APLICAÇÃO DE FASE EXTRATORA À BASE DE POLIPIRROL PARA A DETERMINAÇÃO DE HORMÔNIOS E
HIDROCARBONETOS POLICÍCLICOS AROMÁTICOS EM AMOSTRAS DE ÁGUA PELA TÉCNICA DE EXTRAÇÃO EM
PONTEIRA DESCARTÁVEL
Dissertação submetida ao Programa de Pós-Graduação em Ciência e Engenharia de Materiais da Universidade Federal de Santa Catarina para a obtenção do título de Mestre em Ciência e Engenharia de Materiais
Orientador: Prof. Dr. Guilherme Mariz de Oliveira Barra
Coorientador: Prof. Dr. Eduardo Carasek da Rocha
Florianópolis 2019
APLICAÇÃO DE FASE EXTRATORA À BASE DE POLIPIRROL PARA A DETERMINAÇÃO DE HORMÔNIOS E
HIDROCARBONETOS POLICÍCLICOS AROMÁTICOS EM AMOSTRAS DE ÁGUA PELA TÉCNICA DE EXTRAÇÃO EM
PONTEIRA DESCARTÁVEL
Esta Dissertação foi julgada adequada para obtenção do título de Mestre e aprovada em sua forma final pelo Programa de Pós-Graduação em
Ciência e Engenharia de Materiais. Florianópolis, 29 de março de 2019.
________________________
Prof. Dr. Guilherme Mariz de Oliveira Barra
Orientador/Coordenador do Programa de Pós-Graduação em Ciência e Engenharia de Materiais
Banca Examinadora:
________________________ Prof. Dr. Eduardo Carasek da Rocha
Coorientador
Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC)
________________________ Prof.ª Dr.ª Claudia Merlini
Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC)
________________________ Prof.ª Dr.ª Adriana Neves Dias Instituto Federal Catarinense (IFC)
Aos meus pais Deila e Gilberto, que me deram forças para lutar, seguir em frente e de cabeça erguida, encarando todos os desafios ao longo desses dois anos de mestrado e também durante toda graduação. Por mais que eu tivesse medo, sempre me passaram confiança e estiveram ao meu lado. Amo vocês.
A minha irmã Caroline, que desde cedo me incentivou a vir pra UFSC e me recebeu aqui em Florianópolis. A gente se aproximou tanto nos últimos anos, mesmo que tantas vezes a gente brigava, no fim das contas, tudo ficava bem.
Aos meus avós Zenir e Elias (in memoriam), que sabiam da importância do meu estudo e desde sempre me auxiliaram ao máximo no que eu precisei.
Ao meu orientador, professor Dr. Guilherme Mariz de Oliveira Barra, gostaria de agradecer por me aceitar em seu laboratório e por sua orientação, por sempre reconhecer os meus esforços e me dar todo seu apoio para realização deste trabalho.
Ao meu coorientador, professor Dr. Eduardo Carasek, que além de professor e orientador na graduação, me deu a oportunidade de fazer parte do meu trabalho do mestrado em seu laboratório, pela confiança e por todo seu conhecimento transmitido.
Aos professores que tive ao longo da graduação e pós-graduação, que me proporcionaram realizar o curso, seus ensinamentos contribuíram (e muito) para minha formação.
A professora Drª. Adriana Neves Dias, Adri, que me auxiliou muito na finalização do TCC e agora, por ter aceitado fazer parte da banca examinadora deste trabalho. Além de todo o seu ensinamento, quero que saiba que você tem parte especial na minha vida acadêmica.
A professora Drª. Claudia Merlini, pela participação no exame de qualificação, por ter aceitado fazer parte da banca examinadora deste trabalho e também na disciplina de Estudo Dirigido, suas sugestões e contribuições foram essenciais e de grande importância.
Gostaria de agradecer também, ao professor Dr. Thiago Ferreira da Conceição e ao Dr. Luiz Gustavo Ecco pela participação e sugestões feitas no exame de qualificação e a Drª. Sílvia Daniela Araújo da Silva Ramôa, que aceitou fazer parte da banca na disciplina de Estudo Dirigido e pode contribuir muito para finalização deste trabalho.
Aos meus colegas e amigos de ambos os laboratórios (POLICOM e CroMaas) em que tive o prazer de trabalhar e conviver, cada um contribuiu de forma única para realização e deste trabalho. Em especial ao Josias, que me auxiliou tanto durante a graduação e foi nele que me espelhei pra seguir com o mestrado!
Em especial ao Lucas, que além de grande amigo, me ajudou durante todo trabalho, sem ele me auxiliando nada disso teria dado certo. E se eu consegui finalizar este trabalho, o mérito também é seu!
Aos amigos que a UFSC me deu ao longo desses anos, cada um que me acrescentou em algo sabe o quanto eu considero. Em especial, Murara, Ana e a todos os amigos da Automação, vocês são muito importantes pra mim! Por último, mas não menos importantes, ao Andy, que sempre me ajudou e esteve ao meu lado desde os primeiros passos dentro da UFSC e que mesmo quando esteve longe, eu sabia que estava presente e a Marina, que por mais que a gente se conheça e conviva há pouco tempo (apenas oito meses), nos identificamos logo de cara, e vimos que nossa amizade tinha tudo pra dar muito certo.
Gostaria de agradecer também ao Rogério, por toda ajuda e disponibilidade sempre que necessário em situações envolvendo a coordenação do PGMAT.
Ao CNPq pela bolsa de fornecida, porque sem isso, eu não conseguiria me manter aqui ao longo do programa de pós-graduação. E por fim, gostaria muito de agradecer a UFSC, foram alguns anos fazendo parte dessa universidade maravilhosa.
Neste trabalho foi realizado um estudo da viabilização do uso de diferentes polipirróis como fase extratora na técnica de extração em ponteira descartável (DPX) para determinação de hormônios e hidrocarbonetos policíclicos aromáticos em amostras de água. Inicialmente, foram preparados três tipos de polipirróis, denominados como PPy, PPy.CTAB e MMT/PPy.CTAB, a partir da síntese oxidativa do pirrol (Py), utilizando cloreto férrico hexahidratado. Os mesmos foram caracterizados por meio de espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier (FTIR) e microscopia eletrônica de varredura (MEV). Em uma segunda etapa, foi desenvolvida uma metodologia que permitiu a determinação dos 16 compostos, dentre eles, 17β-estradiol (E2), 17α-etinilestradiol (EE2), Estrona (E1), Acenaftileno (Aceti), Fluoreno (Fluo), Antraceno (Ant), Fenantreno (Fen), Pireno (Pir), Criseno (Cri), Benzo[a]antraceno (BaA), Benzo[b]fluoranteno (BbF), Benzo[k]fluoranteno (BkF), Benzo[a]pireno (BaP), Dibenzo[a,h]antraceno (DBA), Benzo[g,h,i]perileno (BghiP) e Indeno[1,2,3-c,d]pireno (InP). Foram utilizadas ponteiras de 1 mL, preenchidas com cada um dos polipirróis e a eficiência de extração de cada um deles foi avaliada utilizando água ultrapura fortificada com solução de concentração 100 µg L-1. A partir dos resultados obtidos o PPy.CTAB foi selecionado como fase extratora. Após a definição da fase extratora, as otimizações do método foram realizadas através de abordagens univariadas e multivariadas. As condições ótimas de extração foram 700 µL de água em 2 ciclos de 15 segundos cada, pH da amostra mantido em 6,00 e sem adição de NaCl. Para dessorção, foram obtidas as condições otimizadas de 200 µL de uma mistura dos solventes acetonitrila e metanol (50:50 v/v), utilizando 6 ciclos de 15 segundos cada. Para reutilizar as ponteiras foi otimizado um procedimento de limpeza realizado antes das extrações, com 200 µL da mistura de solventes acetonitrila e metanol (50:50 v/v) em 2 ciclos de 15 segundos cada. As curvas de calibração foram realizadas na matriz da amostra. Os valores de limite de detecção (LOD) e limite de quantificação (LOQ) foram de 1,5 à 6,1 µg L-1 e 5,0 à 20,0 µg L-1, respectivamente. A exatidão e a precisão do método foram avaliadas pela recuperação relativa em três níveis de concentração e as precisões intradia e interdia em um nível de concentração comum a todos os analitos. Os coeficientes de correlação lineares obtidos foram maiores ou iguais a 0,9901, a recuperação variou de 53-164% e os valores de precisão intradia e interdia foram ≤ 8% e ≤ 26%, respectivamente. A
metodologia foi aplicada em três amostras coletadas no Rio Tubarão localizado no município de Orleans – SC, mas os analitos não foram detectados nessas amostras ou se encontram abaixo do LOD, apesar disso, foi demonstrado a viabilidade de utilização do PPy.CTAB como fase extratora na técnica de DPX para a extração de diferentes classes de compostos em amostras de água.
