GOVERNO DO ESTADO DE SÃO PAULO
SECRETARIA DA CIÊNCIA, TECNOLOGIA E DESENVOLVIMENTO ECONÔMICO FACULDADE DE ENGENHARIA QUÍMICA DE LORENA
DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGIA
Tese de Doutorado
EFEITO DA RELAÇÃO GLICOSE:XILOSE NA BIOCONVERSÃO
DE XILOSE EM XILITOL POR Candida guilliermondii EM
HIDROLISADO DE BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR
Débora Danielle Virgínio da Silva
Lorena – SP- Brasil 2004
FACULDADE DE ENGENHARIA QUÍMICA DE LORENA DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGIA
PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL
EFEITO DA RELAÇÃO GLICOSE:XILOSE NA BIOCONVERSÃO DE
XILOSE EM XILITOL POR Candida guilliermondii EM HIDROLISADO
DE BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR
Tese de Doutorado apresentada como parte das exigências para a obtenção do título de Doutor em Biotecnologia Industrial
Banca Examinadora:
Dra. Maria das Graças de Almeida Felipe, FAENQUIL (Presidente) Dr. Ismael Maciel de Mancilha, FAENQUIL
Dr. Arnaldo Márcio Ramalho Prata, FAENQUIL Dra. Luciane Sene, UNIOESTE
Dr. Michele Vitolo, USP
Estudante:
Débora Danielle Virgínio da Silva
Lorena – SP – Brasil 2004
Ficha Catalográfica
Elaborada pela Biblioteca Universitária da FAENQUIL
SILVA, Débora Danielle Virgínio da
S586e Efeito da relação glicose:xilose na bioconversão de xilose em xilitol por Candida guilliermondii em hidrolisado de bagaço de cana-de-açúcar / Débora Danielle Virgínio da Silva. – Lorena, 2004.
82p.
Tese (doutorado) – Faculdade de Engenharia Química de Lorena. Departamento de Biotecnologia.
Orientadora: Felipe, Maria das Graças de Almeida
1. Biotecnologia – 2. Candida guilliermondii – 3. Xilitol – 4. Glicose – 5. Bagaço de cana-de-açúcar I. Título II Felipe Maria das Graças de Almeida orientadora
FACULDADE DE ENGENHARIA QUÍMICA DE LORENA
DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGIA
PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL
EFEITO DA RELAÇÃO GLICOSE:XILOSE NA BIOCONVERSÃO DE
XILOSE EM XILITOL POR Candida guilliermondii EM HIDROLISADO
DE BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR
Este exemplar corresponde à versão final da Tese de Doutorado aprovada pela banca examinadora.
________________________________________ Dra. Maria das Graças de Almeida Felipe Orientadora e Presidente da Banca Examinadora
Lorena – SP – Brasil 2004
“Nada acontece por acaso. Não existe a sorte. Há um significado por detrás de cada pequeno ato. Talvez não possa ser visto com clareza imediatamente,
mas sê-lo-á antes que se passe muito tempo.”
AGRADECIMENTOS
À Profª. Dra. Maria das Graças de Almeida Felipe pela dedicação, paciência e competência com as quais me orientou durante o desenvolvimento deste trabalho. À Graça, pela amizade e confiança durante estes anos de convivência diária. (“A glória da amizade não é a mão estendida, nem o sorriso carinhoso, nem mesmo a delícia da companhia. É a inspiração espiritual que vem quando você descobre que alguém acredita e confia em você."_ Ralph W. Emerson).
A todos os amigos do DEBIQ pelo companheirismo, pelo incentivo e pelo agradável convívio dentro e fora dos laboratórios. Em especial agradeço àqueles com os quais compartilhei a maior parte do meu tempo: Lili, Marcelo Marton, Martha, Francislene, Talita, Gilvani, Rita, Larissa Poppi, Larissa Canilha, Giovani, Priscila, Fernanda, Rimenys, Carol e Laís. (“Se a nossa amizade depende de coisas como o espaço e o tempo, então quando finalmente ultrapassarmos o espaço e o tempo, teremos destruído a nossa fraternidade! Mas ultrapassando o espaço, tudo o que nos resta é Aqui. Ultrapassando o tempo, tudo o que nos resta é Agora. E entre Aqui e Agora você não crê que poderemos ver-nos uma ou duas vezes?”_Richard Bach).
A todos os meus amigos que não são do DEBIQ, e que também foram muito importantes. (“As pessoas realmente ligadas não precisam de ligação física. Quando se
reencontram, mesmo depois de muitos anos afastados, sua amizade é tão forte quanto sempre.”_Deng Ming-Dao)
À minha família: Válter, Neide, Glauce, João, Cleber, Milene e Beatriz, muito obrigada! (“Suas vidas são mais importantes que todo o ouro do mundo. Mais belas que as estrelas, apesar dos seus defeitos. Ninguém é igual a vocês. Vocês são insubstituíveis.”_adaptado de Augusto Cury).
A todos os professores e funcionários do Departamento de Biotecnologia (DEBIQ), pela colaboração e agradável convivência.
Ao Departamento de Biotecnologia e à Faculdade de Engenharia Química de Lorena.
À Coordenadoria de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pela concessão da bolsa e à Fundação de Apoio à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) pelo apoio financeiro destinado a este projeto.
RESUMO
Efeito da Relação Glicose:Xilose na Bioconversão de Xilose em Xilitol por
Candida guilliermondii em Hidrolisado de Bagaço de Cana-de-Açúcar. Débora
Danielle Virgínio da Silva. Tese de Doutorado. Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia Industrial. Departamento de Biotecnologia, Faculdade de Engenharia Química de Lorena. Orientadora: Dra. Maria das Graças de Almeida Felipe (Departamento de Biotecnologia, FAENQUIL, C. P. 116, 12600-970, Lorena, SP, Brasil). Banca Examinadora: Dr. Ismael Maciel de Mancilha, Dr. Arnaldo Márcio Ramalho Prata, Dr. Michele Vitolo e Dra. Luciane Sene. Dezembro de 2004.
Há alguns anos, pesquisadores do Departamento de Biotecnologia da FAENQUIL vêm estudando a utilização do hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar como meio de cultivo para a levedura Candida guilliermondii, visando a produção biotecnológica de xilitol, um adoçante anticariogênico apropriado para diabéticos e obesos, comercialmente produzido a partir da catálise química de xilose obtida de materiais lignocelulósicos ricos em xilana. A assimilação da xilose presente nos hidrolisados hemicelulósicos é dependente da capacidade de leveduras em induzir a síntese das enzimas xilose redutase (XR) e xilitol desidrogenase (XDH), que participam das reações iniciais do metabolismo de xilose. As atividades destas enzimas podem ser influenciadas por diferentes compostos presentes no hidrolisado, como a glicose, apontada como um dos compostos reguladores da bioconversão de xilose em xilitol. A influência da glicose neste metabolismo foi avaliada a partir de fermentações em hidrolisado de bagaço de cana com diferentes relações glicose:xilose (1:25, 1:12, 1:5 e 1:2,5) empregando inóculo de Candida guilliermondii obtido do cultivo em meio contendo glicose, xilose e a mistura destas duas fontes de carbono. De acordo com os resultados, a relação glicose:xilose interferiu positivamente nesta bioconversão não se observando correlação entre a condição de favorecimento da produção de xilitol e as atividades das enzimas XR e XDH. A máxima atividade específica de XR (0,582 U/mgprot)
ocorreu na fermentação realizada em meio com relação glicose:xilose de 1:25 empregando-se inóculo cultivado em meio contendo apenas glicose. A máxima atividade específica de XDH (0,360 U/mgprot) foi verificada na fermentação de meio
com relação glicose:xilose de 1:2,5 e inóculo cultivado em mistura de glicose e xilose. Os máximos valores do fator de conversão de xilose em xilitol (YP/S= 0,59 g/g)
e produtividade volumétrica de xilitol (QP=0,53 g/L.h) foram alcançados quando a
relação glicose:xilose foi 1:5 e o inóculo cultivado apenas em xilose, indicando que não somente a relação glicose:xilose no meio de fermentação influenciou nestes resultados, mas também a presença de glicose no meio de preparo do inóculo. Quanto ao crescimento celular, verificou-se que o aumento da relação glicose:xilose favoreceu a formação de biomassa, com conseqüente aumento da formação dos subprodutos glicerol e etanol.
