PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM NEUROCIÊNCIAS
Ian Carlos Hübner
Investigação do enriquecimento ambiental como estratégia terapêutica para os efeitos da exposição ao álcool e ao estresse precoce durante o desenvolvimento
Florianópolis 2020
Ian Carlos Hübner
Investigação do enriquecimento ambiental como estratégia terapêutica para os efeitos da exposição ao álcool e ao estresse durante o desenvolvimento
Dissertação submetida ao Programa de Pós-graduação em Neurociências da Universidade Federal de Santa Catarina para a obtenção do título de Mestre em Neurociências
Orientadora: Profa. Dra. Patricia de Souza Brocardo Coorientadora: Profa. Dra. Cristiane Ribeiro de Carvalho
Florianópolis 2020
Ian Carlos Hübner
Investigação do enriquecimento ambiental como estratégia terapêutica para os efeitos da exposição ao álcool e ao estresse durante o desenvolvimento
O presente trabalho em nível de mestrado foi avaliado e aprovado por banca examinadora composta pelos seguintes membros:
Prof. Eduardo Luiz Gasnhar Moreira, Dr. Universidade Federal de Santa Catarina
Prof. Gabriel Adan Araujo Leite, Dr. Universidade Federal de Santa Catarina
Profa. Manuella Pinto Kaster, Dra. Universidade Federal de Santa Catarina
Profa. Kieiv Resende Sousa de Moura, Dra. Universidade Federal de Santa Catarina
Certificamos que esta é a versão original e final do trabalho de conclusão que foi julgado adequado para obtenção do título de mestre em Neurociências.
____________________________ Prof. Eduardo Luiz Gasnhar Moreira, Dr.
Coordenador(a) do Programa
____________________________ Profa. Patricia de Souza Brocardo, Dra.
Orientadora
Florianópolis, 2020. Documento assinado digitalmente Patricia de Souza Brocardo Data: 28/02/2020 13:55:31-0300 CPF: 000.604.779-38 Documento assinado digitalmente Eduardo Luiz Gasnhar Moreira Data: 28/02/2020 14:19:21-0300 CPF: 053.168.189-03
Este trabalho é dedicado a todos aqueles que persistem em acender a vela da ciência nesta vastidão de escuridão.
AGRADECIMENTOS
Gostaria de agradecer imensamente à todos aqueles que fizeram parte desta empreitada, tanto nos bastidores quanto aqueles que ajudaram a colocar a mão na massa.
Agradeço a minha família por todo apoio, mesmo sem entender muito bem o que eu faço, mas que nunca deixaram de fornecer todo o suporte necessário. A minha namorada Vancéli por aguentar meus elevados níveis de estresse e a diminuição forçada de tempo que passamos juntos. Aos meus amigos com quem pude compartilhar parte das angústias e que me ajudavam a mudar um pouco o foco.
Não posso deixar de agradecer a todos os membros do LANEP, que me ensinaram e ajudaram muito nesse percurso! A Claudia que passou maus bocados junto comigo nos experimentos intermináveis, Evelini e Tine que me ensinaram muito, Bianca que deu um super apoio para que a pesquisa acontecesse, a Priscila, Marina e Pâmela que sempre se mostraram solicitas a ajudar e tornar o ambiente mais agradável. Levei sorte de ter vocês fazendo parte dessa jornada.
Deixo esse parágrafo aqui para agradecer a todos os professores, colegas de disciplinas e laboratórios parceiros que contribuíram tanto para a aquisição de conhecimento quanto para a execução dessa pesquisa. Nem citarei nomes aqui para não correr o risco de esquecer alguém, mas se você estiver lendo isso agora e for um desses, você saberá. Sinta meu abraço e meu muito obrigado.
Agradeço também a minha coorientadora Cris que me ensinou e me ajudou muito, tudo se tornou mais claro com seus conselhos e ensinamentos, muito do que fiz aqui tem seu toque.
Gostaria de agradecer especialmente a minha querida orientadora Pati, que me acolheu mesmo sem me conhecer, abriu as portas do laboratório e forneceu todo o suporte necessário. É uma pessoa de um coração enorme, que atrai todo mundo, generosa e dedicada ao que faz, é um exemplo para todos nós. Fico orgulhoso de ter tido você como orientadora.
E, por fim, agradeço a toda UFSC por resistir e ser um espaço tão especial para aqueles que amam o conhecimento, aos animais que serviram a esta e tantas outras pesquisas e a CAPES pelo apoio financeiro, cada vez mais necessário nesse atual cenário.
A exposição pré-natal ao álcool (EPA) pode ocasionar alterações comportamentais e neuromorfológicas permanentes. Os indivíduos que sofrem EPA geralmente estão expostos ao estresse precoce durante a infância e apresentam maior incidência de transtornos psicológicos no futuro. Nesse estudo os efeitos da exposição a um ambiente enriquecido (AE) sobre o desempenho cognitivo, afetivo e social de ratos jovens submetidos aos protocolos de exposição perinatal ao álcool e ao estresse por separação materna foram investigados. Foram utilizados filhotes provenientes de ratas Wistar prenhas (n=16) fornecidas pelo Biotério Central da UFSC. No dia pós-natal (DPN) 2, os filhotes foram agrupados em 4 grupos: 1) Controle salina, 2) Etanol (EtOH), 3) Separação Materna (SM) e 4) EtOH+SM. O EtOH foi administrado em duas doses (total 5g/kg/dia, i.p., 25% em solução salina) nos DPNs 4, 6, 8 e 10. A SM foi realizada por 13 dias (DPN 2-14), durante 3h/dia. Após o desmame (DPN21), os grupos foram separados por sexo (Machos e Fêmeas, n = 8) e designados ao ambiente padrão (AP) ou ao ambiente enriquecido (AE) onde permaneceram por 16 dias (DPN 21- 36). Foram realizados testes comportamentais no início da adolescência (DPN37-44). Os parâmetros analisados foram aprendizado e memória pelos testes de reconhecimento de novos objetos e labirinto aquático de Morris, locomoção e comportamento tipo ansioso no teste do campo aberto e investigação social entre os pares. Foram analisadas também as ramificações dendríticas de neurônios granulares do giro denteado impregnados com Golgi através da análise de Sholl. Os animais expostos a SM e ao EtOH demonstraram redução do peso no período de amamentação, enquanto que na adolescência apenas as fêmeas expostas ao EtOH tiveram o peso reduzido. A exposição ao AE reduziu o peso dos animais de ambos os sexos na adolescência. No teste de reconhecimento de novos objetos todos os grupos experimentais apresentaram maior tempo de exploração do objeto novo, sugerindo que a memória espacial encontra-se inalterada nos grupos analisados. No labirinto aquático de Morris houve efeito do AE na velocidade de aquisição de aprendizado, diminuindo o tempo de latência para encontrar a plataforma no primeiro dia de treino, porém esse resultado não foi observado no grupo exposto ao EtOH. No teste do campo aberto o AE reduziu o comportamento exploratório enquanto o EtOH+SM aumentou o comportamento tipo ansioso em animais alojados no AE. A investigação social foi diferentemente afetada pelo sexo, machos foram mais sensíveis as diferentes condições aumentando o tempo de investigação social quando expostos ao EtOH+SM. A análise de Sholl revelou que os animais expostos ao EtOH, SM ou EtOH+SM apresentaram aumento no número de ramificações e extensão do dendrito em células do giro denteado. A exposição perinatal ao EtOH ou a SM per se ou quando associados não ocasionaram prejuízos cognitivos durante a adolescência, porém prejudicou o comportamento social e afetivo, além de alterar a maturação de dendritos de células hipocampais.