Palavras-chave: Hormônios, HPAs, polipirrol, polímero condutor, DPX.
In this work, the viabilization of the use of different polypyrroles as extractor phase in disposable pipette extraction technique (DPX) for the determination of hormones and polycyclic aromatic hydrocarbons in water samples was studied. Initially, it was prepared three types of polypyrrole, PPy, PPy.CTAB and MMT/PPy.CTAB, from the oxidative synthesis of pyrrole (Py) using iron (III) chloride hexahydrate and characterized by Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR) and scanning electron microscopy (SEM). In a second step, a methodology was developed that allowed the simultaneous determination of 16 compounds including 17β-estradiol (E2), 17α-ethynylestradiol (EE2), Estrone (E1), Acenaphthylene (Aceti), Fluorene (Fluo), Anthracene (Ant), Phenanthrene (Fen), Pyrene (Pir), Chrysene (Cri), Benzo[a]anthracene (BaA), Benzo[b]fluoranthene (BbK), Benzo[k] fluoranthene (BkF), Benzo[a]pyrene (BaP), Dibenz[a,h]anthracene (DBA), Benzo[g,h,i] perylene (BghiP) and Indeno[1,2,3-cd]pyrene (InP). Disposable tips of 1 mL capacity were filled with each polypyrrole and the extraction efficiency of each was evaluated using ultrapure water spiked with 100 μg L-1 solution and the PPy.CTAB was selected as extractor phase. After the extractor phase definition, the method optimizations were performed through univariate and multivariate approaches. The optimal extraction conditions were 700 μL of sample in 2 cycles of 15 seconds each, pH adjusted at 6.00, and without addition of NaCl. For the desorption step, the optimized conditions of 200 μL of a mixture of acetonitrile and methanol (50:50, v/v) were obtained using 6 cycles of 15 seconds each. In order to reuse the disposable tips, a cleaning procedure performed prior to the extractions was optimized using 200 μL of the solvent mixture acetonitrile and methanol (50:50) (v/v) in 2 cycles of 15 seconds. The calibration curves were performed in the sample matrix. The values of limit of detection (LOD) and limit of quantification (LOQ) ranged from 1.5 to 6.1 µg L-1 and 5.0 to 20.0 µg L-1, respectively. The accuracy and precision of the method were evaluated through relative recovery at three concentration levels and intraday and interday precision at one concentration level for all analytes. The linear correlation coefficients obtained were higher than or equal to 0.9901, the accuracy ranged from 53-164% and intraday and interday precision with values ≤ 8% and ≤ 26%, respectively. The methodology was applied to three samples collected in the Tubarão River located in the city of Orleans – SC, but the analytes were not detected in these samples or are below the LOD,
however, it was demonstrated the feasibility of using PPy.CTAB as extractor phase in the DPX technique for the extraction of different class of compounds in water samples.
Keywords: Hormones, PAHs, Polypyrrole, conducting polymer, DPX.
Figura 1 – Estruturas químicas dos hormônios estudados... 22 Figura 2 – Estruturas químicas dos HPAs estudados. ... 23 Figura 3 – Etapas do procedimento envolvendo SPE. ... 26 Figura 4 – Esquema representativo de uma ponteira empregada em DPX. ... 27 Figura 5 – Etapas do procedimento envolvendo DPX. ... 28 Figura 6 – Estrutura química da unidade de repetição do polipirrol. ... 31 Figura 7 – Reação de polimerização do PPy com o oxidante FeCl3.6H2O. ... 31 Figura 8 – Esquema ilustrativo do preparo das ponteiras de DPX com o pó do material. ... 37 Figura 9 – Pontos de coleta de amostras de água do Rio Tubarão com suas respectivas coordenadas geográficas. ... 44 Figura 10 – Espectros de FTIR do PPy, PPy.CTAB e MMT/PPy.CTAB. ... 46 Figura 11 – Micrografias obtidas do PPy, PPy.CTAB e MMT/PPy.CTAB. ... 47 Figura 12 – Cromatograma da separação dos 16 analitos acompanhados em 220 nm. Analitos: 17β-estradiol (E2), 17α-etinilestradiol (EE2), Estrona (E1), Acenaftileno (Aceti), Fluoreno (Fluo), Antraceno (Ant), Fenantreno (Fen), Pireno (Pir), Criseno (Cri), Benzo[a]antraceno (BaA), Benzo[b]fluoranteno (BbF), Benzo[k]fluoranteno (BkF), Benzo[a]pireno (BaP), Dibenzo[a,h]antraceno (DBA), Benzo[g,h,i]perileno (BghiP) e Indeno[1,2,3-c,d]pireno (InP). ... 48 Figura 13 – Cromatogramas do branco obtido para cada uma das fases extratoras acompanhados em 220 nm (*Condições: Para cada ponteira: 10 mg de material, 700 µL de amostra, 3 ciclos de extração de 30
segundos cada ciclo, pH mantido em 6,00, sem adição de sal, 2 ciclos de dessorção de 30 segundos cada ciclo, 200 µL de uma mistura de solventes ACN:MeOH 50:50 v/v). ... 49 Figura 14 – Gráfico de barras obtido para avaliar a eficiência de extração de cada uma das fases extratoras (Condições: Para cada ponteira: 10 mg de material, fortificação de 100 µg L-1 dos analitos, 700 µL de amostra, 3 ciclos de extração de 30 segundos cada ciclo, pH mantido em 6,00, sem adição de sal, 2 ciclos de dessorção de 30 segundos cada ciclo, 200 µL de uma mistura de solventes ACN:MeOH 50:50 v/v). ... 50 Figura 15 – Superfície ternária obtida para a escolha do solvente de dessorção (*Condições: 10 mg de PPy.CTAB, fortificação de 100 µg L-1 dos analitos, 700 µL de amostra, 3 ciclos de extração de 30 segundos cada ciclo, pH mantido em 6,00, sem adição de sal, 2 ciclos de dessorção de 30 segundos cada ciclo). ... 51 Figura 16 – Superfície de resposta obtida pelos resultados do planejamento Doehlert (*Condições: 10 mg de PPy.CTAB, fortificação de 100 µg L-1 dos analitos, 700 µL de amostra, 3 ciclos de extração de 30 segundos cada ciclo, pH mantido em 6,00, sem adição de sal, 200 µL de uma mistura de solventes ACN:MeOH 50:50 v/v). ... 52 Figura 17 – Gráfico de barras obtido para a massa de PPy.CTAB adicionada na ponteira de DPX (*Condições: fortificação de 100 µg L-1 dos analitos, 700 µL de amostra, 3 ciclos de extração de 30 segundos cada, pH mantido em 6,00, sem adição de sal, 200 µL de uma mistura de solventes ACN:MeOH 50:50 v/v e 6 ciclos de dessorção de 15 segundos cada ciclo). ... 53 Figura 18 – Gráfico de barras obtido para otimização do pH (*Condições: 5 mg de PPy.CTAB, fortificação de 100 µg L-1 dos analitos, 700 µL de amostra, 3 ciclos de extração de 30 segundos cada, sem adição de sal, 200 µL de uma mistura de solventes ACN:MeOH 50:50 v/v e 6 ciclos de dessorção de 15 segundos cada ciclo). ... 55 Figura 19 – Superfícies de resposta obtidas para (a) número de ciclos versus tempo, (b) sal versus número de ciclos (c) sal versus tempo. (*Condições: 5 mg de PPy.CTAB, fortificação de 100 µg L-1 dos
15 segundos cada ciclo). ... 56 Figura 20 – Gráfico obtido para o número de ciclos de limpeza (*Condições: 5 mg de PPy.CTAB, fortificação de 100 µg L-1 dos analitos, 700 µL de amostra, 2 ciclos de extração de 15 segundos cada, pH mantido em 6,00, sem adição de sal, 200 µL de uma mistura de solventes ACN:MeOH 50:50 v/v e 6 ciclos de dessorção de 15 segundos cada ciclo). ... 57 Figura 21 – Cromatogramas das amostras coletadas em diferentes pontos do Rio Tubarão. ... 60
Tabela 1 – Ponteiras comercializadas para DPX contendo diferentes materiais sorventes. ... 29 Tabela 2 – Experimentos realizados no planejamento segundo modelo simplex-centroide. ... 39 Tabela 3 – Experimentos realizados no planejamento Doehlert. ... 40 Tabela 4 – Experimentos realizados no planejamento Composto Central. ... 42 Tabela 5 – Limites de detecção, quantificação, faixa linear de trabalho, coeficiente de determinação, coeficiente de correlação linear e equações lineares para os analitos. ... 59 Tabela 6 – Recuperações e precisões intradia e interdia na amostra de água do rio Tubarão... 61 Tabela 7 – Comparação do método proposto com outros publicados na literatura. ... 65