ABSTRACT
For some years, researchers from the Department of Biotechnology of FAENQUIL have been studying the use of the sugarcane bagasse hemicellulosic hydrolysate as a cultivation medium for the yeast Candida guilliermondii. This study aims the biotechnological production of xylitol, an anticariogenic sweetener appropriate to diabetic and obese people. Xylitol is commercially produced from the chemical catalysis of xylose obtained from xylan-rich lignocellulosic materials. The assimilation of the xylose present in the hemicellulosic hydrolysates is dependent on the yeasts capacity to induce xylose reductase (XR) and xylitol dehydrogenase (XDH) enzymes, which participate in the initial reactions of the xylose metabolism. The activities of these enzymes can be influenced by different compounds present in the hydrolysate, like glucose, indicated as one of the regulatory compounds of the xylose-to-xylitol bioconversion. The influence of the glucose in this metabolism was evaluated from sugarcane bagasse hydrolysate fermentations with different glucose:xylose ratios (1:25, 1:12, 1:5 and 1:2.5) employing inoculum of C.
guilliermondii obtained from the cultivation in medium containing glucose, a mixture
of glucose and xylose or only xylose as carbon sources. According to the results, the glucose:xylose ratio interfered positively in this bioconversion and it was not observed a correlation between the favorable condition of xylitol production and the XR and XDH enzymes activities. The maximum specific activity of XR (0.582 U/mgprot) occurred in the fermentation carried out in medium with 1:25 glucose:xylose
ratio, using inoculum grown in medium containing only glucose. The maximum specific activity of XDH (0.360 U/mgprot) was verified in the fermentation of medium
with 1:2.5 glucose:xylose ratio and inocullum grown in a mixture of glucose and xylose, whereas the maximum values of xylitol yield (0.59 g/g) and volumetric productivity (0.53 g/L.h) were reached when the glucose:xylose ratio was 1:5 and the inoculum was grown in medium containing only xylose. This indicates that the results were influenced not only by the glucose:xylose ratio in the fermentation medium, but also by the presence of glucose in the inoculum growth medium. In relation to the cell growth, it was verified that the increase of the glucose:xylose ratio favored the biomass formation, which consequently increased the formation of glycerol and ethanol by-products.
CONTEÚDO
1- INTRODUÇÃO ...II
2- REVISÃO BIBLIOGRÁFICA...3
2.1-BAGAÇODECANA-DE-AÇÚCAR...3
2.2-XILITOL:PROPRIEDADES E APLICAÇÕES...4
2.3-OCORRÊNCIAEOBTENÇÃODEXILITOL...6
2.3.1- Obtenção Química ...6
2.3.2- Obtenção Microbiológica ...7
2.4-FATORES QUE INFLUENCIAM A BIOCONVERSÃO DE XILOSE EM XILITOL...10
2.4.1 Influência da Glicose como Co-Substrato na Bioconversão de Xilose em Xilitol ...14
2.5-AS ENZIMAS XILOSE REDUTASE E XILITOL DESIDROGENASE...17
2.6-RECUPERAÇÃO DO XILITOL...23
3- MATERIAL E MÉTODOS ...24
3.1- OBTENÇÃO E PREPARO DO HIDROLISADO HEMICELULÓSICO DE BAGAÇODECANA-DE-AÇÚCAR ...24
3.1.1- Hidrólise Ácida ...24
3.1.2- Caracterização e Concentração do Hidrolisado...24
3.1.3- Tratamento do Hidrolisado ...25
3.2-MICRORGANISMO ...25
3.3-PREPARODOINÓCULO ...25
3.4-FERMENTAÇÃO ...26
3.4.1- Avaliação do Efeito da Relação Glicose:Xilose Sobre a Conversão de Xilose em Xilitol por C. guilliermondii em Hidrolisado de Bagaço de Cana26 3.5-DETERMINAÇÃODOCOEFICIENTEVOLUMÉTRICODETRANSFERÊNCIA DEOXIGÊNIO(KLA) ...27
3.6-MÉTODOSANALÍTICOS...27
3.6.1- Rompimento Celular ...28
3.6.2- Medida das Atividades Enzimáticas...28
3.6.3- Determinação de Proteína Solúvel ...29
3.6.5- Determinação da Concentração Celular ...29
3.6.6- Determinação da Concentração de Glicose, Xilose, Arabinose, Xilitol, Glicerol, Etanol e Ácido Acético ...30
3.6.7- Determinação da Concentração de Furfural e Hidroximetilfurfural...30
3.6.8- Determinação da Concentração de Fenóis Totais ...30
3.6.9- Determinação do pH ...31
3.7-DETERMINAÇÃODOSPARÂMETROSFERMENTATIVOS ...31
3.7.1- Fator de Conversão de D-xilose em Xilitol (Yp/s) ...31
3.7.2- Produtividade Volumétrica de Xilitol (Qp) ...31
3.7.3- Eficiência de Conversão (η) ...32
3.7.4- Velocidade de Consumo ...32
3.7.5- Fator de Conversão de D-xilose e D-glicose em Biomassa (YX/s) ...32
4- RESULTADOS E DISCUSSÃO...33
4.1-HIDROLISADOHEMICELULÓSICODEBAGAÇODECANA-DE-AÇÚCAR..33
4.2- INFLUÊNCIA DA GLICOSE NO CONSUMO DE AÇÚCARES E ÁCIDO ACÉTICO...34
4.3- INFLUÊNCIA DA GLICOSE NA FORMAÇÃO DE XILITOL E NO CRESCIMENTOCELULAR ...39
4.4-INFLUÊNCIADAGLICOSENAFORMAÇÃODEGLICEROLEETANOL ...45
4.5- INFLUÊNCIA DA RELAÇÃO GLICOSE:XILOSE SOBRE A ATIVIDADE DAS ENZIMASXILOSEREDUTASEEXILITOLDESIDROGENASE...50
5- CONCLUSÕES ...60
6- SUGESTÕES DE TRABALHOS FUTUROS ...62
LISTA DE TABELAS
TABELAI.PRINCIPAIS AÇÚCARES ENCONTRADOS EM HIDROLISADOS HEMICELULÓSICOS DE
DIFERENTES MATÉRIAS-PRIMAS...14
TABELAII.CARACTERÍSTICAS DO HIDROLISADO HEMICELULÓSICO DE BAGAÇO DE CANA..33
TABELA III. VELOCIDADE DE CONSUMO DE XILOSE DURANTE A FERMENTAÇÃO DO
HIDROLISADO DE BAGAÇO DE CANA POR C. GUILLIERMONDII EM FUNÇÃO DA RELAÇÃO
GLICOSE:XILOSE NO MEIO DE FERMENTAÇÃO E DO PREPARO DO INÓCULO...36
TABELAIV.FATOR DE CONVERSÃO DE XILOSE E GLICOSE EM BIOMASSA CELULAR (YX/S) EM
96 H DE FERMENTAÇÃO DO HIDROLISADO DE BAGAÇO DE CANA POR C. GUILLIERMONDII
EM FUNÇÃO DA RELAÇÃO GLICOSE:XILOSE NO MEIO DE FERMENTAÇÃO E DO PREPARO
DO INÓCULO...43
TABELAV.INFLUÊNCIA DA RELAÇÃO GLICOSE:XILOSE NA ATIVIDADE ESPECÍFICA DA XILOSE
REDUTASE DURANTE AS FERMENTAÇÕES DO HIDROLISADO DE BAGAÇO DE CANA POR C.
