SISTEMAS ISOENZIMÁTICOS NA CARACTERIZAÇÃO DE
RIZOBACTERIAS
ISOZYMES ANALYSIS SYSTEMS IN CHARACTERIZATION
OF RHIZOBACTERIA
Gabriela Cabral Fernandes(1 )
Nathalia Longanezi(2 )
Eliamar Aparecida Nascimbem Pedrinho(3)
João Carlos Campanharo(4 )
Jackson Antônio Marcondes de Souza(5)
Resumo
O estudo de micro-organismos endofíticos é de grande importância devido à falta de informações para a elucidação da base biológica das interações endófitos-plantas. A utilização das isoenzimas tem desempenhado papel importante na caracterização e identificação das linhagens. Este trabalho teve por objetivo a caracterização por meio das enzimas alfa-esterase, superóxido dismutase, álcool desidrogenase e glicose-6-fosfato desidrogenase, de isolados bacterianos da rizosfera de plantas de milho cultivadas em diferentes solos brasileiros. Os sistemas enzimáticos apresentaram uma expressão maior das enzimas -esterase e superóxido dismutase nos isolados. Para todos os marcadores bioquímicos, o padrão foi polimórfico.
Palavras chave: Bactérias promotoras do crescimento de plantas; Caracterização
bioquímica; Polimorfismo; Zea mays
Abstract
The study of endophytic microorganisms is very important due to the lack of information for the elucidation of the biological basis of endophyte-plant interactions. The use of isoenzymes have played an important role in the characterization and identification of various species, especially from individuals belonging to the same species as in the case of strains. This work aimed at the characterization by means of alpha-esterase enzymes, superoxide dismutase, alcohol dehydrogenase and glucose-6-phosphate dehydrogenase in bacteria isolated from the rhizosphere of maize plants grown in different Brazilian soils enzyme systems showed an expression most of enzymes - esterase and superoxide dismutase in the isolates. For all biochemical markers, the standard was polymorphic.
Keywords: Plant growth-promoting bacteria; Biochemistry characterization; Polymorphism;
Zea mays
1 Doutoranda em Microbiologia Agropecuária na FCAV-UNESP. gfernandes1403@gmail.com
2 Graduada em Ciências Biológicas no Centro Universitário de Araraquara – UNIARA. nalonganezi@yahoo.com.br 3 Pós doutora em Microbiologia Agropecuária na FCAV-UNESP. eliamar.pedrinho@gmail.com
4 Doutor em Microbiologia Agropecuária na FCAV-UNESP. jccamp@fcav.unesp.br 5 Professor Assistente Doutor na FCAV-UNESP. jackson@fcav.unesp.br
1 Introdução
O milho (Zea mays), originário nas Américas, é provavelmente a planta mais importante comercialmente devido às diversas formas de sua utilização, que vai desde a alimentação animal até a indústria de alta tecnologia. Há indícios de que sua origem tenha sido no México, América Central e sudoeste dos Estados Unidos.
Dentro da evolução mundial de produção de milho, o Brasil tem se destacado como o terceiro maior produtor, perdendo apenas para os Estados Unidos e China. No site do Ministério da Agricultura (http://www.agricultura.gov.br/vegetal/culturas/milho), há uma previsão de que em 2019/2020, a produção deverá ficar em 70,12 milhões de toneladas e o consumo em 56,20 milhões de toneladas. Esses resultados indicam que o Brasil deverá fazer ajustes no seu quadro de suprimentos para garantir o abastecimento do mercado interno e obter excedente para exportação.
As rizobactérias, pelo fato de facilitar na captação de recursos tais como nitrogênio, fósforo e minerais essenciais; auxiliar na modulação dos níveis hormonais; diminuir o efeito inibitório de diversos agentes patogênicos, atuando no biocontrole, promove o crescimento do vegetal (AHEMAD e KIBRET, 2014). Esses fatores diminuem os gastos na produção e os impactos nos ecossistemas.
A análise isoenzimática além de ser uma técnica rápida, fidedigna e de custo relativamente baixo e possui várias aplicações para o melhoramento vegetal e na caracterização do perfil de diferentes estirpes. O termo isoenzima faz referência às diferentes formas moleculares (alelos) que uma determinada enzima pode apresentar, mas reagem sempre com o mesmo substrato (MARKET e MOLLER, 1959).
Fernandes et al (2015), utilizaram com eficiência a enzima .-esterase para caracterização de bactérias isoladas da torta de filtro.