AOAC – Associação Oficial de Químicos Analíticos, do inglês Association of Official Analytical Chemists
Aceti – Acenaftileno, do inglês Acenaphthylene ACN – Acetonitrila, do inglês Acetonitrile Ant – Antraceno, do inglês Anthracene
BaA – Benzo[a]antraceno, do inglês Benzo[a]anthracene BaP – Benzo[a]pireno, do inglês Benzo[a]pyrene
BbF – Benzo[b]fluoranteno, do inglês Benzo[b]fluoranthene BghiP – Benzo[g,h,i]perileno, do inglês Benzo[g,h,i]perylene BkF – Benzo[k]fluoranteno, do inglês Benzo[k]fluoranthene Cri – Criseno, do inglês Chrysene
CTAB – Brometo de cetiltrimetilamônio, do inglês Cetyltrimethylammonium bromide
DAD – Detector por arranjo de diodos, do inglês Diode array detector DBA – Dibenzo[a,h]antraceno, do inglês Dibenzo[a,h]anthracene DPX – Extração em ponteira descartável, do inglês Disposable pipette extraction
DPX-Blank – Extração em ponteira descartável branca, do inglês Blank disposable pipette extraction
DPX-C18 – Extração em ponteira descartável com fase de partículas C18, do inglês C18 disposable pipette extraction
DPX-CX – Extração em ponteira descartável com fase de troca catiônica, do inglês Cationic change disposable pipette extraction DPX-RP – Extração em ponteira descartável com fase reversa, do inglês Reverse phase disposable pipette extraction
DPX-Si – Extração em ponteira descartável com fase de silício, do inglês Silicon phase disposable pipette extraction
DPX-WAX – Extração em ponteira descartável com fase de troca aniônica, do inglês Anionic change disposable pipette extraction
DPX-WCX – Extração em ponteira descartável com fase de troca catiônica, do inglês Cationic change diposable pipette extraction E1 – Estrona, do inglês Estrone
E2 – 17β-estradiol, do inglês 17β-estradiol
EE2 – 17α-etinilestradiol, do inglês 17α-ethynylestradiol
FeCl3.6H2O – Cloreto de ferro (III) hexahidratado, do inglês Iron (III) chloride hexahydrate
Fen – Fenantreno, do inglês Phenanthrene Fluo – Fluoreno, do inglês Fluorene
FTIR – Infravermelho por transformada de Fourier, do inglês Fourier transform infrared
HCl – Ácido clorídrico, do inglês Chloridric acid
HPAs – Hidrocarbonetos policíclicos aromáticos, do inglês Polycyclic aromatic hydrocarbons
HPLC – Cromatografia líquida de alta eficiência, do inglês High performance liquid chromatography
GC – Cromatografia gasosa, do inglês Gas chromatography InP – Indeno[1,2,3-c,d]pireno, do inglês Indeno[1,2,3-cd]pyrene KBr – Brometo de potássio, do inglês Potassium bromide
LLE – Extração Líquido-líquido, do inglês Liquid-liquid extraction LOD – Limite de detecção, do inglês Limit of detection
LOQ – Limite de quantificação, do inglês Limit of quantification MeOH – Metanol, do inglês Methanol
MEV – Microscópio eletrônico de varredura, do inglês Scanning eletronic microscopy
MMT – Montmorilonita, do inglês Montmorillonite
MMT/PPy.CTAB – aditivo nanoestruturado de
montmorilonita/polipirrol dopado com surfactante brometo de cetiltrimetilamônio, do inglês Nanostructured additive of montmorillonite/polypyrrole doped with surfactant cetyltrimethylammonium bromide
NaCl – Cloreto de sódio, do inglês Sodium chloride NaOH – Hidróxido de sódio, do inglês Sodium hydroxide Pir – Pireno, do inglês Pyrene
PPy – polipirrol, do inglês polypyrrole
PPy.CTAB – polipirrol dopado com surfactante brometo de cetiltrimetilamônio, do inglês Polypyrrole doped with surfactant cetyltrimethylammonium bromide
Py – pirrol, do inglês pyrrole
r – Coeficiente de correlação linear, do inglês Linear correlation coefficient
R2 – Coeficiente de determinação, do inglês Determination coefficient SPE – Extração em fase sólida, do inglês Solid phase extraction
SPME – Microextração em fase sólida, do inglês Solid phase microextraction
USEPA – Agência de Proteção Ambiental dos Estados Unidos, do inglês United States Environmental Protection Agency
1 INTRODUÇÃO ... 17 2 OBJETIVOS ... 19 2.1 OBJETIVO GERAL ... 19 2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ... 19 3 REVISÃO BIBLIOGRÁGICA ... 21 3.1 ANÁLISE DE ÁGUA ... 21 3.2 PREPARO DE AMOSTRA ... 24
3.2.1 Extração em fase sólida (SPE) ... 25
3.2.2 Extração em ponteira descartável (DPX) ... 26
3.3 POLÍMEROS INTRINSECAMENTE CONDUTORES (PICs)...30
4 MATERIAIS E MÉTODOS ... 33
4.1 MATERIAIS E REAGENTES ... 33
4.2 SÍNTESE DOS PICs ... 34
4.3 CARACTERIZAÇÃO DOS PICs ... 35
4.4 INSTRUMENTAÇÃO E CONDIÇÕES CROMATOGRÁFICAS ... 35
4.5 PREPARO DAS PONTEIRAS E ESCOLHA DO MATERIAL ... 36
4.6 OTIMIZAÇÃO DO PROCEDIMENTO DE DPX ... 38
4.6.1 Otimização do solvente de dessorção ... 38
4.6.2 Otimização do número de ciclos e tempo de dessorção ... 39
4.6.3 Otimização da massa de fase extratora ... 40
4.6.4 Otimização do pH ... 40
4.6.5 Otimização do número de ciclos, tempo e efeito salting-out na extração ... 41
4.6.6 Otimização da etapa de limpeza ... 42
4.7 PARÂMETROS ANALÍTICOS DE MÉRITO ... 43
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 45
5.2 SEPARAÇÃO CROMATOGRÁFICA ... 47
5.3 ESCOLHA DO MATERIAL ... 48
5.4 OTIMIZAÇÃO DO MÉTODO ... 50
5.4.1 Otimização do solvente de dessorção ... 51
5.4.2 Otimização do número de ciclos e tempo de dessorção ... 52
5.4.3 Otimização da massa de fase extratora ... 53
5.4.4 Otimização do pH ... 54
5.4.5 Otimização do número de ciclos, tempo e efeito salting-out na extração ... 55
5.4.6 Otimização da etapa de limpeza ... 57
5.5 PARÂMETROS ANALÍTICOS DE MÉRITO ... 58
6 CONCLUSÃO ... 67
1 INTRODUÇÃO
A condição de saúde dos seres vivos pode ser frequentemente relacionada com a qualidade da água consumida, mas esta pode estar sujeita a contaminações. Desta forma, o monitoramento da água deve ser avaliado continuamente para garantir a qualidade de vida dos seres vivos. Considerando que os sistemas de tratamento de água não possuem a capacidade de eliminar totalmente substâncias indesejáveis que apresentam grande toxicidade e também relacionado ao descarte irregular de resíduos que contenham estas substâncias no ambiente, torna-se crucial empregar meios de monitorar a presença de contaminantes na água, para garantir que esteja adequada para ser consumida.
Estudos relacionados ao monitoramento e controle dos níveis de contaminantes presentes em amostras de águas utilizam procedimentos de preparo de amostra, os quais têm como principal objetivo, isolar e pré-concentrar os analitos da matriz para serem analisados por um sistema adequado de separação e detecção (PRIETO et al., 2011). Dentre algumas das técnicas de preparo de amostra que vêm sendo empregadas, pode-se citar a extração em fase sólida (SPE), a microextração em fase sólida (SPME) e a extração em ponteira descartável (DPX).
Na maioria dessas técnicas os dispositivos comercialmente disponíveis no mercado, normalmente, são empregados para extrair uma única classe de analitos (BIANCHIN et al., 2012). A técnica de DPX apresenta algumas vantagens em relação às outras técnicas de preparo de amostra empregadas na determinação dos níveis de contaminantes sendo estas relacionadas à utilização de menores quantidades de massa de fase extratora em uma ponteira, menores volumes de amostra e de solvente orgânico, baixa geração de resíduos, facilidade de execução, além de proporcionar extrações relativamente rápidas. A partir do uso da ponteira sem fase extratora (DPX-Blank) há possibilidade de preencher a ponteira e utilizar fases alternativas para aplicações específicas.
