Bastonetes gram-negativos: ecologia,
sistemática e fatores de virulência
Dra. Viviane Nakano
Curso de Pós-Graduação em Microbiologia BMM 5753 – Bacteriologia de Anaeróbios
Introdução
Bactérias anaeróbias gram-negativas
Gênero
Porphyromonas
(assacarolíticos) GêneroPrevotella
(sacarolíticos) GêneroFusobacterium
Gêneros
Bacteroides
/Parabacteroides
GêneroMitsuokella: M. dentalis
Outros gêneros:
Selenomonas
spp.; Centipeda
spp.;
Leptotrichia buccalis.
Caracterização dos microrganismos
• Bacilos anaeróbios estritos • Não esporulados, imóveis
• Produtores de pigmento marrom a negro (alguns) • Necessitam de hemina e menadiona
• Habitantes da microbiota indígena bucal, intestinal e
trato genito-urinário de humanos e animais.
Evolução taxonômica dos anaeróbios pigmentados
Bacterium melaninogenicus (1921) não fermentadores
(1962) fracos fermentadores (1962) fortes fermentadores (1962)
Subespécies assacharolyticus
(1977)
Subespécies
intermedius (1977) melaninogenicusSubespécies (1977) B. assacharolyticus B. endodontalis B. gingivalis (1988) B. melaninogenicus B. denticola B. loeschii (1990) B. intermedius B. corporis (1990)
Gênero Porphyromonas Gênero Prevotella
Gêneros
Porphyromonas
Prevotella
P. assacharolytica P. endodontalis P. gingivalis P. salivosa P. circumdentaria P. canoris P. cangingivalis P. cansulci P. crevioricanis P. gingivicanis P. gulae P. macacae P. leviifracos fermentadores fortes fermentadores
P. corporis P. intermedia (1992) P. nigrescens (1992) P. pallens (1998) P. melaninogenica P. denticola P. loescheii P. tannerae
Espécies de
Porphyromonas
isoladas de humanos e animais Humanos Animal P. asaccharolytica P. endodontalis P. gingivalis P. catoniae P. cangingivalis P. canoris P. cansulci P. circumdentaria P. crevioricanis P. gingivicanis P. levii P. macacae P. gulae P. levii-like organisms P. endodontalis-like organisms Jousimies-Somer (1997)Prevotella
: Espécies pigmentadas e não pigmentadasPigmentados P. corporis P. denticola P. intermedia P. melaninogenica P. nigrescens P. tannera Não Pigmentados P. bivia P. buccae P. buccalis P. disiens* P. heparinolytica** P. oralis P. oris P. oulorum P. veroralis P. enoeca P. zoogleoformans** * UV vermelho-amarelado ** Reagrupados no gênero Bacteroides
Jousimies-Somer (1997).
Prevotella
spp
. e Porphyromonas
spp
.
Cultura pura
Porphyromonas
spp
.
Fluorescência
Prevotella
spp
. e Porphyromonas
spp
.
Coloração de Gram
Gênero
Fusobacterium
spp.
F. alocisF. necrophorum subsp. funduliforme F. necrophorum subsp. necrophorum F. nucleatum subsp. animalis F. nucleatum subsp. fusiformis F. nucleatum subsp. nucleatum F. nucleatum subsp. polymorphum F. nucleatum subsp. vicentii F. varium
Fusobacterium spp.
Cultura Pura Ágar Omata-Disraely
Fusobacterium spp.
Coloração de Gram
Família
Bacteroidaceae
- Gênero
Bacteroides
Produtores de pigmento negro
Não produtores de pigmento negro
Assacarolíticos Sacarolíticos Bile-sensíveis Bile-resistentes
Gênero Porphyromonas Gênero Prevotella B. capillosus Espécies intestinais: Bacteroides fragilis Sacarolíticos Shah e Collins (1989) B. melaninogenicus
Shah (1992); Garrity e Holt (2001) Porphyromonadaceae
Prevotellaceae
Família
Bacteroidaceae
- Gênero
Bacteroides
Bacteroides fragilis
(Grupo?)
Parabacteroides
(
distasonis e merdae)