Palavras-chave: Transtorno do espectro alcoólico fetal. TEAF. Separação materna. Estresse
ABSTRACT
Prenatal alcohol exposure (PAE) may cause behavioral and permanent morphological alterations in the central nervous system (CNS). Individuals suffering from PAE are generally exposed to early life stress and may present a higher incidence of psychological disorders in the future. This study investigated the effects of the enriched environment (EE) on the cognitive, affective, and social performance of young rats exposure to perinatal alcohol and early life stress protocols by maternal separation. Wistar rats’ puppies (n = 16) provided by the UFSC Central Animal Care Facility were used. On postnatal day 2 (PND2), the pups were divided into 4 groups: 1) Saline control, 2) Ethanol (EtOH), 3) Maternal separation (MS), and 4) EtOH+MS. EtOH was administered at two doses (total 5g / kg/day, ip, 25% in saline) on PND’s 4, 6, 8, and 10. The MS was performed for 13 days (PND 2-14) for 3h/day. After weaning (PND21), the groups were separated by sex (males and females, n = 8) and assigned to the standard environment (SE) or enriched environment (EE), where they remained for 16 days (PND 21-36). Behavioral tests were performed in early adolescence (PND37-44). The parameters analyzed were learning and memory in the novel object recognition test and Morris water maze (MWM), locomotion, and anxious behavior in the open field test and peer social investigation. After the behavioral tests, Sholl analysis was used to evaluate the dendritic branches of Golgi-impregnated dentate gyrus granular neurons. Animals exposed to MS and EtOH demonstrated weight reduction in the breastfeeding period, while during adolescence just the EtOH caused the body weight reduction, EE reduced weight of both sexes. Experimental groups that present longer exploration time of the new object, suggesting that the spatial memory was not altered in the analyzed groups. In the MWM EE affected learning acquisition speed, decreasing latency to find a platform on the first day of training. However, this result was not observed in the EtOH exposed group. In open field test EE reduced exploratory behavior while EtOH+MS increased anxiety-like behavior in animals housed in EE. A social investigation behavior was affected differently by sex; males exposed to EtOH+MS presented more exploration time. The Sholl analysis revealed that animals exposed to EtOH, MS, or EtOH+MS exhibit a higher number of branches and dendrite extension in granular cells. Perinatal exposure to EtOH or MS alone or in combination do not cause cognitive dysfunction during adolescence, but impair social and affective behavior, and alter the maturation of hippocampal cell dendrites.
Keywords: Fetal alcohol spectrum disorders. FASD. Maternal separation. Early life stress.
Environmental enrichment.
Figura 1 – Transtornos do espectro alcoólico fetal. ... 16
Figura 2 – Figura esquemática do estresse por separação materna ... 20
Figura 3 – Estágios da neurogênese hipocampal e seus principais marcadores endógenos .... 22
Figura 4 – Representação da circuitaria hipocampal ... 23
Figura 5 – Efeitos do ambiente enriquecido na neuroplasticidade ... 25
Figura 6 – Linha do tempo dos procedimentos com os animais ... 29
Figura 7 – Representação esquemática dos grupos experimentais ... 30
Figura 8 – Exemplo de ambiente enriquecido utilizado ... 32
Figura 9 – Sequência dos testes comportamentais ... 33
Figura 10 – Representação do traçado e circunferências geradas para análise de Sholl ... 37
Figura 11 – Efeito do ambiente enriquecido em animais expostos ao etanol e separação materna no peso corporal na adolescência (DPN 45). ... 40
Figura 12 – Efeito do ambiente enriquecido em animais expostos ao etanol e separação materna na locomoção e comportamento do tipo ansioso no teste do campo aberto. ... 42
Figura 13 – Efeito do ambiente enriquecido em animais expostos ao etanol e separação materna na memória de reconhecimento no teste RNO. ... 44
Figura 14 – Efeito do ambiente enriquecido em animais expostos ao etanol e separação materna na investigação social. ... 46
Figura 15 – Efeito do ambiente enriquecido em animais expostos ao etanol e separação materna na memória espacial no teste do labirinto aquático de Morris. ... 48
Figura 16 – Efeito do etanol e separação materna na complexidade dendrítica de neurônios do giro denteado do hipocampo. ... 50
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Peso corporal dos animais durante o desenvolvimento ... 39
5-HT1A – Receptor de serotonina do subtipo 1ª
ADH – Álcool Desidrogenase AE – Ambiente enriquecido AP – Ambiente padrão
BDNF – Fator neurotrófico derivado do encéfalo, do inglês brain derived neurotrophic factor CA – Corno de Amon, do latim Cornu Ammonis
CAT - Catalase
CE – Córtex entorrinal
CRH – Hormônio liberador de corticotrofina, do inglês corticotropin release hormone CYP2E1 – Citocromo P450 2E1
DPN – Dia pós-natal
EPA – Exposição pré-natal ao álcool
ERK – Cinase regulada por sinal extracelular, do inglês extracellular signal-regulated kinase ERO – Espécies reativas de oxigênio
EtOH – Etanol
GABA - Ácido gama-aminobutírico GD – Giro denteado
HHA – Hipotálamo-hipófise-adrenal I.p – Intraperitoneal
LTD – Depressão de longa duração, do inglês long-term depression LTP – Potenciação de longa duração, do inglês long-term potentiation NMDA - N-metil D-Aspartato
nSM – Não-separação materna
RNO – teste do reconhecimento de novos objetos SAF – Síndrome alcoólica fetal
SM – Separação materna SNC – Sistema nervoso central
TEAF – Transtorno do espectro alcoólico fetal ZSG – Zona subgranular
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ... 15
1.1 EXPOSIÇÃO PRÉ-NATAL AO ÁLCOOL ... 15
1.2 ESTRESSE POR SEPARAÇÃO MATERNA... 18
1.3 NEUROPLASTICIDADE ... 21
1.3.1 Neuroplasticidade funcional e estrutural ... 21
1.3.2 Neuroplasticidade e função hipocampal ... 22
1.3.3 Exposição ao álcool e separação materna na plasticidade hipocampal ... 24
1.4 ENRIQUECIMENTO AMBIENTAL ... 24 2 JUTIFICATIVA ... 26 3 OBJETIVOS ... 27 3.1 OBJETIVO GERAL ... 27 3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ... 27 4 MATERIAIS E MÉTODOS ... 28 4.1 ANIMAIS ... 28 4.2 PROTOCOLOS EXPERIMENTAIS ... 28
4.2.1 Protocolo de estresse precoce por separação materna ... 30
4.2.2 Administração de Etanol ... 31
4.2.3 Ambiente enriquecido ... 31
4.3 AVALIAÇÕES COMPORTAMENTAIS ... 32
4.3.1 Teste do campo aberto ... 33
4.3.2 Teste de reconhecimento de novos objetos (RNO) ... 33
4.3.3 Investigação social ... 34
4.3.4 Teste do labirinto aquático de Morris ... 35
4.4 PROCESSAMENTO DO ENCÉFALO PARA A IMPREGNAÇÃO COM GOLGI ... 37
4.5 ANÁLISE DE SHOLL ... 37
GANHO DE PESO ... 38 5.2 EFEITOS DA EXPOSIÇÃO AO ETANOL E SEPARAÇÃO MATERNA NA ATIVIDADE LOCOMOTORA E COMPORTAMENTO DO TIPO ANSIOSO ... 41 5.3 EFEITOS DA EXPOSIÇÃO AO ETANOL E SEPARAÇÃO MATERNA NO TESTE DE RECONHECIMENTO DE NOVOS OBJETOS ... 42 5.4 EFEITOS DA EXPOSIÇÃO AO ETANOL E A SEPARAÇÃO MATERNA NA INVESTIGAÇÃO SOCIAL ... 45 5.5 EFEITO DA EXPOSIÇÃO AO ETANOL E A SEPARAÇÃO MATERNA NO LABIRINTO AQUÁTICO DE MORRIS... ... ..45 5.6 EFEITO DA EXPOSIÇÃO AO ETANOL E A SEPARAÇÃO MATERNA NA ARBORIZAÇÃO DENDRÍTICA DE CÉLULAS GRANULARES DO GIRO DENTEADO48
6 DISCUSSÃO ... 50 7 CONCLUSÃO ... 57 REFERÊNCIAS ... 59
1 INTRODUÇÃO
1.1 EXPOSIÇÃO PRÉ-NATAL AO ÁLCOOL
A exposição pré-natal ao álcool (EPA) é uma das maiores causas evitáveis de deficiência intelectual no mundo e estima-se que uma em cada 10 mulheres na população em geral consome álcool durante a gravidez (POPOVA et al., 2019). Sabe-se que indivíduos expostos ao álcool durante a gestação exibem déficits difusos no aprendizado, na atenção, na memória e nas funções executivas (KODITUWAKKU, 2007). Esses indivíduos também podem apresentar várias comorbidades que incluem déficits no desenvolvimento, crescimento prejudicado, anormalidades craniofaciais, alterações comportamentais e alterações no sistema nervoso central (SNC) (JONES et al., 1973; LANGE et al., 2017).
A EPA leva a vários riscos para a gravidez e para o indivíduo em desenvolvimento, tanto no período embrionário quanto fetal, principalmente devido a baixa capacidade enzimática metabólica do etanol (EtOH) durante este período (EHRHART et al., 2019). O álcool é metabolizado de duas formas principais, pela via da álcool desidrogenase (ADH) e pelo citocromo P450 2E1 (CYP2E1), podendo também ser metabolizado pela catalase (CAT), mas em menor grau (KOOP, 2006). A ADH é responsável por cerca de 90% da biotransformação do álcool em um indivíduo adulto, porém no feto a enzima passa a estar ativa apenas na 26ª semana de gestação, enquanto que o CYP2E1 está ativo apenas a partir da semana 16, e ambas as vias apresentam uma atividade muito menor no feto do que em adultos (GUPTA, GUPTA e SHIRASAKA, 2016).