Recentemente, estudos na literatura na área de preparo de amostra têm como foco o desenvolvimento e caracterização de novos materiais para serem empregados como fases extratoras, dentre os quais se destacam os polímeros intrinsecamente condutores (PICs) (HUANG; LEE, 2012). O interesse na síntese de PICs está relacionado com a sua facilidade de síntese, estabilidade, pois a maioria dos PICs são insolúveis em solventes orgânicos e também relacionado à sua multifuncionalidade que pode ser obtida por meio de modificações na
18
estrutura, proporcionando uma fase extratora capaz de extrair diferentes classes de analitos.
Desta forma, este trabalho visa avaliar a viabilidade do uso de polímeros condutores como alternativa de material sorvente empregando DPX para determinação de duas classes distintas de contaminantes em águas, hormônios e hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPAs, do inglês, Polycyclic aromatic hydrocarbons).
2 OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
Avaliar a viabilidade de utilização de diferentes polipirróis como fase extratora na técnica de extração em ponteira descartável (DPX) para determinação de duas classes distintas de analitos, os hormônios e hidrocarbonetos policíclicos aromáticos em amostras de água.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
- Sintetizar e avaliar a estrutura do polipirrol (PPy), do PPy com brometo de cetiltrimetilamônio (PPy.CTAB) e montmorilonita/PPy.CTAB (MMT/PPy.CTAB);
- Investigar a eficiência de extração do PPy, PPy.CTAB e MMT/PPy.CTAB;
- Selecionar o polipirrol com maior eficiência de extração e desenvolver uma metodologia empregando otimizações univariadas e multivariadas; - Determinar os limites de detecção e quantificação (LOD e LOQ, respectivamente), faixa linear de trabalho, coeficiente de correlação linear (r) e equação da reta para cada analito;
- Determinar as recuperações relativas em 3 níveis (10, 50 e 125 µg L-1) e precisões intradia e interdia em 1 nível (125 µg L-1);
3 REVISÃO BIBLIOGRÁGICA 3.1 ANÁLISE DE ÁGUA
A preocupação pelo monitoramento dos níveis de contaminantes em efluentes tem crescido mundialmente nos últimos anos. Segundo a USEPA (Agência de Proteção Ambiental dos Estados Unidos), destacam-se os contaminantes emergentes, os quais são poluentes que não apresentam regulamentação ou limite máximo permitido e quem vem sendo recentemente descobertos por estarem presentes no ambiente. Estes contaminantes consistem de diferentes classes de substâncias de origem natural ou sintética, tais como produtos para cuidados pessoais, produtos farmacêuticos, plastificantes, pesticidas, hormônios, entre outros (LUO et al., 2014; DIMPE; NOMNGONGO, 2016; A.; LIMA, 2018).
O número de contaminantes encontrados no ambiente geralmente é elevado, e embora estejam presentes em níveis traço ou ultratraço e sejam detectados em baixa concentração, podem afetar a qualidade da água e serem prejudiciais ao ecossistema. Além de desregular o sistema endócrino, estes contaminantes possuem a tendência de acumular no ambiente devido a sua lipofilicidade. A eliminação destas substâncias indesejáveis por sistemas de tratamento de água não é totalmente eficaz, ou seja, mesmo quando empregado saneamento adequado, estas substâncias ainda são encontradas em rios, lagos e outras águas superficiais, até mesmo em água potável (BOLONG et al., 2009; GÓMEZ et al., 2009; MALDANER; JARDIM, 2012; MACHADO et al., 2016).
Sendo assim, torna-se necessário a análise de amostras de água a partir de técnicas analíticas que sejam capazes de monitorar, determinar e quantificar os compostos presentes nessas amostras. Estas análises laboratoriais geralmente são capazes de oferecer uma maior precisão, sensibilidade e eficiência na quantificação de contaminantes que podem ser prejudiciais quando presentes (PREBIHALO et al., 2015; WOODIE, 2015; AZZOUZ et al., 2018).
Na literatura são reportados diversos estudos descrevendo técnicas que podem ser empregadas para a determinação de contaminantes em água, embora nestes estudos cada classe de analitos normalmente é analisada separadamente. Neste trabalho, o método proposto envolve a determinação simultânea de duas classes distintas de analitos, os hormônios e os hidrocarbonetos policíclicos aromáticos em amostras de água de rio. Os hormônios em estudo são esteroides que
22
podem ser classificados como estrogênios naturais ou endógenos (17β-estradiol (E2), estrona (E1)) e sintéticos ou exógenos (17α-etinil(17β-estradiol (EE2)), e suas respectivas estruturas são mostradas na Figura 1. Apresentam as funções de regular e desenvolver os órgãos reprodutores, além de serem amplamente empregados como contraceptivos (LIZ et al., 2016; MAFRA et al., 2018).
Figura 1 – Estruturas químicas dos hormônios estudados.
Fonte: Autoria própria (2019).
Estão presentes em efluentes principalmente porque a remoção através das estações de tratamento de água é incompleta. Estas substâncias são consideradas contaminantes emergentes, pois não estão incluídos em programas de monitoramento, mas apesar disso, no decorrer dos últimos anos, houve um crescimento no interesse da determinação destes compostos, que mesmo em concentrações muito baixas, podem ser prejudiciais, pois afetam o sistema endócrino (síntese, secreção, transporte, ligação, ação e eliminação de hormônios) dos seres vivos. São monitorados principalmente por técnicas cromatográficas, como cromatografia gasosa (GC) ou cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), relacionado à possibilidade de determinação simultânea destes analitos (HOUTMAN; BROEK; BROUWER, 2018; TOMŁÍKOVÁ et al., 2012; PETRIE; BARDEN; KASPRZYK-HORDERN, 2015; PREBIHALO et al., 2015; MSIGALA et al., 2017; MERIB et al., 2018).
Além dos hormônios, os HPAs (hidrocarbonetos policíclicos aromáticos) também foram estudados. Os HPAs são poluentes responsáveis pela contaminação atmosférica, do solo e de fontes hídricas. Constituídos por dois ou mais anéis aromáticos conforme mostrado na Figura 2, são produzidos em incêndios, queima de combustíveis fósseis, incineração de lixo, erupções vulcânicas, entre outras fontes (HARITASH; KAUSHIK, 2009; TOPUZ; UYAR, 2017).
Figura 2 – Estruturas químicas dos HPAs estudados.
Fonte: Autoria própria (2019).
Estas substâncias apresentam caráter lipofílico que se eleva com o aumento do número de anéis aromáticos, aumentando a tendência de se acumularem no ambiente, relacionada à baixa solubilidade em água. O risco de contaminação se torna significativo para concentrações de até 0,5 µg L-1, uma vez que estes apresentam elevada toxicidade, relacionada à sua potencial atividade carcinogênica e mutagênica (NETTO et al., 2000; ISHIZAKI et al., 2010).
Um dos meios de absorção dos HPAs é pelo consumo de água poluída, provocando diversos problemas de saúde como dano renal e hepático, problemas respiratórios, diminuição da função imunológica, entre outros. Relacionado a isso, a Comissão Europeia (DIRETIVA 2013/39/EU) estabelece limites máximos para alguns HPAs: antraceno (Ant) 0,1 µg L-1, benzo[a]pireno (BaP) 0,27 µg L-1, benzo[b]fluoranteno (BbF) 0,017 µg L-1, benzo[k]fluoranteno (BkF) e benzo[g,h,i]perileno
Acenaftileno (Aceti) Fluoreno (Fluo) Antraceno (Ant) Fenantreno (Fen)
Pireno (Pir) Criseno (Cri) Benzo[a]antraceno (BaA) Benzo[b]fluoranteno (BbF)
Benzo[k]fluoranteno (BkF) Benzo[a]pireno (BaP) Dibenzo[a,h]antraceno (DBA)
24
(BghiP) 0,0082 µg L-1. Embora encontrados em nível traço, torna-se necessário o desenvolvimento de procedimentos de pré-concentração que sejam eficientes e a utilização de técnicas de separação e análise seletivas e sensíveis (MA et al., 2010; ABDEL-SHAFY; MANSOUR, 2016; TOPUZ; UYAR, 2017).
Dentro deste contexto, com o intuito de separar os hormônios e HPAs da matriz, são empregadas técnicas de preparo de amostra. 3.2 PREPARO DE AMOSTRA
Matrizes complexas, como por exemplo, águas de rio, não devem ser introduzidas diretamente no instrumento analítico, devido à presença de interferentes e material particulado que poderia ocasionar no entupimento e danificação do dispositivo, embora, observou-se uma crescente evolução nestes equipamentos, uma etapa de pré-tratamento, também conhecida como preparo de amostra, é empregada antes das análises. A fim de separar os analitos da matriz aquosa, são empregadas etapas de extração e pré-concentração, sendo este procedimento realizado para melhorar a seletividade, minimizar ou até mesmo evitar o uso de solventes orgânicos e reduzir a ocorrência dos efeitos da matriz (PRIETO et al., 2011; ROCHA et al., 2013; FUMES et al., 2015).
