UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA
INSTITUTO DE QUÍMICA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
DETERMINAÇÃO DE BROMOFENÓIS SIMPLES EM
PEIXES POR MICROEXTRAÇÃO COM GOTA ÚNICA E
CG-EM
JOELMA PEREIRA DOS SANTOS SOBRINHO
Salvador 2012
ii JOELMA PEREIRA DOS SANTOS SOBRINHO
DETERMINAÇÃO DE BROMOFENÓIS SIMPLES EM
PEIXES POR MICROEXTRAÇÃO COM GOTA ÚNICA E
CG-EM
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Química, Instituto de Química, Universidade Federal da Bahia, como requisito parcial para obtenção do grau de Mestre em Ciências
Orientador: Prof. Dr. Jailson Bittencourt de Andrade
Salvador 2012
iii
`A minha mãe Ivanise
Ao meu marido Gilmar
Ao meu bebê Reinan
iv AGRADECIMENTOS
Ao Prof. Jailson, pela orientação.
A Manuela, pela amizade, carinho e pela valiosa ajuda na parte experimental, sempre com muita doçura.
Ao meu marido Gilmar, pelo amor e compreensão.
À minha mãe Ivanise e à minhas cunhadas Soleide e Sônia que cuidavam do meu bebê para eu pudesse estar no laboratório terminando meu trabalho.
À Profª Vilma que, como uma mãe, sempre me apoiou tanto no trabalho científico como nas lições de vida que me ensinou.
À Profª Márcia Veloso, por toda ajuda que me deu ao longo de minha graduação, que ajudaram-me no meu desenvolvimento, tanto como cientista quanto como pessoa. À Profª Gislaine Vieira, pela ajuda no tratamento das amostras de peixes.
Ao Prof. Wilson, pela ajuda sempre dada com carinho e bom humor.
A Eliane, pela amizade, carinho e por toda ajuda sempre dada com muita competência.
À Profª Juceni, por ceder o HPLC de seu laboratório na Faculdade de Farmácia, na época em que o IQ estava fechado por causa do incêndio.
À Profª Zênis pelos espectros no ultravioleta dos padrões de bromofenóis.
A todos do LPQ: Profª Luciana, Prof. Pedro Afonso, Profª Gisele, Prof. Luiz Carvalho, Adalberto, Paulo, Jaqueline, Fábio, Marcele, Paula, Cristiane, Lucas, Neto, Ana Carla, Rogete, Marcos, Luciane, pela convivência pacífica e por terem contribuído direta ou indiretamente para a realização desse trabalho.
Aos colegas do curso de pós-graduação Torquato, Andréa e Sidney, pela amizade e momentos de descontração.
A todos do IQ (funcionários, professores e colegas) que de algum modo contribuíram para a realização desse trabalho
v SUMÁRIO
LISTA DE TABELAS vii
LISTA DE FIGURAS viii
LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS ix
RESUMO x
ABSTRACT xi
1. INTRODUÇÃO 01
2 Bromofenóis em organismos marinhos 04
2.1 Ocorrência 04
2.2 Espécies estudadas 06
2.2.1 Sardinha (Sardinella janeiro) 06
2.2.2 Xaréu (Caranx hippos) 06
2.3 Toxicologia 07
2.4 Propriedades físicas 08
3. Metodologia Analítica para extração e determinação dos
bromofenóis 10
3.1 Isolamento e determinação dos bromofenóis 10
3.1.1 Destilação-extração simultânea 10
3.1.2 Microextração com gota única (SDME) 12
3.2.1 Fatores que influenciam a extração por SDME 13
3.2.1.1 Seleção do solvente 14
3.2.1.2 Volume da gota do solvente 14
3.2.1.3 Agitação 14
3.2.1.4 Tempo de extração 14
3.2.1.5 Temperatura 15
3.2.1.6 Efeito do sal 15
vi
4. Objetivos 16
4.1 Objetivo geral 16
4.2 Objetivos específicos 16
5 PARTE EXPERIMENTAL 17
5.1 Obtenção e preparo das amostras de peixes 17
5.2 Reagentes e solventes 17
5.3 Equipamentos e materiais 17
5.4 Soluções de trabalho 18
5.5 Condições cromatográficas e espectrométricas 18
5.6 Validação do método 21
5.6.1 Curvas analíticas 21
5.6.2 Limites de detecção (LD) e limites de quantificação (LQ) 22
5.6.3 Precisão 23
5.6.4 Exatidão 24
5.7 Extração dos bromofenóis 25
5.7.1 Preparação da amostra 26
6 RESULTADOS E DISCUSSÃO 26
6.1 Otimização do procedimento SDME 26
6.2 Validação do método 30 6.2.1 Curvas analíticas 30 6.2.2 Precisão 30 6.2.3 Exatidão 31 6.3 Aplicação do método 32 7 Conclusão 33
8 Perspectivas para trabalhos futuros 34
vii LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Propriedades físicas dos bromofenóis simples 09 Tabela 2. Tempos de retenção, íon de quantificação e íons
qualificadores de cada analito obtidos com a programação do CG encontrada na Literatura
20
Tabela 3 - Tempos de retenção, íon de quantificação e íons qualificadores de cada analito obtidos com a nova programação do CG
20
Tabela 4 - Constantes físicas dos bromofenóis simples 25 Tabela 5 - Níveis de amostragens utilizados no planejamento
Box-Behnken
27
Tabela 6 - Matriz do planejamento Box-Behnken com três replicatas do ponto central
28
Tabela 7 - Curvas analíticas, limites de detecção e quantificação dos bromofenóis
30
Tabela 8 - Desvios padrão relativos dos bromofenóis 31 Tabela 9- Recuperações dos bromofenóis pelo método desenvolvido 32 Tabela 10- Concentrações dos bromofenóis (ng.g-1) em peixes do
litoral da Bahia obtidos por SDME
viii LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Bromofenóis relacionados ao flavor de organismos marinhos 02 Figura 2 - Peixe Sardinella janeiro (sardinha) 06
Figura 3 - Peixe Caranx hippos (xaréu) 07
Figura 4 - Extratores usados na DES: a) original; b) modificada por
Schultz, 1977 10
Figura 5 - . Aparelhagem de Clévenger modificada, adaptada para SDE 11 Figura 6 - Procedimento de extração por SDME e determinação por
CG-EM 13
Figura 7 - Cromatógrafo a gás GCMS-QP2010 utilizado nas análises 18 Figura 8 - Programação do CG utilizada na literatura para a análise dos
bromofenóis 19
Figura 9 - Nova programação do CG desenvolvida para análise dos
bromofenóis 19
Figura 10 - Cromatograma obtido por CG-EM no modo SIM na injeção de 1µL de uma mistura padrão dos bromofenóis na concentração de 9,0 ng.mL-1. Identificação dos picos: (a) 2-BF; (b) 4-2-BF; (c) 2,4-D2-BF; (d) 2,6-D2-BF; (e) 2,4,6-TBF
21
Figura 11- Cromatograma obtido por CG-EM (modo SIM) na extração
por SDME efetuada em uma amostra de peixe 21 Figura 12- Fluxograma do método de extração dos bromofenóis em
músculos de peixes por SDME 26
Figura 13- Gráfico de Pareto para os efeitos dos parâmetros sobre a
área total dos bromofenóis em músculos de peixes 28 Figura 14- Superfícies de respostas para o planejamento Box-Behnken 29
ix LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS
BF bromofenol
CG-EM cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas COVs Compostos orgânicos voláteis
DBF dibromofenol
DES destilação-extração simultâneas
HPA Hidrocarbonetos policíclicos aromáticos LD limite de detecção
LQ limite de quantificação PBF pentabromofenol
SDME Microextração simples com gota única (Single Drop Microextraction) SIM Selected Íon Monitoring
TBBFA 3, 5, 3’, 5’ –tetrabromobisfenol TBF tribromofenol
TCBFA 3, 5, 3’, 5’-tetraclorobisfenol
CLAE Cromatografia Líquida de Alta Eficiência RDS Desvio padrão relativo
x RESUMO
A atividade de pesca no Brasil e no mundo tem grande importância econômica, pois os peixes têm significativa presença na dieta humana devido à sua constituição protéica, além de ser ricos em proteínas, lipídeos, vitaminas e excelentes fontes de minerais. Os bromofenóis simples [2-bromofenol (2-BF), 4-bromofenol (4-BF), 2,4-dibromofenol (2,4-DBF), 2,6-2,4-dibromofenol (2,6-DBF) e 2,4,6-tribromofenol 2,4,6-TBF)] têm sido identificados como as principais substâncias responsáveis pelo flavor dos alimentos marinhos. A técnica convencionalmente empregada para extração dos bromofenóis em músculos de peixes é a destilação-extração simultânea (DES) que combina simultaneamente duas técnicas clássicas, a destilação por arraste a vapor e a extração líquido-líquido utilizando um extrator de Likens-Nickerson. A microextração com uma gota única (SDME) é uma técnica alternativa que integra amostragem, extração, concentração e introdução da amostra em um único passo e vem ganhando destaque por não ser exaustiva, utilizar uma diminuta quantidade de solvente, requerer curto tempo de análise, apresentar elevada sensibilidade e baixo custo. Nesse trabalho foi desenvolvida uma nova metodologia analítica baseada em SDME e CG-EM para determinação de bromofenóis em músculos de peixes. Além disso, foi feita a otimização de uma programação de temperatura no CG-EM, o que permitiu boa resolução em apenas 15 minutos de corrida cromatográfica. Esta nova metodologia foi validada em função da linearidade das curvas analíticas, limite de detecção e quantificação, precisão e recuperação para cada analito estudado. A recuperação e precisão variaram, respectivamente, de 48,9 a 96,3% e de 0,24 a 10,1%. Os limites de detecção e quantificação variaram, respectivamente, de 0,166 a 0,542 ng.mL-1 e de 0,400 a 1,50 ng.mL-1. Em todas as amostras analisadas o 4-BF e o 2,4,6-TBF foram detectados, sendo o 2,4,6-TBF o que apresentou a maior concentração em todas as amostras, em concordância com a literatura que mostra que o 2,4,6-TBF é o bromofenol encontrado em maior concentração nos peixes, enquanto o 2,6-DBF e o 2-BF, que são bromofenóis que tem menor concentração limiar de flavor, estão presentes em concentrações relativamente mais baixas. A nova metodologia desenvolvida, além de apresentar baixos limites de detecção e quantificação, envolve menor tempo de análise, menor consumo de energia e solventes, sendo assim compatível com os princípios da Química Verde.