Os efeitos farmacológicos do EtOH no SNC devem-se principalmente à sua ação como agonista nos receptores do ácido gama-aminobutírico (GABA) e antagonista nos N-metil D-Aspartato (NMDA) causando um desbalanço na atividade inibitória/excitatória do SNC a curto e longo prazo (HARRISON et al., 2017). Além dos efeitos farmacológicos que podem alterar a neurofisiologia durante o desenvolvimento, o metabolismo do EtOH ainda possui ações tóxicas sobre as células nervosas, um de seus principais metabólitos o acetaldeído tem sido relacionado com os principais efeitos teratogênicos observados contribuindo para a ação deletéria do EtOH no desenvolvimento (FONTAINE et al., 2016).
Devido a grande gama de sintomas e pelas diferenças resultantes da exposição ao álcool em períodos gestacionais e padrões de consumo distintos, utiliza-se o termo Transtorno
do Espectro Alcoólico Fetal (TEAF) para englobar os diferentes fenótipos gerados pela EPA, como os defeitos congênitos relacionados ao álcool (DCRA) e distúrbios neurológicos relacionados com o álcool (DNRA) (RILEY e MCGEE, 2005; RILEY et al., 2011) (Figura 1). A forma mais grave dos sintomas ocasionados pela EPA é a Síndrome Alcoólica Fetal (SAF), descrita inicialmente por Jones et al., (1973) e tem como critérios para o diagnóstico: deficiência de crescimento pré-natal e/ou pós-natal, disfunção do SNC resultando em problemas cognitivos, motores e comportamentais e um padrão característico de anomalias faciais como hipoplasia da face média, olhos espaçados e filtro liso (MURAWSKI et al., 2015).
Figura 1 – Transtornos do espectro alcoólico fetal.
O transtorno do espectro alcoólico fetal (TEAF) é um termo amplo que inclui diferentes diagnósticos ocasionados pelo uso do álcool durante a gravidez. Fonte: autoria própria.
Os efeitos da EPA podem se distinguir pelos períodos em que ocorre a ingesta de álcool pela mãe. Estudos em humanos e modelos experimentais revelam que no primeiro trimestre da gestação humana e no período equivalente em roedores, a exposição ao álcool pode causar malformações oculares (STRÖMLAND, 2004), modificar o desenvolvimento normal do tubo e da crista neural, podendo levar a microcefalia (MILLER, 1996), e a dismorfologia facial característica da SAF (SULIK, JOHNSTON e WEBB, 1981) além de alterações em estruturas encefálicas (FISH et al., 2018). Durante o segundo trimestre a EPA, afeta a migração celular, prejudicando o tempo de proliferação e reduzindo o número de células neuronais e gliais em muitas áreas do encéfalo (ARONNE et al., 2011; RUBERT et
Distúrbios Neurológicos Relacionados com o Álcool
(DNRA) Síndrome Alcoólica
Fetal (SAF)
Defeitos Congênitos Relacionados com o Álcool
(DCRA) Síndrome Alcoólica Fetal
al., 2006). Por fim, durante o terceiro trimestre, a exposição ao álcool pode aumentar a morte celular, comprometer a sinaptogênese e levar a déficits persistentes na plasticidade neuronal, e em processos de aprendizado e memória (ISAYAMA et al., 2009; MOULDER et al., 2002; WOZNIAK et al., 2004).
Na pesquisa básica, os efeitos da exposição ao álcool podem ser distinguidos pelos períodos em que o álcool é consumido pela mãe. No entanto, em roedores, o equivalente ao terceiro trimestre tem uma particularidade, porque ocorre em um período pós-natal (os dez primeiros dias pós-natal) em uma janela de tempo em que o encéfalo do recém-nascido passa por rápidas mudanças organizacionais que se assemelham às alterações cerebrais aceleradas que ocorrem durante o terceiro trimestre em humanos (MARQUARDT E BRIGMAN, 2016). Em muitos aspectos, os animais expostos ao álcool neste período apresentam uma similaridade de deficiências neurológicas observadas em seres humanos com TEAF que podem estar associadas a déficits emocionais, sociais e cognitivos (MATTSON, CROCKER e NGUYEN, 2011).
Foi demonstrado que a exposição neonatal ao álcool (de 4 a 10 dias pós-natal) em roedores, período equivalente ao terceiro trimestre da gestação humana no desenvolvimento do SNC, pode induzir dano hipocampal, o que é refletido por comprometimentos comportamentais em algumas tarefas dependentes do hipocampo, como prejuízos nos testes de reconhecimento de novos objetos (MACILVANE et al., 2016), no labirinto aquático de Morris (FILGUEIRAS, KRAHE e MEDINA, 2010; GIRARD et al., 2000; GOODLETT e JOHNSON, 1997; GOODLETT e PETERSON, 1995; MARINO, AKSENOV e KELLY, 2004; SCHNEIDER e THOMAS, 2016), no condicionamento contextual do medo (GOODFELLOW e LINDQUIST, 2014; HAMILTON et al., 2011, 2014; HEROUX et al., 2019; MURAWSKI, KLINTSOVA e STANTON, 2012; MURAWSKI e STANTON, 2010) e também condicionamento do piscar de olhos (GREEN et al., 2002; HAMILTON et al., 2014).
Além das alterações cognitivas, a exposição ao álcool no terceiro trimestre equivalente a gestação humana pode também alterar a discriminação social (BARBACCIA et al., 2007), a emocionalidade, incluindo o comportamento de ansiedade dos animais (BACULIS, DIAZ e BARBACCIA et al., 2007; DIAZ et al., 2014) e atividade locomotora (GILBERTSON e BARRON, 2005; SCHNEIDER e THOMAS, 2016; MONTGOMERY et al., 2018).
Existe um consenso crescente de que o consumo moderado de álcool durante a gravidez é o padrão mais comum, mas entre 5 e 10% relatam episódios de consumo excessivo de álcool (≥ 4 doses em uma ocasião) considerados um padrão Binge de consumo (ETHEN et al., 2009). Em modelos animais, o nível de consumo ou exposição ao álcool está associado a diferentes consequências dependendo do período da exposição, mas em geral apresentando alterações mais pronunciadas quando expostos a doses altas em relação a doses menores (MARQUARDT e BRIGMAN, 2016).
Os mecanismos celulares da EPA são diversos e incluem à geração de espécies reativas de oxigênio (ERO) que produzem um desequilíbrio no estado redox intracelular, levando a um aumento geral no estresse oxidativo (BROCARDO, GIL-MOHAPEL e CHRISTIE, 2011), além de alterações na expressão gênica envolvidas em processos de apoptose, proliferação e sobrevivência celular (EHRHART et al., 2019) levando aos efeitos deletérios observados no SNC das pessoas expostas ao álcool. Uma das áreas encefálicas mais afetadas pela EPA é a formação hipocampal, onde podem ser observadas alterações estruturais e funcionais dependendo do período e da quantidade álcool ingerida (GIL-MOHAPEL et al., 2010).
Devido à alta prevalência de indivíduos acometidos pela EPA e sem um tratamento que possa curar a condição, o gasto em saúde com estes pacientes ao longo da vida é elevado (RILEY e MCGAE, 2005; THANH e JONSSON, 2014), além disso, pode haver também gastos indiretos com o sistema judiciário devido a maior incidência de problemas externalizantes nesses indivíduos que pode se refletir em conflitos com a lei (THANH e JONSSON, 2015) tornando a EPA um problema biopsicossocial que pode envolver diversos setores da sociedade.
1.2 ESTRESSE POR SEPARAÇÃO MATERNA
Crianças que foram expostas ao álcool no período gestacional também podem vivenciar experiências adversas e geradoras de estresse durante o período pós-natal quando convivem com pais que abusam do uso de álcool (ANDA et al., 2002). Uma das experiências que podem afetar negativamente essas crianças é a ausência dos pais, sabe-se que a exposição à agentes estressores durante os primeiros anos de vida, inclusive a negligência dos cuidadores, está relacionado com o surgimento e manutenção de vários transtornos
psicológicos e comportamentais em fases posteriores da vida (CARR et al., 2013; GRASSO, FORD e BRIGGS-GOWAN, 2013).
O estresse no início da vida prejudica a regulação do feedback do eixo hipotálamo-hipófise-adrenal (HHA) que perdura ao longo do desenvolvimento (BODEGOM, VAN, HOMBERG e HENCKENS, 2017), onde níveis elevados de hormônio liberador de corticotrofina (CRH) contribuem para a arborização dendrítica anormal em regiões encefálicas cruciais para regulação do estresse e do comportamento, como hipocampo e o córtex pré-frontal (CHEN e BARAM, 2016). Em modelos animais, a separação materna produz alterações na expressão de CRH e na reatividade do eixo HHA (FRANCIS et al., 2002) e mudanças comportamentais, como comportamentos semelhantes à ansiedade e à depressão (BANQUERI, MÉNDEZ e ARIAS, 2017; LEUSSIS et al., 2012; LI et al., 2013; LIU et al., 2018) e comprometimentos cognitivos (XUE et al., 2013; CAO et al., 2014) (Figura 2).
