reverter os efeitos apresentados neste estudo, através do tratamento de fibroblastos Neu1-/- com neuraminidase.
8. FONTES CONSULTADAS
Bonten E. Characterization of human lysosomal neuraminidase defines the molecular basis of the metabolic storage disorder sialidosis. Genes Dev. 1996 10(24):3156-69
Bonten EJ. Novel mutations in lysosomal neuraminidase identify functional domains and determine clinical severity in sialidosis. Hum Mol Genet. 2000 9(18):2715-25.
d'Azzo A. Galactosialidosis. In: Scriver CR, Beaudet AL, Sly WS, Valle D, editors. The metabolic and molecular bases of inherited disease. 8 ed. New York: McGraw-Hill Publishing Co.; 2001. p. 3811-26.
de Geest. Systemic and neurologic abnormalities distinguish the lysosomal disorders sialidosis and galactosialidosis in mice. Hum Mol Genet. 2002 11, 1455-64. Hinek. Neuraminidase-1, a subunit of the cell surface elastin receptor, desialylates and functionally inactivates adjacent receptors interacting with the mitogenic growth factors pdgf-bb and igf-2. Am J Pathol. 2008 173(4):1042-56.
Lowden JA, O'Brien JS. Sialidosis: A review of human neuraminidase deficiency. Am J Hum Genet. 1979 31(1):1-18.Miyagi T, Yamaguchi K. Biochemistry of glycoconjugate glycans: Sialic acids. In: Kamerling JP, Boons G, Lee YC, Suzuki A, Taniguchi N, Voragen AGJ, editors. Comprehensive glycoscience. Amsterdam: Elsevier; 2007. p. 297–322.
Monti E. Recent development in mammalian sialidase molecular biology. Neurochem Res. 2002 27(7-8):649-63.
Thomas GH. Disorders of glycoprotein degradation and structure: Α-mannosidosis, β-mannosidosis, fucosidosis, and sialidosis. The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease. 2001 3507–34.
Zanoteli; E. Muscle degeneration in neuraminidase 1-deficient mice results from infiltration of the muscle fibers by expanded connective tissue. Biochim Biophys Acta 2010. 1802, 659-72.
