Renan Pozzi
Avaliação da proliferação celular e apoptose em
células da mucosa bucal de ratos expostos ao
decanoato de nandrolona
Santos
2012
Renan Pozzi
Avaliação da proliferação celular e apoptose em
células da mucosa bucal de ratos expostos ao
decanoato de nandrolona
Orientador: Prof. Dr. Daniel Araki Ribeiro
Santos
2012
Dissertação de Mestrado apresentada à Universidade Federal de São Paulo – Campus Baixada Santista – como parte dos requisitos para a obtenção do título de Mestre em Ciências.
Pozzi, Renan
Avaliação da proliferação celular e apoptose em células da mucosa bucal de ratos Wistar expostos ao decanoato de nandrolona
xvi, 92f
Dissertação (mestrado): Universidade Federal de São Paulo. Programa de Pós Graduação Interdisciplinar em Ciências da Saúde.
Cell proliferation and apoptosis in rat oral mucosa cells exposed to nandrolone decanoate
III
Universidade Federal De São Paulo
Campus Baixada Santista
Departamento de Biociências
Chefe de Departamento de Biociências: Prof. Dr. Odair Aguiar Júnior Coordenador do Curso de Pós Graduação: Prof. Dr. Daniel Araki Ribeiro
IV
Renan Pozzi
Avaliação da proliferação celular e apoptose em células da mucosa bucal de ratos expostos ao decanoato de nandrolona
Presidente da Banca: Prof. Dr. Daniel Araki Ribeiro
BANCA EXAMINADORA
Prof. Dr. Cesar Cilento Ponce
Prof. Dr. Marcelo Donizetti Chaves
Profª. Drª. Alessandra Medeiros
V DEDICATORIA
Aos meus pais João Luis Pozzi e Edna Aparecida Lourenço Pozzi e ao meu irmão Alexandre Pozzi, sem vocês, eu, com certeza, não estaria aqui.
A Camila Baldini Mourão, minha namorada, por estar sempre ao meu lado. A todos que fizeram parte desse trabalho e que de alguma forma contribuíram para que esse estudo fosse concluído.
VI AGRADECIMENTOS
Ao meu professor, orientador e amigo Daniel Araki Ribeiro pela orientação, pela amizade, por acreditar no meu potencial e no meu trabalho, pela oportunidade de um grande aprendizado e pela grande experiência tanto acadêmica como de vida.
À Professora Dra. Ana Claudia Muniz Rennó pelo auxílio no trabalho.
À professora Dra. Helena Regina Cômodo Segreto, Professora Adjunta do Departamento de Medicina e Chefe do Laboratório de Radioterapia Experimental, pelo apoio e por ter me recebido de braços abertos em seu laboratório.
Aos meus queridos amigos e companheiros de trabalho:
Kelly Rossetti Fernandes por ter me ajudado no delineamento experimental. Renato Martins pela força no trabalho e, claro, pelas boas risadas nesses anos. Juliana Carvalho por sempre ter me incentivado e pelo companheirismo.
Carolina Foot G. de Moura pela grande ajuda e por sempre estar disposta a ajudar.
Victor Hugo Pereira da Silva pela sua boa vontade. Gustavo Jesus pela ajuda dentro do laboratório
Renata Tome Luri nas conversas dentro e fora da faculdade.
Juliana Nogutti pela grande ajuda nos cortes e da recepção no laboratório.
Jeferson André Bertolin, Hananiah Tardivo Quintana e Ângela M. P. Magri, Lívia Assis companheiros de laboratório.
VII
Às professoras Raquel Mesquita Ferrari e Kristianne Porta pelo fornecimento do esteróide anabolizante decanoato de nandrolona.
Ao Professor Dr. Marcelo Donizeti Chaves pela ajuda e pelo apoio. Marcelo, técnico do Laboratório de Patologia.
Priscila, técnica do Laboratório de Radioterapia Experimental. A minha família que se não fosse ela não estaria aqui.
A minha namorada pelo carinho, amizade, companheirismo, amor e por tudo que fez por mim.
A todos meus amigos que moraram comigo: Luiz Henrique Soares de Andrade, Guilherme Abreu, Denis Kimoto, Lúcio Jyo, Ivan Pereira, Murilo Curtolo e Pedro Diniz.
A Capes/REUNI (Reestruturação e Expansão das Universidades Federais) pelo apoio financeiro.
VIII EPÍGRAFE
"Se você acha a educação cara, experimente a ignorância."
IX SUMÁRIO BANCA EXAMINADORA ... IV DEDICATORIA ... V AGRADECIMENTOS ... VI EPÍGRAFE ... VIII SUMÁRIO ... IX LISTA DE FIGURAS ... XI LISTA DE TABELAS ... XIII LISTA DE ABREVIATURAS ... XIV RESUMO ... XVI
1 INTRODUÇÃO ... 1
1.1 Hormônios Esteróides ... 2
1.2 Reguladores do ciclo celular ... 6
1.3 Proteína p53... 8 1.4 Proteína ki-67... 11 1.5 Proteína cicloxigenase-2 ... 12 2 OBJETIVOS... 14 3 MATERIAIS E MÉTODOS ... 15 3.1 Animais ... 15 3.2 Delineamento Experimental ... 15 3.3 Eutanásia ... 16 3.4 Análise Macroscópica ... 16 3.5 Preparo histológico ... 17
X
3.6 Descrição Morfológica das Lesões ... 17
3.7 Análise imunoistoquímica ... 17 3.8 Análise Estatística ... 18 4 RESULTADOS ... 19 4.1 Análise Macroscópica ... 19 4.2 Análise Histopatológica ... 19 4.3 Análise Imunoistoquímica ... 21 4.3.1 ki-67 ... 21
4.3.2 Correlação entre o tempo-resposta para a proteína ki-67 ... 24
4.3.3 p53 ... 24
4.3.4 Ciclooxigenase-2 ... 28
4.3.5 Correlação entre p53 e COX-2 ... 31
5 DISCUSSÃO ... 32
6 CONCLUSÃO ... 35
REFERÊNCIAS ... 36
7 ANEXO I ... 44
7.1 Termo de aprovação do CEP ... 44
7.2 Artigo submetido a publicação ... 45
7.3 Artigos publicados ... 73
XI LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Mecanismo de interação de hormônios lipofílicos (GUYTON & HALL, 2006)... 3 Figura 2 – Biossíntese da testosterona (GEBARA et al., 2002)... 4 Figura 3 – Estrutura química tridimensional da molécula de testosterona. C19H28O2
(KICMAN, 2008). ... 4 Figura 4 – Estrutura química tridimensional da molécula de decanoato de nandrolona. C18H26O2 (KICMAN, 2008). ... 7