xi ABSTRACT
The fishing activity in Brazil and the world is of great economic importance, because the fish have significant presence in the human diet because of their protein composition, besides being rich in proteins, lipids, vitamins and excellent sources of minerals. The bromophenols simple [2-bromophenol (2-BP), 4-bromophenol (4-BP), 2,4-dibromophenol (2,4-DBP), 2,6-dibromophenol (2,6-DBP) and 2,4,6-tribromophenol (2,4,6-TBP)] have been identified as the main substances responsible for flavor of seafood. The technique conventionally used for the extraction of bromophenols in muscle of fishes is the simultaneous distillation-extraction (SDE) that simultaneously combines two classic techniques, distillation by steam distillation and liquid-liquid extraction using a Likens-Nickerson extractor. The single drop microextraction with a (SDME) is an alternative technique that integrates sampling, extraction, concentration and sample introduction in one step and has been gaining attention because it is not exhaustive, employs a negligible amount of solvent, requires little time for analysis, has high sensitivity and low cost. In this work we developed a new analytical methodology based on SDME and GC-MS for the determination of bromophenols in muscles of fishes. In addition, optimization of a program was performed in a GC-MS, allowing good separation in just 15 minutes. This new methodology has been validated according to the linearity of calibration curves, limits of detection and quantification, precision and recovery for each analyte studied. Recovery and accuracy varied, respectively, from 48.9 to 96.3% and from 0.24 to 10.1%. The limits of detection and quantification varied, respectively, from 0.166 to 0.542 ng.mL-1 and 0.400 to 1.50 ng.mL-1. In all samples analyzed 4-BP and TBP were detected, and the 2,4,6-TBP presented the highest concentration in all samples, in agreement with the literature shows that the 2,4,6-TBP is the bromophenol found in highest concentration in the fish, while 2-BP and 2,6-DBP, which are bromophenol which has a lower concentration of flavor threshold, are present in concentrations relatively lower. The new proposed method, besides presenting lower limits of detection and quantification, involves analysis less time, consumptions lower of energy and solvent, thus consistent with the principles of Green Chemistry.
1 1. INTRODUÇÃO
Os peixes são bastante utilizados na alimentação humana, principalmente devido à sua constituição protéica e de lipídeos altamente insaturados (Araújo, 1999). Os peixes são considerados um alimento completo, ricos em proteínas, lipídeos, vitaminas e excelentes fontes de minerais fisiologicamente importantes como Na, K, Mg, Ca, I, P, Se, Fe, entre outros, com teores que oscilam de 0,8 a 2%, além de conterem cerca de 0,3 a 1% de carboidratos (Ogawa e Maia, 1999; Coultate, 2004; Ribeiro e Seravalli, 2004). Os peixes possuem sabor e odor característicos (“flavor”) bastante variados, e acredita-se que estes têm relação com a espécie considerada, dieta e mudanças ocorridas durante o armazenamento e processamento (Lindsay et al., 1990; Stansby, 1962). O odor e o sabor do peixe podem-se apresentar agradáveis, sendo apreciado pelos consumidores (“on-flavor”), ou desagradáveis com elevado nível de ranço (“off-flavor”) (Kubitza, 1999).
De acordo com a literatura internacional, “flavor” se emprega no sentido da percepção global integrada de todos os sentidos, no momento da degustação e ingestão de um alimento. A esta percepção sensorial, são somadas sensações subjetivas que estão associadas aos hábitos, aos padrões culturais e à sensibilidade de cada indivíduo. Assim, a análise do “flavor” deve considerar também as sensações auditivas, visuais e táteis, além das gusto-olfativas (Fennema, 1999; Teixeira et al, 1987).
A percepção do aroma é um dos principais critérios para a avaliação de um produto e para posterior aceitação e preferência pelos consumidores (Arora et al., 1995). Cor e “flavor” são os mais importantes atributos de qualidade que os consumidores usam para julgar a qualidade e aceitabilidade do alimento (Soncin et al., 2007).
Os bromofenóis simples tais como 2-bromofenol (2-BF), 4-bromofenol (4-BF), 2,4-dibromofenol (2,4-DBF), 2,6-2,4-dibromofenol (2,6-DBF) e 2,4,6-tribromofenol (2,4,6-TBF) (Figura 1) são substâncias naturais do ambiente marinho e são também componentes importantes do “flavor” de certas espécies de peixes e crustáceos (Whitfield et al., 1996). Em água, os que apresentam “flavor” mais forte dentre esses compostos são o 2,6-DBF, 2-BF e 2,4,6-TBF, que têm concentrações limiares de “flavor”, respectivamente, de 5x10-4, 3x10-2 e 0,6 ng.g-1 (concentração mínima em que cada bromofenol é detectado). A essas concentrações o “flavor” do 2,6-DBF e do 2,4,6-TBF são descritos como iodofórmico, e o “flavor” do 2-BF é descrito com fenólico/iodínico. Em tais concentrações os bromofenóis podem conferir um indesejável “flavor” do tipo
2 iodofórmico ou iodínico à carne de camarões, pitus e peixes. Contudo, em níveis abaixo de sua concentração limiar de “flavor” alguns bromofenóis contribuem positivamente para o reconhecível “flavor” marinho ou oceânico aos frutos do mar. O 4-BF e o 2,4-D4-BF, com concentrações limiares de “flavor” de, respectivamente, 23 e 4 ng.g-1, possuem fraco “flavor” do tipo fenólico (Whitfield et al., 1988). Ainda assim, suas presenças podem produzir menores efeitos no “flavor” percebido de alguns alimentos marinhos (Boyle et al., 1992b).
Figura 1. Bromofenóis relacionados ao flavor de organismos marinhos.