Bacteroides gracilis
(Campylobacter gracilis)Bacteroides forsythus
(Tannerella forsythia)Bacteroides ureolyticus
Bacteroides capillosus
Gêneros
Bacteroides
e
Parabacteroides
Bacteroidaceae
Bacteroides
Bacteroides fragilis
B. fragilis, B. vulgatus, B. ovatus, B. uniformis, B. caccae, B. thetaiotaomicron, B. eggerthii, B. stercoris.
Família Gênero Grupo
Espécies
Novas espécies do gênero
Bacteroides
Song et al. (2004) Bacteroides nordii Bacteroides salyersae Kitahara et al. (2005) Bacteroides plebeius Bacteroides coprocola Fenner et al. (2005) Bacteroides massiliensis* Song et al. (2005) Bacteroides goldsteinii Bakir et al. (2006) Bacteroides intestinalis Bacteroides dorei Bacteroides finegoldii * Isolado de sangue de recém-nascidoSong et al. (2004)
Bakir et al. (2006) Sakamoto & Benno (2006)
Novo gênero
Parabacteroides
Meio BBE
Bacteroides fragilis
Bacteroides fragilis
Coloração de Gram
Grupo
Bacteroides fragilis
Ecologia
Reguladores da Microbiota Intestinal e Bucal Autóctone
Produção de substâncias antagonistas
Bacteriocina
Auto-antagonismo Iso-antagonismo Hetero-antagonismo
Microbiota Intestinal Água contaminada (esgoto) Abscessos Sangue Feridas cirúrgicas Humanos Animais Microbiota Bucal Prevotella spp. Porphyromonas spp. Fusobacterium spp. Bacteroides spp. Prevotella spp. Porphyromonas spp. Fusobacterium spp.
Fatores de virulência e
Patologias associadas
BACTÉRIAS TRABALHANDOFatores de virulência
Adesinas* Cápsula Colagenase Protease
Edema e acúmulo de neutrófilos no sítio da infecção
Prevotella
spp
. e Porphyromonas
spp
.
Prevotella
spp
. e Porphyromonas
spp
.
Patologias associadas
• Abscesso cerebral, infecções de cabeça e pescoço
e endocardites • Infecções bucais – Gengivite – Periodontite – Infecções endodônticas
Periodontite
Prevotella
spp
. e Porphyromonas
spp
.
Prevotella
spp
. e Porphyromonas
spp
.
Periodontite canina
Porphyromonas
spp
. -
animal
46 com periodontite – 38 isolados + P. gulae 28 saudáveis – 15 isolados + P. gulae
Ativação do Complemento
Fusobacterium
spp.Hidrofobicidade
Estimulação de Linfócitos
Aderência aos tecidos do hospedeiro (adesinas e fímbrias) Metabólitos tóxicos (H2S) Hemolisinas (alfa e beta)
Fatores de virulência
Patologias associadas
Fusobacterium
spp.
• Abscesso cerebral, meningites, infecções pélvicas,
trato respiratório superior e intra-abdominais.
• Infecções bucais – Gengivite – Periodontite
Fusobacterium nucleatum
Gengivite ulcero-necrosante (GUN)
Fusobacterium necrophorum
Pododermatite (caprinos e ovinos) Dichelobacter (Bacteroides) nodosus
Fator de virulência Estágio da infecção Cápsula polissacarídica Fímbrias Hemaglutininas Hemolisinas Neuraminidase Fragilisina (Toxina) Cápsula polissacarídica Lipopolissacarídeo Aminas ADESÃO ESTABELECIMENTO DA INFECÇÃO/DANO TECIDUAL ANTIFAGOCITOSE PRODUTO DO METABOLISMO
Principais fatores de virulência de
Bacteroides
Lipopolissacarídeo
Componentes ausentes no LPS
• 2-ceto-3-deoxioctanato (CDO) e heptose – polissacarídeo interno • ácido 3-hidroxi-tetradecanóico – lipídio A
Madigan et al., 2010
(120.000 X) (27.400 X)
Kasper (1976); Nakano (2006)
Cápsula
B. fragilis - três tipos
reversíveis de cápsula: grande, pequena e camada
eletrodensa (52.000 X) Resistência ao soro Reid e Patrick (1984) Antifagocitose Processo de adesão
Cápsula
Formação de abcessosFatores de virulência
Bacteroides
spp
. e Parabacteroides
spp
.
Adesão de
Bacteroides
às células HEp-2
Nakano et al. (2008) Adesão localizada E. coli O127:H6 B. ovatus B. vulgatus B. fragilis
Adesão – Caco-2, WiDr (intestinal)
Padrão de adesão não definido
Invasão de
Bacteroides
e
Parabacteroides
às
células HEp-2
B. fragilis B. vulgatus P. distasonis Microscopia confocalPI – Iodeto de Propídio (vermelho) Marcador de DNA DiOC – Iodeto diexiloxacarbocianina (verde)
Marcador de membrana celular
Nakano et al. (2008)
Fatores de virulência
Bacteroides
spp
. e Parabacteroides
spp
.
Adesão de B. fragilis em células HT-29
Pumbwe et al. (2007)
BSC: Sais biliares conjugado BSM: Sais biliares (mistura)
Biofilme de B. fragilis Adesão de B. fragilis em células HT-29 Pumbwe et al. (2007) Pumbwe et al. (2007) Tratada com BSM Tratada com BSC Não tratada Fímbrias Vesículas de membrana externa
Neuraminidase
Neuraminidase (sialidase)Cliva ácidos siálicos (ácido N-acetil neuramínico)
células eucarióticas - imunoglobulinas
contribuição
Nutrição Aderir, invadir e destruir tecidos
Fatores de virulência
Bacteroides
spp
. e Parabacteroides
spp
.