Figura 5 – Fases do ciclo celular: Intérfase (G0, G1, S, G2) e Mitótica (fase M) (azul); e as fases do ciclo em que as proteínas ki-67 (amarela) e p53 (laranja) atuam (Adaptado de KANTHAN et al., 2010). ... 8 Figura 6 – p53 um sensor de múltiplas formas do estresse (HAFSI & HAINAUT, 2011). ... 11 Figura 7 – Ciclo do ácido araquidônico (HILÁRIO et al., 2006). ... 14 Figura 8 – Fotomicrografia do epitélio lingual dos grupos G1 (grupo controle 15 dias), G2 (grupo controle 30 dias), G3 (grupo tratado 15 dias) e G4 (grupo tratado 30 dias). Não foram observadas alterações morfológicas da mucosa bucal entre os grupos. Coloração em H.E. Aumento de 400x. ... 20 Figura 9 – Fotomicrografia da análise imunoistoquímica para a proteína ki-67, grupos G1 (grupo controle 15 dias), G2 (grupo controle 30 dias), G3 (grupo tratado 15 dias) e G4 (grupo tratado 30 dias). Aumento de 400x. ... 22 Figura 10 – Imunoexpressão da proteína ki-67. Resultados expressos em média ± D.P., p<0.05 (ANOVA seguido de Bonferroni). “a”: diferença estatisticamente significativa do
XII
grupo tratado com decanoato de nandrolona 30 dias em relação ao seu respectivo controle. “b” diferença estatisticamente significativa entre os grupos tratados com decanoato de nandrolona (15 e 30 dias... 23 Figura 11 – Fotomicrografia da análise imunoistoquímica para a proteína p53 dos grupos G1 (grupo controle 15 dias), G2 (grupo controle 30 dias), G3 (grupo tratado 15 dias) e G4 (grupo tratado 30 dias). Aumento de 400x. ... 26 Figura 12 –Imunoexpressão da proteína p53. Resultados expressos em média ± D.P., p<0.0006 (ANOVA seguido de Bonferroni). “a”: diferença estatisticamente significativa do grupo tratado com decanoato de nandrolona 15 e 30 dias com seus respectivos controles 15 e 30 dias. ... 27 Figura 13 – Fotomicrografia da análise imunoistoquímica para COX-2 dos grupos G1 (grupo controle 15 dias), G2 (grupo controle 30 dias), G3 (grupo tratado 15 dias) e G4 (grupo tratado 30 dias). Aumento de 400x. ... 29 Figura 14 – Imunoexpressão da proteína COX-2. Resultados expressos em média ± D.P., p<0.0001 (ANOVA seguido de Bonferroni). “a”: diferença estatisticamente significativa do grupo tratado com decanoato de nandrolona 15 e 30 dias com seus respectivos controles 15 e 30 dias (p<0.0006)... 30
XIII LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Coeficiente de correlação entre o tempo-resposta para a proteína ki-67.... 24 Tabela 2 – Coeficiente de correlação entre p53 e COX-2 expostos ao decanoato de nandrolona... 31
XIV LISTA DE ABREVIATURAS
EAA – Esteróides Anabolizantes Andrógenos
OBID – Observatório Brasileiro de Informações sobre Drogas DECA – decanoato de nandrolona
kDa – kilo Dalton
DNA – Ácido Desoxirribonucléico RNA – Ácido Ribonucléico
MDM-2 – Murine Double Minute-2 Mg – Miligrama
Kg – Quilograma
Hsp-70 – Proteína de choque térmico 70 IL-1β – Interleucina 1 beta
COX – Ciclooxigenase H.E. – Hematoxilina e Eosina
OMS – Organização Mundial de Saúde
CEDEME– Centro de desenvolvimento de medicina experimental CEP – Comitê de Ética em Pesquisa
NaCl – Cloreto de Sódio
XV DAB – Diaminobenzidina
D.P. – Desvio Padrão
XVI RESUMO
Objetivo: Verificar a interferência do decanoato de nandrolona em proteínas regulatórias relacionadas à proliferação celular, apoptose e COX-2 em células da mucosa bucal de ratos Wistar.
Metodologia: Um total de 40 ratos foi distribuído em quatro grupos. Dois grupos experimentais foram tratados com decanoato de nandrolona, na dose de 5mg/kg, via subcutânea, três vezes por semana em dois períodos experimentais: 15 e 30 dias (G3 e G4, respectivamente). Os demais grupos (G1 e G2), receberam somente solução salina a 0,9% via subcutânea, três vezes por semana. Após os períodos experimentais, os animais foram submetidos à eutanásia e as línguas coletadas para análise morfológica e de marcadores relacionados à proliferação, apoptose e inflamação (ki-67, p53 e COX-2) por meio da técnica de imunoistoquímica.
Resultados: Na análise histopatológica, não foram observadas modificações morfológicas no tecido lingual em todos os grupos avaliados. Entretanto, um aumento significativo na imunoexpressão das proteínas ki-67, p53 e COX-2 foi detectado nos grupos tratados com decanoato de nandrolona em 15 e 30 dias quando comparados aos seus respectivos controles. Além disso, houve correlação tempo-resposta para a proteína ki-67, a qual se evidenciou aumento significativo. Encontrou-se também correlação positiva entre a imunoexpressão das proteínas p53 e COX-2 nos dois momentos experimentais avaliados.
Conclusão: Nossos resultados sugerem que o decanoato de nandrolona foi capaz de alterar a expressão de proteínas relacionadas ao ciclo celular, bem como induzir a imunoexpressão de COX-2 em células da língua de ratos Wistar. Foi confirmada a correlação positiva de tempo-resposta para a proteína ki-67 e entre a imunoexpressão das proteínas COX-2 e p53.
1 INTRODUÇÃO
Os esteróides anabolizantes andrógenos (EAA) são hormônios sintéticos de atividade semelhante à testosterona, cuja função é promover características associadas à masculinidade bem como acarretar efeito anabólico nos tecidos (KANAYAMA et al., 2010). Atualmente, são utilizados indiscriminadamente por atletas e praticantes de atividade física devido aos seus efeitos anabólicos imediatos. Muitas vezes, tais substâncias são de procedência duvidosa e/ou manipuladas sem a assepsia adequada, podendo ser responsáveis pela transmissão de doenças infectocontagiosas (SILVA, 2002). Alterações relacionadas ao crescimento, osteoporose, tratamento de carcinomas mamários e anemia estão entre as indicações terapêuticas para o uso farmacológico de EAA que podem também ser utilizados como medicamentos secundários no tratamento de deficiências nutricionais, hormonais e doenças fibrinolíticas (NEED et al., 1993; KOPERA, 1985).