A qualidade organoléptica de produtos de aqüicultura é geralmente aceitável, mas alguns consumidores têm sugerido que há uma óbvia diferença entre o “flavor” de alimentos marinhos cultivados e o de pescados de seu ambiente natural tais como peixes (Ma et al., 2005). Foi demonstrado, no início dos anos 1960 que a dieta e o ambiente exercem um impacto no “flavor” dos alimentos marinhos. O desejável efeito de bromofenóis no “flavor” de peixes tem sido extensivamente investigado por Boyle et al. (1992). Esses autores estudaram o conteúdo de bromofenóis de quatro espécies de salmão do Pacífico (Oncorhynchus spp.) obtidos tanto de água doce quanto de água salgada. Foi revelado que, enquanto a carne de peixe de água salgada contém entre 6,1 e 34,8 ng.g-1 de bromofenóis totais, a carne do peixe de água doce é isenta desses compostos. Essencialmente, aos peixes de água doce falta o “flavor” oceânico
3 característico do salmão de água salgada. Os mesmos autores também revelaram que a carne do salmão do Atlântico cultivado (Salmo salar) contém menos que 2 ng.g-1 de bromofenóis. Eles concluíram que peixes que crescem em sistemas de aqüicultura marinha não contêm essas substâncias porque sua dieta manufaturada contém pouco ou nenhum bromofenol (Whitfield et al., 1998). Similarmente, Whitfield et al. (1997) revelaram que o conteúdo total de bromofenóis de camarões silvestres da Austrália variou entre 9,5 e 1114 ng.g-1, enquanto em animais cultivados em tanques comerciais esses valores foram menores que 1 ng.g-1. Mesmo em camarões silvestres, ocorrem variações no conteúdo total de bromofenóis em diferentes espécies (Whitfield et al., 1997). A causa para tais variações é desconhecida. Contudo, foi anteriormente sugerido (Whitfield, 1990; Whitfield et al., 1992) que tais variações poderiam ser devido a um ou mais de três fatores: (i) o padrão de alimentação dos camarões durante os dias antes da pesca, (ii) a razão de bioacumulação e (iii) a razão de eliminação do material ingerido. Assim, a concentração dos bromofenóis em cada captura de camarões dependeria largamente dos níveis dessas substâncias que estavam presentes na sua mais recente alimentação.
Um possível modo de aumentar tanto a aceitação quanto o valor dos produtos de aqüicultura seria melhorar a qualidade do “flavor” pela elevação do seu conteúdo de bromofenóis (Ma et al., 2005). Evidências sugerem que o “flavor” de camarões cultivados poderia ser seguramente modificado pela adição dessas substâncias em quantidades apropriadas à dieta do animal. Contudo, tentativas de produzir um alimento para camarão com um alto conteúdo de bromofenóis pela adição direta dessas substâncias ao alimento não processado não tem conseguido êxito. Os bromofenóis foram perdidos durante o preparo do alimento (Whitfield et al., 1997). Estudos revelaram que a adição de 30% da alga Padina arborescens ou da alga Sargassum siliquastrum à alimentação tradicional de peixes cultivados aumentou o conteúdo total de bromofenóis de 8,9 para 132 e 340 ng.g-1, respectivamente (Ma et al., 2005).
Muitos bromofenóis, incluindo 2,6-DBF e 2,4,6-TBF, são conhecidos por possuir atividades fungicidas, bactericidas e ascaricida (Zsolnai, 1960; Jeney e Zsolnai, 1967). Consequentemente, tem sido sugerido que essas substâncias são produzidas por vermes marinhos como defesa química contra microorganismos e alguns animais marinhos predadores (Sheikn e Djerassi, 1975; Higa et al., 1980; Woodin et al., 1987). No entanto, quando Hay et al (2004) alimentaram duas espécies de peixes (Fundulus
4 heteroclitus e Leiostomus xanthurus) e um caranguejo (Callinectes similis) com 16 espécies de vermes marinhos, apenas uma espécie foi rejeitada por ambos os peixes mas foi prontamente consumido pelo caranguejo. Investigações demonstraram que o verme rejeitado continha 2,3,4-tribromopirrol a 0,2% de massa seca do verme. Em um teste final, os mesmos autores adicionaram substâncias bromadas que são conhecidamente produzidas por vermes marinhos (4-bromofenol, 2,4-dibromofenol, 2,6-dibromofenol, 2,4,6-tribromofenol e bromohidroquinona) em uma pasta de lula a concentrações que variaram desde a concentração em que se encontram naturalmente até 20 vezes o valor dessa concentração. Os resultados mostraram que nenhum metabólito bromado foi rejeitado à concentração natural. Quando elevado a 20 vezes a concentração natural, a pasta de lula contendo 4-bromofenol, 2,6-dibromofenol, 2,4,6-tribromofenol e bromohidroquinona foi prontamente consumida. Apenas o 2,4-dibromofenol foi rejeitado por alguns consumidores a concentrações que variaram de 5 a 15 vezes a concentração natural. Isso mostra que, embora se tenha suposto que metabólitos bromados atuem como defesa contra predadores para os vermes marinhos parece que eles raramente têm essa função. (Hay et al., 2004).
2. BROMOFENÓIS EM ORGANISMOS MARINHOS 2.1. OCORRÊNCIA
Os bromofenóis são produzidos diretamente por algas, briozoários e poliquetas que são classificados como produtores primários, enquanto que na maioria dos organismos marinhos, como peixes, moluscos e crustáceos, a incorporação ocorre a partir da dieta, sendo estes classificados como produtores secundários (da Silva et al., 2007).
Os peixes carnívoros bentônicos, que se alimentam principalmente de poliquetas, são os que possuem maior concentração de bromofenóis, seguidos pelos peixes onívoros diversos, cuja alimentação consiste principalmente de poliquetas, algas e briozoários (Whitifield et al., 1996). O 2,4,6-TBF é o bromofenol encontrado em maior concentração nos peixes (Chung et al, 2003), enquanto o 2,6-DBF e o 2-BF, que tem menor concentração limiar de “flavor”, estão presentes em concentrações relativamente mais baixas (Whitifield et al., 1996; da Silva et al., 2005).
Nos briozoários todos os bromofenóis simples são encontrados, sendo que aqueles que se apresentam em maior concentração são o 2,4,6-TBF, o 2,6-DBF e o 2,4-DBF.
5 Estudos feitos em algumas espécies de briozoários mostraram que o conteúdo total de bromofenóis variou de 36 a 1668 ng.g-1 (Whitfield et al., 1999b).
As poliquetas são um dos mais populosos organismos bentônicos no ambiente marinho e são conhecidas como produtoras de bromofenóis (Whitifield et al., 1996). O conteúdo total de bromofenóis nesses animais depende do habitat em que vivem. As poliquetas que vivem em ambiente lamoso possuem um maior conteúdo de bromofenóis do que as que vivem em ambientes arenosos ou rochosos (Whitifield et al., 1996; Whitfield et al., 1999b) A concentração de bromofenóis nesses animais é da ordem de mg.g-1 e o 2,4,6-TBF é o bromofenol majoritário na maioria das espécies. (Whitfield et al., 1996; Whitfield et al., 1999b).
Nas esponjas os bromofenóis que aparecem em maiores concentrações são o 2,4,6-TBF, o 2,4-DBF e o 4-BF enquanto o 2-BF e o 2,6-DBF apresentam concentrações bem mais baixas. (Whitfield et al., 1996).
Em mexilhões e ostras os bromofenóis foram detectados em todas as espécies estudadas, com seu conteúdo variando de 10,3 a 246 ng.g-1 em mexilhões e 13,6 a 75,8 ng.g-1 em ostras. O 2,4,6-TBF e o 2,4-DBF foram os bromofenóis que apresentaram maiores concentrações.
Com relação aos camarões, o 2,4,6-TBF é o bromofenol que apresenta maior concentração, sendo que o cefalotórax contém maior concentração que a cauda (Chung et al, 2003). Todos os camarões são carnívoros bentônicos e as diferenças na dieta são ditadas pelo habitat em que os camarões são alimentados. Dessa forma, a concentração de bromofenóis em camarões cultivados é bem menor que em camarões silvestres (Whitfield et al., 1996). Em camarões, os bromofenóis com menor concentração limiar de flavor, ou seja, o 2,6-DBF e o 2-BF, estão usualmente presentes em maior concentração do que em peixes. Isso explica, pelo menos em parte, o porquê do forte “flavor” percebido em camarões comparado com aquele da maioria dos peixes (Whitfield et al., 1996). Os principais componentes da dieta dos camarões são crustáceos, poliquetas e moluscos (Whitfield et al., 1997).