A ausência de cuidados maternos durante o início da vida de roedores pode ocasionar alterações encefálicas como redução do volume hipocampal e da espessura de regiões corticais (AKSIĆ et al, 2013; LIU et al, 2018), menores corpos celulares de neurônios corticais (AKSIĆ et al, 2014) e ainda pode diminuir a expressão do fator neurotrófico derivado do encéfalo (BDNF) no córtex pré-frontal medial (XUE et al, 2013).
Figura 2 – Figura esquemática do estresse por separação materna.
A exposição ao estresse precoce ocasiona em alterações na regulação do eixo hipotálamo-hipófise-adrenal (HHA) levando a alterações na plasticidade cerebral que se refletem no comportamento. CRH – Hormônio liberador de corticotrofina; ACTH - Hormônio adrenocorticotrófico Fonte: autoria própria.
As pesquisas com animais expostos ao álcool durante o período perinatal e com posterior indução de estresse por separação materna ainda são escassos e seus resultados pouco consistentes. Alberry e Singh (2016) encontraram diferenças comportamentais entre machos e fêmeas expostos ao álcool e separação materna, os machos apresentaram déficits no aprendizado e as fêmeas apresentaram diminuição da atividade locomotora, porém nenhum efeito somatório de grande impacto foi observado entre separação materna e exposição ao álcool. Swart, Russell e Dimatelis (2019) encontraram efeitos atenuadores da separação
materna em relação aos efeitos da exposição ao álcool; o estresse por separação materna diminuiu as taxas de fosforilação da cinase regulada por sinal extracelular (ERK, do inglês,
extracellular signal-regulated kinase) no córtex pré-frontal e no hipocampo dorsal causadas
pela administração do álcool, além de diminuir a hiperlocomoção. Biggio e colaboradores. (2018) encontraram maior incidência de comportamentos do tipo ansioso em animais expostos à ambas condições, além de alteração no padrão de consumo de álcool voluntário na vida adulta. No entanto, não se conhece os efeitos da exposição a doses altas de álcool durante o período equivalente ao terceiro trimestre da gravidez humana e sua associação com o estresse no início da vida.
1.3 NEUROPLASTICIDADE
1.3.1 Neuroplasticidade funcional e estrutural
Neuroplasticidade se refere a capacidade do sistema nervoso de alterar sua estrutura ou função em decorrência do desenvolvimento, aprendizagem, interações com o ambiente ou por quadros patológicos, permitindo com que haja flexibilidade de respostas neuronais frente a diferentes condições (LLEDO, ALONSO e GRUBB, 2006). Podem-se distinguir duas formas principais de neuroplasticidade: a funcional e estrutural. A plasticidade funcional alude a aptidão dos neurônios de fortalecer ou enfraquecer suas conexões, podendo assim remodela-las de acordo com a atividade (GAGE, 2004). Já a plasticidade estrutural se dá pelo nascimento de novos neurônios após o período embrionário e fetal, fenômeno conhecido como neurogênese adulta, e pela modificação dos espinhos dendríticos, seja em seu número ou morfologia (FUCHS e FLÜGGE, 2014).
A neurogênese adulta em mamíferos se restringe a duas regiões encefálicas distintas, a zona subgranular (ZSG) do giro denteado (GD) hipocampal, em que os novos neurônios quando maduros se juntam a circuitaria hipocampal, e a zona subventricular (ZSV) onde os neurônios gerados nessa região que irão migrar e se integrar aos interneurônios do bulbo olfatório (LLEDO, ALONSO e GRUBB, 2006). Embora existam discussões sobre a existência e a importância da neurogênese adulta em seres humanos, a atual perspectiva é que de esse é um campo ainda em construção e com evidências a favor do surgimento de novos neurônios após o período gestacional (KEMPERMANN et al., 2018).
1.3.2 Neuroplasticidade e função hipocampal
Uma das estruturas centrais para o funcionamento de processos cognitivos e emocionais em mamíferos é a formação hipocampal, que apresenta uma gama de funções importantes e está relacionada com processos de memória, aprendizagem e navegação espacial (LISMAN et al., 2017). Além de seu importante papel, o hipocampo também é uma estrutura privilegiada sob o ponto de vista neuroplástico, ele recebe aferências de várias regiões encefálicas e tem um grande potencial de neuromodulação por diferentes sistemas de neurotransmissores que atuam na modulação da potenciação de longa duração (LTP, do inglês
long term potentiation) e da depressão de longa duração (LTD, do inglês long term depression) das células hipocampais (PALACIOS-FILARDO e MELLOR, 2019).
Outra característica distinta do hipocampo e que o torna um alvo de grande interesse, é que ele é uma das poucas regiões encefálicas a ter neurogênese adulta, essas novas células surgem a partir de células do tipo glia radiais que se proliferam na ZSG, após sua proliferação elas migram para a camada granular onde se diferenciam em neuroblastos e, por fim, quando maduras estendem seus axônios até os neurônios da região CA3 e seus dendritos em direção a camada molecular, integrando-se a circuitaria hipocampal local (LLEDO, ALONSO e GRUBB, 2006; NASCIMENTO CASTRO, GIL-MOHAPEL e BROCARDO, 2017) (Figura 3).
Figura 3 – Estágios da neurogênese hipocampal e seus principais marcadores endógenos.
Esquema dos estágios da neurogênese adulta da formação hipocampal: proliferação, diferenciação, migração e maturação. Na parte inferior está demonstrada a expressão de marcadores específicos de cada estágio. CG: Camada granular; ZSG: Zona subgranular; GFAP: Proteína ácida fibrilar glial; PCNA: Antígeno nuclear da proliferação celular; DCX: Doublecortina; NeuN: Antígeno nuclear neuronal. Fonte: Nascimento Castro et al. (2017).
A circuitaria hipocampal é conhecida classicamente pela sua formação trisináptica, células do córtex entorrinal (CE) mandam projeções para as células granulares do GD que, por sua vez, fazem sinapses com as células piramidais e interneurônios da região CA3 que enviam seus axônios e estabelecem sinapses com neurônios da região CA1 (SENZAI, 2019). Essa circuitaria local tem uma importante função na formação de memórias associativas e de memórias não relacionadas, a informação que chega ao hipocampo indiretamente via o córtex entorrinal precisa ser identificada como pertencente a um padrão específico para se formar memórias distintas, as células granulares do GD têm sido relacionadas com esta função de distinção de padrões de atividade neuronal, já a junção da informação parece estar mais relacionada com a atividade das células da região CA3 (SENZAI, 2019; YASSA e STARK, 2011) (Figura 4).
Figura 4 – Representação da circuitaria hipocampal.
Esquema representativo da circuitaria hipocampal. CA: Cornu Ammonis; CE: Córtex entorrinal; GD: Giro denteado. Fonte: modificado de Senzai (2019).
1.3.3 Exposição ao álcool e separação materna na plasticidade hipocampal
Durante o terceiro trimestre da gestação humana ocorre um grande crescimento cerebral, e a exposição ao álcool neste período pode levar à perda de células hipocampais (IKONOMIDOU et al., 2000; KLINTSOVA et al., 2007; MIKI et al., 2000), alterações nas ramificações dendríticas de neurônios piramidais hipocampais (GOEKE et al., 2018), alterações na plasticidade e na LTP em neurônios da região CA1 do hipocampo (PUGLIA e VALENZUELA, 2010) e alterações na ativação de receptores de serotonina 5-HT1A na área CA3 (MORTON e VALENZUELA, 2016).
O estresse precoce induzido por separação materna também é capaz de afetar negativamente a plasticidade hipocampal, reduzindo a LTP no GD de ratos adultos (CAO et al., 2014) e nas sinapses CA1/CA3 de ratos idosos (SOUSA et al., 2014). A separação materna também é capaz de reduzir o número de células granulares do GD e alterar sua morfologia em fêmeas (OOMEN et al., 2011), e diminuir o número de células proliferativas em animais adultos (HULSHOF et al., 2011), para uma revisão dos efeitos do estresse precoce na neurogênese adulta, ver Korosi e colaboradores (2012).
1.4 ENRIQUECIMENTO AMBIENTAL
Uma das possíveis estratégias para atenuar as consequências da exposição ao álcool e a separação materna em roedores é a utilização de enriquecimento ambiental, que se refere a uma mudança experimental no qual os animais de laboratório são alojados em um ambiente que permite a estimulação cognitiva, motora e sensorial em níveis muito maiores do que aqueles que ocorrem sob condições de laboratório padrão (ALWIS e RAJAN, 2014).
