UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS INSTITUTO DE QUÍMICA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA
Desenvolvimento de biossensores enzimáticos utilizando
tecidos de fruto de lobeira (Solanum lycocarpum), guariroba
(Sygarus oleracea Becc) e manga (Mangifera indica) aplicados
à determinação de paracetamol
Ramon Silva Vilela
Orientador: Flávio Colmati Júnior Co-orientadora: Kátia Flávia Fernandes
Universidade Federal De Goiás Instituto De Química
Programa de Pós-Graduação em Química
Desenvolvimento de biossensores enzimáticos utilizando tecidos de fruto de lobeira (Solanum lycocarpum), guariroba (Sygarus oleracea Becc) e manga
(Mangifera indica) aplicados à determinação de paracetamol
Discente: Ramon Silva Vilela Orientador: Flávio Colmati Júnior
Co-orientadora: Kátia Flávia Fernandes
GOIÂNIA – FEVEREIRO DE 2019
Tese de doutorado apresentada ao Instituto de Química da Universidade Federal de Goiás como exigência parcial, para a obtenção do título de Doutor em Química.
Sumário
LISTA DE FIGURAS... i
LISTA DE TABELAS ... iv
LISTA DE ABREVIATURAS OU SIGLAS... v
LISTA DE SÍMBOLOS ... vi
RESUMO ... vii
ABSTRACT ... viii
1. INTRODUÇÃO ... 1
1.1. Paracetamol: Histórico e usos ... 1
1.2. O paracetamol como poluente emergente ... 5
1.3. Biossensores ... 8 1.4. Biossensores enzimáticos ... 9 1.5. Oxidorredutases... 10 1.6. Peroxidases ... 11 1.7. Polifenoloxidases ... 13 1.8. Guariroba ... 14 1.9. Lobeira ... 16 1.10. Manga... 18
1.11. Eletrodos de pasta de carbono ... 20
2. JUSTIFICATIVA E OBJETIVOS ... 22
3. EXPERIMENTAL ... 23
3.1. Reagentes, soluções e instrumentação. ... 23
3.2. Obtenção do material vegetal ... 24
3.3. Preparo dos biossensores ... 24
3.4.1. Caracterização Eletroquímica dos biossensores ... 27
3.4.2. Estimativa da área eletroativa ... 27
3.4.3. Perfil eletroquímico de solução de paracetamol ... 27
3.4.4. Estudo do tempo de incubação ... 28
3.4.5. Concentração ótima de H2O2... 28
3.4.6. Avaliação do pH ótimo de operação ... 28
3.4.7. Otimização da porcentagem de tecido vegetal nos biossensores 28 3.4.8. Otimização dos parâmetros eletroquímicos de análise ... 29
3.4.9. Construção das curvas analíticas ... 29
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 29
4.1. Caracterização Eletroquímica dos biossensores ... 30
4.2. Estimativa da área eletroativa ... 32
4.3. Perfil eletroquímico de solução de paracetamol ... 36
4.4. Estudo do tempo de incubação... 41
4.5. Concentração ótima de H2O2 ... 42
4.6. Otimização da porcentagem de tecido vegetal nos biossensores. . 44
4.7. Avaliação do pH ótimo de operação ... 47
4.8. Otimização dos parâmetros de análise. ... 48
4.8.3. Incremento da onda ... 52
4.9. Construção das curvas analíticas ... 53
5. CONCLUSÕES ... 56
i LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Reações envolvidas nas vias metabólicas do paracetamol _____ 3 Figura 2 – Representação esquemática de um biossensor _____________ 9 Figura 3 - Ciclo catalítico da enzima peroxidase ____________________ 12 Figura 4 - Ciclo catalítico das enzimas polifenoloxidases _____________ 13 Figura 5 – Bainhas de guariroba descartadas em feira livre ___________ 15 Figura 6 – Fotografia de uma árvore de lobeira no município de Goiânia - GO __________________________________________________________ 16 Figura 7 – Fotografias de flor e fruto de lobeira _____________________ 17 Figura 8 – Fotografia de uma amêndoa de manga __________________ 19 Figura 9 – Representação esquemática da construção de um eletrodo de pasta de carbono quimicamente modificado com tecido vegetal. _______ 21 Figura 10 – Procedimento de obtenção dos tecidos vegetais desidratados 25 Figura 11 – (Da esquerda para direita) Tecidos vegetais de polpa de lobeira, bainha de guariroba e amêndoa de manga desidratados. _____________ 25 Figura 12 – (esquerda) Voltamogramas cíclicos obtidos em tampão fosfato 0,1 mol L-1, pH 6,5 = 200 mV s-1, entre -0,2 e 0,8 V, (direita) primeiro e décimo
voltamogramas das análises ___________________________________ 30 Figura 13 – (Esquerda) voltamogramas cíclicos para a espécie K3Fe(CN)6 1,0
mmol L-1 em KCl 0,1 mol L−1 , = 10 - 100 mVs-¹ de -0,2 a +0,8 V. (Direita)
Gráficos de Ipc e Ipa vesrus 1/2 ________________________________ 33
Figura 14 - gráficos de log (Ip) vs log ( ) para os biossensores de guariroba, lobeira e manga _____________________________________________ 34 Figura 15 - Voltamogramas cíclicos entre -0,2 a + 0,8 V e = 50 mVs-1 (a):
Branco EPC; (b): Branco biossensores; (c): análise de solução 0,05 mmol L -1 de paracetamol no EPC; (d) análise para solução 0,5 mmol L-1nos
biossensores. _______________________________________________ 36 Figura 16 – reações envolvidas na determinação eletroquímica do paracetamol ________________________________________________ 37 Figura 17 - (esquerda) – Voltamogramas cíclicos de solução paracetamol 0,5
ii
mmol l-1 entre -0,2 a +0,8 V para os biossensores com = 20- 140 mV s-1
[Gráfico inserido: Relação entre Ip versus ¹/². (DIREITA) – Relação entre log
Ip e log para os considerando as correntes catódica e anódica._______ 39 Figura 18 – (Esquerda) Voltamogramas cíclicos obtidos no estudo de tempo de incubação minutos na análise de solução paracetamol 0,05 mmol L-1, entre
-0,2 a + 0,8 V, = 50 mVs-1; (Direita) – respostas relativas encontradas para
o estudo de tempo de incubação. _______________________________ 41 Figura 19 – (Esquerda) - Voltamogramas cíclicos obtidos na determinação da concentração ótima de H2O2 para análise de paracetamol 0,05 mmol L-1 , =
50 mV s-1 entre -0,2 e +0,8 V. (Direita) – Gráficos do valor de corrente catódica
em função da concentração de H2O2. ____________________________ 43
Figura 20 – (Esquerda) voltamogramas cíclicos de solução de paracetamol 0,5 mmol L-1, = 50 mV s-1 entre -0,2 e +0,8 V. (Direita) – Respostas relativas
obtidas no experimento de otimização da concentração de material vegetal. __________________________________________________________ 44 Figura 21 - voltamogramas cíclicos obtidos no experimento de determinação do pH ótimo de operação, = 50 mV s-1 com janela de potencial entre -0,2 e
+0,8 V. ____________________________________________________ 47 Figura 22 - Voltamogramas de onda quadrada do experimento de otimização d a frequência para solução de paracetamol 0,05 mmol L-1 A= 50 mV, I= 5 mV,
janela de potencial entre -0,2 e +1,0V. ___________________________ 49 Figura 23 - Voltamogramas de onda quadrada do experimento de otimização da amplitude de pulso para solução de paracetamol 0,05 mmol L-1 F=50 Hz
I=5 mV, janela de potencial entre -0,2 e+1,0 V. _____________________ 51 Figura 24 - Voltamogramas de onda quadrada do experimento de incremento de onda para solução de paracetamol 0,05 mmol L-1 F=50 Hz A=50 mV, janela
de potencial entre -0,2 e + 1,0 V. _______________________________ 52 Figura 25 - (ESQUERDA) Voltamogramas de onda quadrada para soluções de paracetamol em diferentes concentrações, f = 40Hz, I = 4 mV e A = 100 mVs-1 utilizando o biossensor de guariroba (DIREITA) – Curva analítica para
iii
Figura 26 - (ESQUERDA) Voltamogramas de onda quadrada para soluções de paracetamol em diferentes concentrações, f = 50Hz, I = 7 mV e A = 100 mVs-1 utilizando o biossensor de lobeira (DIREITA) – Curva analítica para as
soluções de paracetamol ______________________________________ 54 Figura 27 - (ESQUERDA) Voltamogramas de onda quadrada para soluções de paracetamol em diferentes concentrações, f = 40Hz, I = 4 mV e A = 100 mVs-1 utilizando o biossensor de manga (DIREITA) – Curva analítica para as