GUILLIERMONDII PRÉ-CULTIVADA EM MEIO CONTENDO GLICOSE; GLICOSE + XILOSE;
XILOSE...50
TABELA VI. INFLUÊNCIA DA RELAÇÃO GLICOSE:XILOSE NA ATIVIDADE ESPECÍFICA DA XILITOL DESIDROGENASE DURANTE AS FERMENTAÇÕES DO HIDROLISADO DE BAGAÇO DE
CANA POR C. GUILLIERMONDII PRÉ-CULTIVADA EM MEIO CONTENDO GLICOSE; GLICOSE +
XILOSE; XILOSE...53
TABELAVII.RAZÕES ENTRE A VELOCIDADE DE CONSUMO DE XILOSE E AS VELOCIDADES DE
FORMAÇÃO DE XILITOL E BIOMASSA EM FUNÇÃO DA RELAÇÃO GLICOSE:XILOSE NO
LISTA DE FIGURAS
FIGURA1.ESQUEMA COMPARATIVO DOS PROCESSOS DE OBTENÇÃO DO XILITOL. ...9
FIGURA 2. ESQUEMA DO METABOLISMO DE GLICOSE, XILOSE E ARABINOSE EM CANDIDA GUILLIERMONDII...12
FIGURA3.ESQUEMA DO METABOLISMO DE D-XILOSE EM LEVEDURAS.. ...18
FIGURA4.ESTRUTURA DA XILOSE REDUTASE DE C. TENUIS. ...21
FIGURA5.ESTRUTURA DA XILOSE REDUTASE DE P. GUILLIERMONDII...21
FIGURA6.ESTRUTURA DA XILITOL DESIDROGENASE DE CANDIDA SP. ...21
FIGURA 7. INFLUÊNCIA DA RELAÇÃO GLICOSE:XILOSE NO HIDROLISADO DE BAGAÇO DE CANA SOBRE O CONSUMO DE XILOSE POR C. GUILLIERMONDII PRÉ-CULTIVADA EM MEIO CONTENDO APENAS GLICOSE, MISTURA DE GLICOSE E XILOSE OU APENAS XILOSE . ....35
FIGURA 8. INFLUÊNCIA DA RELAÇÃO GLICOSE:XILOSE NO HIDROLISADO DE BAGAÇO DE CANA SOBRE O CONSUMO DE GLICOSE E ARABINOSE POR C. GUILLIERMONDII PRÉ -CULTIVADA EM MEIO CONTENDO APENAS GLICOSE, MISTURA DE GLICOSE E XILOSE OU APENAS XILOSE...38
FIGURA 9. INFLUÊNCIA DA RELAÇÃO GLICOSE:XILOSE NO HIDROLISADO DE BAGAÇO DE CANA SOBRE A VARIAÇÃO DO PH E O CONSUMO DE ÁCIDO ACÉTICO POR C. GUILLIERMONDII PRÉ-CULTIVADA EM MEIO CONTENDO APENAS GLICOSE, MISTURA DE GLICOSE E XILOSE OU APENAS XILOSE . ...40
FIGURA 10. INFLUÊNCIA DA RELAÇÃO GLICOSE:XILOSE NO HIDROLISADO DE BAGAÇO DE CANA SOBRE A FORMAÇÃO DE XILITOL POR C. GUILLIERMONDII PRÉ-CULTIVADA EM MEIO CONTENDO APENAS GLICOSE, MISTURA DE GLICOSE E XILOSE OU APENAS XILOSE...42
FIGURA 11. INFLUÊNCIA DA RELAÇÃO GLICOSE:XILOSE NO HIDROLISADO DE BAGAÇO DE CANA SOBRE O FATOR DE CONVERSÃO DE XILOSE EM XILITOL (YP/S) E PRODUTIVIDADE (QP) DE XILITOL POR C. GUILLIERMONDII PRÉ-CULTIVADA EM MEIO CONTENDO APENAS GLICOSE, EM MISTURA DE GLICOSE E XILOSE OU APENAS XILOSE...44
FIGURA 12. INFLUÊNCIA DA RELAÇÃO GLICOSE:XILOSE NO HIDROLISADO DE BAGAÇO DE
CANA SOBRE A FORMAÇÃO DE BIOMASSA CELULAR POR C. GUILLIERMONDII PRÉ
-CULTIVADA EM MEIO CONTENDO APENAS GLICOSE, MISTURA DE GLICOSE E XILOSE OU
APENAS XILOSE...46
FIGURA 13. INFLUÊNCIA DA RELAÇÃO GLICOSE:XILOSE NO HIDROLISADO DE BAGAÇO DE
CANA SOBRE A FORMAÇÃO DE GLICEROL POR C. GUILLIERMONDII PRÉ-CULTIVADA EM
MEIO CONTENDO GLICOSE, GLICOSE + XILOSE OU XILOSE. ...49
FIGURA 14. INFLUÊNCIA DA RELAÇÃO GLICOSE:XILOSE NO HIDROLISADO DE BAGAÇO DE
CANA SOBRE A FORMAÇÃO DE ETANOL POR C. GUILLIERMONDII PRÉ-CULTIVADA EM MEIO
CONTENDO GLICOSE, GLICOSE + XILOSE OU XILOSE...49
FIGURA 15. INFLUÊNCIA DA RELAÇÃO GLICOSE:XILOSE NO HIDROLISADO DE BAGAÇO DE
CANA NA ATIVIDADE ESPECÍFICA MÁXIMA DE XR DE C. GUILLIERMONDII PRÉ-CULTIVADA
EM MEIO CONTENDO GLICOSE; GLICOSE + XILOSE; XILOSE...52
FIGURA 16. INFLUÊNCIA DA RELAÇÃO GLICOSE:XILOSE NO HIDROLISADO DE BAGAÇO DE
CANA NA ATIVIDADE ESPECÍFICA MÁXIMA DE XDH DE C. GUILLIERMONDII PRÉ-CULTIVADA
EM MEIO CONTENDO GLICOSE; GLICOSE + XILOSE; XILOSE. ...54
FIGURA 17. INFLUÊNCIA DA RELAÇÃO GLICOSE:XILOSE NA RAZÃO XR/XDH MÁXIMA NAS
FERMENTAÇÕES DO HIDROLISADO DE BAGAÇO DE CANA POR C. GUILLIERMONDII PRÉ
-CULTIVADA EM MEIO CONTENDO GLICOSE; GLICOSE + XILOSE; XILOSE...55
FIGURA18.INFLUÊNCIA DA RELAÇÃO GLICOSE:XILOSE NA ATIVIDADE ESPECIFICA DE XR E
XDH, NA FORMAÇÃO DE XILITOL E BIOMASSA, NO FATOR DE CONVERSÃO DE XILOSE EM
XILITOL E PRODUTIVIDADE DE XILITOL COM 48 H DE FERMENTAÇÃO DO HIDROLISADO DE
BAGAÇO DE CANA POR C. GUILLIERMONDII PRÉ-CULTIVADA EM MEIO CONTENDO
GLICOSE; GLICOSE + XILOSE; XILOSE...56
FIGURA 19. CONDIÇÕES DE FERMENTAÇÃO PARA A OBTENÇÃO DAS MÁXIMAS ATIVIDADES
DE XR E XDH, FATOR DE CONVERSÃO DE XILOSE EM XILITOL_YP/S, PRODUTIVIDADE DE
XILITOL_QP, EFICIÊNCIA DE CONVERSÃO_η, FORMAÇÃO DE XILITOL, GLICEROL E
1- INTRODUÇÃO
Os materiais lignocelulósicos como os resíduos florestais e agro-industriais constituem-se numa das mais abundantes fontes de matéria orgânica do planeta, com potencial uso como fonte de energia e na produção de insumos químicos, alimentos e enzimas. A cada dia cresce, portanto, o interesse em desenvolver tecnologias alternativas para reutilizar estas fontes renováveis de matéria orgânica visando a obtenção de novos produtos e a diminuição de impactos negativos ao meio ambiente causados pelo acúmulo de tais materiais.
Diversos grupos de pesquisa vêm estudando o aproveitamento dos materiais lignocelulósicos para a obtenção biotecnológica de xilitol. Este produto é um poliol obtido por via química, de poder adoçante equivalente ao da sacarose, utilizado na dieta de diabéticos e obesos. Recentemente foi indicado no tratamento de infecções respiratórias, otites e osteoporose, tornando-se cada vez mais, alvo de estudos, não apenas pelas suas características, mas também devido à possibilidade de aplicação da biotecnologia para a sua obtenção a partir de materiais lignocelulósicos ricos em xilana, como é o caso do bagaço de cana-de-açúcar. O bagaço de cana, um subproduto da indústria sucro-alcooleira, se constitui em uma matéria-prima abundante para ser aplicada em bioprocessos, embora seja utilizado como fonte de energia nas próprias indústrias.
O bagaço, para ser utilizado na produção de xilitol, deve ser submetido a um processo de hidrólise ácida para a liberação de monossacarídeos fermentescíveis da sua fração hemicelulósica, principalmente a xilose. O interesse pelo uso do hidrolisado hemicelulósico do bagaço de cana para a obtenção do xilitol se deve principalmente às características peculiares deste poliol, bem como à possibilidade de desenvolvimento de uma tecnologia capaz de agregar valor ao bagaço e também de contribuir para o meio ambiente pela redução do nível de poluentes.
O aproveitamento do bagaço de cana-de-açúcar para a obtenção biotecnológica de xilitol é uma das principais linhas de pesquisa do Departamento de Biotecnologia (Debiq) da FAENQUIL. Os trabalhos desenvolvidos pelo grupo têm demonstrado que o processo biotecnológico se apresenta como alternativa ao processo químico, via industrial de obtenção de xilitol a partir de hidrolisados hemicelulósicos ricos em xilose.
A bioconversão de xilose em xilitol é influenciada por vários fatores, dentre os quais destacam-se: o tipo de hidrolisado hemicelulósico, a temperatura, o pH, a concentração inicial de xilose e suplementação nutricional do meio de fermentação, a relação glicose:xilose nos hidrolisados, bem como a concentração de compostos inibitórios ao metabolismo microbiano, tais como ácido acético, furfural, hidroximetilfurfural e compostos fenólicos. Estes compostos são tóxicos aos microrganismos, pois interferem nas atividades das enzimas xilose redutase e xilitol desidrogenase, envolvidas nos passos iniciais de assimilação da xilose, em função de suas concentrações no meio de fermentação, o que resulta em baixa eficiência deste bioprocesso.
Muitos dos parâmetros importantes para o desenvolvimento deste bioprocesso já foram estabelecidos, mas ainda são necessários estudos para melhor entendimento das vias metabólicas envolvidas nesta bioconversão, principalmente com relação às atividades das enzimas xilose redutase e a xilitol desidrogenase, as quais são induzidas pela xilose e requerem os cofatores NAD(P)H e NAD(P)+, respectivamente. O conhecimento dos parâmetros que possam interferir na indução e/ou atividade destas enzimas é muito importante, principalmente nas fermentações de hidrolisados hemicelulósicos, uma vez que neles está presente, além da xilose, a glicose, hexose apontada como reguladora do metabolismo de pentoses.
Estudos realizados em meio sintético indicam que a glicose é prejudicial à bioconversão de xilose em xilitol, principalmente devido à repressão catabólica exercida pela glicose sobre a assimilação de xilose. Outros estudos também indicam que o efeito da glicose neste bioprocesso é dependente da sua concentração no meio de fermentação e da proporção em esta se encontra em relação à xilose.
Em função dos vários resultados promissores até agora obtidos relativos ao aproveitamento do bagaço de cana-de-açúcar como matéria-prima para a produção biotecnológica de xilitol e ao fato da relação glicose:xilose variar de acordo com o tipo de material lignocelulósico a ser utilizado neste bioprocesso, este trabalho teve como objetivos principais avaliar o efeito da relação glicose:xilose sobre as atividades das enzimas xilose redutase e xilitol desidrogenase durante a fermentação do hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar, bem como da presença de glicose durante o cultivo do inóculo sobre a bioconversão de xilose em xilitol por Candida guilliermondii.
