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Introdução. Bastonetes gram-negativos: ecologia, sistemática e fatores de virulência. Caracterização dos microrganismos

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Academic year: 2021

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(1)

Bastonetes gram-negativos: ecologia,

sistemática e fatores de virulência

Dra. Viviane Nakano

Curso de Pós-Graduação em Microbiologia BMM 5753 – Bacteriologia de Anaeróbios

Introdução

Bactérias anaeróbias gram-negativas

Gênero

Porphyromonas

(assacarolíticos) Gênero

Prevotella

(sacarolíticos) Gênero

Fusobacterium

Gêneros

Bacteroides

/

Parabacteroides

Gênero

Mitsuokella: M. dentalis

Outros gêneros:

Selenomonas

spp.

; Centipeda

spp.

;

Leptotrichia buccalis.

Caracterização dos microrganismos

• Bacilos anaeróbios estritos • Não esporulados, imóveis

• Produtores de pigmento marrom a negro (alguns) • Necessitam de hemina e menadiona

• Habitantes da microbiota indígena bucal, intestinal e

trato genito-urinário de humanos e animais.

Evolução taxonômica dos anaeróbios pigmentados

Bacterium melaninogenicus (1921) não fermentadores

(1962) fracos fermentadores (1962) fortes fermentadores (1962)

Subespécies assacharolyticus

(1977)

Subespécies

intermedius (1977) melaninogenicusSubespécies (1977) B. assacharolyticus B. endodontalis B. gingivalis (1988) B. melaninogenicus B. denticola B. loeschii (1990) B. intermedius B. corporis (1990)

Gênero Porphyromonas Gênero Prevotella

Gêneros

Porphyromonas

Prevotella

P. assacharolytica P. endodontalis P. gingivalis P. salivosa P. circumdentaria P. canoris P. cangingivalis P. cansulci P. crevioricanis P. gingivicanis P. gulae P. macacae P. levii

fracos fermentadores fortes fermentadores

P. corporis P. intermedia (1992) P. nigrescens (1992) P. pallens (1998) P. melaninogenica P. denticola P. loescheii P. tannerae

(2)

Espécies de

Porphyromonas

isoladas de humanos e animais Humanos Animal P. asaccharolytica P. endodontalis P. gingivalis P. catoniae P. cangingivalis P. canoris P. cansulci P. circumdentaria P. crevioricanis P. gingivicanis P. levii P. macacae P. gulae P. levii-like organisms P. endodontalis-like organisms Jousimies-Somer (1997)

Prevotella

: Espécies pigmentadas e não pigmentadas

Pigmentados P. corporis P. denticola P. intermedia P. melaninogenica P. nigrescens P. tannera Não Pigmentados P. bivia P. buccae P. buccalis P. disiens* P. heparinolytica** P. oralis P. oris P. oulorum P. veroralis P. enoeca P. zoogleoformans** * UV vermelho-amarelado ** Reagrupados no gênero Bacteroides

Jousimies-Somer (1997).

Prevotella

spp

. e Porphyromonas

spp

.

Cultura pura

Porphyromonas

spp

.

Fluorescência

Prevotella

spp

. e Porphyromonas

spp

.

Coloração de Gram

Gênero

Fusobacterium

spp.

F. alocis

F. necrophorum subsp. funduliforme F. necrophorum subsp. necrophorum F. nucleatum subsp. animalis F. nucleatum subsp. fusiformis F. nucleatum subsp. nucleatum F. nucleatum subsp. polymorphum F. nucleatum subsp. vicentii F. varium

(3)

Fusobacterium spp.

Cultura Pura Ágar Omata-Disraely

Fusobacterium spp.

Coloração de Gram

Família

Bacteroidaceae

- Gênero

Bacteroides

Produtores de pigmento negro

Não produtores de pigmento negro

Assacarolíticos Sacarolíticos Bile-sensíveis Bile-resistentes

Gênero Porphyromonas Gênero Prevotella B. capillosus Espécies intestinais: Bacteroides fragilis Sacarolíticos Shah e Collins (1989) B. melaninogenicus

Shah (1992); Garrity e Holt (2001) Porphyromonadaceae

Prevotellaceae

Família

Bacteroidaceae

- Gênero

Bacteroides

Bacteroides fragilis

(Grupo?)

Parabacteroides

(

distasonis e merdae)

Bacteroides gracilis

(Campylobacter gracilis)

Bacteroides forsythus

(Tannerella forsythia)

Bacteroides ureolyticus

Bacteroides capillosus

Gêneros

Bacteroides

e

Parabacteroides

Bacteroidaceae

Bacteroides

Bacteroides fragilis

B. fragilis, B. vulgatus, B. ovatus, B. uniformis, B. caccae, B. thetaiotaomicron, B. eggerthii, B. stercoris.

Família Gênero Grupo

Espécies

(4)

Novas espécies do gênero

Bacteroides

Song et al. (2004) Bacteroides nordii Bacteroides salyersae Kitahara et al. (2005) Bacteroides plebeius Bacteroides coprocola Fenner et al. (2005) Bacteroides massiliensis* Song et al. (2005) Bacteroides goldsteinii Bakir et al. (2006) Bacteroides intestinalis Bacteroides dorei Bacteroides finegoldii * Isolado de sangue de recém-nascido