Os principais motivos que levam ao abuso dos EAA estão relacionados à estética e desempenho físico que aumentam a contratilidade de miócitos, promovem balanço nitrogenado positivo, retenção de glicogênio e bloqueio do cortisol (GUIMARÃES NETO, 2005; BARROS et al., 2008). Estudos sobre o uso indiscriminado de EAA são escassos, principalmente no Brasil. Dados indicativos da extensão do consumo dessas substâncias são incomuns em virtude dos sujeitos não assumirem serem usuários. Entretanto, alguns estudiosos sugerem que seu uso é maior entre os jovens, independente da classe social (OBID, 2007). Em 2005, um levantamento realizado sobre o uso de drogas psicotrópicas no Brasil apontou que menos de 1% dos entrevistados afirmaram já ter feito uso de esteróides, sendo a maioria, homens na faixa etária entre 18 e 34 anos de idade (OBID, 2007). Nos Estados Unidos, cerca de 4 a 6% dos meninos e 2% das meninas com idade entre 12 e 18 anos, admitiram utilizar algum tipo de substância anabolizante. Essas estimativas levam a acreditar que, aproximadamente, um milhão de americanos teria feito uso de EAA em algum momento de suas vidas (BASARIA, 2010). Pärssinen e colaboradores (2000) sugeriram que há associação entre abuso de EAA e morte prematura, considerando que o índice
de mortalidade é cinco vezes maior em usuários de anabolizantes devido à promoção de problemas cardiovasculares.
1.1 Hormônios Esteróides
Os hormônios esteróides são secretados pelo córtex adrenal, pelos ovários, placenta e testículos. São substâncias lipossolúveis, sintetizadas a partir da molécula de pré-colesterol que se difundem pela membrana celular e interagem com receptores específicos no citosol. O complexo hormônio-receptor quando ativado se liga a uma sequência do DNA regulador específico chamado elemento de resposta hormonal, responsável por ativar ou reprimir a transcrição de genes específicos, formação do RNA mensageiro e, posteriormente, a síntese protéica (IMPERLINI et al., 2010) (Figura 1).
Os testículos secretam hormônios sexuais que são chamados coletivamente de andrógenos. O termo “andrógeno” significa qualquer hormônio esteróide que tenha efeito masculinizante, incluindo a própria testosterona (GUYTON & HALL, 2006). A síntese desses hormônios requer diversas reações enzimáticas sequenciais que convertem o colesterol em pregnolona e, por fim, testosterona (BAULIEU et al., 2001) (Figura 2).
Figura 2: Biosíntese da testosterona (GEBARA et al., 2002).
A testosterona, principal hormônio esteróide endógeno, é formada pelas células de Leydig e é responsável por várias funções no organismo bem como desenvolvimento e manutenção da musculatura esquelética e das características sexuais masculinas secundárias (SILVA et al., 2002). Sua constituição química está representada na Figura 3.
Figura 3: Estrutura química tridimensional da testosterona. C19H28O2 (KICMAN, 2008).
Os EAA são substâncias derivadas da testosterona modificadas sinteticamente por manipulação química, a fim de isolar o efeito anabólico do androgênico (HALL & HALL, 2005). O efeito andrógeno é responsável pelo desenvolvimento das genitálias, espessamento das cordas vocais, aumento da libido e de secreção das glândulas sebáceas e pelos (FORTUNATO et al., 2007). Por outro lado, os efeitos anabólicos destacam-se pelo aumento de massa muscular, da concentração da hemoglobina e hemácias, retenção de nitrogênio, deposição de cálcio no tecido ósseo e pela diminuição das reservas de gordura corpórea (LISE et al., 1999).
Dentre os mecanismos anabólicos desencadeados para o ganho da massa muscular, incluem o aumento da síntese protéica, inibição dos efeitos catabólicos na musculatura esquelética, estimulação da formação óssea, inibição do catabolismo protéico e estímulo da eritropoiese (LISE et al., 1999). Além disso, a ação anabólica melhora o desempenho físico ao agir nos receptores andrógenos específicos da musculatura esquelética e promove uma ação miotrófica, por meio do aumento da síntese protéica que leva, consequentemente, ao aumento da massa muscular e potencialização da força (KAM & YARROW, 2005).
O uso dessas substâncias em doses fisiológicas em pacientes que apresentam deficiência natural de andrógenos ou para a recuperação de cirurgias e atrofias musculares tornou-se importante e eficiente no início da década de 50 (DIRIX & TITELL, 1988). Entretanto, quando administrados indiscriminadamente em doses
suprafisiológicas, os EAA podem produzir efeitos colaterais como retenção hídrica, fechamento precoce das epífises ósseas (ALVES et al., 2010), agressividade (BRONSON, 1996; FARRELL & MCGINNI, 2003), irritabilidade, raiva, hostilidade; sintomas cognitivos como distração, esquecimento e confusão (SU et al., 1993), atrofia testicular, alterações na próstata e vesícula seminal, ginecomastia, alterações no ciclo menstrual, alterações de crescimento, desenvolvimento de cistos hepáticos, hepatomas (COUNCIL ON SCIENTIFIC AFFAIRS, 1990; BRONSON, 1996; BROEDER, 2003), alterações cardíacas como infarto do miocárdio, acidente vascular encefálico, aumento de plaquetas e agregação plaquetária e hipertrofia patológica do miocárdio, aumentando a probabilidade de arritmias e morte súbita (SCHARHAG et al., 2003; HALL & HALL, 2005).
Os EAA também promovem dependência de seus usuários, podendo levar à síndrome de abstinência (BROWER et al., 1990; COPELAND et al., 2000). Alguns estudos indicaram que o uso de hormônios anabolizantes provoca transtornos hepáticos e renais (POWERS, 2002). YOSHIDA et al. (1994) relataram aparecimento de colestase grave e falência renal aguda em atletas clinicamente saudáveis, após o uso de esteróides anabolizantes. Seus exames apresentaram aumento nos índices de bilirrubina e fosfatase alcalina que resultaram na alteração da fisiologia desses órgãos (HALL & HALL, 2005).
Existem três formas de utilização dos EAA: pirâmide, stacking e ciclos. A utilização denominada pirâmide começa com pequenas doses da droga, aumentando-a progressivamente até atingir uma dosagem máxima e subsequente redução regressiva até o final do período (SILVA et al., 2002). O stacking, uso alternado de esteróides de acordo com a toxicidade, envolve o uso de dois ou mais andrógenos, em um aumento de dosagem progressiva durante um curto período de tempo (BASARIA, 2010). Por fim, a forma mais utilizada de administração de EAA é por meio de ciclos que se refere a um período de utilização que pode variar de 4 a 18 semanas (período on) seguido por um período de tempo variável sem a ingestão de quaisquer drogas com efeito
anabolizante, variando de 4 semanas a vários meses (período off). O objetivo é reduzir a probabilidade de efeitos indesejáveis, porém alguns usuários fazem uso contínuo destas drogas (KICMAN, 2008).