iv LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Princípios ativos dos medicamentos mais utilizados em automedicação _______________________________________________ 4 Tabela 2 – Fármacos detectados na biota aquática brasileira e os métodos analíticos empregados para a determinação dos mesmos _____________ 7 Tabela 3 – Biossensores confeccionados e suas respectivas composições 26 Tabela 4 - Áreas eletroativas calculadas para os biossensores construídos 35 Tabela 5 - Potenciais e correntes de pico catódico e anódico encontrados na caracterização eletroquímica dos biossensores ____________________ 38 Tabela 6 - Potenciais e correntes de oxidação e redução determinado na otimização da concentração de material vegetal dos biossensores _____ 46
v LISTA DE ABREVIATURAS OU SIGLAS
∆E – Diferença entre dois potenciais CB – Carbon black
CLAE – Cromatografia líquida de alta eficiência CNTS – Nanotubos de carbono (Carbon nanotubes) DAD – Detector de arranjo de diodos
DET – Transferência direta de elétron DNA – Ácido desoxirribonucleico EFS – Extração em fase sólida EM – Espectrômetro de massas Epa – Potenciais de pico anódico Epc – Potenciais de pico catódico EPC – Eletrodo de pasta de carbono
HRP – Peroxidase de raíz forte (Horseradish Peroxidase) Ipc – Corrente de pico catódico
Ipa – Corrente de pico anódico
IUPAC – União internacional de Química Pura e Aplicada KDa – Quilo Daltons
LAC – Laccase
LD – Limite de detecção LQ – Limite de quantificação
log – Logarítmo da velocidade de varredura log Ip – Logarítimo da corrente de pico
POD – Peroxidase
pH – Potencial hidrogeniônico TYR – Tirosinase
vi LISTA DE SÍMBOLOS % - Porcentagem –Micro – Velocidade de varredura – Coeficiente angular
A – Área geométrica do eletrodo A – Ampére C – Concentração cm – Centímetro D – Coeficiente de difusão F – Frequência Hz – Hertz L –Litro
mol – Quantidade de matéria n – Número de elétrons s – Segundo
vii RESUMO
O uso de enzimas extraídas de vegetais para fins bioanalíticos vem aumentando gradualmente, e isto está relacionado ao desenvolvimento de novos dispositivos de análises cada vez mais específicos. O desenvolvimento de novos biossensores enzimáticos vem crescendo devido à alta seletividade que estes aparatos apresentam. As oxidorredutases são um grupo de enzimas que catalisam a conversão de um composto fenólico a uma quinona, que pode ser reduzida eletroquimicamente e permite assim a quantificação do analito de interesse. Estas enzimas são encontradas em diversos vegetais, dentre eles o fruto da lobeira (Solanum lycocarpum), a bainha de guariroba (Sygarus oleracea Becc) e a amêndoa de manga (Mangifera Indica). Neste trabalho foram utilizadas partes destes vegetais que não são aproveitados com fim econômico como fonte de enzimas na construção de biossensores enzimáticos e foi otimizado um método de determinação eletroquímica de paracetamol com os biossensores construídos. A quantificação de paracetamol é de grande interesse, pois devido ao indiscriminado uso vêm aumentando a concentração do mesmo em águas residuais e de uso, o que o classifica como um poluente emergente, podendo levar a malefícios da saúde da população em geral. Os dispositivos construídos se mostraram eficientes na quantificação de soluções de paracetamol, apresentando limites de detecção entre 77 e 109 mol L-1.
viii ABSTRACT
The use of enzymes extracted from bioanalytical plants has been gradually increasing, and this is related to the development of new increasingly specific analysis devices. The development of new enzymatic biosensors has been growing due to the high selectivity that these devices present. Oxidorreducutases are a group of enzymes that catalyze the conversion of a phenolic compound to a quinone, which can be reduced electrochemically and thus allows the quantification of the analyte of interest. These enzymes are found in several vegetables, including the lobeira fruit (Solanum lycocarpum), the guariroba sheath (Sygarus oleracea Becc) and the mango kernel (Mangifera Indica). In this work, parts of these vegetables that are not used with economic purpose as a source of enzymes in the construction of enzymatic biosensors were used and an electrochemical determination method of paracetamol with the biosensors constructed was optimized. The quantification of paracetamol is of great interest, because due to the indiscriminate use have increased the concentration of it in wastewater and use, which classifies it as an emerging pollutant, which can lead to harms of the health of the general population. The built devices proved to be efficient in quantifying paracetamol solutions, presenting detection limits between 77 and 109 mol L-1.
1 1. INTRODUÇÃO
1.1. Paracetamol: Histórico e usos
As propriedades farmacológicas do paracetamol foram descobertas acidentalmente no final do século XIX, pelos médicos Arnold Chan e Paul Heppa, da Universidade de Strausburg, na França. Na ocasião, um paciente foi erroneamente medicado com acetanilida ao invés de naftaleno, que era utilizado no tratamento de parasitas intestinais, e então perceberam que a substância não foi eficaz na erradicação dos parasitas, porém a febre desenvolvida no paciente diminuiu drasticamente. Com estudos posteriores e a divulgação dos resultados, a acetanilida foi introduzida na prática médica em 1886 com o nome de ‘antifebrin’, porém apresentava alta toxicidade e levava ao desenvolvimento de metemoglobinemia, e logo se iniciou a busca por substitutos sintéticos e menos tóxicos para este medicamento (JOZWIAK-BEBENISTA; NOWAK, 2014).
Os principais candidatos desenvolvidos como analgésicos e antipiréticos substitutos à acetanilida foram a fenacetina e o paracetamol. A fenacetina foi introduzida no mercado em 1887, sendo comercializada por quase 50 anos com o nome comercial de Saridon®. As primeiras complicações à saúde associadas à intoxicação por Saridon® foram descritas por cientistas da cidade de Basel, na Suíça. O quadro clínico dos pacientes intoxicados pelo medicamento se iniciava com hipertensão, seguida de inflamação renal e pigmentação da pele, e posteriormente morte prematura por infarto ou insuficiência cardíaca. Investigando o histórico dos pacientes constatou-se que todos faziam uso regular de Saridon® para combater dores de cabeça, que em seguida se tornavam persistentes e desencadeavam os demais sintomas (BRUNE; RENNER; TIEGS, 2015).
Até então, acreditava-se que o paracetamol era um metabólito da acetanilida, e, portanto, apresentava os mesmos efeitos tóxicos ao organismo. Esta associação errônea foi derrubada quando Bernard Brodie e Julius
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Axelrod, demonstraram que a metemoglobinemia era induzida por outro metabólito da acetanilida: a fenilhidroxilamina. Esta descoberta revolucionou o mercado de analgésicos e alavancou a comercialização do paracetamol, sendo introduzido comercialmente nos Estados Unidos na década de 50 (PRESCOTT, 2000).
O paracetamol é um analgésico não opióide que apresenta propriedade antipirética (ou antitérmica), eficaz no alívio de dores leves a moderadas. O seu mecanismo de ação baseia-se na ativação indireta de receptores CB1 do sistema canabinóide, um complexo sistema de neurotransmissores relacionados ao balanço energético, alterações emocionais, dor, hipertermia e hiperfagia (QUEIROZ et al., 2013).