As algas marinhas contêm relativamente elevadas concentrações de bromofenóis. Algumas espécies estudadas por Whitfield et al. (1999a) apresentaram conteúdos que variaram entre 433 e 2590 ng.g-1. Algas marinhas são o maior componente da dieta da maioria de espécies de peixes oceânicos onívoros (Whitfield et al., 1998).
6 2.2. Espécies estudadas
2.2.1. Sardinha (Sardinella janeiro)
A sardinha é um pequeno peixe de escamas, de coloração prateada (Figura 2). Vive no máximo 4 anos. Sua carne tem três destinos diferentes: uma parte é comercializada fresca, outra é destinada à indústria de enlatados e outra para a fabricação de farinha de peixe. A sardinha é importante para a economia pesqueira das regiões Sudeste e Sul onde se localiza a totalidade da indústria de conservas. Pode atingir 25 cm de comprimento.
É um peixe pelágico costeiro de águas rasas. Pode-se encontrar também em estuários e lagoas. Ocorre em todo o litoral brasileiro. Formam grandes e compactos cardumes junto à superfície.
Quando juvenis alimentam-se de fitoplâncton e, quando adultos, de microrganismos (zooplâncton).
Inicia o processo de maturação em seu primeiro ano de vida com 16 a 17 cm de comprimento. A desova ocorre em três áreas distintas do Sudeste e Sul do Brasil entre novembro e fevereiro (http://www.vivaterra.org.br/peixes_salgada_6.htm acessado em 03/09/2011).
Figura 2. Peixe Sardinella janeiro (Sardinha)
2.2.2. Xaréu (Caranx hippos)
O xaréu é um peixe de escamas com corpo ovalado e comprimido, cabeça volumosa e alta. Focinho arredondado, olhos relativamente grandes. Nadadeira peitoral longa, ultrapassando a origem da nadadeira anal. A linha lateral é muito curvada apresentando carenas no final (as escamas da linha lateral são modificadas em escudos). O pedúnculo caudal é muito fino com duas quilhas. A coloração é verde-azulada no dorso, os flancos são prateados com nuances douradas e o ventre
7 amarelado. Possui uma mancha preta na nadadeira peitoral e outra no opérculo. Os indivíduos jovens possuem cinco faixas verticais escuras no corpo e uma na cabeça (Figura 3). Alcança mais de 1 m de comprimento total e cerca de 25 Kg . Importante na pesca esportiva e comercial.
Habita oceanos, ilhas costeiras e recifes, porém também podem ser encontrados em regiões de estuário, canais, bocas de barras, costeiras e regiões de mangue, tanto na superfície como no fundo. Grandes exemplares são encontrados em mar aberto.
Ocorre em toda a costa brasileira.
O xaréu é um predador diurno. Nada em cardumes. Pode tolerar uma ampla variação de salinidade. É um migrador e um predador voraz.
Alimentam-se de pequenos peixes, como paratis e tainha, assim como camarões e outros invertebrados. Os jovens se alimentam de zooplâncton e crustáceos do fundo do mar. A época reprodutiva é de março a setembro (http://www.vivaterra.org.br/peixes_salgada_6.htm acessado em 03/09/2011).
Figura 3. Peixe Caranx hippos (xaréu)
2.3. TOXICOLOGIA
Como os bromofenóis são uma classe de substâncias importantes para o “flavor” em alimentos marinhos, sua toxicidade poderia ser uma preocupação para os consumidores. Frequentemente, compostos halogenados exibem maior toxicidade biológica que seus correlatos não halogenados. Fenóis clorados são até 500 vezes mais tóxicos que o fenol, e a toxicidade aumenta com o aumento do número de átomos de cloro como substituintes (Kwasniewska e Kaiser, 1983). Geralmente, como acontece com compostos clorados, um aumento no número átomos de bromo comosubstituintes parece resultar em um aumento na toxicidade (Kwasniewska e Kaiser, 1983). Contudo, compostos fenólicos clorados são geralmente mais bioativos que seus comparáveis
8 correlatos bromofenóis (Sweet, 1987; Sax e Lewis, 1989). Bromofenóis são descritos como moderadamente tóxicos e pode causar irritação na pele, olhos e mucosas (Sax e Lewis, 1989). Dados da literatura indicam que as doses letais (LD50) para o 2-BF, 4-BF,
2,4-DBF, e 2,4,6-TBF administradas oralmente a camundongos ou ratos são 6,52x105, 5,23x105, 2,82x105 e 2x106 ng.g-1, respectivamente. Contudo, para produzir um efeito letal em humanos, foi estimado que de 8 milhões a 600 milhões de camarões deveriam ser consumidos (Boyle et al., 1993).
2.4. Propriedades físicas
Os bromofenóis têm alta massa molar devido à contribuição do átomo de bromo. Dessa forma, eles exibem altos pontos de ebulição, o que torna difícil seu isolamento de peixes e alimentos marinhos (Boyle et al., 1993). Os bromofenóis são relativamente polares, especialmente os isômeros monobromados, sendo solúveis em algum grau em água. Contudo, Boyle et al. (1992b) observou que os monobromofenóis não se dispersam em nenhuma extensão em óleo vegetal. Os coeficientes de partição octanol/água (Tabela 1) determinados para os bromofenóis (Boyle et al., 1992a) indicam que apenas o 2,4-DBF (Log P=3) e o 2,4,6-TBF (Log P=3,74) poderiam potencialmente ser bioacumulados em peixes e outros animais marinhos. Geralmente, compostos com valores de Log P abaixo de 3 serão solubilizados em fase aquosa e não se bioacumularão em células e tecidos lipídicas (Gobas et al., 1988; Poels et al., 1988).
9 Tabela 1. Propriedades físicas dos bromofenóis simples.
Propriedade 2-BF 4-BF 2,4-DBF 2,6-DBF 2,4,6-TBF
Fórmula C6H5BrO C6H5BrO C6H4Br2O C6H4Br2O C6H3Br3O
massa molar 172 172 252 252 330 Densidade (g.cm-1) 1,492420/4 b 1,84015 a,b - - 2,5520/20 a,b Solubilidade Água, éter Álcool, CHCl3, éter, 7 partes de água
Éter, álcool Éter, álcool Álcool, CHCl3,
14.000 partes de água.
Estado físico Líquido oleosoa Cristais piramidais tetragonais (CHCl3, Et2O)a Cristais em agulhas (éter de petróleo)b Cristais em agulha (água)b Cristais longosa; em agulhas (EtOH)b; prismas (bz)b Ponto de ebulição (ºC) 194c 238c 238c 255c 282c Ponto de fusão (ºC) 5,6b 64a 40b 55-56b 95-96a Log P* 1,69d 1,94d 3,00d 2,37d 3,74d
*P = Constante de partição em octanol/água, expresso em log P
a INDEX MERCK, 1983 b HANDBOOK, 1974 c Buckingham, 1982; Verschueren, 1983 d
10 3. METODOLOGIAS ANALÍTICAS PARA EXTRAÇÃO E DETERMINAÇÃO DE
BROMOFENOIS
3.1. Isolamento e Determinação dos Bromofenóis 3.1.1. Destilação-extração simultânea
Geralmente, os bromofenóis são quantificados pela análise em cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (CG-EM) do extrato bruto obtido por destilação-extração simultâneas (DES) (Whitfield et al., 1988). A DES combina simultaneamente duas técnicas clássicas, a destilação por arraste a vapor e a extração líquido-líquido. A DES é muito empregada na extração de bromofenóis voláteis de organismos marinhos através do extrator de Likens-Nickerson (Figura 4) (Schultz et al., 1977). Da Silva e colaboradores (2005) utilizaram uma aparelhagem de Clévenger modificada, adaptada para DES (Figura 5), para extração dos bromofenóis, seguida pela determinação por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE)
Figura 4. Extratores usados na DES: a) original; b) modificada por Schultz, 1977.