3
2- REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1- BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR
O Brasil é o maior produtor mundial de cana-de-açúcar, tendo sido estimada uma produção de 340 milhões de toneladas para a safra 2003/2004 (PROCANA, 2004). O bagaço, como subproduto da indústria sucro-alcooleira, atinge aproximadamente 28% desta quantidade, o que equivaleria à cerca de 100 milhões de toneladas por ano. Estimando que 88% do bagaço (aproximadamente 79 milhões de toneladas/ano) será consumido para a produção de vapor, aproximadamente 11 milhões de toneladas será o excedente (GRANDE MORAVIA INDUSTRIAL, 2004), o qual acarreta em graves problemas de estocagem e poluição ambiental (PROCKNOR, 2000), apesar de seu aproveitamento para a geração de energia elétrica nas próprias usinas (PATUSCO, 1997; PANDEY et al., 2000). Além disto, ele é também utilizado na produção de polpa, papel e produtos aglomerados (MITRANI et al., 1999), além de recentes pesquisas indicarem seu aproveitamento na produção de álcool combustível (PESQUISA FAPESP, 2004).
As fibras do bagaço da cana contêm, como principais componentes, cerca de 40% de celulose, 35% de hemicelulose e 15% de lignina. A celulose é um polímero linear constituído por unidades de D-glicose unidas por ligações glicosídicas β-1→4; a hemicelulose é um heteropolímero composto predominantemente por pentoses como D-xilose e L-arabinose e hexoses como D-glicose e D-galactose, enquanto a lignina é uma macromolécula polifenólica constituída por unidades básicas de 3-5-dimetoxi-fenilpropano, 3-metoxi-fenilpropano e 4-hidroxi-fenilpropano (FENGEL, WEGENER, 1989). A elevada proporção de xilose na fração hemicelulósica do bagaço, podendo corresponder a até 80% do total de açúcar nesta fração (RODRIGUES et al., 2001) e a capacidade de assimilação desta pentose por várias leveduras (BARBOSA et al., 1988) são os principais fatores que impulsionam o aproveitamento deste resíduo em diferentes processos de bioconversão.
Além do bagaço de cana, outros materiais lignocelulósicos também vêm sendo estudados como matéria-prima para a obtenção do xilitol, como por exemplo: cavacos de eucalipto (CANETIERI, ALMEIDA E SILVA, FELIPE, 2002), palha de arroz (MUSSATO, ROBERTO, 2003), palha de trigo (CANILHA, CÂNDIDO,
4
ALMEIDA E SILVA, 2003), casca de aveia (FELIPE et al., 2003) e palha de cevada (CÂNDIDO et al., 2004).
2.2- XILITOL: Propriedades e Aplicações
O xilitol (C5H12O5) é um carboidrato natural classificado como um poliol (álcool
polihidroxilado ou açúcar-álcool), sem grupos redutores na sua molécula e com todos os cinco átomos de carbono ligando-se a um grupo OH. É descrito como um pó cristalino branco com poder edulcorante equivalente ao da sacarose e superior ao de outros polióis como sorbitol e manitol (FATIBELLO-FILHO et al., 1996; AGUIAR, OETTERER, MENEZES, 1999; MÄKINEN, 2000).
Entre as propriedades do xilitol estão seus efeitos anti e não-cariogênico (MAKINEN, 1976). O xilitol não é metabolisado pelos microrganismos da flora bucal, principalmente pela bactéria Streptococcus mutans e, além disso, reduz a retenção de glicose na superfície dos dentes, diminuindo a incidência de cárie (MÄKINEN, 1992, IWATA et al., 2003). Sua utilização não proporciona a formação de ácidos que atacam o esmalte dos dentes e ajuda na estabilização de íons cálcio e fosfato na saliva, aumentando a remineralização e possibilitando a reversão de lesões recém formadas (MÄKINEN, 2000; MAGUIRE, RUGG-GUNN, WRIGHT, 2000). Estudos clínicos com crianças em idade escolar evidenciaram que o consumo de xilitol na forma de drágeas ou em produtos como doces, gomas de mascar e cremes dentais, é efetivo na prevenção de cárie dentária e na manutenção da higiene-oral (ALANEN et al., 2000; MAKINEN et al., 2001). Há ainda estudos indicando que o consumo de xilitol por gestantes, durante os últimos meses de gravidez e na amamentação, pode prevenir a transmissão de S. mutans para a criança (SODERLING et al., 2001; CHESTNUTT, 2003).
Uma outra característica importante deste adoçante é o fato de seu metabolismo ser independente de insulina, tendo sido empregado como substituto da glicose em dieta de diabéticos (MANZ, VANNINEN, VOIROL, 1973; PEPPER, OLINGER, 1988; VALERO et al., 2001). Foi verificado ainda, que seu metabolismo pode contribuir para a síntese e glicosilação de colágeno em ratos diabéticos (KNUUTTILA et al., 2000). O xilitol também é usado na terapia da deficiência da enzima glicose-6-fosfato desidrogenase nas hemácias (van EYS et al., 1974) e na dieta de obesos, uma vez que exerce pequena contribuição para a formação de
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tecidos gordurosos quando comparado a outros açúcares (MANZ, VANNINEN, VOIROL, 1973). Em estudos realizados com ratos a ingestão de xilitol reduziu o ganho de peso e o consumo de alimento, além de diminuir os níveis plasmáticos de triglicerídeos e colesterol (ELLWOOD et al., 1999).
Pesquisas mais recentes revelam também o efeito do xilitol no tratamento de doenças respiratórias pela inibição do crescimento de Streptococcus pneumoniae na nasofaringe (KONTIOKARI, UHARI, KOSKELA, 1995; TAPIAINEN et al., 2001). A prevenção de infecção pulmonar em pacientes com fibrose cística também foi constatada com o uso de xilitol, pois este contribui para aumentar o sistema de defesa antibacteriano inato (ZABNER et al., 2000). A utilização de xilitol por crianças, na forma de xarope ou goma de mascar, preveniu também a otite, diminuindo a necessidade de antimicrobianos (UHARI, KONTIOKARI, NIEMELA 1998; UHARI, TAPIAINEN, KONTIOKARI, 2000). A prevenção de osteoporose pela utilização do xilitol foi também relatada em estudos realizados em ratos, onde foi constatado o aumento do volume, do conteúdo mineral e proteção contra a perda das propriedades biomecânicas dos ossos dos ratos cuja dieta continha xilitol (MATILLA, KNUUTTILA, SVANBERG, 1998; MATILLA, SVANBERG, KNUUTTILA, 2001).
A incorporação de xilitol em alimentos é permitida por ser este uma substância atóxica, tendo sua utilização por humanos sido aceita pela European
Economic Community (EEC) desde 1984, e reconhecido como um aditivo do tipo
“GRAS” (Generally Regarded as Safe) pelo Food and Drug Admistration (FDA) dos Estados Unidos, em 1986. A partir de 1994 o xilitol foi considerado como “seguro para os dentes” (Safe for Teeth), e a Joint Expert Comittee on Food Additives (JEFCA), uma divisão da Organização Mundial de Saúde (OMC), confirmou os estudos de toxicidade do xilitol e o classificou como aceitável para consumo diário (Acceptable Daily Intake – ADI). A DL50 em ratos é de 25,7 g/kg de peso corporal, o
que corresponde à ingestão diária de quase dois quilogramas para um adulto de 75 kg (AGUIAR, OETTERER, MENEZES, 1999). Segundo Mäkinen (apud AGUIAR, OETTERER, MENEZES, 1999), uma característica peculiar na absorção de xilitol é um aumento adaptável da absorção durante a administração prolongada. Para pessoas não adaptadas que não têm o costume de ingerir xilitol comumente, a dose máxima tolerável é de 20-40 g/dia, enquanto o aumento das doses pode causar diarréia osmótica.
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De acordo com o Codex Alimentarius, o xilitol é um adoçante permitido para ser utilizado na dieta para diabéticos (AGUIAR, OETTERER, MENEZES, 1999). Atualmente o xilitol é usado em produtos alimentícios, farmacêuticos ou de saúde oral em países como Alemanha, Argentina, Bélgica, Canadá, Estados Unidos, Finlândia, França, Holanda, Inglaterra, Japão, México, Suécia, Suíça, Rússia (CCC – Calorie Control Council, 2004). No Brasil, o xilitol também tem sido utilizado como insumo para diferentes produtos como creme dental, gomas de mascar e pastilhas.
2.3- OCORRÊNCIA E OBTENÇÃO DE XILITOL
Na natureza o xilitol é encontrado em frutas, legumes, leveduras, líquens e algas, porém em baixa proporção (900 mg/100 g) (HYVÖNEN, KOIVISTOINEN, VOIROL, 1982; PEPPER, OLINGER, 1988). O xilitol é também um intermediário metabólico normal no metabolismo de carboidratos em mamíferos, sendo produzido no metabolismo de humanos na proporção de 5 a 15 g por dia (BÄR, 1991, apud WINKELHAUSEN, KUZMANOVA, 1998, p. 1).