Diante do exposto, esse trabalho teve por objetivo a caracterização de isolados bacterianos da rizosfera de plantas de milho cultivadas em diferentes solos brasileiros por meio das enzimas alfa-esterase, superóxido dismutase, álcool desidrogenase e glicose-6-fosfato desidrogenase.
2 Material e Métodos
2.1 Cultivo e crescimento bacteriano
Os isolados bacterianos previamente identificados no estudo de Pedrinho et al, 2010, encontravam-se armazenados em ultrafreezer à -80°C, no Laboratório de Bioquímica de Microrganismos e Plantas, no Departamento de Tecnologia, da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias (FCAV), Câmpus de Jaboticabal-SP. Esses foram cultivados em meio DYGS (RODRIGUES NETO et al, 1986), por 48 horas e posteriormente as células desenvolvidas foram lavadas com solução salina (NaCl 0,85%) e centrifugadas à 4ºC, à 16.266 x g, durante 30 minutos por duas vezes para remoção do meio de cultura. Dessa suspensão bacteriana, 4 ml foram centrifugados durante 5 minutos e os “pellets” obtidos foram utilizados para extração das isoenzimas.
2.2 Extração de isoenzimas
As células centrifugadas ou “pellets”, já em temperatura ambiente, foram ressuspendidas em 0.5 ml de tampão de extração (Tabela 1), seguidas de centrifugação a 16.000 x g durante 5 minutos (Centrifuga Micco – spin I) e ressuspendidas em 0.5 ml do mesmo tampão, contendo 1 mg/ml de lisozima. Em seguida, foram incubadas durante 10 minutos à temperatura ambiente, centrifugadas novamente nas condições descritas e, posteriormente, ressuspendidas em 0,5 ml de tampão de sonicação (Tabela 2). As amostras foram sonicadas (banho de gelo) em sonicador Branson Sonifer mod. 250 acoplado de micro tip, durante 5 minutos [com duty cycle 10 e output 5 (20W)]. Após centrifugadas a 16.000 x g, à 4ºC durante 20 minutos, o sobrenadante foi coletado (isoenzimas), para posterior análise eletroforética.
Tabela 1- Solução tampão de extração (quantidade suficiente para 100 ml) Componente Quantidade Acetato de Magnésio 5mM 0,1g Glicerol a 15% 15 g 2-Mercaptoetanol 0,1% 100 µl Tris - HCl 0,1M 1,21g pH 7,2
Tabela 2- Solução tampão de sonicação (quantidade suficiente para 100 ml) Componente Quantidade Glicerol 15% 15 g Tris – HCl 0,1M 1,21 g pH 8,8
2.3 Eletroforese em gel de poliacrilamida
Para a eletroforese das isoenzimas em gel de poliacrilamida, foram utilizados géis de separação (Tabela 3) a 10%, de concentração (Tabela 4) a 5%, preparados e montados entre placas de vidro de 105 x 80 mm, com espaçador de 1 mm. No processo eletroforético, foram utilizadas cubas especiais “Sigma – Chemical C.O.” preenchidas com tampão de corrida (Tabela 5). A eletroforese foi realizada em câmara fria sob corrente de 500 mA à 200V, durante aproximadamente cinco horas e no gel foram aplicados cerca de 25 ul de isoenzima referente a cada amostra.
Tabela 3- Solução gel de separação a 10%
Componente Quantidade Tris – HCl 2,25M 4,90 ml Acrilamida: Bis Acrilamida 9,80 ml Temed 40 µl Persulfato de Amônio a 10% 350 µl Água 14,95 ml pH 8,8 Tabela 4- Solução gel de concentração a 5%
Componente Quantidade Tris 0,5M 4,0 ml Acrilamida: Bis Acrilamida 2,66 ml Temed 30 µl Persulfato de Amônio a 10% 150 µl Água 9,20 ml pH 6,8
Tabela 5- Solução tampão de corrida (quantidade suficiente para um litro) Componente Quantidade Glicina 0,096M 7,1 g Tris – HCl 0,0125M 1,5 g pH 7,9
2.4 Detecção isoenzimática
A revelação das bandas das isoenzimas nos géis (um para cada enzima) foi realizada segundo as metodologias descritas por Pasteur et al (1988) e Alfenas et al (1991), a seguir.
2.4.1 Alfa-esterase
• Tampão fosfato 0,1M – 100 ml (pH 6,2) • Fast Blue (0,12g) – 100 ml
• Alfa – nafitilacetato – 70 mg
Foi misturado o Fast Blue e Alfa-nafitilacetato, agitado rigorosamente e colocado no gel juntos. O tempo de coloração variou de 30 a 40 minutos (PASTEUR et al, 1988).