Nesse sistema o material é colocado em um balão de fundo redondo com água desionizada e acidificada a pH=1. Esse material fica em repouso por aproximadamente 12 horas. Após isso, o sistema é aquecido e a água destila arrastando os compostos voláteis presentes no peixe. A extração utilizando a mistura de solventes pentano-éter
11 etílico ocorre em um intervalo de tempo de 2 a 4 horas. Após a extração, o pH do resíduo é medido para garantir que a acidez foi mantida durante todo o processo. O extrato coletado é filtrado com sulfato de sódio, concentrado com nitrogênio e estocado a -15°C até a análise (Whitfield et al., 1998, 1999c; Chung et al., 2003; da Silva et al., 2005).
Apesar da alta sensibilidade do CG-EM, a injeção de uma alíquota do extrato do solvente orgânico concentrado diretamente na coluna causa significativa perda de sensibilidade porque os óleos voláteis nesses extratos rapidamente são acumulados na frente da coluna do CG (Whitfield et al., 2002). Como consequência, frequente limpeza da coluna é necessária para manter o desempenho analítico. Dessa forma, a aplicabilidade deste método para análises de rotina é reduzida (Fuller et al., 2008). Portanto, para se obter melhores resultados de análises cromatográficas, é preciso determinar a melhor técnica de extração dos compostos da amostra.
12 3.1. 2. Microextração com gota única (SDME)
O processo analítico está compreendido de vários passos: amostragem, manuseio da amostra, preparação da amostra no laboratório, separação e quantificação e avaliação estatística. Cada desses passos é importante para obtenção de resultados corretos, mas a preparação da amostra é um componente chave do processo analítico (Wardencki et al, 2007).
A extração líquido-líquido (Liquid-liquid extraction – LLE) é um dos mais antigos procedimentos de pré tratamento de amostras e é comumente usado por causa de sua simplicidade e baixo custo. Contudo, essa técnica requer relativamente grandes volumes de solvente orgânico, consome tempo e exige o manuseio de substâncias perigosas para a saúde e meio ambiente. A extração em fase sólida (solid-phase extraction – SPE) além de demandar um grande volume de solvente orgânico, há o problema do alto custo dos cartuchos SPE.
A microextração em fase sólida (Solid phase microextraction – SPME) é um método robusto, sensível e preciso. Entretanto, sua aplicação tem sido limitada pelo elevado preço e fragilidade da camada de recobrimento. Fibras tendem a degradar com o uso e a perda parcial da fase estacionária conduz a picos que podem coeluir com os analitos, afetando a precisão (Cortada et al, 2009).
A microextração com uma gota única (Single Drop Microextraction - SDME), desenvolvida por Jeannot e Cantwel (1996), provê uma técnica alternativa que integra amostragem, extração, concentração e introdução da amostra em um único passo (Zang et al, 2008). Essa técnica é executada pela suspensão de uma gota (volume na ordem de µL) de um solvente orgânico na solução aquosa em agitação, em que os analitos são particionados entre a gota orgânica e a fase aquosa para extração (Tor, 2006) A Figura 6 mostra um esquema de SDME.
13 Figura 6. Procedimento de extração por SDME e determinação por CG-EM
A SDME tem várias vantagens em comparação com outras técnicas de extração/preconcentração: não é exaustiva, utiliza uma quantidade de solvente desprezível (o que minimiza o contato do analista com substâncias potencialmente tóxicas), oferece a liberdade de selecionar o solvente mais adequado para os analitos de interesse, requer pouco tempo de análise, tem elevada sensibilidade e baixo custo, quando comparado com SPME e SPE e utiliza um equipamento simples (Pinheiro e Andrade, 2009).
Por outro lado, as desvantagens da SDME incluem variação do volume da gota durante o processo de extração, o que afeta diretamente parâmetros tais como: precisão, estabilidade da gota, dissolução do solvente da gota quando usado condições extremas de extração tais como velocidade de agitação alta, longo tempo de extração e elevada temperatura. Além disso, a experiência do operador pode afetar a linearidade e precisão da extração por SDME (Pinheiro e de Andrade, 2009; Pinheiro et al., 2011).
3.2.1. Fatores que influenciam a extração por SDME
A eficiência da extração por SDME é influenciada por muitos fatores tais como tempo de extração, propriedades químicas e físicas do solvente, tamanho da gota, razão de agitação, temperatura e força iônica da solução (Wardencki et al, 2007).
14 3.2.1.1. Seleção do solvente
A seleção do solvente de extração está baseada no princípio de que “semelhante dissolve semelhante” (Sarkhosh et al, 2011). O critério de seleção do solvente é similar àquele para extração líquido-líquido (LLE), isto é, os analitos devem ser mais solúveis no solvente de extração do que na amostra. Em geral, para SDME, a escolha de um solvente orgânico deve se basear na comparação de seletividade, eficiência da extração, incidência de perda da gota, taxa de dissolução da gota, bem como nível de toxicidade (Wardencki et al, 2007). Além disso, o solvente precisa ter ponto de ebulição elevado o suficiente para não evaporar, mas também apropriado para o sistema cromatográfico (Patel El al, 2010; Pinheiro e de Andrade, 2009).
3.2.1.2. Volume da gota de solvente
Em SDME, o volume da gota é uma importante variável na eficiência da extração. A quantidade de analito extraído aumenta com o aumento do volume da gota. Porém, uma gota maior que 3 µL é instável e a gota pode cair da agulha, especialmente quando utilizada a imersão direta (Patel El al, 2010). Gotas de solvente de 1-2 µL são mais estáveis e sua geometria é mais facilmente reproduzida (Wardencki et al, 2007).
3.2.1.3. Agitação
A agitação da amostra pode reduzir o tempo necessário para alcançar o equilíbrio termodinâmico, especialmente para analitos com elevado peso molecular. Por isso, a taxa de agitação é um importante parâmetro que afeta a eficiência da SDME (Sarkhosh et al, 2011). Contudo, a uma elevada velocidade de agitação pode-se promover bolhas de ar, aumentado a incidência de perda ou deslocamento da gota. Além disso, uma velocidade de agitação elevada pode provocar a redução do volume da gota devido à dissolução na fase aquosa. Assim, é preferível uma velocidade de agitação baixa. Se a extração é eficiente, nenhuma agitação seria necessária (Wardencki et al, 2007).
3.2.1.4. Tempo de extração
O processo de SDME depende do equilíbrio em vez de depender de uma extração exaustiva. Na maioria das aplicações em SDME a eficiência da extração aumenta com
15 o tempo de extração (Sarkhosh et al, 2011). Um tempo de extração suficiente é necessário para alcançar o equilíbrio dos analitos entre a fase aquosa e a gota orgânica. Porém um tempo de extração muito longo para alcançar o equilíbrio completo pode resultar em dissolução e perda da gota (Zang et al, 2008).
Em alguns casos, um aumento do tempo de exposição causa um aumento do volume da gota quando o solvente é hidrofílico, pela absorção de água. Além disso, a um longo tempo de amostragem, a gota de solvente pode perder o contato com a agulha devido à força gravitacional (Wardencki et al, 2007).
3.2.1.5. Temperatura
Resultados experimentais revelaram que o aumento da temperatura aumenta a eficiência da extração. Contudo, elevadas temperaturas pode causar perda da gota de solvente e diminuição da reprodutibilidade do processo de SDME. Para simplificar o método, a maioria dos químicos realiza os experimentos à temperatura ambiente (Wardencki et al, 2007).
3.2.1.6. Efeito da adição de sal
Em extração líquido-líquido convencional, a eficiência da extração é usualmente aumentada com o aumento da concentração do sal na solução da amostra devido ao efeito “salting-out” (Ye et al, 2007). Em SDME, geralmente há uma inesperada diminuição da eficiência da extração com o aumento da força iônica para a maioria dos analitos, o que é mais pronunciado para os analitos menos polares (Wardencki et al, 2007). NaCl dissolvido em água pode mudar as propriedades físicas do filme de extração e reduzir a taxa de difusão dos analitos de interesse em direção à gota orgânica (Sarkhosh et al, 2011).