Em uma das vias metabólicas do paracetamol no organismo, este é convertido no fígado por enzimas do complexo citrocromo P450 a um eletrófilo citotóxico denominado N-acetil-p-benzoquinonaimina (NAPBQI), que se liga a proteínas celulares. Quando o paracetamol é ingerido em doses terapêuticas, todo o NAPBQI produzido é totalmente eliminado pelos rins, porém, em situações de sobredosagens, o NAPBQI se acumula no fígado por ligações com os grupos tióis das proteínas hepáticas, causando stress oxidativo, colapso das membranas mitocondriais, aumento da peroxidação lipídica e pode causar necrose centrilobular e danos à medula renal (KLAASSEN, 2008). Além da via citada anteriormente, o paracetamol pode ser metabolizado na forma de sulfato de paracetamol e de glucoronido de paracetamol, ambos eliminados na urina (CASTRO, 2014). Uma representação das reações envolvidas na metabolização do paracetamol é mostrada na Figura 1:
3 Fonte: adaptado de Klaasen, Curtis D. Casarett and Doull ’ S Toxicology The Basic Science of Poisons. 6. ed. [S.l.]: McGraw-Hill, 2008
A Organização Mundial da Saúde (OMS) define a automedicação como “a seleção e o uso de medicamentos sem prescrição para o tratamento de sintomas ou doenças reconhecidas pelo usuário” (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2014). Um estudo conduzido por Arrais e colaboradores investigou a prevalência da automedicação na população brasileira e os fatores associados a esse costume. Foram avaliadas as respostas obtidas na base de dados da PNAUM (Pesquisa Nacional Sobre Acesso, Utilização e Promoção do Uso Racional de Medicamentos), onde foram entrevistados 41.433 indivíduos de todas as regiões do Brasil, entre 2012 e 2013 em 20.404 municípios (MENGUE et al., 2016).
Os resultados mostraram que 16,1% dos entrevistados faziam uso de Figura 1 - Reações envolvidas nas vias metabólicas do paracetamol
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medicações por conta própria, sendo a maior prevalência destes do sexo feminino, na faixa etária de 20 a 39 anos de idade, e a região Nordeste com maior número de incidência de entrevistados que se automedicam. Quanto aos grupos terapêuticos dos medicamentos que os entrevistados utilizavam com maior frequência, a maior incidência ficou com os analgésicos (33,4%), seguido de relaxantes musculares (14,8%) e anti-inflamatórios (11,7%). A distribuição das respostas obtidas em função do princípio ativo dos medicamentos mais utilizados é disposta na Tabela 1:
Tabela 1 – Princípios ativos dos medicamentos mais utilizados em automedicação
Princípio ativo Porcentagem MSP MP
Dipirona 15,4 X
Cafeína + orfenadrina + dipirona 12,1 X
Paracetamol 11,4 X
Cafeína + carisoprodol + paracetamol +
diclofenaco 3,6 X
Diclofenaco 3,5 X
Cafeína + dipirona + isometepteno 3,3 X
Etinilestradiol + levonorgestrel 2,5 X
Ibuprofeno 2,3 X
Fenilepinefrina + clorofeniramina +
paracetamol 2,2 X
Omeprazol 1,8 X
Cafeína + clorofeniramina + dipirona 1,8 X
Nimesulida X
MSP – Medicamento vendido sem prescrição; MP – Medicamento vendido com prescrição.
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É importante destacar a grande participação do paracetamol dentro do cenário da automedicação no Brasil, aparecendo tanto como um medicamento isolado quanto como componente de outras formulações, conforme mostrado na tabela 01. Um fator que deve ser correlacionado com os dados apresentados é que não foi encontrada associação significativa entre a prática da automedicação e a classificação econômica dos indivíduos entrevistados (classes A, B, C, D e E). Isto pode ser explicado pelo fato que os medicamentos mais consumidos apresentam baixo custo, fácil acesso, podendo ser adquiridos sem prescrição médica, como a dipirona, o ibuprofeno e o paracetamol (ARRAIS et al., 2016).
1.2. O paracetamol como poluente emergente
Poluentes emergentes (PE) podem ser definidos como qualquer substância de ocorrência natural ou sintética, que não é rotineiramente monitorada no ambiente, porém, apresenta potencial de ser inserida no mesmo, podendo causar a danos ecológicos ou efeitos adversos à saúde humana, ou que provavelmente já estão inseridas no ambiente há muito tempo, mas só foram detectadas recentemente (RAGHAV et al., 2013). O monitoramento dos níveis dos PE é de grande interesse porque eles são inseridos no ambiente através do uso e produção contínuos, e geralmente não há legislação que regulamente a concentração dos mesmos nos ecossistemas aquáticos e no solo (WELLS et al., 2018).
O uso rotineiro do paracetamol, aliado ao hábito da automedicação e o descarte inapropriado contribuem para o seu posicionamento no cenário das substâncias classificadas como PE, sendo frequentemente detectado em águas de uso doméstico, águas subterrâneas e pluviais ao redor do mundo. Uma vez metabolizado, o paracetamol sofre pequenas alterações em sua estrutura (como por exemplo o glucoronido de paracetamol) que pode ser fragmentado durante o tratamento do esgoto e convertido à sua forma ativa original, e posteriormente liberado novamente para o ambiente aquático (WU; ZHANG; CHEN, 2012).
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Outro fator que preocupa a comunidade científica é a possibilidade de o paracetamol poder atuar como um disruptor endócrino, ou seja, uma substância química que interfere em qualquer aspecto na ação hormonal do organismo (NADAL et al., 2017). Como exemplo, Albert et al. (2003) estudaram os efeitos da produção de testosterona in vitro sob o efeito da administração de paracetamol, indometacina e aspirina em doses compatíveis com as disponíveis comercialmente. Os resultados mostraram que a exposição ao paracetamol não afetou a morfologia dos tecidos estudados, porém a administração em doses de 10-4 e 10-5 mol L-1 levou à diminuição da
produção de testosterona em 18 e 30% respectivamente no intervalo de 24 horas (ALBERT et al., 2013).
Os estudos sobre os efeitos da exposição de humanos a disruptores endócrinos sugerem que há relação entre a exposição à essas substâncias e o desenvolvimento de doenças crônicas como diabetes mielitus tipo II, obesidade, disfunções da tireóide e diminuição da fertilidade (BOUCHARD, 2017). Apesar de ainda não ser possível afirmar categoricamente que a exposição a esses compostos leva a anomalias metabólicas, o monitoramento dos níveis destes no ambiente vem despertando grande interesse da comunidade científica.
No Brasil, os parâmetros de qualidade de água e as condições padrão para o lançamento de efluentes são determinados pelas resoluções Conama 357/2005, Conama 430/2011 e ANVISA 2914/2011. Apesar dos iminentes riscos associados ao despejo de produtos farmacêuticos em efluentes e o consumo de água contaminada com os mesmos, não há nenhum dispositivo que regule a quantidade de paracetamol no ambiente aquático nas resoluções citadas.
Um estudo conduzido por Boger e colaboradores (2015) realizou o levantamento da presença de PE de origem farmacêutica em matrizes aquosas no Brasil. Os métodos analíticos mais utilizados para a detecção destes compostos são os métodos cromatográficos em fase líquida e em fase gasosa, acoplados a detectores de ultravioleta, espectrômetros de massas e por fluorescência. A Tabela 2 mostra alguns dos resultados encontrados neste
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estudo (BOGER et al., 2015):
Tabela 2 – Fármacos detectados na biota aquática brasileira e os métodos analíticos empregados para a determinação dos mesmos
Matriz aquosa e local Procedimento analítico Fármaco detectado Concentração (g L-1) Rio Atibaia, Campinas - SP EFS – CLAE/ UV/DAD E FL paracetamol cafeína AAS 0,84 41,7 4,15 Rio Monjolinho, São Carlos – SP EFS – CLAE – EM cafeína paracetamol atenolol 0,129 3,672 0,979 ETE em Três Lagoas – MS EFS – CLAE/ UV/DAD Ibuprofeno diclofenaco naproxeno paracetamol piroxicam 0,23 0,27 0,07 0,13 0,33
EFS – extração em fase sólida; CLAE – cromatografia líquida de alta eficiência; UV – ultravioleta; DAD – Detector de arranjo de diodos; EM – espectrometria de massas
Dados adaptados de BOGER, Beatriz et al. Ciência e Natura, v. 37, p. 725–739, 2015
No que se refere à detecção de espécies poluentes, os biossensores se mostram como uma promissora alternativa aos métodos clássicos de análise, como a cromatografia e a ressonância magnética nuclear, que normalmente apresentam altos custos de análise, manutenção e requerem exaustivas etapas no preparo das amostras.
8 1.3. Biossensores
Segundo a IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry), biossensores são dispositivos que se utilizam de reações bioquímicas específicas mediadas por enzimas, imunossistemas, tecidos, organelas ou células inteiras na detecção de compostos, através de sinais elétricos, térmicos ou óticos (IUPAC, 2014). O sistema de reconhecimento biológico (ou biorreceptor) geralmente se encontra imobilizado na superfície do dispositivo, e é responsável pelo reconhecimento do analito de interesse.