Existem disponíveis no mercado vários tipos de EAA que desencadeiam de forma indissociável efeitos anabólicos e androgênicos. Dentre os mais utilizados mundialmente, está o decanoato de nandrolona (DECA) (Figura 4), comercialmente conhecido como Deca Durabolin® (KUTSCHER et al., 2002). Quando comparado à testosterona, apresenta maior ação anabólica e menor atividade androgênica (WILSON, 1988).
Figura 4: Estrutura química tridimensional do decanoato de nandrolona. C18H26O2 (KICMAN, 2008)
1.2 Reguladores do ciclo celular
O uso dos EAA pode atingir o funcionamento normal da célula alterando o ciclo celular e, consequentemente, interferir nas fases e pontos de verificação antes da divisão celular.
DORN et al. (2008) relataram que os EAA foram capazes de desregular o ciclo celular das células V79 in vitro; houve diminuição nas frações G0/G1 e um aumento nas frações S e G2/M das células submetidas ao EAA.
A divisão celular consiste em dois processos consecutivos, a replicação do DNA e a segregação dos cromossomos duplicados em duas celulas separadas, dividindo o ciclo celular em duas fases: intérfase e mitose, a qual a primeira é subdividida em três fases: G1, S e G2 (VERMEULEN et al., 2003).
Na fase G1, há um aumento do volume celular em função da preparação para a síntese de DNA. Em S, ocorre a síntese de DNA propriamente dita. Já na fase G2, a célula prepara-se para o início da divisão celular, ou seja, a fase M. Assim, as células filhas poderão continuar a proliferação, reiniciando o ciclo celular, ou ficarem estáveis na fase G0 (Figura 5) (RIVOIRE et al., 2001; KANTHAN et al., 2010). Algumas células, como hemácias, hepatócitos e neurônios não sofrem divisão celular. Estas se encontram na fase de latência do ciclo denominada G0 ou fase de quiescência, onde permanecem metabolicamente ativas e somente iniciam sua divisão quando há necessidade de renovação tecidual, após morte ou lesão celular (AIDÉ et al., 2008).
Figura 5: Fases do ciclo celular: Intérfase (G0, G1, S, G2) e Mitótica (fase M) (azul); e as fases do ciclo
Existem três momentos chave (checkpoint) para a regulação do ciclo: G1, G2 e metáfase. No checkpoint de G1, verifica-se o tamanho da célula e se o ambiente está adequado para a síntese. Em G2, certifica-se se o DNA foi replicado com sucesso e se este está apto a se dividir. Na metáfase, confere se os cromossomos estão alinhados para dar prosseguimento à divisão propriamente dita (KANTHAN et al., 2010). Caso alguns desses parâmetros não estejam de acordo, a célula ativa proteínas específicas que irão atuar coordenando a proliferação, a quiescência, a diferenciação e, em ultima instancia, a morte celular (NURSE, 2000; VERMEULEN et al., 2003).
O processo de apoptose, ou morte programada, foi descrito pela primeira vez em 1972 por Kerr e colaboradores. É um fenômeno morfológico e coordenado, constituído pela condensação e fragmentação da cromatina, invaginação da membrana plasmática, retração celular e, eventualmente, fragmentação celular da membrana plasmática que gera pequenos corpos apoptóticos, sem resposta inflamatória, pois antagonicamente à necrose, representa um mecanismo de morte celular programada que garante a eliminação de células no estágio final ou acometidas por danos genéticos irreparáveis (GRIVICICH et al., 2007).
1.3 Proteína p53
A proteína p53 desempenha um papel fundamental na regulação do ciclo e morte celular (SIONOV & HAUPR, 1999). Codificada pelo gene Tp53 localizado no cromossomo 17, leva este nome em referência ao seu peso molecular que é de 53 kDa. Dentre suas funções, a proteína p53 está envolvido em múltiplos eventos celulares monitorando o ciclo celular, mantendo a integridade do código genético; atua na senescência celular, no reparo e na recombinação do DNA; na diferenciação celular; na amplificação gênica; na segregação cromossômica e angiogênese por meio de mecanismos que incluem a ativação transcricional ou inibição da expressão de inúmeros genes-alvo e início da apoptose (RIVOIRE et al., 2001; OKAZAKI et al., 2002; GRÖSCH et al., 2005; LIU et al., 2005).
Durante o ciclo celular, a proteína p53 verifica se houve ou não mutação do material genético. Caso seja verificada a ocorrência de uma mutação, a proteína p53 impede que a divisão celular seja completa, podendo levar à correção desta alteração ou induzir a morte celular por meio da apoptose (PINHO, 2000).
Em condições fisiológicas, a proteína de ligação MDM-2 regula negativamente os níveis de p53 que inativa a proteína quinase C-Jun-N-terminal, responsável pela instabilidade constitutiva da p53. Em condições de estresse, a região N-terminal da p53 é liberada permitindo que esta proteína seja fosforilada e, posteriormente, acetilada por meio de outras quinases para resíduos de serina e treonina levando à estabilização e seu acúmulo, não levando a p53 a degradação no proteassoma (LANE & LEVINE, 2010; VOUSDEN, 2002; GRÖSCH et al., 2005).
Em células normais, os níveis de concentração de p53 encontram-se baixos porém na presença de estímulos que causem algum tipo de estresse nuclear ou intracelular como a hipóxia, danos no DNA, ativação de oncogenes, insuficiência de nucleotídeos para síntese de DNA, choque térmico, exposição ao óxido nítrico ou radiação ultravioleta, ocorre a fosforilação desta proteína, aumentando os níveis de p53, impedindo que a célula entre na fase S do ciclo celular (GRÖSCH et al., 2005; LIU et al., 2005).
Dessa forma, a parada reversível do ciclo celular na transição G1-S permite a reparação da lesão do DNA e o reestabelecimento da integridade do genoma. Quando as alterações no DNA excedem a capacidade de reparo, é desencadeada a morte celular por apoptose, acionada pela cascata das caspases. Assim, o gene Tp53 está envolvido no controle da integridade do DNA, sendo, por esta razão, denominado “guardião do genoma”. Por outro lado, mutações no gene Tp53 levam à produção de uma proteína alterada, de meia-vida longa, sem capacidade de se combinar com o DNA, capaz de se acumular no núcleo celular, sendo facilmente visualizada por métodos imunoistoquímicos. Além disso, a inativação do gene Tp53 favorece a
progressão do ciclo celular descontrolado, o acúmulo de mutações e a instabilidade genômica (OKAZAKI et al., 2002).