3.2.2. Algumas aplicações da Microextração com gota única
Zhang e colaboradores (2008) desenvolveram metodologia para extração de pesticidas organoclorados em vegetais. Eles utilizaram uma gota de 1µL de uma mistura de solventes (p-xileno:acetona 8:2, v/v) imersa em uma solução aquosa de 2 mL e agitada a 400 rpm. Ye e colaboradores (2007) desenvolveram um pequeno dispositivo
16 afunilado para extração por SDME, que permite a utilização de uma gota de grande volume, o que melhorou a sensibilidade analítica. A estabilidade da gota foi aumentada por causa do aumento da área de contato e por causa da superfície interior áspera do dispositivo de extração. Foi utilizada uma gota de 20 µL de 1-octanol. Cortada e colaboradores (2009) utilizaram SDME para preconcentrar oito pesticidas organoclorados em amostras de água usando uma gota de 2 µL de tolueno. Pinheiro e de Andrade (2009) utilizaram SDME para determinação de multiresíduo de pesticidas em água. Os parâmetros que afetam o desempenho de SDME foram estudados e otimizados utilizando um planejamento fatorial. SDME foi utilizada também para extração de cocaína e metabólitos da cocaína em urina (Jager and Andrews, 2001) Até o momento, não existem trabalhos publicados em que se utilizou SDME na determinação de bromofenóis em amostra marinhas.
4. Objetivos
4.1. Objetivo geral
Desenvolver metodologia analítica para a determinação de bromofenóis em músculos de peixes com base na microextração com gota única e cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas.
4.2. Objetivos específicos
Aplicar planejamento Box-Behnken na otimização de um método de microextração com gota única de cinco bromofenóis (2-bromofenol; 4-bromofenol; 2,4-di4-bromofenol; 2,6-dibromofenol e 2,4,6-tribromofenol);
Otimizar as condições para obtenção dos melhores parâmetros em cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas para quantificação dos cinco bromofenóis estudados;
Validar a metodologia desenvolvida obtendo-se seus parâmetros de mérito como limites de detecção e quantificação, precisão, faixa dinâmica linear e exatidão;
Aplicar a metodologia desenvolvida na determinação dos cinco bromofenóis estudados em amostras de peixe coletadas no litoral do Estado da Bahia.
17 5. PARTE EXPERIMENTAL
5.1. Obtenção e preparo das amostras de peixe
Algumas espécies de peixes (badejo, sardinha e xaréu) foram obtidas logo após a captura na Colônia de Pesca Z-1, situada no bairro do Rio Vermelho na cidade de Salvador, Bahia (13º01’S e 38º31’W).
Os peixes recém pescados foram descamados e acondicionados em sacos plásticos, sendo então transportados para o Laboratório de Fisiologia Animal do Instituto de Biologia da UFBA. Neste Laboratório os peixes foram lavados com água destilada e os músculos foram retirados, colocados numa solução saturada de cloreto de sódio e posteriormente triturados. O purê obtido foi dividido em pequenas alíquotas com cerca de 100 g cada. Estas amostras foram guardadas em recipiente de polietileno e mantidas à -4 0C até a obtenção dos extratos.
5.2. Reagentes e Solventes
Os padrões dos bromofenóis 2-BF; 4-BF; 2,4-DBF; 2,6-DBF e 2,4,6-TBF utilizados nas análises cromatográficas por CG-EM foram da Aldrich com 97-99 % de pureza. A acetonitrila utilizada no preparo destas soluções padrões foi de grau HPLC da Merck. O ácido sulfúrico e o tolueno utilizados nos procedimentos de extração foram de grau analítico de procedência da Merck. A água desionizada utilizada nos procedimentos de extração foi obtida por destilação e filtração no sistema E-pure da Altech.
5.3. Equipamentos e materiais
Nas análises cromatográficas utilizou-se o Cromatógrafo a gás da Shimadzu GCMS-QP2010.
A centrífuga da Marconi, modelo MA-1810, foi utilizada nos procedimentos de centrifugação das amostras.
A balança analítica utilizada nas pesagens dos materiais analisados é da Sartorius, modelo TE214S.
18 5.4. Soluções de trabalho
Uma solução estoque de 1000 µg.mL-1 de cada bromofenol (2-BF; 4-BF; 2,4-DBF; 2,6-DBF e 2,4,6-TBF) em acetonitrila foi preparada e posteriormente armazenada a 4ºC em frasco de vidro âmbar.
Para a construção da curva de calibração foram feitas diluições em água da solução estoque no mesmo dia em que a curva foi construída.
5.5. Condições cromatográficas e espectrométricas
As análises por CG-EM foram realizadas em um sistema Shimadzu GCMS-QP2010 (Figura 7), equipado com injetor split/splitless, operando no modo splitless. Para separação dos analitos foi empregada uma coluna DB5 J & Scientific (30 mx 0,25 mm ID x 0,25 µm) com fase estacionária 5% difenil-95-dimetil-polisilixano, utilizando hélio como gás de arraste, com velocidade linear de 40 cm.s-1.
19 Os analitos foram inicialmente submetidos à análise por CG-EM utilizando uma programação desenvolvida pelo grupo de pesquisa (Figura 8) para a separação dos bromofenóis 2-BF; 4-BF; 2,4-DBF; 2,6-DBF e 2,4,6-TBF. A programação do CG apresentou tempo de análise de aproximadamente 30 minutos, volume de injeção de 1,0 μL, bem como temperatura do injetor e linha de transferência de 2600
C. O detector foi operado no modo impacto de elétron (70 e-v) com a temperatura da fonte de íons de 250oC.
.
Figura 8. Programação do CG utilizada na literatura para a análise dos bromofenóis
Apesar da boa resolução dos picos (Tabela 2), foi feita uma otimização deste método cromatográfico com o objetivo de diminuir o tempo de análise. A nova programação desenvolvida (Figura 9) apresenta tempo de análise de aproximadamente 15 minutos e resultou em boa resolução dos cinco picos referente aos cinco analitos estudados (Tabela 3). As temperaturas do injetor e da linha de transferência foram de 2700C e 2600C, respectivamente. O detector foi operado no modo impacto de elétron (70 e-v) com a temperatura da fonte de íons de 250oC.
.
Figura 9. Nova programação do CG desenvolvida para a análise dos bromofenóis
A identificação dos analitos foi realizada por comparação dos tempos de retenção observados após a injeção da solução padrão de cada bromofenol na nova programação desenvolvida, bem como por comparação dos espectros de massas obtidos com os espectros de massas relatados na biblioteca eletrônica NIST.
20 Com base na intensidade relativa dos picos observados nos espectros de massas obtidos, foram selecionados os íons de quantificação e de confirmação de cada analito para serem monitorados no modo SIM (Selected Íon Monitoring). Foram monitorados no mínimo dois íons para cada substância: o íon que forneceu maior área foi utilizado para a quantificação e os outros íons foram utilizados como qualificadores. A Tabela 3 mostra os tempos de retenção obtidos com a programação desenvolvida, os íons de quantificação utilizados na construção da curva de calibração e os íons qualificadores de cada analito. A Figura 10 mostra o cromatograma obtido por CG-EM no modo SIM na injeção de 1,0 μL de uma mistura padrão dos bromofenóis na concentração de 9,0 ng.mL-1. A Figura 11 mostra um cromatograma obtido no modo SIM, na extração por SDME de uma amostra de peixe.
Tabela 2. Tempos de retenção, íon de quantificação e íons qualificadores de cada analito obtidos com a programação do CG encontrada na Literatura
Analitos Tretenção (min.) Íon quantificador (m/z) Íons qualificadores (m/z) 2-BF 8,36 172 174 4-BF 13,28 172 174 2,4-DBF 15,09 252 250+254 2,6-DBF 15,82 252 250+254 2,4,6-TBF 20,76 330 332
Tabela 3. Tempos de retenção, íon de quantificação e íons qualificadores de cada analito obtidos com a nova programação do CG
Analitos Tretenção (min.) Íon quantificador (m/z) Íons qualificadores (m/z) 2-BF 3,94 172 174 4-BF 5,98 172 174 2,4-DBF 7,22 252 250+254 2,6-DBF 7,69 252 250+254 2,4,6-TBF 11,09 330 332
21 Figura 10. Cromatograma obtido por CG-EM no modo SIM na injeção de 1,0 μL de uma mistura padrão
dos bromofenóis na concentração de 9,0 ng. mL-1
. Identificação dos picos: (a) 2-BF; (b) 4-BF; (c) 2,4-DBF; (d) 2,6-2,4-DBF; (e) 2,4,6-TBF
Figura 11. Cromatograma obtido por CG-EM (modo SIM) na extração por SDME, efetuada em uma amostra de peixe
5.6. Validação do método 5.6.1. Curvas analíticas
A linearidade corresponde à capacidade do método em fornecer resultados diretamente proporcionais à concentração da substância analisada, dentro de uma determinada faixa de aplicação. Na maior parte dos casos, a relação matemática entre o sinal medido (área ou altura do pico) e a concentração da espécie de interesse deve ser determinada empiricamente, a partir de sinais medidos para concentrações conhecidas dessas espécies. Essa relação matemática pode ser expressa como uma equação de reta chamada de curva analítica (Ribani et al., 2004). A equação da reta tem a forma y=ax+b, em que x é a variável independente e relaciona-se às várias concentrações preparadas do padrão da substância de interesse, y é a variável dependente e refere-se ao sinal analítico obtido para cada concentração do padrão, a é o coeficiente
22 angular que expressa a inclinação da reta em relação aos eixos, e b é o coeficiente linear que expressa a intersecção da reta com os eixos. O número mínimo de pontos geralmente aceitos na curva analítica varia entre 5 e 6. Segundo a International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC), como limite inferior da curva emprega-se o limite de quantificação (LQ), enquanto o limite superior da curva é determinado removendo-se o ponto mais alto da curva até que um aumento na concentração ainda produza um aumento proporcional na resposta. A correlação é geralmente calculada pelo coeficiente de determinação r2 (Lanças, 2004).