A exposição de roedores a um ambiente enriquecido (AE) em diferentes modelos e linhagens demonstrou resultados favoráveis em diversos parâmetros, promovendo efeitos benéficos em muitos domínios como comportamento cognitivo e emocional e neuroplasticidade (SAMPEDRO-PIQUERO e BEGEGA, 2016). A exposição ao AE aumenta o desempenho em tarefas de aprendizagem e memória dependentes do hipocampo, mudanças funcionais nos neurônios das áreas CA1 e no GD do hipocampo (OHLINE e ABRAHAM, 2018), bem como no aumento na neurogênese adulta hipocampal (VAN PRAAG,
KEMPERMANN e GAGE, 2000; RIZZI et al., 2011) e em seu volume (GUALTIERI et al., 2017), além de outras mudanças neuroplásticas, como representado na figura 5.
Nos modelos animais de TEAF, o enriquecimento ambiental pode melhorar o desempenho nas tarefas de memória e aprendizado e promover alterações estruturais e funcionais em diferentes regiões do encéfalo, levando a efeitos positivos no desempenho motor e cognitivo (HANNIGAN, O’LEARY-MOORE e BERMAN, 2007), o AE também mostrou resultados promissores em animais que sofreram estresse por separação materna, melhorando o desempenho em tarefas de comportamento tipo ansioso e depressivo e de aprendizado na tarefa de esquiva inibitória, além de reverter alterações na amígdala basolateral e melhorar a plasticidade sináptica hipocampal (DORESTE-MENDEZ et al., 2019; KOE, ASHOKAN e MITRA, 2016; VIVINETTO, SUÁREZ e RIVAROLA, 2013).
Figura 5 – Efeitos do ambiente enriquecido na neuroplasticidade.
Resumo dos mecanismos envolvidos na neuroplasticidade ocasionada pelo ambiente enriquecido (AE). Fonte: Adaptado de Alwis e Rajan, 2014.
2 JUTIFICATIVA
Visto que a EPA afeta muitos indivíduos no mundo inteiro, criando uma gama diversificada de sintomas e que essas crianças geralmente são expostas a ambientes estressantes durante o desenvolvimento é necessário pesquisar e desenvolver estratégias terapêuticas que busquem mitigar os sintomas nestes indivíduos. Como os primeiros sinais da exposição ao álcool e ao estresse precoce costumam se manifestar nos primeiros anos de vida, sobretudo durante o período escolar, pensar em estratégias direcionadas a essas crianças e que potencializem seu desempenho na aprendizagem e nas interações sociais com seus pares é de suma importância para seu pleno desenvolvimento, melhorando sua qualidade de vida e suas perspectivas futuras. O uso do protocolo experimental proposto nesse projeto possibilitou estudar os efeitos do AE como uma estratégia terapêutica não invasiva em reverter/minimizar os efeitos da exposição ao álcool e ao estresse da separação materna durante o desenvolvimento do SNC.
3 OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GERAL
Investigar os efeitos da exposição a um AE de estímulos sobre o desempenho cognitivo e social e na neuroplasticidade hipocampal de ratos jovens submetidos aos protocolos de exposição perinatal ao álcool e a separação materna.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Verificar os efeitos da exposição ao álcool durante o terceiro trimestre equivalente em humanos no desempenho cognitivo e social de ratos adolescentes;
Verificar os efeitos do estresse precoce por separação materna no desempenho cognitivo e social dos animais durante a adolescência;
Avaliar se há efeito somatório da exposição ao álcool e separação materna no desempenho social, cognitivo e na neuroplasticidade hipocampal em ratos jovens;
Avaliar os efeitos da exposição ao álcool e ao estresse da separação materna na neuroplasticidade hipocampal;
Avaliar se a exposição a um AE é capaz de mitigar os efeitos do álcool e da separação materna no desempenho cognitivo, social destes animais na adolescência;
4 MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 ANIMAIS
Ratas Wistar adultas prenhes (250-300 g) foram fornecidas pelo Biotério Central da Universidade Federal de Santa Catarina e mantidas no Biotério Setorial do Departamento de Bioquímica, as ratas prenhas foram mantidas em duplas até o dia gestacional 18 e então alojadas individualmente. As mães e seus filhotes (n=10 por ninhada, 5 machos e 5 fêmeas, quando possível) foram mantidas a 20°C ± 22°C com livre acesso a água e comida, em ciclo claro/escuro 12:12 h. Todas as manipulações foram realizadas entre às 8:00 e 17:00 h. Os animais tiveram livre acesso à ração comercial para ratos NUVITAL – Nuvilab CR1 e água filtrada e potável. O dia do nascimento dos filhotes foi considerado dia pós-natal 0 (DPN0). As ninhadas foram deixadas intactas até o DPN2, quando ocorreu a separação por sexo dos filhotes (machos n = 5 e fêmeas n = 5) e foram divididos em grupos de separação materna (SM) ou não separados (nSM). Os filhotes foram desmamados de suas mães no DPN21 e alojados em grupos de ninhadas separados por sexo em gaiolas plásticas (42 cm × 34 cm × 17 cm) (Protocolo CEUA: 6980201116).
4.2 PROTOCOLOS EXPERIMENTAIS
O dia do nascimento foi considerado DPN0 e no DPN2 o protocolo de estresse de
separação materna teve inicio. A exposição ao álcool ocorreu nos dias DPN4, 6, 8 e 10. A exposição ao AE aconteceu do DPN21-36 que é considerado período da infância e início da adolescência, comparado ao desenvolvimento humano, e os testes comportamentais foram realizados no período de DPN37-44, considerado adolescência (SENGUPTA, 2013) (Figura 6).
Figura 6 – Linha do tempo dos procedimentos com os animais.
Os animais foram separados das mães do dia DPN2 até o DPN14, a administração do EtOH ocorreu em quatro dias distintos, no DPN4, DPN6, DPN8 e DPN10. O período de exposição ao AE ocorreu entre os dias DPN21 e DPN36 e as avaliações comportamentais ocorreram entre os dias DPN37 e DPN44, 24h após o término das avaliações comportamentais os animais foram eutanasiados e os encéfalos foram processados para a análise da neuroplasticidade hipocampal. Abreviaturas: SM-separação materna; EtOH- etanol; DPN- dia pós-natal.
Um total de 128 ratos provenientes de 16 ratas prenhas foi utilizado neste estudo, os animais foram divididos por sexo para as análises e protocolos experimentais, machos e fêmeas foram designados separadamente para um desses grupos experimentais: etanol (EtOH) + separação materna (SM) (n) = 16 por sexo); EtOH + não separação materna (nSM) (n = 16 por sexo); Controle Salina + SM (n = 16 por sexo); Controle salina + nSM (n = 16 por sexo). Cada um desses grupos passou por um período de tratamento com exposição ao AE (n = 8 por sexo) e outro grupo em um Ambiente Padrão (AP) (n = 8 por sexo), totalizando 16 grupos experimentais (Figura 7).
Figura 7 – Representação esquemática dos grupos experimentais.
Os animais foram divididos em grupos etanol (EtOH) + separação materna (SM) (n) = 16 por sexo); EtOH + não separação materna (nSM) (n = 16 por sexo); Controle Salina + SM (n = 16 por sexo); Controle salina + nSM (n = 16 por sexo). Cada um desses grupos passou por um período de tratamento com exposição ao Ambiente Enriquecido (AE) (n = 8 por sexo) e outro grupo em um Ambiente Padrão (AP) (n = 8 por sexo), totalizando 16 grupos experimentais.
4.2.1 Protocolo de estresse precoce por separação materna
As ninhadas inteiras foram escolhidas aleatoriamente para se submeterem à separação materna (SM, n = 64) do DPN2 ao DPN14 por 3 h / dia (09: 00-12: 00), enquanto as ninhadas do grupo controle não foram perturbadas (nSM, n = 64). Os filhotes do grupo SM foram cuidadosamente removidos de sua gaiola e colocados em uma gaiola limpa e foram levados para outra sala aquecida (± 25 ° C) para evitar a comunicação entre os filhotes e a mãe. Após 3 h, os filhotes foram devolvidos à sua gaiola junto da mãe (adaptado de Swart et al., 2019).
Animais (n=128) Machos EtOH (n=32) Salina (n=32) EtOH SM (n=16) nSM (n=16) AE (n=8) AP (n=8) AE (n=8) AP (n=8) Salina SM (n=16) nSM (n=16) AE (n=8) AP (n=8) AE (n=8) AP (n=8) Fêmeas EtOH (n=32) Salina (n=32) EtOH SM (n=16) nSM (n=16) AE (n=8) AP (n=8) AE (n=8) AP (n=8) Salina SM (n=16) nSM (n=16) AE (n=8) AP (n=8) AE (n=8) AP (n=8)
Todos os filhotes foram pesados em DPN2, DPN4, DPN8, DPN10, DPN21 e DPN45 para monitorar os efeitos da exposição ao álcool perinatal e separação materna no peso corporal. No DPN21, todos os filhotes foram desmamados da mãe. Filhotes da mesma ninhada foram separados por sexo e alojados em grupos de 4-5 ratos por gaiola.