Além do biorreceptores, os biossensores são constituídos de outros dois itens: o transdutor e o sistema de processamento do sinal. O transdutor é o componente que transforma o sinal produzido pela reação entre o biorreceptor e o analito, como aparecimento de produtos de reação, produção de calor, fluxo de elétrons, oscilações de pH, transporte de massa, entre outras mudanças do sistema, em um sinal analítico útil. Este, por sua vez, pode então ser amplificado e processado em dados mensuráveis e passíveis de serem interpretados pelo operador (BHALLA et al., 2016).
Os biossensores podem ser classificados de acordo com o tipo de biorreceptor ou pelo tipo do transdutor. Levando em consideração o tipo de biorreceptor, podemos citar exemplos como os biossensores enzimáticos, imunossensores, biossensores baseados em DNA e até em microrganismos. E de acordo com o tipo de transdutor podemos citar os biossensores eletroquímicos, piezoelétricos, calorimétricos e óticos. (PERUMAL; HASHIM, 2014). Na Figura 2 é mostrado o esquema de construção de um biossensor com exemplos de biorreceptores e transdutores comumente utilizados.
9 Fonte: Autoria própria.
A grande variedade de biossensores disponíveis permite que esses dispositivos sejam aplicados em diversas áreas do conhecimento e da indústria. Dentre as suas aplicações se destacam as áreas biomédica, controle de qualidade de alimentos e cosméticos, diagnósticos clínicos e monitoramento de poluentes no ambiente.
1.4. Biossensores enzimáticos
Devido às suas complexas estruturas, as enzimas fazem reações altamente específicas aos seus substratos, sendo capazes de detectá-los em matrizes multicomponentes. Esta característica da reatividade das enzimas pode conferir aos biossensores alta seletividade, reprodutibilidade e sensibilidade. Outras vantagens dos biossensores que podem ser citadas são o relativo baixo custo de análise e equipamentos, operação simples e poucas ou nenhuma etapa de preparação de amostra (DI FUSCO et al., 2010). Estas
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características podem ser aliadas a transdutores eletroquímicos, que comparados a outros sistemas apresentam baixo custo, fácil manuseio e com variadas possibilidades de miniaturização e portabilidade (WANG, 2006), o que significa grande vantagem no desenvolvimento de métodos analíticos para análises ambientais.
O funcionamento dos biossensores eletroquímicos enzimáticos se baseia na transferência de elétrons oriundos das reações redox entre o sítio ativo da enzima e o substrato, que chegam ao transdutor e depois de processados são transformados em sinais analíticos. Estes dispositivos podem ser amperométricos, caso onde é feito o registro da corrente elétrica gerada pela oxidação ou redução do analito (SADEGHI, 2013), condutimétricos, onde se registra a alteração condutividade elétrica do meio via perda ou ganho de elétrons (DZYADEVYCH; JAFFREZIC-RENAULT, 2014) ou potenciométricos, onde é medido do potencial da célula eletroquímica na ausência de corrente mensurável (MATAVELI et al., 2010).
1.5. Oxidorredutases
As enzimas mais utilizadas na detecção de compostos fenólicos pertencem à classe das oxidorredutases, tendo destaque as peroxidases (POD), e as polifenoloxidases (PPO). Estas enzimas são encontradas em vegetais, e estão associadas a diversas funções metabólicas desses organismos. Em vários vegetais é observado um processo denominado escurecimento enzimático, que consiste no aparecimento de manchas escuras, predominantemente de cor marrom em tecidos submetidos à cortes ou a algum tipo de dano (CHEYNIER, 2012). Este processo está relacionado à oxidação enzimática de compostos fenólicos presentes na matriz vegetal pelas enzimas PPO, onde as quinonas produzidas pela oxidação enzimática se polimerizam formando um pigmento escuro e insolúvel, denominado melanina, ou reage não enzimaticamente com outros compostos fenólicos, porém, obtendo o mesmo pigmento escuro (LUPETTI et al., 2005).
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biossensores, sendo a mais utilizada a horseradish peroxidase, extraída da raiz forte (Armoracia rusticana), conhecida pela sigla HRP (LAVERY et al., 2010). Enzimas manufaturadas apresentam a vantagem de serem adquiridas com alto grau de pureza, conferindo aos dispositivos analíticos alta seletividade, porém geralmente apresentam alto custo de aquisição. Uma alternativa às enzimas disponíveis comercialmente é o uso de extratos brutos ou de tecidos vegetais, sendo relatado na literatura o uso analítico de polifenoloxidases encontrados em maçã, banana, abobrinha, pêssego, soja e vários outros vegetais. (FATIBELLO-FILHO; DA CRUZ VIEIRA, 2002).
O uso de extratos ou tecidos vegetais como fonte enzimática apresenta várias vantagens em relação às enzimas comerciais, como alta disponibilidade e variedade de fontes de enzima, baixo custo, biodisponibilidade de cofatores e alto rendimento, devido de as enzimas estarem imobilizadas em seu microambiente natural, o que dificulta a sua desnaturação. Porém, quando se trata do desenvolvimento de dispositivos analíticos, tem-se a desvantagem da perda de seletividade quando comparadas às enzimas manufaturadas, devido à presença de compostos oriundos da matriz vegetal que podem agir como interferentes (ADELOJU, 2005).
1.6. Peroxidases
As POD constituem uma vasta família dentro da classe das oxidorredutases que catalisam reações com vários compostos orgânicos e inorgânicos utilizando peróxido de hidrogênio como aceptor de elétrons. As peroxidases mais comuns apresentam no seu sítio ativo a protoporfirina IX, que contém um átomo de ferro (também chamado de grupo heme) como grupo prostético (BERNARDS; SUMMERHURST; RAZEM, 2004).
Esta classe de enzimas é extensivamente utilizada em bioquímica clínica, sínteses químicas, na descontaminação de leitos por fenóis e em várias outras aplicações tecnológicas. (REGALADO; GARCÍA-ALMENDÁREZ; DUARTE-VÁZQUEZ, 2004). A peroxidase mais distribuída comercialmente é a horseradish peroxidase (ou HRP), comumente
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encontrada em kits diagnósticos de imunoensaios.
O ciclo catalítico exibido por grande maioria das peroxidases consiste na transferência inicial de dois elétrons para uma molécula de H2O2, formando
duas moléculas de água e a forma oxidada do sítio ativo (composto I). Posteriormente, o composto I é reduzido pelo agente oxidante (neste caso, um composto fenólico), através da transferência de um elétron, levando à formação do composto II e um radical derivado do composto fenólico. Por último, o processo anterior se repete, levando à regeneração do estado nativo da enzima. Este mecanismo é ilustrado na Figura 3 (GONZALEZ-RIVERA; PRECIADO; OSMA, 2014):
Fonte: Adaptado de Gonzalez-Rivera, J.C., Preciado, J.E., Osma, J.F. (2014). Biosensors: Recent Advances and Mathematcal Challenges.
13 1.7. Polifenoloxidases
As enzimas da família PPO são enzimas que contém átomos de cobre em seu sítio ativo, também conhecidas como catecol oxidase, catecolase e tyrosinase. Estas enzimas catalisam duas reações distintas dependentes de oxigênio: a hidroxilação de monofenóis a o-difenóis, também chamada de atividade cresolase e a subsequente oxidação o-difenóis a o-quinonas, denominada atividade catecolase (VIRADOR et al., 2010). Apesar de as tirosinases estarem distribuídas em plantas, animais, e diversos microrganismos, a extração e purificação de tirosinases para fins comerciais é feita majoritariamente a partir de fungos e das bactérias Streotomyces spp. A Figura 4 mostra as reações envolvidas nas atividades cresolase e catecolase exibida pelas PPO, assim como prováveis intermediários de reação (MARTINEZ; WHITAKER, 1995).
14 1.8. Guariroba
A guariroba, Syagrus oleracea (Mart.) Becc., é uma palmeira nativa do Brasil, ocorrendo frequentemente nos Estados da Bahia, Minas Gerais, Goiás, Mato Grosso do Sul e São Paulo, conhecida popularmente também como coqueiro amargoso, gueroba, guarirova, gueirova e amargoso (HIANE et al., 2011) . O estipe (ou caule) da guariroba pode atingir até 11 metros de altura, apresenta coloração cinzenta e de aspecto estirado, sendo revestido pelo remanescente das bainhas foliares. Esta palmeira produz frutos ovalados, de tamanho entre 6 e 7 centímetros de coloração externa verde-amarelada, ocorrendo a sua maturação na estação chuvosa, entre os meses de setembro e novembro (SANTELLI; CALBO; CALBO, 2006).