Nesse trabalho, a quantificação dos analitos foi feita pelo método da padronização externa. As curvas analíticas foram obtidas por regressão linear, construídas pelo registro da área do pico versus a concentração do analito.
5.6.2. Limites de detecção (LD) e limites de quantificação (LQ)
O limite de detecção (LD) corresponde à menor quantidade de um analito que pode ser detectada, porém, não necessariamente quantificada como um valor exato. Na prática, o limite de detecção é determinado como a menor concentração do analito que pode ser diferenciada do ruído do sistema com segurança.
O limite de quantificação (LQ) corresponde à menor quantidade de um analito que pode ser quantificada com exatidão (Lanças, 2004).
Os LD e LQ podem ser calculados de três maneiras diferentes:
1. Método visual→ Se utiliza a matriz com adição de concentrações conhecidas da substância de interesse, de tal modo que se possa distinguir entre o ruído e o sinal analítico pela visualização da menor concentração visível (detectável); 2. Método relação sinal-ruído→ É feita a comparação entre a medição em baixas
concentrações conhecidas da substância de interesse na matriz e um branco (matriz isenta da substância de interesse). Dessa forma, é estabelecida uma concentração mínima na qual esta substância pode ser facilmente detectada. A relação sinal-ruído pode ser 3:1 ou 2:1 para o LD e 10:1 para o LQ;
3. Método baseado em parâmetros da curva analítica→ O LD e o LQ podem ser expressos como:
23 onde s é a estimativa do desvio padrão do coeficiente linear da equação e a é a inclinação ou coeficiente angular da curva analítica.
Para a maioria das técnicas analíticas, o método mais utilizado é o da relação sinal-ruído. Porém, em técnicas analíticas de separação, como as cromatografias, a medição sinal-ruído não é trivial, pois tanto o LD quanto o LQ podem ser afetados por condições cromatográficas e pelo tipo de coluna e tempo de uso da mesma (Ribani et al., 2004). Uma vez que o método baseado nos parâmetros da curva analítica é estatisticamente mais confiável, este foi o utilizado nesse estudo.
5.6.3. Precisão
A precisão é a expressão da concordância entre vários resultados analíticos obtidos para uma mesma amostra (Lanças, 2004).
A precisão pode ser determinada em condições de repetibilidade e reprodutibilidade. Na repetibilidade os resultados independentes são obtidos usando o mesmo método, para a mesma amostra, no mesmo laboratório, pelo mesmo operador, usando o mesmo equipamento e em um curto intervalo de tempo.
Na reprodutibilidade, os resultados são obtidos usando o mesmo método, para a mesma amostra, em diferentes laboratórios, por diferentes operadores e usando diferentes equipamentos (Lanças, 2004).
Na prática, em validação de métodos, o número de determinações é geralmente pequeno e o que se calcula é a estimativa do desvio padrão absoluto (s) (Equação 1) (Ribani et al., 2004).
(1)
x é a média aritmética de um pequeno número de medições (média das determinações); xi é o valor individual de uma medição e n é o número de medições.
24 Outra expressão da precisão é através da estimativa do desvio padrão relativo (RSD), também conhecido como coeficiente de variação (CV) (Equação 2).
(2)
5.6.4. Exatidão
A exatidão expressa a concordância entre o valor encontrado e o valor aceito como verdadeiro ou aceito como referência (Lanças, 2004).
Os processos mais utilizados para avaliar a exatidão de um método são: materiais de referência certificados; comparação de métodos; ensaios de recuperação; adição padrão (Ribani et al., 2004).
Os materiais de referência certificados são amostras cuja concentração do analito de interesse é conhecida (Lanças, 2004). Os materiais de referência certificados (MRC) são fornecidos por organismos reconhecidos e confiáveis, como NIST (“National Institute of Standards and Technology” - USA), LGC (“Laboratory of the Government Chemist” - UK), USP, FAPAS (“Food Analysis Performance Assessment Scheme” - UK), etc (Ribani et al., 2004). O processo de avaliação por meio de MRC consiste em analisar número suficiente de replicatas desse material e comparar os resultados obtidos com o valor certificado. Entretanto, o alto custo do MRC e a abrangência limitada de matrizes e analitos restringem seu uso (Brito et al., 2003).
O estudo da recuperação consiste na "fortificação" da amostra, ou seja, na adição de soluções com diferentes concentrações do analito de interesse seguida pela determinação da concentração do analito adicionado. Calcula-se a quantidade percentual recuperada pelo processo usando a equação 3:
(3)
A comparação dos métodos consiste na confrontação entre resultados obtidos empregando-se o método em desenvolvimento e os resultados conseguidos através de uma técnica baseada em um princípio diferente (Lanças, 2004).
25 A adição de padrão é método usado quando for difícil ou impossível preparar um branco da matriz sem a substância de interesse. No método de adição padrão, quantidades conhecidas da substância são adicionadas em diferentes níveis numa matriz da amostra, antes do procedimento de preparo da amostra, que já contenha quantidades (desconhecidas) da substância. Em geral, para adição padrão, uma boa abordagem é adicionar 25, 50 e 100% da concentração esperada da substância na matriz. A amostra sem adição do padrão e cada uma das amostras com o padrão adicionado devem ser analisadas e as quantidades medidas relacionadas com a quantidade adicionada (Brito et al., 2003).
5.7. Extração dos bromofenóis
A extração dos bromofenóis foi feita por sonicação, seguida pela pré-concentração através de uma técnica desenvolvida, que utiliza microextração com gota única (SDME) As diferentes propriedades físicas dessas substâncias, tais como pressão de vapor, solubilidade em água e constante de ionização (Tabela 4) podem explicar as dificuldades de extração. O emprego de condições ácidas inibe o processo de ionização dos bromofenóis livres, aumentando a eficiência da extração. Esse fato é mais pronunciado no caso do 2,6-DBF e 2,4,6-TBF, que possuem menores valores de pKa.
Tabela 4. Constantes físicas dos bromofenóis simples Bromofenol Estado físico MM pKa Pv (mmHg) Solubilidade em água 2-BF Líquido 172 8,45 0,0373 0,22325ºC 4-BF Sólido 172 9,17 0,0117 1,425ºC 2,4-DBF Sólido 252 7,79 0,00134 0,1925ºC 2,6-DBF Sólido 252 6,67 0,00134 0,011925ºC 2,4,6-TBF Sólido 330 6,80 0,000303 0,00715ºC
Quanto menor o valor de pKa maior a acidez do ácido, e consequentemente, mais ionizado será. Dessa forma, uma diminuição no pH provoca um aumento na
26 concentração de espécies neutras de compostos ácidos, aumentando assim a quantidade extraída.
5.7.1. Preparação da amostra
Aproximadamente 3 g de músculo de peixe foram colocadas em um tubo de centrífuga. Acrescentou-se 5 mL de água destilada e ácido sulfúrico concentrado até pH 1. O tubo foi fechado e seu conteúdo foi sonicado por 30 minutos e em seguida centrifugada por 5 minutos. O sobrenadante foi recolhido e os bromofenóis foram extraídos com uma gota de 1µL de tolueno (Figura 12).