2.4.2 Álcool desidrogenase (ADH) (EC.1.1.1.1)
Foi incubado o gel em 50 ml de tampão Tris – HCl 0,2M (pH 8,0), contendo:
• MgCl2 0,5M – 02 ml
• Etanol (95%) – 3 ml
• NAD (1% em H2O) – 2 ml
• MTT (1%em H2O) – 0,3 ml
• PMS (1%em H2O) – 0,5 ml
A coloração foi mantida no escuro por aproximadamente 60 minutos (PASTEUR et al, 1988).
2.4.3 Glicose -6- fosfato desidrogenase (G6PDH) (EC.1.1.1.49) Os géis foram incubados em 40 ml de tampão Tris – HCl 0,2M (pH 8,0), contendo:
• Glicose – 6 – fosfato – 80 mg • NADP (1% em H2O) – 1,6 ml • NBT (1% em H2O) – 1 ml • MTT (1% em H2O) – 1 ml • PMS (1% em H2O) – 2,4 ml • MgCl2 0,5M – 16 ml
O gel foi mantido em ausência de luz por aproximadamente 30 minutos (PASTEUR et al, 1988).
2.4.4 SOD – Superóxido dismutase (EC.1.15.1.1)
• Tris – HCl 0,05M – 100 ml (pH 8,5) • EDTA Na2 – 300 mg
• Riboflavina – 4 mg
• MTT – 1 ml (1% em H2O)
O EDTA foi agitado ate dissolução por 30 minutos, já que a solubilidade no tampão é lenta. Já a riboflavina foi agitada até dissolução por 10 minutos. Foi acrescentado o MTT lentamente, transferido para um recipiente de vidro com o gel, sendo agitado por aproximadamente 3 minutos e mantido em repouso sob luz (ALFENAS et al, 1991).
2.5 Análise dos resultados
2.5.1 Comparação dos perfis eletroforéticos das isoenzimas
A avaliação das estirpes foi feita através da análise visual dos perfis de bandas obtidos após a eletroforese. Os parâmetros utilizados na avaliação e diferenciação dos géis foram baseados na intensidade e na ausência ou presença de bandas, onde foi conferido o parâmetro 1 para a presença de banda e 0 para a ausência de banda, permitindo a elaboração de uma matriz binária. Essa matriz foi utilizada para a construção de um filograma pelo “software” FreeTree Win 95/98/NT (HAMPL et al., 2001). A similaridade genética entre os acessos foi estimada pelo coeficiente de distância descrito por Nei (1986). Para o agrupamento dos dados da matriz filogenética foi utilizado o método da média das distâncias genéticas (UPGMA-Unweighted Pair Group Method for Arithmetic Averages) (SNEATH & SOKAL, 1973), sendo que, o filograma foi obtido com o auxílio do “software” TreeView (PAGE, 1996).
3 Resultados e Discussão
O meio DYGS, mesmo não sendo apropriado para o isolamento de diazotróficos, foi utilizado por ser um meio rico, de crescimento rápido e forneceu quantidade satisfatória de células.
A presença das enzimas é caracterizada pela presença ou ausência de bandas verificada nos géis. A caracterização isoenzimática desses isolados bacterianos possibilitou também, avaliar a similaridade entre eles.
Nas figuras a seguir, os números de 1 a 20 correspondem aos isolados rizosféricos sequenciados parcialmente pelo gene 16S rRna, citados a seguir na Tabela 6.
Tabela 6- Identificação dos isolados sequenciados parcialmente pelo gene 16S rRNA (PEDRINHO et al, 2010).
Nome dos isolados Blast
1) R1.3 Sphingobium sp 2) R1.4 Sphingomonas sp 3) R2.2 Azospirillum sp 4) R2.5 Bacillus sp 5) R2.6 Burkholderia sp 6) R2.11 Rhodoferax sp 7) R2.13 Sphingobium sp 8) R2.15 Não identificado 9) R2.16 Pantoea sp 10) R2.17 Azospirillum sp 11) R2.19 Labrys sp 12) R2.20 Bacillus sp 13) R2.22 Burkholderia sp 14) R2.31 Ralstonia sp 15) R3.21 Burkholderia sp 16) R3.25 Burkholderia sp 17) R4.1 Sphingomonas sp 18) R4.2 Bacillus sp 19) S2.3 Ralstonia sp 20) S3.2 Burkholderia sp 3.1 Sistemas isoenzimáticos
A utilização das isoenzimas tem desempenhado papel importante na caracterização e identificação de diversas espécies, principalmente dos indivíduos pertencentes a uma mesma espécie, como no caso das variedades. De maneira simplificada, as isoenzimas podem ser consideradas variações de uma dada enzima dentro de um organismo, que apresentam uma
mesma especificidade de substrato. Assim sendo, a variação específica em número, composição e atividade das isoenzimas em cada sistema enzimático, permite a diferenciação entre variedades (LARSEN, 1969).