Várias partes da guariroba são aproveitadas comercialmente. Os frutos possuem polpa fibrosa, são comestíveis e de sabor agradável, servem de alimento à fauna e são empregados na fabricação de doces. O óleo extraído da amêndoa dos frutos é aplicado na fabricação de cosméticos e as folhas e a bainha são utilizadas na alimentação de ruminantes em substituição a forragens comuns na época da seca. Há relatos do uso das flores, de folhas raízes novas de guariroba na medicina popular no tratamento de bronquite, hemorroida e dores de coluna (REIS; PINTO; FALEIO, 2013).
O palmito da guariroba é rico em enzimas das famílias POD e PPO e em compostos fenólicos, sendo susceptível ao escurecimento enzimático. Os fenóis são responsáveis pelo gosto adstringente e amargo característico da guariroba, tornando-a muito apreciada na culinária regional. O palmito industrializável é dividido em: brotos foliares, que é a parte mais apical do palmito, industrial, que constitui a parte comestível e mais nobre do palmito, e caulinar (ou coração), que é a porção que se situa logo abaixo da parte industrial (ALMEIDA et al., 2000). Um fator que chama atenção no processamento de palmitos é o desperdício de matéria-prima e a baixa relação entre o número de palmeiras cortadas e o rendimento do produto enlatado, já que o palmito representa uma porcentagem pequena comparada à extensão de toda palmeira. Na produção de uma lata de conserva de
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guariroba utiliza-se entre 2,7 e 3,4 palmitos. Na etapa inicial do processamento do palmito, as bainhas mais externas e duras são descartadas, devido à elevada lignificação das paredes celulares, formado fibras resistentes à mastigação. Na comercialização da guariroba in natura observa-se o mesmo processo de descarte das bainhas.
Este fato é interessante, pois as bainhas representam grande parte do material vegetal da palmeira e não apresenta valor agregado, situação que a torna atrativa visando o aproveitamento deste componente com fins biotecnológicos considerando o seu baixo custo. A Figura 5 mostra bainhas de guariroba descartadas em uma feira livre no município de Goiânia, as quais foram utilizadas neste trabalho.
Fonte: Autoria própria.
16 1.9. Lobeira
A lobeira (Solanum lycocarpum), também conhecida popularmente como fruto do lobo, é uma árvore pertencente à família Solanaceae, que ocorre frequentemente na região do cerrado e é considerada uma espécie invasora de plantações e pastagens. A lobeira é uma espécie perene, com porte médio variando entre 3 e 4 metros de altura, de caule tortuoso e superfície aveludada, com acúleos curtos. As folhas têm consistência coriácea, com numerosos pelos e acúleos localizados principalmente na nervura principal (KUHLMANN; FAGG, 2018).
Fonte: Autoria própria.
A lobeira produz frutos durante todo o ano, porém apresentam pico de produção na estação chuvosa. A árvore pode produzir de 40 a 100 unidades do fruto, pesando entre 400 e 900 gramas cada (PASCOAL, 2015). Apresentam forma globosa e ligeiramente achatados, de coloração verde mesmo quando maduros. No estado verde de maturação, a polpa apresenta aspecto esbranquiçado e de consistência firme, porém quando madura têm coloração amarelada e desenvolve odor forte e extremamente macia e adocicada (VIDAL; STACCIARINI-SERAPHIN; CAMARA, 1999).
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Os frutos da lobeira representam até 50% da dieta alimentar do lobo-guará do cerrado (Chrysocyon brachyurus) e são utilizados por algumas populações no preparo de doces e geleias. Na medicina popular são empregados como diuréticos, calmantes, antiespasmódicos, antiofídicos e antipiléticos. O amido extraído dos frutos de lobeira é utilizado no controle de diabetes, obesidade e outras enfermidades, e o suco do fruto é aplicado em uso tópico para a eliminação de verrugas (LORENZI; MATOS, 2008).
Esta espécie é comumente encontrada em áreas degradadas, como por exemplo na beira de estradas, sendo capaz de se desenvolver em ambientes de condições climáticas desfavoráveis com períodos de seca prolongados, solos ácidos e pobres em nutrientes, além de resistir a ações predatórias da ação humana, como as queimadas (RATTI, 2009).
Além da comercialização do amido derivado do fruto da lobeira para fins medicinais, não há relatos de processamento visando a exploração comercial destes frutos. As características citadas anteriormente em relação ao seu desenvolvimento indicam que esta espécie apresenta fácil manejo, visando a produção de derivados de seus frutos para aplicações biotecnológicas (TORRALBO et al., 2012), como por exemplo, o isolamento de enzimas. A Figura 7 mostra em detalhe flores e o fruto da lobeira.
Extraído de Kuhlmann, Marcelo; Fagg, Christopher William. Frutos e sementes do Cerrado: espécies atrativas para fauna - Volume I. 2 ed. 2018
18 1.10. Manga
A manga é uma fruta pertencente à família Anarcadiacea, nativa do continente asiático, produzida nos continentes com clima sub-tropical e é uma das frutas mais consumidas no mundo. A árvore da manga (ou mangueira) pode atingir até 40 metros de altura e a coloração de seus frutos quando maduros pode variar entre amarelo, laranja e vermelho. A polpa dos frutos é firme, saborosa e suculenta, com fibras finas, curtas e macias representando aproximadamente 70% da fruta. Devido à estas características sensoriais, aliado ao seu sabor doce e agradável, há grande interesse comercial no processamento para produção de polpa e suco derivados da manga.
Conforme divulgado no Anuário brasileiro de fruticultura, a manga foi a fruta mais exportada pelo Brasil em 2016, sendo o sexto maior exportador de manga do mundo, embarcando 156.337 toneladas, movimentando mais de 180 milhões de dólares. Neste mesmo ano, o Brasil foi o sétimo maior produtor mundial da fruta, colhendo mais de um milhão de hectares de manga. A nível nacional, o estado da Bahia é o maior produtor, seguido do estado de Pernambuco (CARVALHO et al., 2017).
A espécie também é empregada em medicina popular, sendo o chá das folhas recomendado no tratamento de bronquites crônicas desinteria e hemorragias intestinais (RAMOS; DUARTE; JINÉNEZ, 2015). Apresenta efeito diurético e estimulante da função láctea, e o extrato hidroalcóolico da polpa de manga apresenta potencial atividade antimicrobiana frente a bactérias Staphyococcus aureus. (GARCIA; ORLANDA, 2014).
O processamento industrial da manga para a elaboração de produtos como polpas, néctar, geleias, fruta desidratas e entre outros resulta num grande volume de resíduo, constituído das cascas e das sementes com as amêndoas no seu interior, que juntas podem compreender em até 43% da massa da fruta (ONIAS; CAVALCANTI, 2014). Apesar de ser descartada, a amêndoa da manga é rica em compostos naturais bioativos como enzimas e polifenóis, que apresentam potenciais aplicações tecnológicas, podendo ser empregados como antioxidantes, antimicrobianos (ARBOS; STEVANI;
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CASTANHA, 2013), e no caso deste trabalho, a construção de dispositivos de análise.
Fonte: Banco de imagens da Embrapa, disponível em https://www.embrapa.br/busca-de-imagens/-/midia/4399001/casca-e-amendoa-do-caroco-de-manga; acessado em 09/02/2018
Com o enorme volume de resíduos de amêndoa de manga gerado anualmente surgiu a necessidade do desenvolvimento de tecnologias visando o aproveitamento do mesmo. Como alguns exemplos de soluções para esse problema desenvolvidos no Brasil, podemos citar a extração e uso do amido presente na amêndoa, como espessante em bebidas fermentadas (SILVA, G. A. S. et al., 2013), no processamento da mesma na forma de farinha e o uso como suplemento nutricional devido ao seu alto valor nutritivo em farinhas e a elaboração de produtos de panificação, como bolos e biscoitos (GOMES, 2017).