Song et al. (2004)

Bakir et al. (2006) Sakamoto & Benno (2006)

Novo gênero

Parabacteroides

Meio BBE

Bacteroides fragilis

Bacteroides fragilis

(5)

Coloração de Gram

Grupo

Bacteroides fragilis

Ecologia

Reguladores da Microbiota Intestinal e Bucal Autóctone

Produção de substâncias antagonistas

Bacteriocina

Auto-antagonismo Iso-antagonismo Hetero-antagonismo

Microbiota Intestinal Água contaminada (esgoto) Abscessos Sangue Feridas cirúrgicas Humanos Animais Microbiota Bucal Prevotella spp. Porphyromonas spp. Fusobacterium spp. Bacteroides spp. Prevotella spp. Porphyromonas spp. Fusobacterium spp.

Fatores de virulência e

Patologias associadas

BACTÉRIAS TRABALHANDO

Fatores de virulência

Adesinas* Cápsula Colagenase Protease

Edema e acúmulo de neutrófilos no sítio da infecção

Prevotella

spp

. e Porphyromonas

spp

.

(6)

Prevotella

spp

. e Porphyromonas

spp

.

Patologias associadas

• Abscesso cerebral, infecções de cabeça e pescoço

e endocardites • Infecções bucais – Gengivite – Periodontite – Infecções endodônticas

Periodontite

Prevotella

spp

. e Porphyromonas

spp

.

Prevotella

spp

. e Porphyromonas

spp

.

Periodontite canina

Porphyromonas

spp

. -

animal

46 com periodontite – 38 isolados + P. gulae 28 saudáveis – 15 isolados + P. gulae

Ativação do Complemento

Fusobacterium

spp.

Hidrofobicidade

Estimulação de Linfócitos

Aderência aos tecidos do hospedeiro (adesinas e fímbrias) Metabólitos tóxicos (H2S) Hemolisinas (alfa e beta)

Fatores de virulência

Patologias associadas

Fusobacterium

spp.

• Abscesso cerebral, meningites, infecções pélvicas,

trato respiratório superior e intra-abdominais.

• Infecções bucais – Gengivite – Periodontite

(7)

Fusobacterium nucleatum

Gengivite ulcero-necrosante (GUN)

Fusobacterium necrophorum

Pododermatite (caprinos e ovinos) Dichelobacter (Bacteroides) nodosus

Fator de virulência Estágio da infecção Cápsula polissacarídica Fímbrias Hemaglutininas Hemolisinas Neuraminidase Fragilisina (Toxina) Cápsula polissacarídica Lipopolissacarídeo Aminas ADESÃO ESTABELECIMENTO DA INFECÇÃO/DANO TECIDUAL ANTIFAGOCITOSE PRODUTO DO METABOLISMO

Principais fatores de virulência de

Bacteroides

Lipopolissacarídeo

Componentes ausentes no LPS

• 2-ceto-3-deoxioctanato (CDO) e heptose – polissacarídeo interno • ácido 3-hidroxi-tetradecanóico – lipídio A

Madigan et al., 2010

(8)

(120.000 X) (27.400 X)

Kasper (1976); Nakano (2006)

Cápsula

B. fragilis - três tipos

reversíveis de cápsula: grande, pequena e camada

eletrodensa (52.000 X) Resistência ao soro Reid e Patrick (1984) Antifagocitose Processo de adesão

Cápsula

Formação de abcessos

Fatores de virulência

Bacteroides

spp

. e Parabacteroides

spp

.

Adesão de

Bacteroides

às células HEp-2

Nakano et al. (2008) Adesão localizada E. coli O127:H6 B. ovatus B. vulgatus B. fragilis

Adesão – Caco-2, WiDr (intestinal)

Padrão de adesão não definido

Invasão de

Bacteroides

e

Parabacteroides

às

células HEp-2

B. fragilis B. vulgatus P. distasonis Microscopia confocal

PI – Iodeto de Propídio (vermelho) Marcador de DNA DiOC – Iodeto diexiloxacarbocianina (verde)

Marcador de membrana celular

Nakano et al. (2008)

Fatores de virulência

Bacteroides

spp

. e Parabacteroides

spp

.

(9)

Adesão de B. fragilis em células HT-29

Pumbwe et al. (2007)

BSC: Sais biliares conjugado BSM: Sais biliares (mistura)

Biofilme de B. fragilis Adesão de B. fragilis em células HT-29 Pumbwe et al. (2007) Pumbwe et al. (2007) Tratada com BSM Tratada com BSC Não tratada Fímbrias Vesículas de membrana externa

Neuraminidase

Neuraminidase (sialidase)

Cliva ácidos siálicos (ácido N-acetil neuramínico)

células eucarióticas - imunoglobulinas

contribuição

Nutrição Aderir, invadir e destruir tecidos

Fatores de virulência

Bacteroides

spp

. e Parabacteroides

spp

.