A ativação da proteína p53 está relacionada à formação de espécies reativas de oxigênio induzida pelos EAA (SCHWINGEL et al., 2011). Esse estresse citotóxico leva a parada do ciclo celular mediada pela p53, levando a apoptose, senescência, diferenciação ou ao reparo genômico (Figura 6).
Figura 6: p53 um sensor de múltiplas formas do estresse (Adaptado de HAFSI & HAINAUT, 2011)
É importante salientar que o DECA, assim como outros EAA, é um anabolizante sintético modificado da testosterona que, em sua metabolização, pode liberar
metabolitos citotóxicos como o 17β-estradiol, levando a célula a um estresse capaz de induzir a síntese e ativação de p53, indicando de alguma forma que possíveis agressões ao DNA foram provocadas (HAFSI & HAINAUT, 2011).
1.4 Proteína ki-67
A proliferação celular é considerada um processo biológico fundamental pelo papel que desempenha no crescimento e manutenção da homeostase dos tecidos (WATANABE et al., 2010). A ki-67 é uma proteína nuclear fortemente associada à proliferação celular; entretanto, sua exata função ainda é incerta na literatura (SCHOLZEN & GERDES, 2000; ENDL & GERDES, 2000). Localizada no cromossomo 10, possui peso molecular que varia entre 320 a 359 kDa, cuja presença reside em todas as fases ativas do ciclo celular.
Em geral, os níveis de ki-67 são baixos durante a fase G1 e no início da fase S do ciclo celular e aumentam gradativamente até atingir seu nível máximo na fase mitótica. O fato da expressão desta proteína ser irregular explica a imprecisão deste marcador na identificação de células na fase proliferativa (MARTINEZ-ARRIBAS et al., 2002; URRUTICOECHEA et al., 2005). Alterações nesse mecanismo estão diretamente relacionadas a diversos processos patológicos, como a oncogênese (VAN DIEST et al., 1998).
De qualquer forma, a proteína ki-67 tem relação direta com a atividade proliferativa. Por essa razão, a ki-67 tem sido utilizada em estudos com o propósito de investigar a atividade proliferativa em diferentes órgãos como o pulmão, cérebro, próstata e mucosa bucal (SMILEK et al., 2006; DRAKOS et al., 2007; KIM et al., 2007; KUDRIMOTI et al., 2007; STEINAU et al., 2007).
A atuação dos esteróides na proliferação celular ocorre a partir de duas hipóteses principais: a primeira é pela interação de seus receptores com sequências de DNA específicas que regulam a expressão de genes necessários para a multiplicação
celular, levando, assim, a um processo de proliferação indireta ou pela produção de fatores de crescimento nas células-alvo (MIGLIACCIO et al., 2000). Sendo assim, altos níveis de ki-67 estão relacionados a proliferação celular induzida pelo EAA, em diversos tecidos (SORONEN et al., 2004). CHIMENTO et al. (2012) demonstraram que o DECA é capaz de induzir a proliferação celular em células Leydig R2C. Entretanto, não há estudos até o presente momento que demonstrem o papel dos esteróides perante a proliferação celular em mucosa bucal.
1.5 Proteína cicloxigenase-2
A ciclooxigenase tipo 2 (COX-2) é responsável por sintetizar prostanóides a partir do ácido araquidônico, convertendo-a em prostaglandina. É expressa em uma grande variedade de processos patológicos, principalmente àqueles associados a processos inflamatórios, além de estar envolvida no processo de carcinogênese e inibição da apoptose. Sua expressão está relacionada à ocorrência de metástases, à diminuição da sobrevida dos tumores e ao grau de invasão vascular (Figura 7) (FELIN et al., 2008a).
Existem duas principais isoformas de ciclooxigenases (COX): a cicloxigenase tipo 1 (prostaglandina H sintetase 1 ou COX-1) e a cicloxigenase tipo 2 (prostaglandina H sintetase 2 ou COX-2) (GALLO et al., 2002; CHOI et al., 2005).
A COX-1 é expressa constitutivamente, sendo encontrada na maioria dos tecidos; está relacionada a funções fisiológicas e à homeostasia dos tecidos, tais como citoproteção da mucosa gástrica, regulação do fluxo sangüíneo e controle da agregação plaquetária.
A COX-2 é indetectável ou expressa em baixos níveis nos tecidos em atividade fisiológica, embora existam exceções, como nas vesículas seminais, rins e regiões do sistema nervoso central (hipotálamo, hipocampo e espinal). São rapidamente induzidas por mediadores pró-inflamatórios de lesões, inflamações, citocinas, fatores de crescimento, hormônios e promotores tumorais (RADI, 2009; GALLO et al., 2002; ZIMMERMANN et al., 1999). A superexpressão de COX-2 é observada em uma variedade de tumores humanos e diversos estudos indicaram que esse marcador inflamatório contribui para a tumorigênese bem como para o desenvolvimento de fenótipos malignos por meio de vários mecanismos como a inibição da apoptose, aumento da angiogênese, capacidade de invasão, imunossupressão e estimulação da proliferação celular (MAURO et al., 2010). SCHWINGEL e colaboradores (2011) relataram que em estudos experimentais com ratos, a exposição ao EAA por curtos e longos periodos é capaz de induzir um processo inflamatório hepático que, por sua vez, é mediada pelo aumento de COX-2, está superexpressão pode levar à formação de espécies reativas de oxigênio e, com isso, induzir algum tipo de estresse celular.
2 OBJETIVOS
O objetivo desse estudo foi investigar a interferência de anabolizantes esteróides na proliferação celular, apoptose e no mediador do processo inflamatório na mucosa bucal de ratos expostos ao decanoato de nandrolona.
Para isso, foram avaliados os seguintes parâmetros:
- Análise macroscópica e histopatológica da mucosa bucal;
- Expressão das proteínas p53, ki-67 e COX-2 em células da mucosa bucal; - Possíveis correlações entre os parâmetros supracitados.
3 MATERIAIS E MÉTODOS 3.1 Animais
Foram utilizados 40 ratos Wistar machos com oito semanas de idade, com peso corporal médio de 300-350 g, mantidos em gaiolas coletivas (5 animais por gaiola) provenientes CEDEME (centro de desenvolvimento de medicina experimental). Todos os animais permaneceram na guarda de animais do Departamento de Biociências da UNIFESP-Campus Baixada Santista, sob condições de ciclo claro/escuro de 12 horas, com início do período claro às 07:00 horas, temperatura e umidade relativa do ar foram controladas em 22 ± 2 °C e 60 ± 5% de umidade local, respectivamente. Os animais tiveram acesso à água e ração ad libitum. Esse trabalho foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) da Universidade Federal de São Paulo, sob o número 0607/11 (ANEXO I).