Para obter resultados satisfatórios e garantir o sucesso de qualquer método analítico, na etapa de preparo de amostra deve-se considerar o tipo de analito, suas propriedades físico-químicas (solubilidade, volatilidade, polaridade) e os componentes da matriz (BOYACI et al., 2015).
Várias técnicas de preparo de amostra foram e vem sendo desenvolvidas para extração de analitos das mais variadas matrizes. Podemos citar como técnicas tradicionais ou também conhecidas como técnicas clássicas de preparo de amostra a extração líquido-líquido (LLE) e a extração em fase sólida (SPE) e com a crescente busca pela miniaturização, algumas técnicas vêm sendo amplamente utilizadas, como a microextração em fase sólida (SPME) e também a extração em ponteira descartável (DPX) (PRIETO et al., 2011; PENA-ABAURREA; LA TORRE; RAMOS, 2013).
As técnicas tradicionais apresentam algumas desvantagens com relação ao tempo empregado no procedimento, mão de obra, custo elevado e o alto consumo de solvente, que é prejudicial para saúde do analista. Devido às desvantagens destas técnicas, tendências atuais buscam a simplificação, miniaturização e automação, envolvendo
procedimentos ambientalmente corretos (ASENSIO-RAMOS et al., 2011; BIDARI et al., 2011).
3.2.1 Extração em fase sólida (SPE)
Com a finalidade de superar algumas limitações da extração líquido-líquido (LLE), como utilização de grandes quantidades de solventes, maior tempo empregado para realização do procedimento e, como consequência, gerando possíveis fontes de erro, em 1976 foi desenvolvida a técnica de extração em fase sólida (SPE). O objetivo da técnica é isolar e concentrar os analitos em uma fase extratora sólida e em seguida, é realizada a eluição utilizando um solvente adequado (JARDIM, 2010; KOLE et al., 2010; ÖTLES; KARTAL, 2016).
A SPE emprega volumes menores do que a LLE, proporcionando assim um melhor fator de pré-concentração dos compostos, melhorando os resultados de análise, podendo ser utilizada em cromatografia líquida de alta eficiência, cromatografia gasosa e eletroforese capilar. Na SPE a escolha da fase extratora torna-se essencial para melhorar a seletividade e a eficiência do procedimento, sendo dependente da identidade do analito e sua interação com o sorvente e da natureza da matriz. (JARDIM, 2010; HASHEMI; ZOHRABI; SHAMSIPUR, 2018).
Na Figura 3 são ilustradas as etapas do procedimento da SPE, que consistem em 1) condicionar a fase extratora com um solvente apropriado para ativação dos sítios de ligação e após o condicionamento esse solvente descartado, 2) introdução da amostra e após extração dos analitos, a amostra é descartada, 3) etapa de limpeza empregando um solvente, com a finalidade de retirar possíveis interferentes que eventualmente estavam presentes na matriz e também tenham sido extraídos e 4) eluição dos analitos (OSHITA; JARDIM, 2015).
26
Figura 3 – Etapas do procedimento envolvendo SPE.
Fonte: Adaptado de Jardim (2010).
Entretanto, a SPE também apresenta algumas desvantagens, sendo considerada uma técnica demorada, necessita grande quantidade de fase extratora e amostra e o custo é elevado, pois seus cartuchos comerciais são utilizados geralmente uma única vez, sendo descartados após o uso. Uma alternativa para superar as desvantagens das técnicas clássicas de preparo de amostra, é o desenvolvimento das chamadas técnicas de microextração que visam à utilização de menores volumes de solvente, necessitam menor quantidade de amostra, o tempo empregado no procedimento é reduzido e geram menor quantidade de resíduos. Dentre algumas dessas técnicas de microextração, a extração em ponteira descartável (DPX) foi recentemente desenvolvida (BIDARI et al., 2011; ANDRADE-EIROA et al., 2016; OCAÑA-GONZÁLEZ et al., 2016; FILIPPOU; BITAS; SAMANIDOU, 2017).
3.2.2 Extração em ponteira descartável (DPX)
Desenvolvida pelo Dr. William Brewer (Universidade da Carolina do Sul, EUA) no ano de 2003, a extração em ponteira descartável, DPX, patente (n° US6566145 B2), é uma alternativa para a extração em fase sólida (SPE), com a finalidade de reduzir o uso de fase extratora, o tempo de extração e também o volume de amostra e solvente orgânico. Consiste de uma ponteira com capacidade de 1 ou 5 mL, preenchida com uma pequena quantidade de fase extratora, a qual encontra-se dispersa livremente entre dois filtros contidos no interior da Analitos Interferentes (1) (2) (3) (4)
Condicionamento Lavagem com solvente Eluição Introdução da Amostra
ponteira, como mostrado na Figura 4 (PINTO; QUEIROZ, 2015; BORDIN et al., 2016). Em procedimentos empregando a DPX, a mistura com a amostra é feita por meio da aspiração de ar, favorecendo o equilíbrio de sorção do analito e proporcionando uma extração rápida e eficiente, além de poder ser facilmente automatizada.
Figura 4 – Esquema representativo de uma ponteira empregada em DPX.
Fonte: Adaptado de Bordin et al. (2016).
As etapas do procedimento empregando DPX (Figura 5) são semelhantes às da tradicional SPE. Inicialmente, o material contido dentro da ponteira é condicionado com um solvente apropriado para ativação dos sítios de ligação e após o condicionamento esse solvente é eluído da ponteira. A amostra é aspirada a partir de uma ponteira e misturada com a fase extratora por meio da aspiração de ar. Após essa etapa, a amostra é descartada e pode ser realizada uma etapa de limpeza, sendo que a escolha do solvente empregado na limpeza é baseada no tipo ou natureza química da fase extratora do e analito, bem como nos interferentes presentes na matriz. Por fim, é realizada a eluição, na qual
Ponteira
Filtro
Sorvente Filtro
28
um solvente apropriado é aspirado para o interior da ponteira, juntamente com a aspiração de ar, várias vezes, a fim de assegurar à completa dessorção dos analitos sorvidos (KOLE et al., 2010; PINTO; QUEIROZ, 2015).
Figura 5 – Etapas do procedimento envolvendo DPX.
Fonte: Adaptado de Bordin et al. (2016).
A escolha do material empregado como fase extratora é baseada nas características dos analitos e de constituintes da matriz (PINTO;
Etapas 1 – Condicionamento, 2 – Aspiração da amostra,
3 – Mistura com ar, 4 – Descarte da amostra, 5 – Limpeza, 6 – Eluição.
QUEIROZ, 2015), sendo que se encontram disponíveis comercialmente uma variedade de materiais sorventes como mostrado na Tabela 1.
Tabela 1 – Ponteiras comercializadas para DPX contendo diferentes materiais
sorventes.
Tipo Composição Aplicação
DPX-RP Estirenodivinilbenzeno (fase reversa)
Ideal para compostos não polares e ligeiramente polares.
Extração de pesticidas e tetrahidrocanabinol (THC) em
sangue e urina.
DPX-WAX Grupos poli-amino
Interação de adsorção com compostos ácidos, bem como
uma fase reversa forte para muitos fármacos. DPX-CX Grupos ácido sulfônico Interação de adsorção com
compostos básicos. DPX-WCX Grupos carboxilato Adsorção de compostos
básicos.
DPX-Si Sílica gel Limpeza de amostras
ambientais.
DPX-C18 C18 Limpeza de amostras para
remoção de interferentes da matriz.
Fonte: Adaptado de DPX Technologies (2018).
Apesar das técnicas de preparo de amostra apresentarem uma variedade de sorventes comercialmente disponíveis, a obtenção, desenvolvimento e caracterização de novos materiais extratores vêm ganhando destaque. O objetivo da aplicação de novas fases extratoras é obter melhor seletividade ou até mesmo especificidade em relação aos analitos, melhorar a capacidade sortiva, e assim, obter sensibilidade e detectabilidade adequadas, proporcionar maior estabilidade térmica e química para a fase extratora empregada e alcançar um aumento da vida útil dos dispositivos quando comparados com outros sorventes disponíveis no mercado. Dentre esses novos materiais sorventes que vêm sendo abordados, podemos citar sorventes a base de grafeno, líquidos iônicos, líquidos iônicos poliméricos, polímeros de impressão
30
molecular e também polímeros intrinsecamente condutores (AUGUSTO et al., 2010; HUANG; LEE, 2012).