Em escala comercial, este adoçante é obtido por via química (MELAJA, HÄMÄLÄINEN, 1977). Segundo Winkelhausen e Kuzmanova (1998), na via química é difícil alcançar alto rendimento (50-60% baseado na xilana convertida) principalmente pelo alto custo dos processos de recuperação e purificação do xilitol, enquanto na produção microbiana são alcançados altos rendimentos a partir de xilose (65-85%).
2.3.1- Obtenção Química
De acordo com Melaja e Hämäläinen (1977) o processo comercial de síntese química de xilitol inicia-se com a obtenção de xilose, a partir de materiais lignocelulósicos ricos em xilana. A xilose é separada do hidrolisado por cromatografia e a solução de xilose pura sofre redução catalítica em xilitol na presença de catalisador (níquel). O xilitol passa então por processo de cristalização, que requer várias etapas de purificação para remoção de resíduos tóxicos do catalisador e de subprodutos que venham a ser formados durante a hidrogenação.
O rendimento deste processo bem como a qualidade do xilitol estão intrinsecamente relacionados com a pureza da solução inicial de xilose, uma vez que
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a presença de impurezas interfere no processo de catálise, sendo necessárias exaustivas etapas de purificação para a obtenção de uma solução inicial de xilose de elevada pureza. Além disso, a produção de xilitol por via química requer várias etapas de purificação para a remoção de resíduos tóxicos do catalisador e de subprodutos originados durante o processo de hidrogenação (MELAJA, HÄMÄLÄINEN, 1977), ocasionando aumento do tempo de processo e encarecimento do produto (PARAJÓ, DOMINGUEZ, DOMINGUEZ, 1998a).
2.3.2- Obtenção Microbiológica
A possibilidade de uma tecnologia alternativa ao processo químico de obtenção de xilitol impulsiona as pesquisas com o objetivo de se alcançar a obtenção microbiológica de xilitol a partir do estudo de microrganismos fermentadores de xilose, podendo ser observado na FIGURA 1 um esquema comparativo entre os processos químico e biotecnológico.
A obtenção de xilitol por fermentação da xilose pode ocorrer empregando-se bactérias, leveduras e fungos filamentosos, sendo as leveduras consideradas como as melhores produtoras (WINKELHAUSEN, KUZMANONA, 1998). Segundo Winkelhausen e Kuzmanona (1998), o metabolismo da xilose em leveduras inicia-se com o seu transporte através da membrana celular, que pode ocorrer por diferentes mecanismos. No caso de C. guilliermondii, no interior das células, a xilose é reduzida em xilitol, em uma reação catalisada pela enzima xilose redutase (E.C. 1.1.1.21) ligada à nicotinamida adenina dinucleotídeo, fosfatada ou não, em sua forma reduzida (NADPH/NADH). O xilitol é oxidado a xilulose pela enzima xilitol desidrogenase (E.C.1.1.1.9) ligada à nicotinamida adenina dinucleotídeo, fosfatada ou não em sua forma oxidada (NADP+/NAD+). A xilulose é fosforilada a xilulose-5-fosfato que pode ser convertida em piruvato através da conexão da via das fosfopentoses com a via Embden-Meyerhof-Parnas (HAHN-HÄGERDAL et al., 1994) (FIGURA 2).
Segundo Gong et al. (1983), a redução de xilose em xilitol e a ativação da via das fosfopentoses em leveduras são controladas pela disponibilidade de NADP+ e NADPH, sendo que a geração de NADP+ durante a redução de xilose pode estimular a atividade da enzima glicose-6-fosfato desidrogenase a qual estimula a ativação da via das fosfopentoses. De acordo com Barbosa et al. (1988), o acúmulo de xilitol na
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célula e sua posterior excreção para o meio estão relacionados à geração de NADPH. Segundo Taylor et al. (1990), a produção de xilitol é favorecida pela elevada produção deste cofator reduzido.
Segundo Barbosa et al. (1988), o NADPH é reoxidado a NADP+ através da via das fosfopentoses e o NAD+ é regenerado a partir de NADH via cadeia respiratória. Entretanto, sob condições de baixa aeração, o NADH produzido não é regenerado através da fosforilação oxidativa. Como resultado, uma fonte alternativa de geração de ATP deve ser obtida. Nestes casos, de acordo com Flores et al. (2000), o NADH produzido na glicólise é reoxidado a NAD+ pela formação de etanol; enquanto o NADH resultante de reações não pertencentes à via glicolítica é regenerado principalmente pela produção de glicerol (FIGURA 2).
A produção de etanol ou glicerol a partir do metabolismo de açúcares em leveduras é dependente das condições de cultivo, uma vez que a formação do glicerol é um mecanismo no qual o microrganismo evita a perda de água para o meio extracelular, enquanto que, no meio intracelular, a sua formação permite a manutenção do equilíbrio redox do citosol, principalmente na ausência de oxigênio (NEVOIGT, STAHL, 1997). Granström e Leisola (2002) observaram que a produção de glicerol ou etanol foi uma estratégia para regeneração de NAD+ em C.
guilliermondii e Candida tropicalis. A formação destes subprodutos foi também
verificada durante o cultivo de C. guilliermondii em meio sintético (GRANSTRÖM, OJAMO, LEISOLA, 2001), em hidrolisado de bagaço de cana (MATOS, FELIPE, SILVA, 2003; RODRIGUES et al. 2003b) e em hidrolisado de casca de aveia (FELIPE et al., 2003).
É interessante também notar que tanto o glicerol como o etanol podem ser utilizados como fontes de carbono e energia por um grande número de leveduras (WALKER, 1998). Segundo Rolland, Winderickx e Thevelein (2002), o etanol formado durante a fermentação pode ser subseqüentemente utilizado como fonte de carbono não fermentescível, resultando em completa utilização de todo o carbono disponível. Isto ocorreria porque, na presença de oxigênio, as células são capazes de respirar e gerar ATP a partir de fontes de carbono não fermentescíveis através da fosforilação oxidativa mitocondrial. Matos, Felipe, Silva (2003) observaram a assimilação de etanol por C. guilliermondii cultivada em hidrolisado de bagaço de cana.
10 O glicerol também pode ser utilizado como fonte de carbono por diferentes leveduras (FLORES et al., 2000). Duas diferentes vias de catabolismo são sugeridas em leveduras: (1) em Saccharomyces cerevisae ou Candida utilis o glicerol é fosforilado por uma glicerol quinase e o L-glicerol-3-fosfato formado é oxidado por uma glicerol fosfato ubiquinona oxirredutase mitocondrial; (2) em
Schizosaccharomyces pombe a desidrogenação do glicerol por uma glicerol
desidrogenase dependente de NAD+ forma dihidroxiacetona, a qual é então fosforilada por uma dihidroxiacetona quinase (GANCEDO, apud FLORES et al., 2000, p. 519).
2.4- Fatores que Influenciam a Bioconversão de Xilose em Xilitol
Muitos fatores estão envolvidos na regulação da conversão de xilose em xilitol, destacando-se a temperatura (BARBOSA et al., 1988; SENE et al., 2000), a idade e a concentração inicial do inóculo (PFEIFER et al., 1996; SILVA et al., 1996a; FELIPE et al., 1997a), a concentração inicial de D-xilose (SILVA et al., 1996a; FELIPE et al., 1997a; ROSA et al., 1998), o suprimento de O2 (FELIPE et al., 1996;
MARTINEZ, SILVA, FELIPE, 2000), o pH (FELIPE et al., 1997b; MORITA, SILVA, FELIPE, 2000; RODRIGUES et al., 2003a). Além destes, a presença de D-glicose (FELIPE et al., 1993; ROSA et al., 1998) e L-arabinose (MATOS et al., 2002a e 2002b) como co-substrato, bem como de compostos fenólicos (PALMQVIST, HAHN-HÄGERDAL, 2000) e ácido acético nos hidrolisados (SILVA, 2001, LIMA et al., 2004) são fatores reguladores desta bioconversão.
Barbosa et al. (1988) relataram que a produção de xilitol por C. guilliermondii cultivada em meio sintético foi favorecida na faixa entre 30 oC a 35 oC, enquanto Sene et al. (2000) encontraram, para esta levedura cultivada em hidrolisado de bagaço de cana, o favorecimento do rendimento em xilitol com o aumento da temperatura de 25 oC para 35 oC.
Segundo Pfeifer et al. (1996) a utilização de inóculo de C. guilliermondii obtido de células jovens (16-24 h) favoreceu a produtividade do xilitol em meio sintético, semelhante ao obtido por Felipe et al. (1997a) quando se utilizou hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana. Segundo estes autores, a utilização de inóculo de C. guilliermondii na faixa de 0,1 a 3,0 g/L favoreceu a produção de xilitol neste
11 hidrolisado, sendo o nível do inóculo dependente da concentração de xilose e da aeração do meio.