Neuraminidase
Eritrócitos + Bactéria (108 cél/ml) + PNA* – lectina de amendoim = Neuraminidase Hemaglutinação*PeanutArachis hypogae
Nakano et al. (2006)
1 2 3 4 5 6 7 8 bp 648
Detecção do gene
nanH
por Nested-PCR
nanH – apenas a espécie B. fragilis
Nakano et al. (2005)
Produção da neuraminidase e detecção do gene
nanH
em espécies do grupoB. fragilis
isoladas de fezesdiarréicas (51) e não diarréicas (50)
Neuraminidase
Origem das Bactérias Produção Presença do gene (n) n (%) n (%) Pacientes (51) 42 (82,3) 29 (56,8) Sadios (50) 43 (86) 37 (74) TOTAL (101) 85 (84,1) 66 (65,3) Nakano et al. (2006)
Enterotoxina
Toxina Bacteroides fragilis (ETBF)Animais (Myers et al., 1984)
Humanos (Myers et al., 1987) Diarréia
Metaloprotease (Moncrief et al., 1995; Obiso et al., 1997) Familia metzincina:
fragilisina
Zinco – estaliza e potencializa Histidina – essencial para o zinco Metionina – integridade da ligação
Populações genéticas de
Bacteroides fragilis
Padrão I (ETBF)
Padrão II (NTBF) Padrão III (NTBF)
Região de 6-kb – BfPAI
Região de 12-kb – Região lateral bft mpII Região de 18-kb
Sears (2001)
Padrões genéticos
B. fragilis
não
enterotoxigênico (NTBF) de humanos e bezerros
Bactérias Humanos Animais (n) n (%) n (%) NTBF padrão II 33 (62,2) 40 (80) NTBF padrão III 20 (37,7) 10 (20) TOTAL 53 (100) 50 (100)
Oliveira et al., 2005
Teste citotóxico de ETBF em células HT-29/C
1Controle ETBF
Nakano et al. (2005) Outras linhagens : Caco-2, T84
Mecanismo de ação da toxina
Tight junctions E-caderina BFT Etapa 1 BFT Microvilosidades Zônula de oclusão Zônula de aderência Etapa 2
Citocinas (IL-8) – leucócitos – reação inflamatória – efeito secretor
Etapa 3
Secreção de fluídos
Mecanismo in vivo DIARRÉIA
Sears (2001)
Distribuição mundial de organismos ETBF
associados à diarréia infantil
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
EUA It ália Bangladesh Calcut á Japão Brasil (SP) Nicaraguá Vietnam Turquia Brasil (MG) Brasil (SP) %
Crianças com diarréia Crianças sem diarréia
(1992) (1994) (1994) (1997) (1999) (2000) (2000) (2005) (2005) (2010) (2011) 294 1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8 190 bp
bft
bft-1
Detecção do gene
bft
(PCR) e subtipo
bft-1
(Multiplex-PCR)
Nakano et al. (2005) Três subtipos: bft-1, bft-2 e bft-3.
Fatores de virulência
Bacteroides
spp
. e Parabacteroides
spp
.
Inoculação intra-gástrica em camundongos isentos de germes
Colonização e patogenicidade de
B. fragilis
enterotoxigênicos
Nakano et al. (2006)
Alterações histopatológicas do produzidas nos camundongos
Subtipos
Órgãos
Ceco Cólon Fígado
bft-1
Edema moderado e aumento da lâmina própria. Erosão extensiva
e perda da camada superficial epitelial bft-2 Extensiva e proeminente ulcerações. Erosões superficiais.
Edema e aumento das células da lâmina própria
Edema moderado e aumento da lâmina própria
Estrutura lobular preservada sem alterações degenerativas difusas, mas com raros focos de células inflamatórias
Congestão difusa com poucas células inflamatórias
Nakano et al. (2006)
Aspectos histopatológicos do intestino grosso de camundongos
bft-1
bft-2
Não ETBF Nakano et al. (2006)Fatores de virulência
Sears, (2009)Fatores de virulência
Fatores de virulência
Bacteroides
spp
. e Parabacteroides
spp
.
Diversidade genética de ETBF humanos (AP-PCR)
Nakano et al., (2007)
ATCC/GAI: bft-2
Importância clínica e patologias associadas
• Gêneros
Bacteroides
eParabacteroides
- microbiotaintestinal - predominantes:
B. vulgatus, P. distasonis e
B. thetaiotaomicron
(1010g/fezes).• Abscessos e infecções extra-intestinais, sendo
B.
fragilis
a mais frequentemente.• Infecções intestinais: associação com outros
enteropatógenos – diarréia (ETBF).
Bacteroides fragilis
Fascite Necrosante Peritonite
Abscesso hepático
Conclusões
- Anaeróbios gram-negativos predominantes e
clinicamente mais relevantes - infecções do trato gastro-intestinal;
- São altamente heterogêneos – reclassificação; - Apresentam elevada diversidade genética.