3.3 POLÍMEROS INTRINSECAMENTE CONDUTORES (PICs) Os PICs são polímeros com cadeias poliênicas conjugadas constituídas essencialmente de carbono e hidrogênio, podendo conter enxofre, nitrogênio ou oxigênio. Esses materiais apresentam propriedades elétricas semelhantes às dos metais, os quais influenciaram diversos pesquisadores a propor aplicações para estes materiais nas mais variadas áreas da ciência e tecnologia. Vários grupos de pesquisas têm focado seus estudos para a utilização dos PICs em dispositivos eletrônicos e eletrocrômicos, baterias recarregáveis, supercapacitores, revestimentos anticorrosivos, blindagem eletromagnética, entre outras aplicações (MERLINI et al., 2012; HOLZE; WU, 2014).
Além das aplicações já mencionadas anteriormente, os PICs têm despertado o interesse em estudos na área de preparo de amostra, pois estes materiais vêm sendo considerados alternativas promissoras para serem utilizados como novas fases extratoras nas técnicas de extração, em razão das diferentes interações, sejam elas, hidrofóbicas, π-π, troca iônica e ácido-base de seus grupos multifuncionais com os analitos, bem como a estabilidade em meio orgânico, facilidade de síntese, capacidade de serem dopados com diferentes contra íons e elevada área superficial. Estas características facilitam a difusão dos analitos na fase extratora (LI; ZHONG; CHEN, 2008; CHAVES; QUEIROZ, 2010; BAGHERI; AYAZI; NADERI, 2013).
Vários pesquisadores empregaram PICs como fases extratoras. He et al. (2014) utilizaram polianilina para determinação de clorofenóis (4-clorofenol, 2,4,6-triclorofenol, 2,4-diclorofenol, 2,3,4,6-tetraclorofenol e pentaclorofenol) em amostras de água. Szultka et al. (2010), empregou polipirrol para determinação de três antibióticos (linezolida, daptomicina e moxifloxacina) em amostras de sangue. Pelit e Dizdaş (2013) utilizaram politiofeno para a determinação de pesticidas (clorpirifós, penconazol, procimidona, bromopropilato e λ-cialotrina) desreguladores do sistema endócrino em amostras de águas de poços.
Dentre os PICs comumente estudados, vale destacar o polipirrol (PPy). Constituído de cadeias poliméricas com ligações duplas conjugadas (Figura 6), este material torna-se condutor a partir da reação de óxido-redução, esse processo é acompanhado por um aumento na condutividade elétrica de várias ordens de grandeza, a qual é atribuída à
delocalização de elétrons π ao longo da cadeia (GIROTTO; PAOLI, 1999; AWUZIE, 2017).
Figura 6 – Estrutura química da unidade de repetição do polipirrol.
Fonte: Elaborado pela autora (2018).
O PPy pode ser obtido pela oxidação ou redução do pirrol, seguida de polimerização utilizando agentes oxidantes/redutores ou por oxidação anódica/redução catódica. Considerando a simplicidade de implementar na prática e por ser comumente empregada para síntese de polímeros condutores em solução e também para o preparo em grande quantidade, é empregado a síntese utilizando-se um agente oxidante, como por exemplo, persulfato de amônio ((NH4)2S2O8) ou cloreto de ferro (III) hexahidratado (FeCl3.6H2O), como mostrado na Figura 7 (SHARMA et al., 2012; BAGHERI; AYAZI; NADERI, 2013; AWUZIE; 2017).
Figura 7 – Reação de polimerização do PPy com o oxidante FeCl3.6H2O.
Fonte: Adaptado de Ramôa (2015).
Com a finalidade de desenvolver novos materiais funcionais, grupos de pesquisa vêm desenvolvendo trabalhos envolvendo a síntese do PPy com a adição de surfactantes, como brometo de cetiltrimetilamônio (CTAB) e também empregando diferentes tipos de
+ 2n FeCl3.6H2O →
32
materiais inorgânicos, como por exemplo a argila montmorilonita (MMT) (BAGHERI; AYAZI; NADERI, 2013; RAMÔA et al., 2014). Após a síntese, é essencial realizar alguns procedimentos que permitam identificar e confirmar que o polímero condutor desejado foi realmente obtido e isto pode ser feito através da caracterização. Atualmente as técnicas mais comuns empregadas para esta finalidade são: medida de condutividade, a espectroscopia no infravermelho por transformada de Fourier (FTIR), que permite a identificação das bandas de absorção características, possibilitando a obtenção de informações relacionadas à composição, estrutura e o tipo de ligação envolvida, a microscopia eletrônica de varredura (MEV), que é utilizada para avaliar a morfologia, análise de área superficial (BET), que faz o uso de gases ou vapores, os quais são adsorvidos no material e assim possibilitando determinar a área superficial e a estrutura dos poros presentes na superfície (NEGI; ADHYAPAK, 2002).
4 MATERIAIS E MÉTODOS 4.1 MATERIAIS E REAGENTES
Neste trabalho, foram utilizados o monômero pirrol (Py) adquirido da Sigma Aldrich (St. Louis, MO, EUA) e este foi destilado sob vácuo e armazenado a 4 ºC antes de ser utilizado, cloreto de ferro (III) hexahidratado (FeCl3.6H2O) obtido da Dinâmica Química Contemporânea (São Paulo, Brasil) e o surfactante catiônico brometo de cetiltrimetilamônio (CTAB) obtido da VETEC (Rio de Janeiro, Brasil). O FeCl3.6H2O e o CTAB foram utilizados sem purificação prévia. A argila empregada (VULGEL CN 45) foi a Bentonita Sódica Natural (MMT-Na+) produzida por Aliança Latina Indústrias e Comércio Ltda (Rio Grande do Sul, Brasil).
Uma solução de trabalho foi preparada contendo todos os analitos em concentração de 2,5 mg L-1, em metanol, a partir da mistura de duas soluções estoque. A solução estoque de HPAs foi preparada a partir da solução mix EPA 525 B, contendo os seguintes analitos: Acenaftileno (Aceti), Antraceno (Ant), Benzo[a]antraceno (BaA), Benzo[b]fluoranteno (BbF), Benzo[k]fluoranteno (BkF), Benzo[g,h,i]perileno (BghiP), Benzo[a]pireno (BaP), Criseno (Cri), Dibenzo[a,h]antraceno (DBA), Fluoreno (Fluo), Indeno[1,2,3-c,d]pireno (InP), Fenantreno (Fen) e Pireno (Pir), sendo este material de referência certificado, adquirido da Sigma Aldrich (St. Louis, MO, EUA). A solução estoque de hormônios foi preparada a partir de uma mistura de cada solução padrão individual, contendo os seguintes analitos: 17β-estradiol (E2), 17α-etinil17β-estradiol (EE2) e Estrona (E1), sendo cada uma destas soluções, materiais de referência certificados, adquiridos da Sigma Aldrich (St. Louis, MO, EUA).
Os solventes empregados acetonitrila (ACN) e metanol (MeOH), de grau cromatográfico (99.9%), foram obtidos da J.T. Baker (Mallinckrodt, NJ, EUA) e água ultrapura obtida a partir de um sistema de purificação de água (Mega Pureza, Billerica, EUA). Ponteiras descartáveis DPX-Blank de 1 mL (DPX Labs, Columbia, SC, EUA) foram empregadas para o procedimento de extração. Para avaliar o efeito salting-out foi adicionado cloreto de sódio (NaCl) (99%) obtido da Dinâmica Química Contemporânea (São Paulo, Brasil). Para avaliação do pH, foram utilizadas soluções de ácido clorídrico (HCl) 0,1 mol L-1 e hidróxido de sódio (NaOH) 0,1 mol L-1 adquiridas da VETEC (Rio de Janeiro, Brasil).
34
4.2 SÍNTESE DOS PICs
O PPy foi obtido a partir da reação de polimerização oxidativa do pirrol (Py), empregando o oxidante cloreto de ferro (III) hexahidratado (FeCl3.6H2O) em solução aquosa contendo surfactante catiônico brometo de cetiltrimetilamônio (CTAB) na presença de uma dispersão contendo MMT, sendo empregadas as seguintes razões molares: surfactante/pirrol= 1:5, oxidante/pirrol= 2,3:1 e MMT/pirrol= 1:3 de acordo com o trabalho de Ramôa et al. (2015). Inicialmente, em um béquer de 250 mL, 1,000 g de MMT foram misturados em 100 mL de água destilada contendo 3,098 g de CTAB, o qual foi mantido durante 2 horas sob agitação à temperatura ambiente. Em seguida, a mistura foi dispersa em um processador ultrassônico Sonics modelo VCX 750, por 20 minutos, com potência de 35% (263 W). Logo após, 27,480 g de FeCl3.6H2O foram dissolvidos em 50 mL de água destilada e adicionados à dispersão de MMT, sob agitação, à temperatura ambiente. Depois de 15 minutos, 2,964 g (0,26 mol L-1) de pirrol (Py) foram dissolvidos em 20 mL de água destilada e essa solução foi adicionada gota a gota à mistura contendo oxidante e CTAB. A síntese foi mantida por 1 hora sob agitação constante, à temperatura ambiente. Após 24 horas em repouso, foi obtido o aditivo nanoestruturado de montmorilonita/polipirrol dopado com surfactante CTAB, denominado MMT/PPy.CTAB, o qual foi filtrado e lavado diversas vezes com água destilada com o objetivo de eliminar possíveis subprodutos residuais da reação e seco em estufa na temperatura de 60 °C até obtenção de peso constante.