(10)

Neuraminidase

Eritrócitos + Bactéria (108 cél/ml) + PNA* – lectina de amendoim = Neuraminidase Hemaglutinação

*PeanutArachis hypogae

Nakano et al. (2006)

1 2 3 4 5 6 7 8 bp 648

Detecção do gene

nanH

por Nested-PCR

nanH – apenas a espécie B. fragilis

Nakano et al. (2005)

Produção da neuraminidase e detecção do gene

nanH

em espécies do grupo

B. fragilis

isoladas de fezes

diarréicas (51) e não diarréicas (50)

Neuraminidase

Origem das Bactérias Produção Presença do gene (n) n (%) n (%) Pacientes (51) 42 (82,3) 29 (56,8) Sadios (50) 43 (86) 37 (74) TOTAL (101) 85 (84,1) 66 (65,3) Nakano et al. (2006)

Enterotoxina

Toxina Bacteroides fragilis (ETBF)

Animais (Myers et al., 1984)

Humanos (Myers et al., 1987) Diarréia

Metaloprotease (Moncrief et al., 1995; Obiso et al., 1997) Familia metzincina:

fragilisina

Zinco – estaliza e potencializa Histidina – essencial para o zinco Metionina – integridade da ligação

Populações genéticas de

Bacteroides fragilis

Padrão I (ETBF)

Padrão II (NTBF) Padrão III (NTBF)

Região de 6-kb – BfPAI

Região de 12-kb – Região lateral bft mpII Região de 18-kb

Sears (2001)

(11)

Padrões genéticos

B. fragilis

não

enterotoxigênico (NTBF) de humanos e bezerros

Bactérias Humanos Animais (n) n (%) n (%) NTBF padrão II 33 (62,2) 40 (80) NTBF padrão III 20 (37,7) 10 (20) TOTAL 53 (100) 50 (100)

Oliveira et al., 2005

Teste citotóxico de ETBF em células HT-29/C

1

Controle ETBF

Nakano et al. (2005) Outras linhagens : Caco-2, T84

Mecanismo de ação da toxina

Tight junctions E-caderina BFT Etapa 1 BFT Microvilosidades Zônula de oclusão Zônula de aderência Etapa 2

Citocinas (IL-8) – leucócitos – reação inflamatória – efeito secretor

Etapa 3

Secreção de fluídos

Mecanismo in vivo DIARRÉIA

Sears (2001)

Distribuição mundial de organismos ETBF

associados à diarréia infantil

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18

EUA It ália Bangladesh Calcut á Japão Brasil (SP) Nicaraguá Vietnam Turquia Brasil (MG) Brasil (SP) %

Crianças com diarréia Crianças sem diarréia

(1992) (1994) (1994) (1997) (1999) (2000) (2000) (2005) (2005) (2010) (2011) 294 1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8 190 bp

bft

bft-1

Detecção do gene

bft

(PCR) e subtipo

bft-1

(Multiplex-PCR)

Nakano et al. (2005) Três subtipos: bft-1, bft-2 e bft-3.

(12)

Fatores de virulência

Bacteroides

spp

. e Parabacteroides

spp

.

Inoculação intra-gástrica em camundongos isentos de germes

Colonização e patogenicidade de

B. fragilis

enterotoxigênicos

Nakano et al. (2006)

Alterações histopatológicas do produzidas nos camundongos

Subtipos

Órgãos

Ceco Cólon Fígado

bft-1

Edema moderado e aumento da lâmina própria. Erosão extensiva

e perda da camada superficial epitelial bft-2 Extensiva e proeminente ulcerações. Erosões superficiais.

Edema e aumento das células da lâmina própria

Edema moderado e aumento da lâmina própria

Estrutura lobular preservada sem alterações degenerativas difusas, mas com raros focos de células inflamatórias

Congestão difusa com poucas células inflamatórias

Nakano et al. (2006)

Aspectos histopatológicos do intestino grosso de camundongos

bft-1

bft-2

Não ETBF Nakano et al. (2006)

Fatores de virulência

Sears, (2009)

Fatores de virulência

(13)

Fatores de virulência

Bacteroides

spp

. e Parabacteroides

spp

.

Diversidade genética de ETBF humanos (AP-PCR)

Nakano et al., (2007)

ATCC/GAI: bft-2

Importância clínica e patologias associadas

• Gêneros

Bacteroides

e

Parabacteroides

- microbiota

intestinal - predominantes:

B. vulgatus, P. distasonis e

B. thetaiotaomicron

(1010g/fezes).

• Abscessos e infecções extra-intestinais, sendo

B.

fragilis

a mais frequentemente.

• Infecções intestinais: associação com outros

enteropatógenos – diarréia (ETBF).

Bacteroides fragilis

Fascite Necrosante Peritonite

Abscesso hepático

Conclusões

- Anaeróbios gram-negativos predominantes e

clinicamente mais relevantes - infecções do trato gastro-intestinal;

- São altamente heterogêneos – reclassificação; - Apresentam elevada diversidade genética.

Referências

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