20 1.11. Eletrodos de pasta de carbono
A natureza do material utilizado como transdutor é um fator de extrema importância no desempenho de dispositivos bioanalíticos, pois o este componente é o responsável por converter a resposta biológica em um sinal analítico mensurável. Neste contexto, o material utilizado como transdutor apresentar necessariamente apresentar certas características, como elevada área superficial, considerável condutividade elétrica, e estabilidade física e química (OLIVEIRA et al., 2013). Tais características são encontradas materiais de carbono, e por esta razão estes têm sido amplamente utilizados na imobilização de biomoléculas para construção de biossensores eletroquímicos.
Os eletrodos de pasta de carbono (CPE, do inglês carbon paste electrodes) são muito versáteis e podem ser facilmente preparados pela mistura mecânica de pó de carbono (carbon black, nanotubos de carbono, grafite, dentre outros) com algum agente modificador e um aglutinante (SVANCARA et al., 2012). Sendo assim, torna-se possível a construção de dispositivos que apresentam superfície eletroativa sensível aplicada à quantificação de analitos de interesse. Uma das principais vantagens de se utilizar os eletrodos de pasta de carbono é a possibilidade de constante renovação da superfície do eletrodo (SILVA, T. A. et al., 2017).
Frequentemente, as pastas de carbono utilizadas na construção de dispositivos de análise são suportadas em tubos de Teflon® ou vidro confeccionados e comercializados especificamente para este fim. Estes também podem ser preparados pela adaptação de utensílios já existentes, como relato o relato de eletrodos confeccionados a partir de seringas para aplicação de insulina (VIEIRA; LUPETTI; FATIBELLO-FILHO, 2003). A Figura 9 ilustra o procedimento de construção de um eletrodo de pasta de carbono modificado com tecido vegetal.
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Figura 9 – Representação esquemática da construção de um eletrodo de pasta de carbono quimicamente modificado com tecido vegetal.
22 2. JUSTIFICATIVA E OBJETIVOS
Como exposto no capítulo anterior, o uso indiscriminado do medicamento paracetamol leva ao seu acúmulo no ambiente, sendo o mesmo facilmente detectado em águas de diversas origens e em distintas partes do país. O monitoramento dos níveis de paracetamol no ambiente vem se tornando um assunto de grande destaque, visto que não há na legislação brasileira vigente dispositivos que efetuem o controle dos níveis deste poluente na água, e seu consumo indireto pode causar malefícios à saúde
O aproveitamento de produtos de baixo valor agregado, como o fruto de lobeira, a bainha de guariroba e a amêndoa de manga pode surgir como alternativa ao desenvolvimento de tecnologias com tais produtos e o desenvolvimento de metodologias analíticas alternativas e de menor custo comparado aos métodos mais utilizados na detecção do paracetamol. Diante destes argumentos, foram delineados como objetivo deste trabalho:
i) Avaliar a atividade bioeletroquímica e a viabilidade do uso de tecidos vegetais de bainha de guariroba (Syagrus oleracea Becc), amêndoa de manga (Mangifera indica) e polpa de lobeira (Solanum lycocarpum) como fonte de material enzimático utilizando a técnica de voltametria cíclica;
ii) Construir eletrodos de pasta de carbono modificados com os tecidos vegetais propostos e verificar a sua atividade frente a soluções de paracetamol;
iii) Caracterizar eletroquimicamente os biossensores e otimizar os parâmetros experimentais de análise, visando a obtenção da máxima resposta eletroquímica possível;
iv) Realizar a construção de curvas analíticas para soluções de paracetamol e determinar as principais figuras de mérito, como limite de detecção, limite de quantificação, linearidade e estabilidade dos biossensores.
23 3. EXPERIMENTAL
3.1. Reagentes, soluções e instrumentação.
Todos os reagentes utilizados foram adquiridos em pureza analítica, utilizados sem processos de purificação, e todas as soluções foram preparadas utilizando água ultrapura (MiliQ™ – Merck Milipore).
As soluções de tampão acetato pH 4 e 5 foram preparadas pela mistura e posterior diluição de soluções 0,2 M de acetato de sódio (CH3COONa∙3H2O
P.A. – ACS, Dinâmica Química) e ácido acético (CH3COOH P.A. – ACS, Vetec
Química) e as soluções de tampão fosfato pH 6, 7 e 8 foram preparadas pela mistura e posterior diluição de soluções a 0,2 M de fosfato de sódio monobásico NaH2PO4∙H2O P.A. – ACS, Dinâmica Química) e fosfato de sódio
dibásico (Na2HPO4 anidro 99%, Dinâmica Química), como mostrado por
(GOMORI, 1955).
Foi preparada solução estoque de paracetamol 0,1 mol L-1 pela
dissolução do reagente grau USP (Synth) em tampão fosfato pH 6,8 0,1 mol L-1. Todas as outras soluções de paracetamol utilizadas nas determinações
analíticas foram preparadas a partir desta solução estoque.
Para a confecção dos eletrodos de pasta de carbono foi utilizado o carbono Vulcan XC72R (Cabot Corporation), com área superficial aproximada 248 m2g-1 e óleo mineral Nujol (Nutrifarma).
As medidas eletroquímicas foram realizadas em um potenciostato µ-Autolab Type II, controlado pelo software NOVA2.0 (Metrohm). A célula eletroquímica em todas as análises era constituída por um eletrodo de trabalho (biossensor), um contra eletrodo de platina e um eletrodo de referência Ag/AgCl/KCl(sat).
24 3.2. Obtenção do material vegetal
Foram avaliados como fontes das enzimas POD e PPO tecidos vegetais de amêndoas de manga (Mangifera indica), bainha de guariroba (Syagrus oleracea Becc) e polpa de lobeira (Solanum lycocarpum). Todas as amostras vegetais que serão descritas foram obtidas no mês de dezembro de 2018.
As amostras de manga obtidas diretamente da árvore na zona rural do município de Nova Veneza – Go (coordenadas geográficas 16º20’20.771” S 49º20’49.005” O). As amostras de bainha de guariroba foram recolhidas em feira livre realizada no Setor Itatiaia, município de Goiânia – GO, as quais seriam descartadas pelos feirantes (vide Figura 5), pois esta parte da planta não é aproveitada para o consumo humano. As palmeiras de onde foram extraídas as bainhas eram adultas e haviam sido recém-cortadas.
As amostras de lobeira foram colhidas diretamente da árvore, na região urbana de Goiânia (coordenadas geográficas -16º35’29.9” -49º15’48.6” ). Os frutos escolhidos apresentavam colocação verde clara, com polpa firme e quando cortados, exibiam polpa com coloração esbranquiçada, o que indica que se encontravam em estado de maturação intermediário. Foi depositada uma exsicata com amostra de galho da árvore onde foram coletados os frutos no herbário da UFG, sob número de depósito 69488. Parte das lobeiras foram utilizadas posteriormente à coleta, e o excedente foi congelado a -18°C até a sua utilização.
3.3. Preparo dos biossensores
Primeiramente obteve-se os tecidos vegetais na forma de pó, segundo procedimento adaptado de (KOZAN et al., 2007) e conforme o fluxograma apresentado na Figura 10.
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Depois de processados e secos, os tecidos vegetais foram armazenados a 4 ºC até o momento de sua utilização. A Figura 11 mostra o aspecto do material vegetal desidratado e de seus respectivos pós:
Figura 11 – (Da esquerda para direita) Tecidos vegetais de polpa de lobeira, bainha de guariroba e amêndoa de manga desidratados.
Higienização do material vegetal com solução etanol/água (70% v/v), hipoclorito de sódio 0,9%(v/v) e água destilada
Desidratação a 36° C por 48 horas
Processamento dos tecidos desidratados em liquidificador e peneiração a 200 mesh
Lavagem das farinhas com acetonitrila e secagem em dessecador por 24 horas
Construção dos biossensores
26
A fim de se determinar a proporção tecido vegetal que produz a melhor resposta bioeletroquímica, foram preparadas pastas de carbono contendo 1; 3; 5; 7 e 9% (%m/m) de tecido vegetal. Em um almofariz de ágata foram homogeneizados carbono Vulcan XC72R, óleo mineral Nujol e tecidos vegetais nas proporções indicadas na Tabela 3, sendo preparado este conjunto de biossensores para cada espécie vegetal analisada. Os biossensores preparados foram acondicionados em frascos de penicilina e armazenadas a 4 ºC até a sua utilização.