A síntese do polipirrol sem a presença do surfactante e sem a presença da argila foi conduzida pelo mesmo procedimento experimental descrito anteriormente obtendo polipirrol denominado apenas PPy e também polipirrol dopado com surfactante CTAB, denominado PPy.CTAB.
4.3 CARACTERIZAÇÃO DOS PICs
Foram realizadas análises de infravermelho com transformada de Fourier (FTIR) em um espectrômetro da marca Bruker (Billerica, Massachusetts, EUA) modelo ALPHA, localizado no Laboratório de Espectrometria de Infravermelho da Central de Análises do Departamento de Química da Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC). Os espectros foram obtidos através de pastilhas de KBr preparadas com o pó de cada polímero. As análises foram realizadas com 16 varreduras e uma resolução de 4 cm-1 na faixa de 2000 a 600 cm-1. A análise de FTIR foi utilizada para identificar bandas de absorção de grupos funcionais características dos materiais descritos acima, além de deslocamentos nessas bandas que podem indicar a ocorrência de possíveis interações entre os componentes.
A morfologia dos materiais de partida foi avaliada empregando um microscópio eletrônico de varredura (MEV) da marca Jeol, modelo JSM-6390 LV, localizado no Laboratório Central de Microscopia Eletrônica, da Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC). As amostras na forma de pó de cada polímero foram fixadas em suporte metálico empregando fita dupla-face de carbono e metalizadas com ouro, operando tensões de 10 kV.
4.4 INSTRUMENTAÇÃO E CONDIÇÕES CROMATOGRÁFICAS As análises foram realizadas em um cromatógrafo líquido, modelo LC 20 AT da Shimadzu (Kyoto, Japão), localizado no Laboratório de Cromatografia e Espectrometria Atômica do Departamento de Química da Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC). O cromatógrafo é equipado com um detector por arranjo de diodos (DAD), modelo SPD-M20A, com loop de 20 µL e injetor manual Rheodyne 7725i (Rohnert Park, CA, EUA). Uma coluna C18 (250 mm de comprimento x 4,6 mm de diâmetro interno e espessura de filme de 5 µm) da Agilent Technologies (EUA) foi usada para separação cromatográfica. O fluxo de fase móvel foi de 1 mL min-1 empregado no modo gradiente usando acetonitrila (A) e água ultrapura (B) nas seguintes condições: 65% da fase móvel A de 0 a 11 minutos; de 11 a 16 minutos, a fase móvel A foi aumentada para 75% e esta composição foi mantida de 16 a 23 minutos; de 23 a 24 minutos, a fase móvel A foi aumentada para 90% e esta condição foi mantida de 24 a 40 minutos; de 40 a 45 minutos a condição inicial foi retomada. Os comprimentos de onda usados para as detecções foram ajustados em 220 nm para os
36
hormônios e 224 nm para os HPAs de acordo com os trabalhos de Fonseca (2013) e Barbosa et al. (2014), respectivamente. O software do LC solution (Shimadzu, Kyoto, Japão) foi utilizado para avaliar os dados obtidos. Uma microsseringa Hamilton (Reno, Nevada, EUA) de 100 µL foi utilizada para injeção manual no cromatógrafo e um micropipetador manual de 100-1000 µL da Kasvi (China) e poços de polipropileno de 2 mL (Axygen Scientific, CA, USA) foram utilizados para se realizar a técnica de DPX.
4.5 PREPARO DAS PONTEIRAS E ESCOLHA DO MATERIAL Após a síntese, cada polímero foi peneirado em peneira com granulometria de 200 mesh da marca Bertel. Em 3 ponteiras DPX-Blank foi adicionada certa quantidade de cada polímero e em seguida, estas foram seladas com um filtro. Cada ponteira foi condicionadas empregando 5 ciclos de 200 µL cada de uma mistura acetonitrila e metanol (50:50 v/v), 30 segundos em cada ciclo. Na Figura 8 encontra-se o esquema de preparo e condicionamento das ponteiras com a faencontra-se.
Figura 8 – Esquema ilustrativo do preparo das ponteiras de DPX com o pó do
material.
Fonte: Autoria própria (2019).
Com a finalidade de escolher a fase extratora que apresenta maior eficiência de extração para posteriores experimentos, cada Antes de iniciar a otimização do procedimento de DPX, cada um dos três polímeros adicionados nas ponteiras foram avaliados para aplicação como fase extratora nessa metodologia, sendo eles: PPy, PPy.CTAB e MMT/PPy.CTAB. Após etapa de condicionamento, cada ponteira foi empregada para extração em água ultrapura, obtendo-se um cromatograma do branco de cada polímero, a fim de verificar possíveis interferentes. Para verificar qual fase extratora apresentaria melhor eficiência de extração foram realizadas extrações em água ultrapura previamente fortificada com os analitos. As condições estabelecidas para esta avaliação foram: 700 µL de água ultrapura fortificada com 100 µg L-1 da solução de trabalho, empregando 3 ciclos de extração de 30 segundos cada ciclo, pH mantido em 6,00 e sem adição de sal. Na
A ponteira contendo cada material foi condicionada empregando 5 ciclos de 200 µL cada de uma mistura acetonitrila e metanol (50:50 v/v) empregando 30 segundos em cada ciclo.
Polímero após a síntese
Polímero peneirado Peneirar em peneira com
granulometria de 200 mesh
Ponteira DPX-BLANK preenchida com
38
dessorção foram utilizados 200 µL de solvente ACN:MeOH 50:50 v/v, empregando 2 ciclos de 30 segundos cada ciclo.
4.6 OTIMIZAÇÃO DO PROCEDIMENTO DE DPX
Para otimização do procedimento de DPX uma série de experimentos foram realizados. Como mencionado anteriormente, foram utilizados para extração 700 µL de água ultrapura fortificada com 100 µg L-1 da solução de trabalho em uma ponteira de 1 mL, sendo o volume de amostra foi mantido constante a fim de favorecer uma mistura dinâmica entre a fase extratora (destacando que a fase extratora utilizada nas otimizações foi aquela que apresentou melhor eficiência de extração dos analitos) e a amostra dentro da ponteira.
Os principais parâmetros relacionados com a extração e a dessorção foram otimizados, incluindo solvente de dessorção, número de ciclos e tempo de dessorção, a massa de fase extratora, pH, número de ciclos, tempo e efeito salting-out na extração e etapa de limpeza. Tanto modelos multivariados como os univariados foram empregados nas otimizações e nas análises e o tratamento dos dados foi realizado no software Statsoft Statistica 8.0 (Statsoft, EUA) e Microsoft Excel 2016 (EUA).
4.6.1 Otimização do solvente de dessorção
O solvente de dessorção foi otimizado através da escolha do solvente ou mistura de solventes (acetonitrila, metanol e acetona) de acordo com o planejamento de superfície ternária, onde foi selecionado o modelo Simplex-Centróide, sendo realizados 12 experimentos (com triplicata no ponto central), empregando um volume final de 200 µL e os experimentos são apresentados na Tabela 2. Nesta otimização foram utilizados 3 ciclos para extração e 2 ciclos para dessorção, ambos de 30 segundos cada ciclo.
Tabela 2 – Experimentos realizados no planejamento segundo modelo
simplex-centroide.
Experimento
ACN (µL) MeOH (µL) Acetona (µL)
(µL) (%) (µL) (%) (µL) (%) 1 200 100 0 0 0 0 2 0 0 200 100 0 0 3 0 0 0 0 200 100 4 100 50 100 50 0 0 5 100 50 0 0 100 50 6 0 0 100 50 100 50 7 133,34 66,7 33,34 16,7 33,34 16,7 8 33,34 16,7 133,34 66,7 33,34 16,7 9 33,34 16,7 33,34 16,7 133,34 66,7 10,11,12 66,67 33,3 66,67 33,3 66,67 33,3
Fonte: Autoria própria (2019).