A influência da concentração inicial de xilose sobre esta bioconversão tem sido relacionada à disponibilidade de oxigênio no meio, sendo encontrado que, altas concentrações de xilose favoreceram a produção de xilitol por C. guilliermondii porém, concentração inicial acima de 170 g/L resultou em limitação de oxigênio dissolvido ou aumento da pressão osmótica exercida pelo meio de cultura, prejudicando esta bioconversão (SILVA et al., 1996a). Segundo Vandeska et al. (1995), a taxa de consumo de oxigênio determina quando a xilose é utilizada em processos respiratórios ou fermentativos. De acordo com Felipe et al. (1996), a bioconversão de xilose em xilitol por C. guilliermondii a partir do hidrolisado de bagaço de cana é afetada pela taxa de aeração, sendo que alta produtividade foi obtida quando a vazão específica utilizada foi de 0,6 vvm. Martinez, Silva e Felipe (2000) também relataram que o oxigênio é um importante parâmetro neste processo, observando que baixos valores (em torno de 20 h-1) do coeficiente volumétrico de transferência de oxigênio (kLa) foram essenciais para obtenção dos máximos valores
da produção do xilitol por esta levedura em hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana. De acordo com Rosa et al. (1998), durante o cultivo desta mesma levedura em meio sintético, os melhores resultados quanto aos parâmetros fermentativos da produção de xilitol foram obtidos com a concentração de xilose variando de 15 a 60 g/L.
Um outro parâmetro que interfere neste metabolismo é o pH, principalmente quando da utilização de meios formulados à base de hidrolisados lignocelulósicos, devido à presença de ácido acético, cuja toxicidade está relacionada à forte acidez do meio (FELIPE et al., 1997a). Em fermentações de hidrolisado de bagaço por C.
guilliermondii em pH inferior a 4,5 a bioconversão de xilose em xilitol foi fortemente
inibida, encontrando-se o favorecimento da formação de xilitol em condições de pH próximo a 6,5 (FELIPE et al., 1997b). Morita, Silva e Felipe (2000) também constataram a influência do pH inicial do meio de fermentação, verificando que os máximos valores de rendimento e produtividade volumétrica de xilitol, produtividade de células e consumo de xilose foram obtidos em pH 7,0. De acordo com Rodrigues et al. (2003a), em fermentações em batelada do hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana por C. guilliermondii, os máximos valores de rendimento e produtividade de xilitol foram obtidos
em pH 5,5, enquanto que em pH 7,5 o metabolismo de xilose pela levedura resultou em maior crescimento celular do que formação de xilitol.
A arabinose, pentose presente em baixas concentrações no hidrolisado de bagaço de cana é lentamente assimilada por C. guilliermondii, porém durante a avaliação de sua influência sobre a bioconversão de xilose em xilitol, Matos et al. (2002a), encontraram que a obtenção do inóculo de C. guilliermondii a partir do cultivo das células em meio contendo arabinose resultou em favorecimento do rendimento em xilitol.
No caso dos hidrolisados hemicelulósicos, a presença de compostos tóxicos aos microrganismos, como furfural, hidroximetilfurfural, ácido acético e compostos fenólicos, deve ser também considerada, uma vez que estes inibem a atividade microbiana. Furfural e hidroximetilfurfural exercem efeito inibitório no crescimento de
C. guilliermondii em concentrações acima de 1 g/L (SANCHES, BAUTISTA, 1988). O
ácido acético exerceu efeito inibitório sobre a bioconversão de xilose em xilitol em concentrações acima de 5 g/L (LIMA et al., 2004), sendo este efeito também dependente do tempo de fermentação em que a levedura foi exposta a este ácido (SILVA, 2001). Em relação aos compostos fenólicos, seu efeito inibitório é devido à capacidade de se associarem a membranas biológicas, causando perda de integridade e afetando sua habilidade de servir como barreira seletiva (PALMQVIST, HAHN-HÄGERDAL, 2000).
Para contornar o problema da toxicidade do hidrolisado, este é concentrado e tratado, anteriormente à sua utilização como meio de fermentação, para reduzir as concentrações dos compostos tóxicos até níveis toleráveis pela levedura. O processo de concentração a vácuo, que é utilizado para aumentar o teor de xilose no hidrolisado e favorecer a produção de xilitol também auxilia na redução do teor dos compostos tóxicos voláteis, como o ácido acético, mas também aumenta a concentração dos não voláteis (RODRIGUES et al., 2001). Assim, são utilizados diferentes procedimentos de tratamento dos hidrolisados como variação do pH com ácidos e bases associada à adsorção em carvão ativo (ALVES et al., 1998; MARTON et al., 2003), a utilização de resinas de troca-iônica (VINÃLS, MANCILHA, POPPI, 2000,) ou mesmo a combinação destes procedimentos (MARTON et al., 2004). Outras metodologias que propiciaram a melhoria da produtividade de xilitol por C. guilliermondii foram a utilização de células adaptadas ao hidrolisado e a reutilização destas em sucessivas etapas de fermentação, encontrando-se a
redução da concentração dos compostos tóxicos do hidrolisado de bagaço de cana principalmente pela assimilação do ácido acético (SENE et al., 1998; MATOS, 2004). Além disso, também tem sido avaliada a reutilização de células de C. guilliermondii imobilizadas em alginato de cálcio (CARVALHO et al., 2003).
2.4.1 Influência da Glicose como Co-Substrato na Bioconversão de Xilose em Xilitol
A produção de xilitol a partir de hidrolisados hemicelulósicos é um processo influenciado pela concentração de açúcares no meio de fermentação e pela proporção em que estes açúcares aparecem, uma vez que altas concentrações de açúcares monoméricos poderiam causar estresse osmótico, inibir a indução da enzima xilose redutase, ou levar à produção de etanol em concentração acima do nível de tolerância da levedura (WALTHER, HENSIRISAK, AGBLEVOR, 2001). Segundo Walther, Hensirisak e Agblevor (2001), a proporção de açúcares pode influenciar o transporte ou a cinética enzimática em casos em que ambos os açúcares competem pelo mesmo sistema de transporte ou são simultaneamente metabolizados. No caso de hidrolisados hemicelulósicos, obtidos por hidrólise ácida, a concentração destes açúcares é variável em função da matéria-prima (TABELA I).
TABELA I. Principais açúcares encontrados em hidrolisados hemicelulósicos de diferentes matérias-primas
Açúcares (g/L)
Matéria-Prima Xilose Glicose Arabinose
Relação glicose:xilose Referências Bagaço de cana 18,24 1,20 1,71 1:15 RODRIGUES et al., 2003b Palha de trigo 10,65 2,79 1,78 1:4 CANILHA, CÂNDIDO, ALMEIDA E SILVA, 2003 Palha de arroz 18,33 3,29 3,40 1:6 MUSSATO, ROBERTO, 2003 Casca de
aveia 32,33 1,61 3,03 1:20 FELIPE et al., 2003 Cavacos de
eucalipto 19,17 2,54 0,41 1:8
CANETTIERI, ALMEIDA E SILVA, FELIPE, 2002
De acordo com Spencer-Martins (1994), a utilização de carboidratos por leveduras requer ou seu transporte através da membrana plasmática ou sua
hidrólise externa, seguida pelo consumo de seus produtos resultantes, encontrando-se que os monossacarídeos podem entrar auxiliados por proteínas de membrana (permeases ou carreadores) a partir de mecanismos de difusão facilitada dependentes do gradiente de concentração do açúcar, ou por mecanismo ativo dependente de energia metabólica.
A literatura não apresenta informações quanto aos mecanismos específicos para utilização de açúcares em C. guilliermondii, mas em geral as células transportam glicose preferencialmente, porém as membranas celulares não são livremente permeáveis a moléculas de açúcares altamente polares e vários mecanismos complexos existem para a translocação da glicose para o interior das células (WALKER, 1998). Em S. cerevisiae, o transporte de monossacarídeos como a glicose ocorre por difusão facilitada porém, a situação pode ser diferente em outras leveduras (FLORES et al., 2000).
A difusão facilitada é mencionada como sistema de transporte para
Kluyveromyces lactis a partir de dois genes que codificam transportadores com
diferentes afinidades por glicose (BILLARD et al., 1996), enquanto em C. utilis este sistema ocorre quando as células são cultivadas sob altas concentrações de glicose embora o transporte por simporte com prótons ocorra sob baixa concentração desta hexose (van den BROEK et al., 1997).
O transporte de xilose em leveduras tem sido bastante investigado bioquimicamente, evidenciando os mecanismos por simporte xilose/próton de alta afinidade e difusão facilitada como sistemas operados nestes microrganismos (GÁRDONYI et al., 2003). Ainda segundo Gárdonyi et al. (2003), o sistema de transporte ativo simporte xilose/próton mostra maior especificidade e alta afinidade para xilose quando comparado aos transportadores por difusão facilitada.
Em Pichia stipitis o transporte de D-xilose (simporte de prótons) ocorre através de um sistema de alta afinidade e outro de baixa afinidade, sendo o de baixa afinidade compartilhado por D-xilose e D-glicose, ao passo que o de alta afinidade é inibido por glicose. Ao contrário do observado para P. stipitis, o transporte de D-xilose em Candida shehatae ocorre tanto por simporte de prótons como por difusão facilitada (KILIAN, van UDEN, 1988).
Para leveduras, a glicose é a fonte de carbono e energia preferencial. É uma importante molécula mensageira primária, ótima sinalizadora das condições de crescimento para a maquinaria celular. A glicose também afeta muitas
características de leveduras comercialmente importantes, como a taxa de crescimento, a capacidade fermentativa e a resistência ao estresse (ROLLAND, WINDERICKX, THEVELEIN, 2002).