Tabela 3 – Biossensores confeccionados e suas respectivas composições
CARBONO VULCAN (%) ÓLEO MINERAL (%) TECIDO VEGETAL (%)
70 30 0
67 30 3
65 30 5
63 30 7
61 30 9
Os biossensores foram construídos pela inserção das pastas de carbono preparadas na extremidade de um tubo plástico com 2,5 mm de diâmetro e posteriormente compactada utilizando um fio de cobre rígido com 2,4 mm de diâmetro, o qual, também é responsável pelo contato elétrico. Antes e depois de cada análise, a superfície do biossensor foi polida pela fricção da mesma em papel sulfite realizando movimentos circulares para garantir o máximo possível de uniformidade. Os biossensores construídos foram utilizados como eletrodos de trabalho em uma célula eletroquímica de três eletrodos.
3.4. Experimentos eletroquímicos
Os experimentos eletroquímicos foram realizados em um potentiostato/ galvanostato μAutolab Tipo III, integrado ao software Nova2.0 (Eco-Chemie, Utrecht, Holanda). Foi utilizada uma célula eletroquímica convencional com
27
um sistema de três eletrodos formada por um eletrodo de trabalho (biossensores), um contra eletrodo (fio de platina) e um eletrodo de referência (Ag/AgCl/KClsat). Foram utilizadas as técnicas de voltametria cíclica nas
etapas de otimização dos biossensores e voltametria de onda quadrada nas etapas de otimização dos parâmetros de análise e construção das curvas analíticas. Os dados obtidos foram tratados e analisados utilizando o software Origin 8 (OriginLab Corporation, Northampton, MA, EUA).
3.4.1. Caracterização Eletroquímica dos biossensores
A atividade bioeletroquímica dos tecidos vegetais foi avaliada utilizando biossensores contendo 3% de material vegetal em experimentos de voltametria cíclica em tampão fosfato 0,1 mol L-1, pH 6,8, por 10 ciclos com
velocidade de varredura de 200 mVs-1.
3.4.2. Estimativa da área eletroativa
A área eletroativa dos biossensores foi estimada pela técnica de voltametria cíclica com biossensores com 3% de tecido vegetal utilizando solução K3Fe(CN)6 1,0 mmol L-1 preparada em KCl 0,1 mol L−1. Os
voltamogramas foram registrados na janela de -0,2 a +0,8 V, variando-se a varredura de potencial entre 10 e 100 mV s-1.
3.4.3. Perfil eletroquímico de solução de paracetamol
O estudo do comportamento eletroquímico de solução de paracetamol foi realizado utilizando os biossensores construídos e os resultados foram comparados à resposta eletroquímica de soluções de paracetamol frente a um eletrodo de pasta de carbono não modificado. Os ensaios de branco foram realizados em tampão fosfato 0,1 mol L-1 pH 6,8, e as soluções de
paracetamol 0,5 mmol L-1 analisadas foram preparadas com a mesma solução
tampão mencionada, suplementada com H2O2 a 10 mol L-1. As condições de
análise foram fixadas na janela de potencial de -0,2 a +0,8 V com = 50 mVs -1. Os biossensores utilizados nesta etapa continham 3% de material vegetal e
28 3.4.4. Estudo do tempo de incubação
Primeiramente os biossensores com 3% de material vegetal foram condicionados com 10 ciclos de voltametria cíclica a 100 mV s-1 em tampão
fosfato pH 6,5. Posteriormente os biossensores foram deixados em solução paracetamol 0,05 mol L-1 preparada em tampão fosfato 0,1 mol L-1 pH 6,5
pelos tempos de 1; 3 e 5 minutos antes de realizada a medida voltamétrica da solução de paracetamol suplementada com H2O2 a 10 mol L-1 por 3 ciclos
com = 50 mVs-1, no intervalo de potencial de -0,2 a +0,8 V.
3.4.5. Concentração ótima de H2O2
Após serem condicionados com 10 ciclos de voltametria cíclica a 100 mVs-1 em tampão fosfato pH 6,5, foram realizados experimentos de
voltametria cíclica com as seguintes concentrações de H2O2 na célula
eletroquímica: 0,25; 0,5; 0,75; 1,0 e 1,25 mol L-1. Os voltamogramas cíclicos
foram realizados em solução de paracetamol 0,5 mmol L-1 = 50 mVs-1, e
janela de potencial de -0,2 a +0,8 V.
3.4.6. Avaliação do pH ótimo de operação
O estudo da dependência do perfil voltamétrico em função do pH do meio foi realizado no intervalo de pH 4 – 8. Nos pHs 4 e 5 os experimentos foram realizados em tampão acetato de sódio 0,1 mol L-1, e nos pHs 6, 7 e 8
em tampão fosfato de sódio 0,1 mol L-1. Foram utilizados os biossensores com
3% de material vegetal e os voltamogramas cíclicos foram obtidos em solução de paracetamol 0,5 mmol L-1 preparadas nos tampões com os respectivos pHs
de análise, contendo H2O2 a 10 mol L-1, = 50 mVs-1, e janela de potencial
de -0,2 a +0,8 V.
3.4.7. Otimização da porcentagem de tecido vegetal nos biossensores
Os biossensores preparados com as porcentagens de tecido vegetal descritas na Tabela 3 foram submetidos a experimentos de voltametria cíclica frente solução de paracetamol 0,5 mmoll L-1 preparada em tampão fosfato 0,1
29
mol L-1, pH 6,5 contendo H
2O2 a 10 mol L-1, com = 50 mVs-1 e janela de
potencial de -0,2 a + 1,0 V.
3.4.8. Otimização dos parâmetros eletroquímicos de análise
Os experimentos de voltametria de onda quadrada foram realizados com janela de potencial de -0,2 a +1,0 V, utilizando os biossensores com a concentração de material vegetal otimizada conforme descrito na seção 3.4.7. Os parâmetros frequência de aplicação da onda, amplitude de pulso e incremento de onda foram otimizados pela variação de um dos parâmetros dentro de uma faixa com os outros dois fixos. A frequência de aplicação da onda foi otimizada na faixa de 10 a 100 Hz, com amplitude em 50 mV e incremento de 5 mV. A amplitude de pulso foi avaliada na faixa entre 10 a 100 mV, com frequência em 50 Hz e incremento em 5 mV. O incremento de onda foi avaliado na faixa entre 1 e 10 mV, com frequência em 50 Hz e amplitude em 50 mV. As análises foram realizadas em solução de paracetamol 0,5 mmol L-1 preparada em tampão fosfato 0,1 mol L-1, pH 6,5 contendo H
2O2 a 10 mol
L-1.
3.4.9. Construção das curvas analíticas
As curvas analíticas foram construídas pelo registro da corrente em experimentos de voltametria de onda quadrada após a adição sucessiva de alíquotas de 50 L de solução de paracetamol a 0,05 mol L-1. Nesta etapa
foram aplicadas todas as condições de otimização descritas entre as seções 3.4.4 e 3.4.8. para os biossensores com os três tecidos vegetais avaliados. Para o biossensor de manga foi estudada a faixa de concentração entre 0,15 e 3,9 mmol L-1 de paracetamol e para os biossensores de guariroba e lobeira
foi estudada a faixa de concentração entre 0,33 e 3,9 mmol L-1.
30 4.1. Caracterização Eletroquímica dos biossensores
Em dispositivos construídos a partir de tecidos vegetais é comum que de constituintes da matriz vegetal eventualmente apresentem atividade eletroquímica frente o material de suporte. Este é o caso das espécies selecionadas para este estudo, e os voltamogramas cíclicos obtidos para os biossensores com tecidos de bainha de guariroba, fruto de lobeira e amêndoa de manga são mostrados na Figura 12:
Figura 12 – (esquerda) Voltamogramas cíclicos obtidos em tampão fosfato 0,1 mol L-1, pH
6,5 = 200 mV s-1, entre -0,2 e 0,8 V, (direita) primeiro e décimo voltamogramas das
31
Os experimentos de voltametria cíclica indicam a presença de compostos da matriz vegetal que apresentam atividade eletroquímica frente ao suporte de carbono Vulcan XC72R, evidenciado pelos picos de oxidação e redução em +0,45 e +0,11 V, +0,25 e +0,13 V e +0,17 e +0,13 V para os biossensores de guariroba, lobeira e manga, respectivamente. Observou-se que a cada novo ciclo a intensidade das correntes catódicas e anódicas diminui, sendo este comportamento característico de espécies que se polimerizam ao serem oxidadas ou reduzidas. Este comportamento é observado por oxidorredutases, as quais capazes de converter compostos fenólicos por reações de acoplamento oxidativo a produtos poliméricos por auto condensação ou acoplamento cruzado com outras moléculas (GHOUL; CHEBIL, 2011). Na literatura há o relato da quantificação de POD e PPO em palmito de guariroba (ALVARENGA CARNEIRO; VIEIRA ROLIM; FLÁVIA FERNANDES, 2003), polpa de lobeira (BATISTA et al., 2014) e amêndoa de manga (AROGBA et al., 1998), corroborando a presença das enzimas de interesse e de seus substratos, compostos fenólicos, nas matrizes vegetais. A diminuição dos valores de corrente catódica ocorre devido ao bloqueio da superfície eletroativa pelo acúmulo de material eletropolimerizado na superfície dos biossensores.