4.6.2 Otimização do número de ciclos e tempo de dessorção
Para otimização do número de ciclos e tempo de cada ciclo de dessorção, foram avaliados de 2 até 10 ciclos e o tempo para cada ciclo de 15, 30 e 45 segundos realizados de forma multivariada pelo planejamento Doehlert, onde foram feitos 9 experimentos (com triplicata no ponto central), sendo apresentadas na Tabela 3 as faixas trabalhadas para ambas as variáveis.
40
Tabela 3 – Experimentos realizados no planejamento Doehlert.
Experimento Número de Ciclos Tempo de Dessorção (s)
1 2 30 2 4 15 3 4 45 4 8 15 5 10 30 6 8 45 7,8,9 6 30
Fonte: Autoria própria (2019). 4.6.3 Otimização da massa de fase extratora
Foi avaliada a massa de material extrator que gerava a melhor eficiência de extração. Nessa otimização, massas de 5, 10 e 20 mg de PPy.CTAB (previamente selecionado) foram colocadas no interior da ponteira de DPX e as extrações foram realizadas em triplicata de forma univariada.
4.6.4 Otimização do pH
A otimização do pH (2,5, 5,5 e 8,0) foi realizada a fim de avaliar a influência do pH da amostra na extração. Este estudo foi realizado de forma univariada em triplicata. Soluções aquosas 0,1 mol L -1
de ácido clorídrico (HCl) e hidróxido de sódio (NaOH) foram utilizadas para o ajuste do pH da amostra.
4.6.5 Otimização do número de ciclos, tempo e efeito salting-out na extração
A otimização do número de ciclos, tempo e efeito salting-out na extração foi realizada de forma multivariada pelo planejamento composto central, onde foram feitos 17 experimentos (com triplicata no ponto central), sendo empregado cloreto de sódio para a avaliação do efeito salting-out. Número de ciclos de extração (de 1 a 11 ciclos), tempo de cada ciclo (10 a 110 segundos) e sal (de 0 a 30%) representados para cada experimento realizado na Tabela 4.
42
Tabela 4 – Experimentos realizados no planejamento Composto Central.
Experimento
NaCl (g/100 mL) Número de
ciclos Tempo de Extração
Valor Cod. Valor Cod. Valor (s) Cod.
1 6 -1 3 -1 30 -1 2 24 +1 9 +1 30 -1 3 24 +1 3 -1 90 +1 4 6 -1 9 +1 90 +1 5 15 0 6 0 60 0 6 24 +1 3 -1 30 -1 7 6 -1 9 +1 30 -1 8 6 -1 3 -1 90 +1 9 24 +1 9 +1 90 +1 10 15 0 6 0 60 0 11 15 0 6 0 10 -1,673 12 15 0 6 0 110 +1,673 13 15 0 1 -1,673 60 0 14 15 0 11 +1,673 60 0 15 0 -1,673 6 0 60 0 16 30 +1,673 6 0 60 0 17 15 0 6 0 60 0
Fonte: Autoria própria (2019). 4.6.6 Otimização da etapa de limpeza
Com a finalidade de avaliar se as ponteiras apresentariam efeito de memória, foi otimizada uma etapa de limpeza após o experimento,
variando o número de ciclos de 1 a 3 empregando em cada ciclo uma nova alíquota de 200 µL de uma mistura de solventes ACN:MeOH 50:50 v/v e 15 segundos em cada ciclo.
4.7 PARÂMETROS ANALÍTICOS DE MÉRITO
As figuras analíticas de mérito foram obtidas pelas curvas de calibração com adição de padrão na matriz da amostra (superposição de matriz) nas concentrações de 5 µg L-1 a 125 µg L-1, com análises realizadas em triplicata. Foram avaliados limite de detecção (LOD), limite de quantificação (LOQ), faixa linear de trabalho e coeficiente de correlação linear (r), recuperação relativa e precisões intradia e interdia. O LOQ foi determinado como primeiro ponto da faixa linear de trabalho para cada analito. O LOD foi calculado utilizando o LOQ dividido por 3,3 vezes (RIBANI et al., 2004). A recuperação está relacionada com a exatidão e a precisão com o desvio padrão relativo (RSD%), sendo assim, os ensaios de recuperação relativa e as precisões intradia e interdia foram avaliados utilizando a amostra de água de rio do Ponto 3 sendo a recuperação em 3 níveis de concentração para cada analito, a precisão intradia e a precisão interdia em 1 nível de concentração comum a todos os analitos. As amostras de água foram coletadas no Rio Tubarão, no município de Orleans – SC nos pontos mostrados na Figura 9, armazenadas em frasco âmbar a 4 ºC até o momento da análise.
44
Figura 9 – Pontos de coleta de amostras de água do Rio Tubarão com suas
respectivas coordenadas geográficas.
Ponto de coleta Coordenadas Geográficas
1 -28.365245, -49.27956
2 -28.364620, -49.335305
3 -28.363555, -49.351351
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO 5.1 CARACTERIZAÇÃO DOS PICs
Depois de sintetizados, os polímeros estudados foram caracterizados por análises de infravermelho com transformada de Fourier (FTIR) com a finalidade de verificar se ocorreu a polimerização do monômero em polímero durante o processo de síntese. As análises foram realizadas na região de 2000 – 600 cm-1 e seus espectros estão apresentados na Figura 10. O espectro de infravermelho do PPy apresentou bandas de absorção entre 1540 cm-1 e 1454 cm-1 que são atribuídas às vibrações do anel de pirrol (estiramento das ligações C=C e ligações C-N, respectivamente). Na região de 1294 a 1164 cm-1 encontram-se bandas relacionadas à deformação no plano das ligações de C-H ou C-N. A banda em 1089 cm-1 é atribuída à deformação no plano da vibração do NH2
+
, na formação do PPy dopado, enquanto que as bandas em 1040 cm-1 e 964 cm-1 são características da deformação vibracional no plano e fora do plano das ligações do anel de pirrol, respectivamente. Comparando os espectros de infravermelho do PPy com PPy.CTAB e MMT/PPy.CTAB observa-se um deslocamento nas bandas de absorção. O deslocamento observado no espectro do PPy.CTAB sugere que, para esta amostra, a deslocalização dos elétrons π ao longo da cadeia é menor que a encontrada para PPy, ou seja, para este composto a condutividade tende a ser menor do que a encontrada para o PPy. No espectro da MMT/PPy.CTAB também é observado um deslocamento das bandas de absorção, e este comportamento sugere que os modos de vibração da cadeia do PPy são afetados pela presença da MMT. Observou-se bandas em 1552 cm-1 e 1465 cm-1 no espectro PPy.CTAB que são semelhantes às bandas encontradas para o MMT/PPy.CTAB, sugerindo que a interação entre os grupos N-H (amina) do PPy e o grupo Si-O-Si da MMT é fraca.. As bandas observadas neste estudo são semelhantes com as encontradas em trabalhos disponíveis na literatura e os resultados confirmam a formação do polímero e detalhes da composição (RAO et al., 2013; RAMÔA et al., 2014; RAMÔA et al., 2015; KHADEM et al., 2017; YUSSUF et al., 2018).
46
Figura 10 – Espectros de FTIR do PPy, PPy.CTAB e MMT/PPy.CTAB.
Fonte: Autoria própria (2019).
Na Figura 11 estão apresentadas as imagens de obtidas pelo microscópio eletrônico de varredura (MEV) do PPy, PPy.CTAB e MMT/PPy.CTAB. A micrografia do PPy mostra uma morfologia granular com aglomerados de diferentes tamanhos, formados por partículas de esféricas. Com a incorporação do surfactante (CTAB), a morfologia das partículas do PPy é alterada. São observados aglomerados mais densos formados por partículas compactadas, sendo que essa diferença na morfologia pode ser explicada pela mudança no meio reacional, provocada pela estrutura química do CTAB. A morfologia do MMT/PPy.CTAB assemelha-se à do PPy.CTAB, sugerindo que a cadeia do PPy não foi apenas polimerizada no interior das galerias da MMT, mas também na superfície das partículas da MMT. As morfologias encontradas e apresentadas são semelhantes às encontradas nos trabalhos de Rao et al. (2013) e Ramôa (2015).
Figura 11 – Micrografias obtidas do PPy, PPy.CTAB e MMT/PPy.CTAB.
Fonte: Autoria própria (2019). 5.2 SEPARAÇÃO CROMATOGRÁFICA
Com a finalidade de verificar os tempos de eluição dos analitos foi feita a separação cromatográfica a partir da injeção direta de 20 µL da solução trabalho na concentração de 2,5 mg L-1 preparada em metanol. A separação foi feita empregando gradiente de solvente conforme descrito na seção 4.4, totalizando 45 minutos de corrida cromatográfica. A separação dos analitos está apresentada na Figura 12.