4.2.2 Administração de Etanol
Os animais foram expostos ao EtOH do DPN4 ao DPN10, período equivalente ao terceiro trimestre da gestação humana. Os filhotes foram escolhidos aleatoriamente para uma das condições experimentais e receberam a respectiva intervenção em dias alternados, o EtOH (Dinâmica, álcool etílico absoluto PA) foi administrado em duas vezes (entre as 9h e 11h) diariamente por injeção intraperitoneal na dose de 2,5 g / kg de peso corporal (por injeção, um total de 5,0 g / kg / dia) em uma concentração de 25% p / v de etanol em solução salina estéril a 0,9% (p / v), em um volume de 5 mL / kg e o controle recebeu um volume equivalente de solução salina. O intervalo entre as injeções foi de 2h. Assim, a exposição ao EtOH ocorreu nos dias DPN4, 6, 8 e 10 (FILGUEIRAS et al., 2010). Segundo o estudo de (FILGUEIRAS, KRAHE e MEDINA, 2010), a concentração de álcool sanguínea (CAS) nesse modelo é em média de 239 mg / dL após uma hora e 216 mg / dL após três horas, considerado um alto nível de álcool. Para minimizar a influência dos efeitos da ninhada, foram utilizadas várias ninhadas e, sempre que possível, os animais da mesma ninhada foram divididos em grupos diferentes e quando muitos animais da mesma ninhada receberam a mesma condição, apenas alguns foram selecionados aleatoriamente para análise.
4.2.3 Ambiente enriquecido
No DPN21, os animais de ambos os sexos foram separados em duas condições distintas de alojamento, metade dos animais foi para o AP e a outra para o AE. Os animais foram mantidos 24 horas por dia em grupos de 4-6 animais para as condições AP e AE até o início dos testes comportamentais no DPN 37. O AP consistia em uma gaiola comum (42 cm × 34 cm × 17 cm). O AE consistiu de duas gaiolas (43 cm × 33 cm × 23 cm) interconectadas por um tubo de PVC, contendo uma variedade de estímulos, isto é, uma roda de corrida, um túnel de tubo de PVC, blocos de plástico e objetos de madeira (DE CARVALHO et al., 2010).
Os objetos foram reorganizados, trocados e limpos duas vezes por semana para manter sempre a novidade no ambiente. Todos os filhotes foram pesados no DPN45 para monitorar os efeitos das condições de alojamento e outras intervenções no peso corporal (Figura 8).
Figura 8 – Exemplo de ambiente enriquecido utilizado.
Ambiente enriquecido utilizado neste estudo, na imagem se vê diferentes objetos dispostos ao longo da caixa, bem como a roda de corrida. Os objetos eram trocados e reposicionados duas vezes por semana. Fonte: autoria própria.
4.3 AVALIAÇÕES COMPORTAMENTAIS
Para investigar os efeitos da exposição ao EtOH e SM durante o neurodesenvolvimento, todos os animais foram submetidos a uma bateria de testes comportamentais quando atingiram a adolescência (DPN37-DPN44). No DPN37, os animais realizaram o teste de campo aberto e a sessão de habituação do teste de reconhecimento de novos objetos (RNO) que continuou no DPN38, no DPN39 foram realizados a sessão de treinamento e teste do RNO e no DPN40 ocorreu o teste de investigação social, e o teste do labirinto aquático de Morris entre DPN41 e DPN44, nos três primeiros dias da fase de aquisição da aprendizagem e no último dia a fase de teste (Figura 9). Todas as tarefas comportamentais foram gravadas em
câmera de vídeo digital (webcam HD Pro C920 Logitech, Newark, CA, EUA) e analisadas no software ANY-Maze (Stoeling Co., Wooddale, IL, EUA).
Figura 9 – Sequência dos testes comportamentais.
As avaliações comportamentais ocorram entre DPN37 e DPN45, sendo que as avaliações foram dispostas em ordem de intensidade, deixando as tarefas mais exigentes para o final do período de avaliação. Abreviaturas: DPN- dia pós-natal; RNO- teste do reconhecimento de novos objetos.
4.3.1 Teste do campo aberto
Para avaliar os efeitos da exposição ao EtOH e da separação materna na atividade locomotora e no comportamento tipo ansioso, os ratos foram avaliados no teste do campo aberto conforme descrito anteriormente (WALSH e CUMMINS, 1976). O aparelho consiste em uma caixa de madeira medindo 40 × 60 × 50 cm. A distância percorrida e o tempo gasto no centro da arena foram medidos durante um período de 6 minutos usando o programa Any-Maze (versão 4.72, 2010; Stoelting Company, Illinois, EUA). O aparelho foi limpo com uma solução de etanol a 70% entre os ensaios para eliminar os odores dos animais.
4.3.2 Teste de reconhecimento de novos objetos (RNO)
O protocolo utilizado foi adaptado de MacIlvane et al. (2016). Essa tarefa consiste em identificar e aprender as características dos objetos dispostos em um novo ambiente. Os animais devem explorar espontaneamente um par de objetos idênticos e, após um período, distinguir entre o objeto agora familiar e um novo objeto. A "preferência inata" para o novo objeto é tomada como parâmetro de aprendizado e memória, portanto, um roedor que se lembra do objeto familiar passará mais tempo explorando o novo objeto.
DPN37 Campo aberto e sessão
de habituação (RNO) DPN40 Investigação Social DPN41-44 Labirinto aquático de Morris D DPN38-39 Sessão de habituação,
Essa tarefa foi realizada em uma arena de campo aberto (40 cm x 60 cm x 50 cm) e contou com três sessões: (I) sessão de habituação (dia 1-2, DPN37-38) por dois dias consecutivos por 15 minutos, com a ausência de objetos, no dia 3 (DPN39), cada animal foi colocado no centro do campo aberto, de costas para os objetos, e submetido ao treinamento (II) e à sessão de teste (III).
A sessão de treinamento envolveu a exploração visual de dois objetos idênticos (A + A, pequenas xícaras brancas de vidro) por 5 minutos, enquanto o teste envolveu a substituição de um dos objetos anteriormente explorados por um novo por 3 minutos (A + B, um objeto roxo oval de plástico), nas duas fases os objetos foram colocados a aproximadamente 15 cm da parede, com uma distância de 12,5 cm entre eles. As razões de exploração para a sessão de treinamento (tempo em segundos explorando o objeto certo / tempo total explorando os dois objetos x 100) e a sessão de teste (tempo explorando o novo objeto / tempo total explorando os dois objetos x 100) foram calculadas para os sujeitos em cada grupo de tratamento. A exploração foi considerada quando o focinho do rato era apontado para o objeto à uma distância de 2-3 cm do objeto, com as vibrissas ativas varrendo ou cheirando. Não contou o tempo sentado no objeto sem indicação de exploração ativa (ENNACEUR e DELACOUR, 1988). O teste foi realizado 240 minutos após a sessão de treinamento. O aparelho foi cuidadosamente limpo com etanol 70% entre os testes comportamentais.
4.3.3 Investigação social
Os comportamentos de investigação social entre os animais foram realizados de acordo com o protocolo adaptado de Mooney e Varlinskaya (2011). Este teste foi realizado em uma caixa com uma parede de vidro transparente (40 cm x 60 cm x 50 cm) dividida em dois compartimentos de tamanho igual por uma grade metálica com uma abertura (8 cm x 8 cm) para permitir a locomoção dos animais através de dois compartimentos. Cada animal foi colocado sozinho no aparelho por 15 minutos durante dois dias consecutivos antes do teste de investigação social. No dia do teste, o animal foi inicialmente colocado sozinho no aparelho de teste e dez minutos depois foi introduzido um animal desconhecido do mesmo sexo e idade e ambos os animais usados no teste estavam privados de contato com outros ratos por 30 minutos, esses animais nunca interagiram entre si antes. As interações sociais foram registradas por dez minutos, mas apenas os cinco primeiros minutos foram analisados a partir
dos registros em vídeo por dois observadores treinados, cegos para os grupos experimentais. A investigação social foi considerada como o tempo gasto pelos animais farejando a aproximadamente ≤ 2 cm do parceiro ou qualquer outro comportamento social, incluindo contato, brincadeira e atividade locomotora. EtOH 70% foi usado para a limpeza.
4.3.4 Teste do labirinto aquático de Morris
O teste do labirinto aquático, descrito inicialmente por Morris (1984), foi utilizado para avaliar a aprendizagem e a memória espacial (VORHEES e WILLIAMS, 2006), o protocolo utilizado foi adaptado do trabalho de An e Zhang (2013).