Figura 1- Sistema isoenzimático Alfa-esterase.
Figura 2- Sistema isoenzimático Superóxido dismutase
As funções de cada enzima variam, sendo as esterases enzimas capazes de hidrolisar ligações do tipo éster de uma grande variedade de substratos, sendo classificadas em A-esterases, B-esterases e C-esterases (BASTOS, 2001). No caso da superóxido dismutase, é
uma enzima de natureza antioxidante, própria à neutralização dos radicais livres de origens metabólicas.
Figura 3- Sistema isoenzimático Álcool desidrogenase
A enzima álcool desidrogenase é uma das principais enzimas fermentativas, que converte o acetaldeído em etanol, considerado menos tóxico à planta do que o acetaldeído e por ser translocado para fora da célula, inclusive para rizosfera (BADINELLI et al, 2008). Figura 4- Sistema isoenzimático Glicose-6-Fosfato Desidrogenase
A glicose-6-fosfato desidrogenase (G6PDH) é uma enzima amplamente distribuída na natureza, sendo encontrada em quase todos os tecidos de origem animal e vegetal e em células de microrganismos (LEVY, 1988).
No sistema da enzima Superóxido Dismutase, os isolados R-2.16 com o R-3.21 e R-3.25 apresentaram 80% de similaridade, permanecendo dentro do mesmo subgrupo da R-1.4 e R-2.22, que apresentaram similaridade de 67%. Ainda dentro do mesmo subgrupo, o isolado R-3.25 e R-3.21, apresentaram 50% de similaridade entre eles.
Considerando outro subgrupo, os isolados R-2.19 e R-2.6 apresentaram 57% de similaridade, enquanto que o isolado R-2.19 e R-2.5 apresentaram 40% e, R-2.5 e R-2.6, uma similaridade de 50%. Figura 5- Dendrograma de similaridade para o sistema enzimático Superóxido Dismutase
No sistema da enzima Alfa-esterase, a similaridade atingida foi de 50% entre os isolados R-2.11 com S-3.2 e, R-2.13 com R-2.22, ambas presentes no mesmo grupo, porém em subgrupos diferentes. Entre os isolados R-2.6 com R-4.2 e, R-2.16 com R-2.20, a similaridade foi de 46%, presentes em subgrupos diferentes. Já entre os isolados R-2.2 com R-2.3, a similaridade foi de 42% e, entre R-2.15 com R-4.1 foi de 40% entre eles, estando ambos em subgrupos diferentes novamente.
No sistema da enzima Álcool Desidrogenase, os isolados R-2.16 e S-3.2, apresentaram nível de similaridade de 67%, sendo que os isolados R-2.22 com R-2.5 e R-2.17 com R-3.21, obtiveram similaridade de 50% entre eles. Dentre os isolados R-2.11 com R-2.20, a similaridade foi de 44% e, entre R-2.6 com R-4.2, de 40% entre eles.
Figura 6- Dendrograma de isoenzimas para o sistema enzimático Alfa-esterase
Figura 7- Dendrograma de isoenzimas para o sistema enzimático Álcool desidrogenase
Para a Glicose-6-fosfato desidrogenase, o nível de similaridade chegou a 100% entre R-1.3 com R-2.6 e, R-4.1 com S-3.2, ocupando estas subgrupos diferentes. Dentre os outros isolados, o nível de similaridade foi de 50% entre 2.16 com 2.20, 1.4 com 4.2 e R-2.19 com R-2.2, e de 40% entre R-2.11 com R-2.31 e R-2.13 com R-3.25.
Figura 8- Dendrograma de isoenzimas para o sistema enzimático Glicose-6-fosfato desidrogenase
4 Conclusão
Analisado os sistemas enzimáticos, pode-se afirmar que em todos foram constatadas presença de bandas, mostrando a presença das enzimas nos isolados testados, bem como, uma maior porcentagem para as enzimas Alfa-esterase e Superóxido dismutase. Quanto ao nível de similaridade, a Glicose-6-fosfato desidrogenase e a Álcool desidrogenase, apresentaram um maior índice comparada às outras, com similaridade de até 100% entre os isolados testados. Em todos os marcadores bioquímicos, o padrão foi polimórfico.
5 Apoio Financeiro
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES).
Referências
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