Utilizando os voltamogramas do lado direito Figura 12, foi calculada a
Figura 12 [continuação] – (esquerda) Voltamogramas cíclicos obtidos em tampão fosfato 0,1 mol L-1, pH 6,5 = 200 mV s-1, entre -0,2 e 0,8 V, (direita) primeiro e décimo
32
diferença entre os valores de corrente entre o primeiro e o décimo ciclo voltamétrico para os picos de oxidação e redução. As correntes de oxidação apresentaram drástica diminuição, com valores de 15 A, para guariroba, 8
A para lobeira e 20 A para manga. Já para as correntes de redução a diminuição nos valores é bem menos expressiva, sendo de 2 A para os biossensores de guariroba e lobeira e 1,2 A para o biossensor de manga. A grande diferença entre as variações de corrente anódicas e catódicas indicam que as reações de eletropolimerização são praticamente irreversíveis no sentido da oxidação.
A prévia degradação enzimática de compostos fenólicos presentes na superfície dos biossensores também pode servir como um procedimento de estabilização do sinal eletroquímico. A realização desta etapa de estabilização diminui flutuações nas correntes registradas, além de minimizar a ação interferente desses compostos. Assim, este procedimento foi aplicado neste trabalho toda vez que a superfície do eletrodo foi renovada para a realização de análises.
4.2. Estimativa da área eletroativa
Os voltamogramas obtidos e a resposta de corrente com a variação da velocidade de varredura para a sonda K3Fe(CN)6 são mostrados na Figura :
Figura 13 – (Esquerda) voltamogramas cíclicos para a espécie K3Fe(CN)6 1,0 mmol L-1 em KCl 0,1 mol L−1 , = 10 - 100 mVs-¹ de -0,2 a +0,8 V. (Direita) Gráficos de Ipc e Ipa vesrus 1/2
33
Os voltamogramas obtidos apresentam o par de picos redox característicos para as espécies [Fe(CN)6]3-/4-, acompanhado do aumento
linear das correntes de pico com o aumento da velocidade de varredura e sem alterações nos potenciais de oxidação e redução. Este comportamento é consistente com o descrito na literatura para o estudo do comportamento de eletrodos com íons hexacianoferrato (THOMAS; HENZE, 2001). A dependência das correntes de pico com a velocidade de varredura é mostrada na Figura , onde observa-se que para todos os casos os dados apresentam coeficientes de correlação maiores que 0,99.
Para se obter uma estimativa da área eletroativa dos biossensores, primeiramente é necessário determinar se as reações de oxidação e redução são controladas por difusão ou por adsorção. Esta informação pode ser obtida pelo gráfico pelo coeficiente angular da curva de log (Ip) versus log (). Se o
Figura 13 (continuação) – (Esquerda) voltamogramas cíclicos para a espécie K3Fe(CN)6 1,0 mmol L-1 em KCl 0,1 mol L−1 , = 10 - 100 mVs-¹ de -0,2 a +0,8 V. (Direita) Gráficos de Ipc e
34
coeficiente angular deste gráfico é próximo de 0,5, trata-se de reação controlada por difusão, e caso o coeficiente angular for próximo de 1, trata-se
de reação controlada por adsorção. Os gráficos de log (Ip) vs log () são mostrados na Figura 14.
Para todos três biossensores avaliados o valor do coeficiente angular determinado é próximo de 0,5, caracterizando reações controladas por difusão. Conhecendo-se o controle difusional, foram estimadas as áreas eletroativas dos eletrodos, empregando-se a equação de Randles-Sevcik para sistemas controlados por difusão:
𝐼𝑝 = ±(2,69𝑥10
5) 𝑛
3/2𝐴 𝐷
1/2𝐶 𝜈
1/2(𝑒𝑞𝑢𝑎çã𝑜 01)
Figura 14 - gráficos de log (Ip) vs log () para os biossensores de guariroba, lobeira e manga= 0,52 = 0,65 = 0,46 = 0,48 = 0,64 = 0,57
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Sendo, Ip = corrente de pico anódico ou catódico, n = número de elétrons envolvidos no processo, A (cm2) = a área eletroativa do eletrodo, D
(cm2s−1) = coeficiente de difusão da espécie, C (mol cm−3) = concentração do
analito e (V s−1) = velocidade de varredura. Para o cálculo da área eletroativa dos biossensores considerou-se n = 1, D = 7,6 × 10−6 cm2 s−1 e C = 1 mmol
L−1, baseado em Konopka e McDuffie, 1970. Os valores de Ip e considerados correspondem à medida das correntes de pico anódico e das velocidades de varredura. Rearranjando os termos da equação 01 para isolar o termo correspondente à área eletroativa, obtém-se a seguinte equação:
𝐴 =
𝐼𝑝
𝜈
1/2𝑥
1
2,69𝑥10
5𝑛
3/2𝐷
1/2𝐶
(𝑒𝑞𝑢𝑎çã𝑜 02)
O termo Ip/¹/² é correspondente ao coeficiente angular das retas Ip vs
¹/² mostradas na figura 20. Portanto, para se calcular a área eletroativa dos
biossensores basta multiplicar os coeficientes angulares pelo segundo termo da equação. A Tabela 4 mostra os valores dos coeficientes angulares e as áreas eletroativas determinadas:
Tabela 4 - Áreas eletroativas calculadas para os biossensores construídos
BIOSSENSOR COEF. ANGULAR ÁREA ELETROATIVA (cm²)
Guariroba 0,82x10-6 1,11x10-3
Lobeira 0,89X10-6 1,20x10-3
36 4.3. Perfil eletroquímico de solução de paracetamol
Na Figura15 são mostrados os voltamogramas cíclicos obtidos para um EPC e para os biossensores de guariroba, lobeira e manga em tampão fosfato e em solução de paracetamol 0,05 mmol L-1.
Os voltamogramas (a) correspondem ao perfil eletroquímico do EPC na solução tampão, não sendo observado nenhum sinal além das correntes capacitivas do eletrodo. As curvas (b) mostram os picos de catódico e anódico referentes à eletropolimerização de componentes do material vegetal utilizados na confecção dos biossensores, conforme discutido na seção 4.1.
Figura 15 - Voltamogramas cíclicos entre -0,2 a + 0,8 V e = 50 mVs-1 (a): Branco EPC; (b): Branco biossensores; (c): análise de solução 0,05 mmol L-1 de paracetamol no EPC; (d) análise para solução 0,5 mmol L-1nos biossensores.
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As curvas (c) e (d) são referentes ao comportamento eletroquímico da solução de paracetamol frente ao EPC e aos biossensores, respectivamente. Em ambos os casos se observa um par de picos redox, sendo o pico no sentido catódico referente à oxidação do paracetamol à N-acetil-benzoquinoimina, e o pico no sentido anódico a redução da quinona ao paracetamol, sendo o pico anódico levado em consideração na determinação eletroquímica deste analito (WONG; SANTOS; FATIBELLO-FILHO, 2018). As análises indicam que as reações redox envolvendo o paracetamol ocorrem em mecanismo quase reversível, o que é compatível com outros biossensores enzimáticos descritos na literatura (ARANGANATHAN et al., 2017). O mecanismo das reações envolvidas na determinação eletroquímica do paracetamol é mostrado na figura 16:
Os valores de picos de potencial e de correntes de pico para o EPC e para os biossensores são mostrados na Tabela5:
OH HN O PPO/POD O N O Paracetamol NABPQI 2e -(oxidação enzimática)
redução eletroquímica (detecção)