3.2 Delineamento Experimental
Os animais foram distribuídos aleatoriamente em quatro grupos de 10 animais cada, conforme descrição a seguir:
Grupo 1 (G1) – Grupo controle 15 dias: os animais não foram submetidos ao tratamento com decanoato de nandrolona e sofreram eutanásia após 15 dias.
Grupo 2 (G2) – Grupo controle 30 dias: os animais não foram submetidos ao tratamento com decanoato de nandrolona e sofreram eutanásia após 30 dias.
Grupo 3 (G3) – Grupo experimental 15 dias: os animais foram submetidos ao tratamento de decanoato de nandrolona durante um período de 15 dias. Após este período, sofreram eutanásia.
Grupo 4 (G4) – Grupo experimental 30 dias: os animais foram submetidos ao tratamento de decanoato de nandrolona durante um período de 30 dias. Após este período, sofreram eutanásia.
A dose de DECA aplicada em cada animal foi de 5mg/kg, por via subcutânea, três vezes por semana (15mg/kg/semana). Essa dosagem foi adotada, por ser equivalente àquela utilizada pelos atletas praticantes de atividade física (POPE & KATZ, 1988). Os animais dos grupos controle (G1 e G2) receberam injeções de solução salina (0,9% NaCl), seguindo o mesmo protocolo utilizado para os demais grupos experimentais. Todos os animais foram pesados semanalmente.
3.3 Eutanásia
Completados os períodos experimentais estabelecidos, todos os animais foram sacrificados e as línguas coletadas. A eutanásia dos animais foi realizada por superdosagem de anestésico (injeção intraperitoneal de ketamina 60 mg/Kg e xilasina 20mg/Kg) de acordo com o peso do animal, 24 horas após o último dia de tratamento. Os animais do grupo controle foram sacrificados concomitantemente aos do grupo experimental.
3.4 Análise Macroscópica
Após a eutanásia, foi realizada a análise macroscópica das lesões bucais, considerando sua forma e cor, observando a presença ou ausência de manchas brancas, manchas vermelhas, formação exofítica e ulceração.
3.5 Processamento histológico
Em seguida, as línguas coletadas foram seccionadas longitudinalmente e fixadas em formol a 10%, por um período mínimo de 24 horas, para posterior processamento histológico. Foram realizados cortes semi-seriados de 5m de espessura e os tecidos foram corados com hematoxilina e eosina (H.E.).
3.6 Descrição Morfológica das Lesões
A descrição morfológica das lesões foi realizada segundo o protocolo de Fassoni e colaboradores (1993), pelo qual se avaliou os seguintes parâmetros: mucosa normal; hiperplasia e hiperqueratose sem displasia epitelial; hiperplasia e hiperqueratose com displasia epitelial; carcinoma microinvasivo (com destruição da membrana basal do epitélio, limitada à lâmina própria) e carcinoma invasivo.
Para diagnóstico com displasia epitelial, a avaliação seguiu-se os critérios estabelecidos pela OMS (Organização Mundial de Saúde), ou seja: perda da polaridade das células basais; presença de mais de uma camada de células com aspecto basalóide; aumento do índice núcleo-citoplasma; aumento do número de figuras de mitose; pleomorfismo celular; hipercromatismo nuclear; nucléolos evidentes; perda ou diminuição da coesão celular; disqueratose; cristas epiteliais irregulares; estratificação epitelial irregular; mitoses na porção superficial do epitélio e mitoses atípicas.
3.7 Análise Imunoistoquímica
Para a avaliação imunoistoquímica, foram utilizados os seguintes marcadores: p53, ki-67 e COX-2.
Para tanto, cortes de 3m foram tratados com proteinase K por 30 minutos, em temperatura ambiente e a peroxidase endógena foi bloqueada com peróxido de hidrogênio a 2% por 10 minutos e lavados com PBS (phosphate buffer solution). Após este período, foram utilizados anticorpos primários policlonais - anti-p53, anti-ki-67 e anti-COX-2 - na concentração de 1:200 (Calbiochem-Novabiochem Coporation®, California, EUA) para cada amostra. Todos os anticorpos primários foram incubados em temperatura ambiente por 24 horas e lavados com PBS durante 30 minutos, por três vezes. Em seguida, os cortes foram incubados com o anticorpo secundário (Biocare Medical, California, EUA) por 30 minutos e, em seguida, corados com DAB (diaminobenzidina) (DAKO®, California, EUA) e contra-corados com hematoxilina de Harris. Para controle negativo foi omitido o anticorpo primário e para o positivo, foram utilizados linfonodos normais.
Foram avaliados 10 campos por lâmina, 50 campos por animal, totalizando 1000 células, e aumentos de 400X, por sistema de casualização sistemática, conforme estabelecido em estudos anteriores conduzidos pelo nosso grupo de pesquisa (FRACALOSSI et al., 2010)
3.8 Análise Estatística
Para a detecção de diferenças na expressividade de cada uma das proteínas, p53, ki-67 e COX-2, foi realizado o teste de ANOVA seguido do teste de Bonferroni. Para a verificação de correlação, utilizou-se o teste de correlação de Spearman. Em todas as análises, foi adotado o valor p<0,05 para significância estatística.
4 RESULTADOS
4.1 Análise Macroscópica
Não foram observadas quaisquer alterações macroscópicas na língua dos grupos controles e dos grupos tratados com DECA nos períodos de 15 e 30 dias. A estrutura lingual observada apresentou-se normal, ou seja, regiões de corpo e raiz preservados. No corpo da língua, o sulco mediano, as papilas gustativas (foliadas, filiformes e fungiformes) e o ápice não apresentaram nenhuma alteração (dados não mostrados).
4.2 Análise Histopatológica
A análise histopatológica do tecido lingual não mostrou diferenças entre os grupos controle e aqueles tratados com DECA 15 e 30 dias. Esse tecido apresentou epitélio estratificado queratinizado, no qual foi possível observar a presença dos quatro estratos epiteliais basal, espinhoso, granuloso e córneo sem quaisquer alterações na cinética de maturação (Figura 8).
Em todos os espécimes analisados, os queratinócitos presentes na camada basal estão alinhados, possuindo de uma a três camadas, característico de epitélio normal. Os queratinócios do estrado espinhoso possuem morfologia poliédrica, em quantidades normais. No estrato granuloso, as células apresentam-se maiores contendo grânulos de querato-hialina dispersos em seu citoplasma. Por fim, o estrato córneo apresenta-se queratinizado, formado por células acidófilas, razão pela qual é corado fortemente pela eosina. Em todos os estratos avaliados a morfologia foi considerada normal. Observa-se ainda tecido conjuntivo frouxo subjacente seguido de tecido muscular do tipo estriado esquelético.