Várias leveduras fermentadoras de pentoses parecem diferir em suas respostas ao efeito regulatório que a glicose e outras hexoses podem exercer sobre o metabolismo de xilose e outros açúcares. Em geral, o modelo observado para o comportamento de leveduras durante o cultivo em mistura de açúcares é a inibição ou retardamento da utilização de xilose pela presença de glicose no meio, observando-se que os açúcares são assimilados seqüencialmente sendo a glicose o primeiro a ser consumido (DU PREEZ, 1994; TAVARES et al., 2000). Walther, Hensirisak e Agblevor (2001) observaram, durante o cultivo de C. tropicalis em meio contendo xilose (60 g/L) e glicose (0-80 g/L), a utilização seqüencial destes açúcares. Estes autores constataram que se a glicose estava presente no meio, alta densidade celular foi obtida sem o consumo da xilose e a produção de xilitol foi fortemente inibida por dois mecanismos: (1) o consumo de xilose foi reprimido e (2) o etanol produzido a partir da utilização da glicose inibiu parcialmente a formação de xilitol. Além disso, o rendimento de xilitol foi influenciado em função da presença de glicose e do regime de aeração, observando-se o máximo rendimento na presença de glicose em condição microaeróbia.
Felipe et al. (1993) também constataram que o efeito da glicose sobre a bioconversão de xilose em xilitol foi dependente da proporção desta em relação a xilose, sendo que a formação de xilitol por C. guilliermondii em meio semi-sintético não foi afetada quando a concentração desta hexose foi inferior a 10% do total de xilose. ROSA et al. (1998) observaram o favorecimento da formação de xilitol por C.
guilliermondii em meio sintético contendo xilose (60 g/L) e glicose (5 g/L).
Em trabalhos realizados com Pachysolen tannophilus constatou-se um efeito benéfico no consumo de xilose com a presença de 0,5% de glicose no meio (JEFFRIES, LIGHTFFOT, FADY, 1985). Segundo Yahashi et al. (1996a), a bioconversão de xilose em xilitol por células imobilizadas de C. tropicalis foi mais eficiente na presença de glicose, a qual foi utilizada para o crescimento celular antes da utilização da xilose, permitindo a geração de NADPH pelo metabolismo através da via das fosfopentoses.
De acordo com Lee (1992), a glicose parece inativar as enzimas envolvidas no metabolismo da xilose, mas a inativação pode ser reversível em baixas
concentrações de glicose. A presença desta hexose prontamente metabolizável pode levar a problemas de regulação devido à interação entre o metabolismo de diferentes açúcares, resultando em pobre assimilação de xilose e grande influência no rendimento e produtividade de xilitol (TAVARES et al., 2000).
A presença de glicose como co-substrato também é importante quando se utilizam microrganismos recombinantes para obtenção de xilitol, principalmente S.
cerevisiae, a fim de se fazer manutenção da energia e geração de NAD(P)H
(HALLBORN et al., 1994; THESTRUP, HAHN-HÄNGERDAL, 1995).
A estimulação do metabolismo de xilose pela glicose pode ser explicada pela geração de intermediários metabólicos para os passos iniciais do metabolismo de xilose pela via das fosfopentoses, através do metabolismo da glicose (FIGURA 2), uma vez que coenzimas tais como NADH e NADPH são essenciais para a redução enzimática da xilose com xilose redutase (MEINANDER, BOELS, HAHN-HÄNGERDAL, 1999; CHUNG et al., 2002).
2.5- As Enzimas Xilose Redutase e Xilitol Desidrogenase
A enzima xilose redutase (XR) de C. guilliermondii é um membro da superfamília aldo-ceto redutase (HANDUMRONGKUL, MA, SILVA, 1998). Entre as enzimas que catalisam reações de oxidação e redução em sistemas vivos estão aquelas pertencentes à superfamília aldo-ceto redutase (AKR). Membros desta superfamília são encontrados em todos os tipos de organismos, como mamíferos, anfíbios, plantas, leveduras, protozoários e bactérias (JEZ, GEOFFREY, PENNING, 1997; JEZ, PENNING, 2001).
A superfamília aldo-ceto redutase é composta por 14 famílias e mais de 100 proteínas (UNIVERSITY OF PENNSYLVANIA, 2004). Embora vários dímeros e tetrâmeros tenham sido caracterizados, elas são na maioria, proteínas monoméricas, com massa molecular de aproximadamente 35 kDa, e catalisam a redução de aldeídos em seus correspondentes álcoois (JEZ, PENNING, 2001). Segundo Ellis (2002), as enzimas da superfamília AKR compartilham um dobramento tridimensional em forma de barril (α/β)8, e informações estruturais têm revelado
importantes detalhes sobre o mecanismo catalítico que envolve um conjunto de quatro aminoácidos que consiste de tirosina, histidina, aspartato e lisina (Tyr, His, Asp e Lys), que são uma seqüência conservada na maioria das AKR. De acordo
com Wilson et al. (2003), após a transferência de H+ do cofator, um próton da tirosina é ativado pela cadeia lateral da lisina; o aspartato serve para polarizar a cadeia lateral da lisina, enquanto que o papel da histidina ainda não está claro, mas parece estar associado à ligação do substrato. Todas as AKRs conhecidas possuem atividade enzimática utilizando o cofator NADPH como doador de H+ e algumas podem utilizar, adicionalmente, o NADH (NEUHAUSER et al., 1998). Outra característica que também parece ser altamente conservada é a ligação destas enzimas ao cofator NADPH sem um dobramento Rossman (JEZ, GEOFFREY, PENNING, 1997; ELLIS, 2002).
As XRs de leveduras formam a sub-família AKR2B8, as quais catalisam a redução de xilose em xilitol, como parte da via para a xilulose, a qual pode conectar-se às vias fosfopentoconectar-se, Embden-Meyerhof ou fosfocetolaconectar-se (FIGURA 3). Elas são proteínas monoméricas consistindo de cerca de 320 aminoácidos, com um alto grau de similaridade na seqüência destes aminoácidos (ELLIS, 2002).
FIGURA 3. Esquema do metabolismo de D-xilose em leveduras. (—) via das fosfopentoses, (----) via fosfocetolase, (1) xilose redutase, (2) xilitol desidrogenase, (3) xilulosequinase, (4) enzimas da via das fosfopentoses, (5) enzimas da via glicolítica + piruvato descarboxilase + álcool desidrogenase, (6) fosfoglicose isomerase, (7) glicose 6P e 6 fosfogluconato desidrogenase, (8) xilulose 5P fosfocetolase, (9) acetatoquinase e álcool desidrogenase (GÍRIO, AMÁLIA PEITO, AMARAL-COLLAÇO, 1989).
Xilose redutase de diferentes leveduras e fungos têm sido purificadas e parcialmente caracterizadas. A maioria destas enzimas é monomérica com massa molar em torno de 33 a 40 kDa, porém, as enzimas de P. stipitis e C. tropicalis consistem de duas subunidades idênticas, sendo que a natureza da interação destas subunidades ainda não é bem conhecida, bem como a existência de interação alostérica durante a redução de xilose pela xilose redutase de P. stipitis (LEE, 1998).
Estudos têm sido desenvolvidos para a identificação dos resíduos cataliticamente essenciais na XR, e esclarecimento quanto ao seu mecanismo de reação. Em estudos de modificação química, os aminoácidos cisteína e histidina mostraram-se essenciais para a atividade desta enzima (WEBB, LEE, 1990). Webb e Lee (1992) observaram modificações na atividade enzimática após tratamento com modificadores dos grupos histidil e tiol, sugerindo o envolvimento destes grupos no sítio catalítico da XR. Além disto, Kostrzynska, Sopher e Lee (1998) observaram que em P. stipitis os resíduos de lisina (Lis 270) estão envolvidos na ligação da XR ao cofator NADPH.
O gene (xyl 1) da xilose redutase dependente de NAD(P)H de P. stipitis foi clonado e seqüenciado (AMORE et al., 1991; HALLBORN et al., 1991). Este gene não contém íntrons e é composto por uma região codante de 954 pb, que codifica um polipepetídeo com 318 aminoácidos e massa molar de 35,8 kDa (LEE, 1998). Dois genes da XR de C. tropicalis também foram clonados e seqüenciados e os produtos destes genes diferem em apenas 3 aminoácidos (YOKOYAMA et al., 1995).
Handumrongkul, Ma e Silva (1998) clonaram e caracterizaram o gene de xilose redutase (xyl 1) de C. guilliermondii ATCC 20118. A região codante de xyl 1 contém 954 nucleotídeos e codifica uma proteína de 317 aminoácidos com massa molar de 36 kDa, baixo ponto isoelétrico (pI 5,7) e um alto conteúdo de aminoácidos hidrofóbicos com predominância de resíduos de leucina. Segundo estes autores, a seqüência de aminoácidos derivados da xilose redutase de C. guilliermondii foi 70,4% homóloga à de P. stipitis e diferenças na especificidade do cofator podem ser devido a diferenças no número de resíduos histidina e nas suas localizações entre as duas proteínas. As XRs de C guilliermondii e P. stipitis contêm número e localização idênticos para os resíduos de cisteína e diferentes localizações para histidina; além disto, C. guilliermondii possui um resíduo de histidina adicional, o que pode contribuir para a sua afinidade pelo cofator NADPH.