O teste foi realizado em uma piscina de 180 cm de diâmetro, preenchida com água limpa (80 cm de profundidade). A água foi mantida a 24 ± 1 ° C. O tanque foi dividido em quatro quadrantes iguais (NO - Noroeste, SO - Sudoeste, NE - Nordeste e SE - Sudeste), e uma plataforma transparente (10 x 10 cm) foi submersa 2 cm abaixo da superfície da água. A plataforma permaneceu na mesma posição ao longo da fase de aquisição da aprendizagem (no meio do quadrante NO) e foi removida da piscina durante o teste. Dicas visuais foram colocadas ao redor da piscina e elas permaneceram na mesma posição durante todo o treinamento e teste. O movimento dos animais foi monitorado por uma câmera conectada a um computador, através da qual os dados gravados na fase de teste foram analisados usando o software Any-Maze (Stoelting Co., Wood Dale, IL, EUA).
A tarefa consistiu em duas etapas consecutivas, a fase de aquisição da aprendizagem e a fase de teste. Na fase de treinamento, os ratos foram testados em dois ensaios por dia, com um intervalo entre ensaios de 4h, durante três dias consecutivos. Cada ensaio consistiu em quatro tentativas, que ocorreram durante três dias consecutivos. Em cada tentativa, aleatoriamente, os animais foram colocados individualmente na água a partir de um dos pontos de partida fora do quadrante correto (SO, NE e SE), de frente para as paredes do tanque. Depois de alcançar a plataforma, o rato permaneceu nela por 10 segundos. Quando não foi possível localizar a plataforma dentro de 60 s, cada rato foi guiado manualmente para a plataforma e, em seguida, mantido por 10 segundos. O tempo necessário para encontrar a plataforma (latência) foi registrado e considerado como parâmetro de aprendizagem. A ordem dos pontos de partida em cada sessão foi escolhida aleatoriamente, mas a mesma para todos os animais. Após cada sessão, os animais foram secos com uma toalha e mantidos em uma
caixa seca por 5 minutos até a próxima tentativa. Nos intervalos entre ensaios, os animais não foram manipulados. 24 horas após o término da fase de aquisição, os ratos foram submetidos ao teste para examinar a memória de referência espacial. Durante o teste, a plataforma foi removida da piscina e o rato foi permitido nadar livremente por 60s. O tempo de permanência no quadrante alvo (onde se encontrava a plataforma) foi definido como o tempo total gasto no quadrante de destino.
4.4 PROCESSAMENTO DO ENCÉFALO PARA A IMPREGNAÇÃO COM GOLGI
Após vinte e quatro horas do término dos testes comportamentais, os animais foram anestesiados profundamente com uma injeção intraperitioneal (ip) de xilazina (8 mg / kg) e cetamina (100 mg / kg) e perfundidos transcardialmente com cloreto de sódio a 0,9% (NaCl) seguido por uma solução de 4% paraformaldeído (PFA), após a perfusão os encéfalos foram prontamente removidos, colocados em frascos contendo 20 mL de solução Golgi-Cox modificada e trocado por uma solução nova após 24 horas e ficaram armazenados no escuro à temperatura ambiente por 14 dias (adaptado de GIBB e KOLB, 1998). Após este período, os encéfalos foram transferidos para uma solução de sacarose a 30%. Posteriormente a saturação em sacarose, seções coronais de 200 μm de espessura em série foram obtidas em um vibratomo (Vibratome®, Série 1000, St. Louis, MO, EUA). Em seguida as fatias foram montadas em lâminas gelatinizadas a 2% e ficaram em uma câmara escura por 48 horas. Depois deste período as amostras foram submetidas a uma sequência de desidratação: água destilada (1 min), hidróxido de amônio (30 minutos), água destilada (1 min), Kodafix (30 min), água destilada (1 min), 50% etanol (1 min), 70% de etanol (1 min), 95% etanol (1 min), 100% etanol (10 min), 100% etanol∕xilol (1:1 por 10 min) e xilol (20 min) (modificado de KANNANGARA et al., 2014). Todas as lâminas foram armazenadas no escuro. As análises morfológicas foram realizadas em um microscópio Confocal Leica DMO6000 B (Leica Microsystem, Wetzlar, Alemanha) disponível no Laboratório Central de Microscopia Eletrônica da UFSC, Florianópolis, Brasil. As seções de Z-stacks foram processadas em neurônios e segmentos dendríticos selecionados. Foram selecionados neurônios hipocampais impregnados com a solução Golgi que possuíam uma impregnação consistente em toda a extensão neuronal, que podiam ser distinguidos das células adjacentes e apresentavam ramificações dendríticas completas.
4.5 ANÁLISE DE SHOLL
A quantificação do número e comprimento das ramificações dos neurônios granulares do GD foi avaliada usando a análise de Sholl, esses parâmetros foram obtidos analisando as ramificações contidas dentro de intervalos concêntricos de 10 µm (GENSEL et al., 2010). Tendo o centro do soma como ponto de referência, foram analisados o número de intersecções por raio, a média do número total de intersecções e o comprimento do dendrito (distância máxima do soma até o final dos dendritos). Foram selecionados aleatoriamente de cada animal 5 neurônios localizados no GD da formação hipocampal, para cada grupo experimental (n=3). Os neurônios com menores sobreposições com outros neurônios e com o maior número de ramificações dendríticas visíveis foram selecionados para análise. As fatias foram analisadas utilizando um microscópio Confocal Leica DMI6000 B com uma ampliação de 40 x e intervalos de 2 µm entre as imagens feitas em Z-stack. Para análise de Sholl foi utilizado o plugin Simple Neurite Tracer do software Image J (FERREIRA et al., 2014), em que os dendritos dos neurônios foram manualmente traçados e a partir destes foi realizada a analise automatizada pelo software, criando circunferências a partir do centro do soma e obtendo uma representação em 3D do neurônio traçado, possibilitando obter a quantificação e comprimento dos prolongamentos e a intersecção deles com as circunferências geradas (Figura 10).
Figura 10 – Representação do traçado e circunferências geradas para análise de Sholl.
Representação de um neurônio impregnado por Golgi (A). Traçado realizado no software Image J (B). Circunferências geradas para a análise de Sholl (C). Fonte: autoria própria.
4.6 ANÁLISES ESTATÍSTISCAS
Todas as comparações estatísticas foram realizadas utilizando o software analítico Statistica 7 (StatSoft Inc., Tulsa, OK, EUA) ou GraphPad Prism versão 7.00 para Windows (GraphPad Software, La Jolla, Califórnia, EUA). Os resultados foram expressos como média ± erro padrão da média (EPM). Os dados comportamentais foram analisados com análise de variância (ANOVA) de medidas repetidas para pesos, ANOVA de três vias (EtOH ou Salina, SM ou nSM e AP ou AE) ou ANOVA de quatro vias (incluindo sexo) para comparação entre os grupos seguidos pelo teste post hoc de Duncan, quando apropriado. O teste t de Student foi usado para avaliar a retenção de memória no teste do labirinto aquático de Morris e RNO. O valor de P <0,05 foi considerado estatisticamente significativo.
5 RESULTADOS
5.1 EFEITOS DA EXPOSIÇÃO AO ETANOL E SEPARAÇÃO MATERNA NO GANHO DE PESO
Os filhotes foram pesados nos DPNs 2, 4, 6, 10 e 21 durante o período de amamentação para avaliar o efeito das intervenções perinatais sobre sua massa corporal. Para esse parâmetro foi realizado ANOVA de duas vias para a exposição ao etanol (EtOH ou salina) e separação materna (SM ou nSM) com medidas repetidas para os diferentes dias de pesagem seguido pelo post hoc de Duncan. O resultado da ANOVA revelou efeito do sexo sobre o peso dos animais (F5,55=3,59, p<0,01), por isso machos e fêmeas foram analisados
separadamente.
A ANOVA de duas vias com medidas repetidas mostrou que todos os filhotes ganharam peso durante esse período (F4, 116 = 1745,6; p = 0,001) para as fêmeas e (F4,120 =
1405,2; p = 0,001) para os machos. Os resultados da ANOVA revelaram um efeito significativo da separação materna nas fêmeas (F1,29 = 12,55; p = 0,013) e em machos (F1,30 =
17,07; p < 0,01), e uma interação entre SM e EtOH em fêmeas (F1 , 29 = 7,29; p < 0,05) e
machos (F1,30 = 9,28; p < 0,01), mas nenhum efeito principal significativo do EtOH sozinho
em fêmeas (F1,29 = 1,72; p =0,199) ou machos (F1,30 = 0,309; p = 0,58). O teste post hoc de
<0,05) e se manteve até o DPN21, quando também foram observadas a diminuição do peso corporal no grupo EtOH (p <0,05) e EtOH+SM (p <0,05) em relação ao controle salina. Nos machos houve resultado similar, porém a diferença apareceu no DPN10 no grupo SM (p < 0,05), enquanto que no DPN21 tanto o grupo SM (p < 0,05), EtOH (p <0,05) e EtOH+SM (p <0,05) demonstraram menor massa corporal em relação ao controle salina, os resultados encontram-se na Tabela 1.