Figura 8: Fotomicrografia do epitélio lingual dos grupos G1 (grupo controle 15 dias), G2 (grupo controle
30 dias), G3 (grupo tratado 15 dias) e G4 (grupo tratado 30 dias). Não foram observadas alterações morfológicas da mucosa bucal entre os grupos. Coloração em H.E. Aumento de 400x.
4.3 Análise Imunoistoquímica 4.3.1 ki-67
Na avaliação da expressão da proteína ki-67 todos os grupos apresentaram marcação nuclear nas células da camada basal do tecido lingual (setas Figura 9). Nos grupos controles (G1 e G2) observou-se uma menor imunoexpressão desta proteína nas células basais, enquanto que nos grupos expostos ao DECA, (G3 e G4), observou-se uma forte marcação de ki-67 em todas as células da camada basal.
Observando o grupo tratado com DECA 30 dias (G4) com seu respectivo grupo controle (controle 30 dias, G2), verificou-se um aumento significativo na expressão da proteína ki-67 no grupo G4 (p<0,05). Em contrapartida, o grupo exposto ao hormônio durante 15 dias (G3) e seu respectivo controle (grupo controle 15 dias, G1) não foi detectada diferença estatística significativa. Na comparação entre os grupos tratados 30 e 15 dias (G4 e G3, respectivamente) foi constatado aumento na imunomarcação nos animais do grupo G4 (p<0,0001), (Figura 10).
Figura 9: Fotomicrografia da análise imunoistoquímica para a proteína ki-67 (setas), grupos G1 (grupo
controle 15 dias), G2 (grupo controle 30 dias), G3 (grupo tratado 15 dias) e G4 (grupo tratado 30 dias). Aumento de 400x.
ki-67 Con trol e 15 dia s Con trol e 30 dia s deca noat o de nan drol ona 15di as deca noat o de nan drol ona 30di as 0 100 200 300 400 500 a, b n ° c é lu la s p o s it iv a s
Figura 10: Imunoexpressão de ki-67. Resultados expressos em média ± D.P. p<0,05 (ANOVA seguido
de Bonferroni). “a”: diferença estatisticamente significativa do grupo tratado com DECA 30 dias em relação ao seu respectivo controle. “b” diferença estatisticamente significativa entre os grupos tratados com DECA (15 e 30 dias).
4.3.2 Correlação entre o tempo-resposta para a proteína ki-67
A tabela 1 representa a correlação entre o tempo-resposta da exposição ao DECA utilizando o teste de Spearman. Observou-se uma correlação tempo-resposta positiva à exposição ao EAA. O valor encontrado relativo à imunoexpressão da proteína ki-67 no grupo exposto ao DECA por 30 dias foi de um coeficiente de correlação de 0,80 e um valor de p<0,05. Diante de tais resultados, verificou-se clara correlação entre o tempo-resposta à esta droga.
* Teste de Spearman
4.3.3 p53
Na análise da expressão para a proteína p53, observou-se marcação citoplasmática em todas as camadas celulares do epitélio lingual. Nos grupos G1 e G2, as células das camadas espinhosa e granulosa mostraram-se marcadas, enquanto que nos grupos expostos à droga, G3 e G4, encontramos maior número de células marcadas distribuídas por todas as camadas celulares do epitélio (Figura 11).
Um aumento significativo no número de células marcadas nos grupos expostos ao DECA nos períodos de 15 e 30 dias de tratamento (G3 e G4, respectivamente) foi encontrado quando comparados aos seus respectivos grupos controles (G1 e G2, respectivamente) (p<0,0006).
Tabela 1: Coeficiente de correlação entre o tempo-resposta para a proteína ki-67 Tempo (dias de exposição ao
decanoato de nandrolona)
Coeficiente de correlação* Valor de p*
Não foi observada diferença significativa na comparação entre os grupos controles G1 e G2 e entre os grupos tratados G3 e G4. Estes resultados estão apresentados na Figura 12.
Figura 11: Fotomicrografia da análise imunoistoquímica para a proteína p53 dos grupos: G1 (grupo
controle 15 dias), G2 (grupo controle 30 dias), G3 (grupo tratado 15 dias) e G4 (grupo tratado 30 dias). Aumento de 400x.
p53 Con trol e 15 dia s Con trol e 30 dia s deca noat o de nan drol ona 15di as deca noat o de nan drol ona 30di as 0 100 200 300 400 500 a a n ° c é lu la s p o s it iv a s
Figura 12: Imunoexpressão de p53. Resultados expressos em média ± D.P. p<0,0006 (ANOVA seguido
de Bonferroni). “a”: diferença estatisticamente significativa do grupo tratado com DECA 15 e 30 dias com seus respectivos controles (p<0,0006).
4.3.4 Ciclooxigenase-2
A análise da imunoexpressão do marcador inflamatório COX-2 foi detectada por marcação citoplasmática. Nos grupos controles (G1 e G2) visualiza-se uma marcação predominante nas camadas espinhosa e granulosa; já os grupos experimentais, G3 e G4, encontrou-se imunoexpessão em todas as camadas do epitélio lingual (Figura 13). Tais achados são semelhantes àqueles encontrados para a proteína p53.
Os grupos expostos à droga por 15 e 30 dias (G3 e G4, respectivamente) apresentaram maiores valores e diferença estatística significativa quando comparados aos seus respectivos controles (p<0,0001). Quando comparados entre si, os grupos G1 e G2 não apresentaram diferença significativa, assim como os grupos G3 e G4 (Figura 14).
Figura 13: Fotomicrografia da análise imunoistoquímica para COX-2 (setas) dos grupos: G1 (grupo
controle 15 dias), G2 (grupo controle 30 dias), G3 (grupo tratado 15 dias) e G4 (grupo tratado 30 dias). Aumento de 400x.
COX-2 Con trol e 15 dia s Con trol e 30 dia s deca noat o de nan drol ona 15di as deca noat o de nan drol ona 30di as 0 100 200 300 400 a a n ° c é lu la s p o s it iv a s
Figura 14: Imunoexpressão da proteína ki-67. Resultados expressos em média ± D.P., p<0,0001
(ANOVA seguido de Bonferroni). “a”: diferença estatisticamente significativa do grupo tratado com DECA 15 e 30 dias com seus respectivos controles (p<0,0006).
4.3.5 Correlação entre p53 e COX-2
A tabela 2 representa a correlação entre as proteínas p53 e COX-2 utilizando o teste de Spearman. Encontram-se correlacionadas a imunoexpressão de p53 e COX-2 em ambos os períodos experimentais de 15 e 30 dias. No grupo G3, os animais expostos a 15 dias ao DECA obtiveram correlação de 0,80 e p< 0,05. No grupo G4, os animais expostos ao período de 30 dias obtiveram coeficiente de 0,95 e p<0,0001, inferindo que há correlação positiva entre os valores de expressão das proteínas p53 e COX-2.