Figura 12: Fluxograma do método de extração dos bromofenóis em músculos de peixes por SDME
6. RESULTADOS E DISCUSSÃO
6.1. Otimização do procedimento SDME
As melhores condições para extração dos bromofenóis com SDME foram conseguidas através de um planejamento fatorial Box-Behnken. Os experimentos de Box-Behnken
27 são caracterizados por delineamentos com 3 níveis dos fatores e por modelos de segunda ordem. As principais características desse tipo de planejamento são (Ferreira et al.,2007):
É aplicado quando o número de variáveis é igual ou superior a três;
O número de experimentos (N) necessários à aplicação do planejamento é dado por N = k2 + k + C, onde k é o número de variáveis e C é o número de replicatas do ponto central;
Os intervalos entre os níveis dos fatores estudados são uniformes;
Todos os fatores são estudados a três níveis (-1, 0, +1);
Não há ensaios onde as variáveis estejam todas em condições extremas, ou seja, todas em seu nível positivo ou todas em seu nível negativo.
Foram estudados três fatores: tempo de extração, tipo de solvente e velocidade de agitação (Tabela 5).
Tabela 5. Níveis das variáveis utilizadas no planejamento Box-Behnken
Fatores Níveis de amostragem
-1 Ponto central 1
Tempo de extração (min) 2 6 10
Solvente de extração Isooctano tolueno ciclohexano
Velocidade de agitação (rpm) 240 Sem agitação 380
A Tabela 6 apresenta a matriz do planejamento Box-Behnken com três replicatas do ponto central.
28 Tabela 6. Matriz do planejamento Box-Behnken com três replicatas do ponto central.
Exp Textração (min) Solvente Vagitação(rpm) Área total dos BFs
1 -1 -1 0 1483 2 1 -1 0 4355 3 -1 1 0 2229 4 1 1 0 5122 5 -1 0 -1 19585 6 1 0 -1 42187 7 -1 0 1 21221 8 1 0 1 58149 9 0 -1 -1 9082 10 0 1 -1 16750 11 0 -1 1 13978 12 0 1 1 12118 13 0 0 0 10240 14 0 0 0 12283 15 0 0 0 16886
A partir da matriz construiu-se o Gráfico de Pareto, que pode ser visualizado na Figura 13.
Figura 13. Gráfico de Pareto para os efeitos dos parâmetros sobre a área total dos bromofenóis nos músculos de peixes
De acordo com o diagrama de Pareto, todos os parâmetros de extração possuem efeitos quadráticos sobre a área total dos bromofenóis nos músculos de peixes.
29 Apenas o tempo apresentou o efeito linear. Os efeitos das interações não foram significativos.
O gráfico de Pareto mostra também que a velocidade é o efeito de maior importância para o processo. O valor negativo indica que a melhor resposta analítica é alcançada para o menor valor de velocidade.
O comportamento da área total dos bromofenóis em função dos parâmetros estudados é apresentado na Figura 14.
Figura 14. Superfícies de respostas para o planejamento Box-Behnken
A Figura 14 mostra que as melhores condições para extração por SDME são: tempo de extração máximo (10 minutos), velocidade de agitação baixa (240 rpm) e tolueno como solvente extrator.
30 6.2. Validação do método
6.2.1. Curvas analíticas
A quantificação dos bromofenóis foi feita por padronização externa. As curvas analíticas dos padrões dos bromofenóis foram obtidas por regressão linear, para os níveis de concentrações 0,4; 0,7; 1,0; 1,5; 3,0; 4,0; 5,0; 7,0 e 9,0 ng.ml-1. As faixas lineares obtidas foram determinadas pelos coeficientes de correlação das curvas geradas a partir de 9 níveis de concentração. Os coeficientes de determinação encontrados para todas as curvas analíticas foram maiores que 0,99, confirmando a linearidade da curva de calibração (Tabela 7).
Tabela 7. Curvas analíticas, limites de detecção e quantificação dos bromofenóis.
Bromofenol Curva analítica R2 LD
(ng.mL-1) LQ (ng.mL-1) Faixa linear (ng.mL-1) 2-BF y = 2348,4x + 762,18 0,9952 0,228 0,401 0,401-5,000 4-BF y = 573,88x – 75,506 0,9966 0,542 1,502 1,502-9,011 2,4-DBF y = 517,62x + 372,33 0,9944 0,219 0,400 0,400-4,000 2,6-DBF y = 778,41x + 134,23 0,9957 0,166 0,400 0,400-3,000 2,4,6-TBF y = 746,99x + 299,46 0,9947 0,353 0,400 0,400-5,000 6.2.2. Precisão
A precisão foi estudada em solução padrão contendo os cinco bromofenóis, pela repetibilidade das áreas dos picos. A precisão foi calculada pelo desvio padrão relativo (RDS) de cinco extrações seguidas feitas no mesmo dia, para uma concentração de 5,0 ng.mL-1, que equivale à concentração média da faixa de calibração. A Tabela 8 apresenta os RDS encontrados para as áreas dos bromofenóis.
31 Tabela 8. Desvios padrão relativos dos bromofenóis
Bromofenóis Desvio padrão relativos (RSD) (%)
2-BF 8,72
4-BF 1,38
2,4-DBF 4,62
2,6-DBF 15,5
2,4,6-TBF 9,15
Os valores de desvios padrão relativos para os dois métodos estão abaixo de 20%, sendo aceitáveis para análise de traços (Ribani et al., 2004).
6.2.3. Exatidão
As recuperações foram avaliadas em três níveis de fortificação (1,5; 5,0 e 9,0 μg kg-1
), onde o menor nível de fortificação (1,5 μg kg-1) corresponde ao LQ do 4-bromofenol. Neste nível, as recuperações apresentaram variação de 50,7% a 96,3% com desvio-padrão relativo variando entre 5,89% e 21,3%. No nível intermediário (5,0 μg kg-1) as recuperações apresentaram variação de 63,4% a 91,3% com desvio-padrão relativo variando entre 7,88% e 16,7%. No maior nível (9,0 μg kg-1
) as recuperações variaram entre 42,6 % e 101% com desvio-padrão relativo variando entre 1,62% e 9,25%. A Tabela 9 mostra os resultados das recuperações relativas obtidas em diferentes concentrações.
32 Tabela 9. Recuperações dos bromofenóis pelo método desenvolvido
Bromofenol Recuperação (%) Nível de fortificação (ng.mL-1) (n=3) 1,5 CV (%) 5,0 CV (%) 9,0 CV (%) 2-BF 63,6 5,89 77,5 0,240 60,3 0,250 4-BF 67,8 8,89 67,3 10,1 48,9 6,87 2,4-DBF 50,7 10,3 89,8 4,08 57,4 9,25 2,6-DBF 74,0 11,9 96,1 0,460 64,0 8,08 2,4,6-TBF 96,3 21,3 64,6 2,00 75,4 3,07 6.3. Aplicação do método
Para testar a aplicabilidade do método proposto na análise de amostras reais, o método desenvolvido foi utilizado para determinar a concentração de bromofenóis em três amostras de peixe do litoral da Bahia: sardinha (Sardinella janeiro) e xaréu (Caranx hippos). As amostras foram analisadas em triplicata. A Tabela 10 mostra os resultados obtidos.
Tabela 10. Concentrações dos bromofenóis (ng. g-1) em peixes do litoral da Bahia obtidos por SDME.
Peixe/ analito
Média das concentrações encontradas, ng.g-1 (RSD, %, n=3)
2-BF 4-DBF 2,6-DBF 2,4-DBF 2,4,6-TBF Sardinha <LQ 1,73 (21,0) nd 0,522 (10,6) 2,10 (9,3) Xaréu <LQ 0,332 (1,08) 0,326 (10,8) nd 6,62 (15) nd=não detectado
<LQ= abaixo do limite de quantificação
Verifica-se que em todas as amostras analisadas o 4-BF e o 2,4,6-TBF foram detectados, sendo o 2,4,6-TBF o que apresentou a maior concentração em todas as amostras. Isto está de acordo com a literatura que mostra que o 2,4,6-TBF é o bromofenol encontrado em maior concentração nos peixes (Chung et al, 2003),