Tabela 1 – Peso corporal dos animais durante o desenvolvimento
As análises estatísticas deste experimento foram realizadas por ANOVA multifatorial, seguida pelo teste Duncan. Os valores estão expressos em média ± E.P.M. (8 animais/grupo). *p<0,05 quando comparados com o grupo controle salina. SM-separação materna; EtOH- etanol e Sal- controle salina.
Os animais foram pesados no DPN 45 (ou seja, após a exposição às condições ao AE ou AP por 16 dias) e os grupos foram avaliados separadamente quanto ao sexo, conforme mostrado na Figura 7. A ANOVA revelou efeitos principais significativos de: (i) EtOH (F1,60
= 6,42; p <0,05) apenas no sexo feminino; o grupo EtOH apresentou um peso corporal menor que o controle salina (p <0,05); (ii) condições de moradia para fêmeas (F1,60 = 15,21; p
<0,001) e machos (F1,57 = 21,36; p <0,001), sendo que os animais alojados no AE pesaram
menos que os alojados no AP (machos p <0,05 e fêmeas p <0,01); e (iii) interação entre separação materna e condições de moradia em fêmeas (F1,60 = 14,35; p <0,001) e machos
Peso corporal
(g) Salina EtOH SM EtOH+SM
M ac h os DPN 2 8,48 ± 0,12 7,80 ± 0,15 7,25 ± 0,15 7,76 ± 0,13 DPN 4 11,21 ± 0,19 10,46 ± 0,29 9,22 ± 0,18 10,07 ± 0,18 DPN 8 17,25 ± 0,08 16,46 ± 0,5 14,15 ± 0,52 15,47 ± 0,22 DPN 10 21,02 ± 0,19 19,26 ± 0,54 16,62 ± 0,33* 18,89 ± 0,96 DPN21 45,00 ± 2,16 40,33 ± 1,47* 38,5 ± 1,11* 39,62 ± 1,28* Fê m eas DPN 2 8,11 ±0,08 7,27 ±0,15 7,10 ±0,012 7,17 ±0,017 DPN 4 10,68 ±0,14 9,52 ±0,26 9,18 ±0,20 9,51 ±0,23 DPN 8 16,48 ±0,07 15,35 ±0,49 13,7 ±0,36* 14,93 ±0,27 DPN 10 19,89 ±0,12 18,4 ±0,61 16,68 ±0,47* 17,77 ±0,28 DPN 21 42,00 ±1,66 38,75 ±1,42* 38,25 ±0,92* 38,25 ±1,29*
(F1,57 = 8,10; p < 0,01), mas sem diferenças entres os grupos demonstrado pelo teste post hoc
(Figura 11 A e B).
Figura 11 – Efeito do ambiente enriquecido em animais expostos ao etanol e separação materna no peso corporal na adolescência (DPN 45).
As análises estatísticas deste experimento foram realizadas por ANOVA multifatorial, seguida pelo teste Duncan. Os valores estão expressos em média ± E.P.M. (8-10 animais/grupo). Peso em gramas em machos (A). Peso em gramas em fêmeas (B). *p<0,05 comparado com grupo controle salina e #p<0,05 e ##p<0,01 comparados com o grupo AP. Abreviaturas: SM-separação materna e nSM-não separação materna; EtOH- etanol e Sal- controle salina; AP-ambiente padrão e AE-ambiente enriquecido.
5.2 EFEITOS DA EXPOSIÇÃO AO ETANOL E SEPARAÇÃO MATERNA NA ATIVIDADE LOCOMOTORA E COMPORTAMENTO DO TIPO ANSIOSO
Para os parâmetros de atividade locomotora e tempo na área central, machos e fêmeas foram analisados juntos. A ANOVA multifatorial revelou um efeito significativo da condição da moradia na atividade locomotora (F1,72 = 4,06; p <0,05) e na interação entre a
condição de moradia e a exposição ao EtOH (F1,72 = 4,06; p <0,05), a exposição ao EtOH por
si só não teve efeito significativo na atividade locomotora (F1,72 = 0,56; p = 0,45). O teste post
hoc demonstrou redução na exploração total no grupo controle salina alojado no AE em
comparação com o grupo alojado no AP (p <0,05, Figura 12A). No tempo gasto no centro do aparelho, apenas a interação entre a exposição ao EtOH e a separação materna teve efeito significativo (F1,72 = 6,43; p =0,01). O teste post hoc identificou diferença no grupo que
recebeu EtOH+SM alojado no AE em comparação com o grupo que não foi separado, diminuindo o tempo de centro (p <0,05, Figura 12B).
Figura 12 – Efeito do ambiente enriquecido em animais expostos ao etanol e separação materna na locomoção e comportamento do tipo ansioso no teste do campo aberto.
As análises estatísticas deste experimento foram realizadas por ANOVA multifatorial, seguida pelo teste Duncan. Os valores estão expressos em média ± E.P.M. (10 animais/grupo). Distância total percorrida em metros (A). Tempo total em segundos na área central do campo aberto (B). #p<0,05 comparado com o grupo AC e @ p<0,05 comparado com o grupo nSM. Abreviaturas: SM-separação materna e nSM-não separação materna; EtOH- etanol e Sal- controle salina; AP-ambiente padrão e AE-ambiente enriquecido.
5.3 EFEITOS DA EXPOSIÇÃO AO ETANOL E SEPARAÇÃO MATERNA NO TESTE DE RECONHECIMENTO DE NOVOS OBJETOS
Nas fases de treino e teste, a ANOVA multifatorial não revelou diferenças significativas entre machos e fêmeas e condição de moradia na razão (treino: F1,115 = 0,43 p
=0,51; memória: F1,113 = 3,22 p =0,07) ou no tempo de exploração (treino: F1,114 = 2,25 p
=0,13; memória: F1,114 = 1,70 p =0,19). Por isso, machos e fêmeas foram agrupados na
análise. As razões de exploração para a sessão de treinamento (tempo explorando um objeto/ tempo total explorando os dois objetos x 100) e a sessão de teste (tempo explorando o novo objeto / tempo total explorando os dois objetos x 100) foram calculadas para os sujeitos em cada grupo de tratamento. Testes t de amostra única foram usados para determinar se a razão de exploração de qualquer grupo excedeu o desempenho do acaso (50%). As proporções da sessão de treinamento (baseadas em objetos idênticos) não variaram significativamente de 50% para nenhum grupo (p > 0,05 para todos os grupos, Figura 13A). No tempo de exploração, a ANOVA de três vias revelou efeito da condição de moradia (F1,122 = 17,61, p
<0,001) e revelou a interação entre exposição ao EtOH, SM e condição de moradia (F1,122 =
6,69, p < 0,01). O teste post hoc mostrou que animais alojados no AE diminuíram o tempo de exploração dos objetos quando expostos a SM (p <0,05 em comparação com nSM e p <0,01 comparados com AP) e EtOH (p <0,01 em comparação com controle salina e p <0,01 comparados com AP) (Figura 13B).
Na fase de teste, todos os grupos de tratamento exploraram o novo objeto a taxas significativamente maiores que o acaso após 240 minutos da sessão de treino (p <0,001 para todos os grupos, Figura 13C) e nenhuma diferença entre os grupos no tempo de exploração foi observada (Figura 13D). Assim, todos os grupos de tratamento mostraram uma preferência significativa pelo novo objeto, indicando que houve memorização das características do primeiro objeto.
Figura 13 – Efeito do ambiente enriquecido em animais expostos etanol e separação materna na memória de reconhecimento no teste RNO.
As análises estatísticas deste experimento foram realizadas por ANOVA multifatorial, seguida pelo teste Duncan para os resultados do tempo de exploração e foi realizado o teste t de student para comparação entre a taxa de exploração dos objetos. Os valores estão expressos em média ± E.P.M. (16-17 animais/grupo). Taxa de exploração do objeto idêntico no treino (A). Tempo total em segundos explorando os objetos no treino (B).Taxa de exploração do objeto diferente no teste (C). Tempo total em segundos explorando os objetos no teste (D). **p<0,01 comparado com o grupo controle salina, ##p<0,01 comparado com o grupo AP e @ p<0,05 comparado com o grupo nSM. Abreviaturas: SM-separação materna e nSM-não separação materna; EtOH- etanol e Sal- controle salina; AP-ambiente padrão e AE-ambiente enriquecido.