* Teste de Spearman
Tabela 2: Coeficiente de correlação entre p53 e COX-2 expostos ao decanoato de nandrolona
Tempo (dias de exposição ao decanoato de nandrolona)
Coeficiente de correlação* Valor de p *
15 r = 0,80 p< 0,05
5 DISCUSSÃO
A utilização dos esteróides anabolizantes andrógenos (EAA) está cada vez mais presente em nossa sociedade, apesar de seu uso ser exclusivo da medicina (GENTILESCHI et al., 2005), muitos indivíduos fazem uso de EAA de forma ilícita com administração de doses elevadas (FRIZON et al., 2005; FERREIRA et al., 2007).
O presente estudo utilizou-se de dosagem subcutânea, submetendo o animal a um efeito sistêmico de DECA de 5 mg por kg corporal do animal, três vezes por semana, totalizando 15 mg por kg corporal (15mg/kg/semana), por 15 e 30 dias, simulando dois períodos de ciclos “on”. A dosagem escolhida de 5mg/Kg de DECA equivale à dose administrada a atletas (8mg/Kg peso corpóreo/semana) (10 a 100 vezes maior que a dose terapêutica) (POPE & KATZ, 1988; WOODIWISS et al., 2000, ROCHA et al., 2007).
Em resultados anteriores, nosso grupo de pesquisa detectou alterações nucleares relacionadas à morte celular em indivíduos usuários de esteróides anabolizantes praticantes de exercício resistido em células da mucosa bucal. Houve aumento de células micronucleadas em usuários de esteróides anabolizantes comparados ao grupo controle (não exposto). (Martins et al., 2010). Entretanto, há ainda escassez na literatura sobre a interferência do DECA na morfologia e a imunoexpressão das proteínas ki-67, p53 e COX-2 na mucosa bucal.
O DECA não alterou a morfologia do tecido lingual no presente estudo, tanto nos grupos expostos à droga pelo período de 15 e 30 dias quanto em seus respectivos controles. Esses resultados confrontam com os achados de McClung e colaboradores (2005) que relataram alterações no tamanho e número de fibras do músculo sóleo induzidas pela administração do DECA, sugerindo que o EAA alterou a morfologia do tecido muscular. Talvez, tal disparidade surgiu decorrente do tipo de tecido estudado.
A proliferação celular é considerada um processo biológico fundamental pelo papel que desempenha no crescimento e manutenção da homeostase dos tecidos
(WATANABE et al., 2010). A proteína ki-67 está presente no ciclo celular, com exceção da fase G1 (FRACALOSSI et al., 2011), aumentando seus níveis de expressão durante a fase S, com pico na fase M (BOAS et al., 2010). Diante disso, diversos estudos têm avaliado os níveis de expressão do antígeno nuclear ki-67 associando-o ao prognóstico de algumas alterações teciduais, como hiperplasia e displasia, inclusive na mucosa oral (VAN DIEST et al., 1998; HADAR et al., 2005; ANGIERO et al., 2008; BOAS et al., 2010). Apesar do aumento significativo da proteína ki-67 no grupo tratado por 30 dias, não encontramos alterações morfológicas relativas à hiperplasia e displasia.
Nossos achados apontam ainda um efeito tempo-resposta na exposição ao EAA com relação a expressão da proteína ki-67. O grupo exposto ao DECA por 30 dias apresentou um aumento significativo desta proteína em relação ao grupo exposto por 15 dias. Este fato pode ser explicado pelo DECA se ligar aos elementos de resposta do DNA alterando a expressão gênica e promovendo, como produto final, o aumento dessa proteína no núcleo, favorecendo a proliferação celular.
Outra proteína vinculada ao ciclo celular, a p53, está diretamente ligada ao mecanismo de verificação da divisão celular. Em caso de parada da divisão celular, essa proteína pode, na impossibilidade de reparo, induzir a célula à morte celular programada por apoptose (HAFSI & HAINAUT, 2011). Em condições fisiológicas, o nível e a atividade da proteína p53 selvagem são baixos, pois apresenta uma meia-vida curta o que torna difícil sua detecção por métodos imunoistoquímicos em razão da sua rápida degradação (GOULART-FILHO et al., 2009). Tal fato explica os baixos níveis de p53 nos grupos controles 15 e 30 dias. O mesmo não ocorre com sua forma mutada que apresenta uma meia-vida mais prolongada e se acumula no núcleo por meio da fosforilação (GOULART-FILHO et al., 2009). Nossos resultados demonstraram um aumento na imunoexpressão da proteína p53 nos grupos DECA expostos por 15 e 30 dias, observados por uma marcação citoplasmática exacerbante.
O aumento da proteína p53 nos grupos expostos ao DECA pode ser explicado pelo fato de os EAA induzirem estresse citotóxico (CARMO et al., 2012). Essa
citotoxicidade é promovida provavelmente por estresse oxidativo que leva à formação de radicais livres e adutos no DNA. Com isso, o xenobiótico pode ativar o sistema de reparo contribuindo para o aumento da imunoexpressão de p53 (CARMO et al., 2012). MONTISCI et al. (2012) relataram que estudos experimentais em animais expostos aos EAA aumentaram a expressão de caspase-3, uma proteína pró apoptótica, sugerindo que a apoptose está envolvida nas lesões cardíacas induzidas pelos esteróides, confirmando a sua citotoxicidade. Os mesmos autores ainda relataram que houve aumento da expressão do marcador apoptótico HSP70 (Heat shock protein 70) e da citocina pró-inflamatória IL-1β (Interleucina 1-beta) em exposição aos EAA.
Estudos in vitro sugerem que a p53 do tipo selvagem possui capacidade de inibir a expressão da COX-2, bloqueando a ação das prostaglandinas. Assim, pode-se inferir que a expressão de COX-2 está relacionada com a regulação positiva do crescimento enquanto que a p53 é um regulador negativo do ciclo celular (SUBBARAMAIAH et al., 1999; HAN et al., 2002; GALLO et al., 2003; CORCORAN et al., 2005; FELIN, 2008b). Estes estudos corroboram com os achados deste trabalho, no qual foi observado aumento da expressão de COX-2 nos grupos tratados com DECA. Além disso, encontramos correlação positiva das imunoexpressões de p53 e COX-2 dos grupos tratados em relação os seus respectivos controles, sugerindo que a expressão de p53 está relacionada à regulação do ciclo celular.
6 CONCLUSÃO
Nossos resultados sugerem que o esteróide anabolizante andrógeno, decanoato de nandrolona, quando administrado continuamente à doses suprafisiológicas, é capaz de desregular a expressão das proteínas reguladoras do ciclo celular ki-67 e p53, bem como induzir a imunoexpressão de COX-2 em células da língua.
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