Quanto à xilitol desidrogenase (XDH), ainda são encontrados poucos trabalhos na literatura que descrevem esta enzima. Em P. stipitis esta enzima possui duas subunidades de 32 kDa, apresentando massa molecular de 63 kDa (RIZZI et al., 1989). Já a xilitol desidrogenase de C. shehatae apresentou massa molar de 82 kDa para a enzima na sua forma nativa e de 40 kDa na forma desnaturada, indicando que a xilitol desidrogenase é composta de duas subunidades (YANG, JEFFRIES, 1990). No caso de Neurospora crassa, a XDH apresenta massa molar de 87 kDa, sendo composta por duas subunidades idênticas de 43,6 kDa (PHADTARE, RAWAT, RAO, 1997). KÖTTER et al. (1990) isolaram e caracterizaram o gene da xilitol desidrogenase (xyl 2) de P. stipitis. A região codante do gene xyl 2 contém 1089 nucleotídeos e codifica um polipeptídeo de 363 aminoácidos com massa molar de 38,5 kDa.
As estruturas moleculares das enzimas XR e XDH de diferentes leveduras podem ser observadas nas FIGURAS 4, 5 e 6.
Dependendo da levedura, as enzimas xilose redutase e xilitol desidrogenase podem ter especificidades diferentes em relação aos cofatores oxidados e reduzidos. A enzima XR sintetizada por C. utilis requer como cofator NADPH, enquanto a XDH é dependente de NAD+. Porém, em P. stipitis, C. shehatae e P. tannophilus estas enzimas têm afinidade pelos cofatores reduzidos (NADPH/NADH) e oxidados (NAD+/NADP+) (BRUINENBERG et al., 1984; HAHN-HÄNGERDAL et al., 1994). Em
C. guilliermondii FTI 20037 a enzima XR é NADPH-dependente e a enzima XDH é
NAD+ ou NADP+-dependente (SILVA et al.,1996a).
Segundo Silva et al. (1996a), a atividade enzimática de XR e XDH de C.
guilliermondii foi fortemente afetada pela idade do inóculo e a concentração inicial de
xilose durante fermentação de meio sintético. Estes autores determinaram que as maiores atividades de XR e XDH foram verificadas empregando-se inóculo de 40 h e concentração inicial de xilose de 120 g/L.
De acordo com Lee, Sopher e Yau (1996), em C. guilliermondii a utilização de xilose está sujeita à regulação por indução e repressão catabólica, encontrando-se que a D-xilose e a L-arabinose são os melhores indutores das atividades de XR e XDH, enquanto que a D-glicose reprime esta indução. Sugai e Delgenes (1995) relataram que a glicose reprimiu parcialmente a indução da aldose redutase de C.
FIGURA 4. Estrutura da xilose redutase de C. tenuis, a partir do Structure Explorer 1MI3-PDB (KAVANAGH, KLIMACEK, NIDETZKY, 2003).
FIGURA 5. Estrutura da xilose redutase de P.
guilliermondii, a partir do Swiss-Model
(Automated Protein Modelling Server) (KOPP, SCHEDE, 2004).
FIGURA 6. Estrutura da xilitol desidrogenase de
Candida sp., a partir do Swiss-Model
(Automated Protein Modelling Server) (PEITSCH, 1995).
que a intensidade desta repressão catabólica está correlacionada com a concentração de glicose no sistema de indução.
De acordo com Rosa et al. (1998) quando C. guilliermondii foi cultivada em meio sintético contendo xilose (60 g/L) e glicose (0-30 g/L), as atividades de XR e XDH foram sensíveis à concentração de glicose presente no meio de cultura. A máxima atividade de XR foi obtida com 5,0 g/L de glicose, enquanto a maior atividade de XDH ocorreu na ausência de glicose. Silva et al. (1996b) também observaram um baixo rendimento de xilitol durante a fermentação de meio contendo xilose e glicose (relação glicose:xilose de 1:4) por C. guilliermondii em relação ao valor obtido na ausência de glicose no meio, provavelmente devido à repressão causada por D-glicose sobre a síntese de XR e XDH.
Para C. guilliermondii cultivada em meio sintético, as melhores condições
para se obter altas atividades de XR e XDH foram: pH inicial entre 3,0-5,0, concentração de xilose variando entre 15-60 g/L, concentração de glicose entre 0-5,0 g/L e tempo de fermentação entre 12-24 h (ROSA et al., 1998).
No caso da utilização do hidrolisado de bagaço de cana por C. guilliermondii, as condições ambientais para alcançar as melhores atividades de XR e XDH foram diferentes das observadas em meio sintético (SENE et al. 2001a). Segundo Sene et al. (2001a), a máxima atividade específica de XR foi encontrada nas condições de temperatura de 65 °C e pH variando entre 5,0-6,0; enquanto que a máxima atividade de XDH foi encontrada nas condições de temperatura de 40 °C e pH variando de 8,0-8,5. Ainda segundo estes autores, os valores de KM para ambas as enzimas
contra substratos e cofatores são: para XR, 6,4x10-2 mM (xilose) e 9,5x10-3 mM (NADPH); para XDH, 1,6x10-1 mM (xilitol) e 9,9x10-2 mM (NAD+).
Também é importante acrescentar que as melhores condições ambientais necessárias para se obter altas atividades enzimáticas são diferentes das condições necessárias para se obter altos rendimentos de xilitol (SENE et al., 2000, SENE et al., 2001a). Ainda, outros fatores como a concentração e o tipo de tratamento do hidrolisado e a presença de compostos tóxicos à levedura, como o ácido acético, podem influenciar as atividades enzimáticas de XR e XDH (ALVES et al., 2002, LIMA et al., 2004). Por outro lado, o ácido acético, considerado tóxico à C. guilliermondii em função de sua concentração no meio (FELIPE et al., 1995) influenciou positivamente as atividades de XR e XDH de C. guilliermondii quando sua concentração nos meios de fermentação sintético ou hidrolisado de bagaço de cana
não ultrapassou a 5,0 g/L, sendo a concentração inicial de xilose de cerca de 42 g/L e relação glicose:xilose de 1:20 (LIMA et al., 2004). Além disto, o reciclo de células, utilizado como forma de contornar o problema da toxicidade do hidrolisado de bagaço de cana durante a bioconversão de xilose em xilitol por C. guilliermondii, não resultou em aumento das atividades de XR e XDH, embora tenha favorecido a produtividade de xilitol (MATOS, 2004). Entretanto, ainda segundo Matos (2004), a adaptação do inóculo desta levedura a partir do cultivo em concentrações crescentes do hidrolisado, ou seja, em maior concentração de açúcares e compostos tóxicos, aumentou a atividade da XDH.
2.6- Recuperação do Xilitol
A recuperação do xilitol é o passo mais complexo de todo o processo fermentativo devido à baixa concentração do produto e à complexa composição do meio de fermentação (DE FAVERI et al., 2004).
Gurgel et al. (1995) avaliaram a recuperação do xilitol a partir da fermentação de hidrolisado de bagaço de cana através da clarificação do meio fermentado com carvão ativo e tratamento com resinas de troca iônica, seguido de cristalização. Heikkilä (apud PARAJÓ, DOMINGUEZ, DOMINGUEZ, 1998b, p. 39) propuseram uma metodologia de recuperação do xilitol através da separação por cromatografia, seguida de cristalização. De Faveri et al. (2002) descreveram a recuperação do xilitol por cristalização de soluções sintéticas e de hidrolisados hemicelulósicos fermentados a partir da evaporação da solução sob baixa pressão até supersaturação, seguida de resfriamento e separação dos cristais por centrifugação e filtração. Segundo estes autores, o valor de supersaturação do xilitol e a temperatura de resfriamento foram os principais fatores a afetar a cristalização do poliol uma vez que influenciam a cinética de cristalização. Mais recentemente, Morita, Silva, Maugeri (2003) avaliaram a separação do xilitol utilizando zeólita como uma alternativa aos processos cromatográficos convencionais, verificando que a separação do xilitol a partir de hidrolisado de bagaço de cana fermentado levou a frações com xilitol puro.
3- MATERIAL E MÉTODOS
3.1- OBTENÇÃO E PREPARO DO HIDROLISADO HEMICELULÓSICO DE BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR
3.1.1- Hidrólise Ácida
O bagaço de cana proveniente da Usina Guarani, Olímpia/SP foi primeiramente seco em estufa a 100 ºC, até peso constante, para a determinação de seu teor de umidade. Em seguida este foi hidrolisado na planta piloto de hidrólise ácida do Departamento de Engenharia Química (Dequi) da FAENQUIL, em reator de aço inox AISI 316 com capacidade volumétrica total de 350 litros, equipado com camisa de óleo térmico para aquecimento indireto por resistência elétrica. A hidrólise foi realizada conforme metodologia estabelecida por Pessoa Júnior, Mancilha, Sato (1997), empregando-se 100 mg de H2SO4 por grama de matéria seca para uma
relação sólido-líquido de 1:10, temperatura de 121 oC, por 20 minutos. O hidrolisado obtido foi primeiramente filtrado a vácuo em filtro de porcelana com papel qualitativo, para remoção de massa residual de sólidos (celulose, lignina), e armazenado em câmara fria para posterior tratamento, concentração e caracterização.
3.1.2- Caracterização e Concentração do Hidrolisado
Após a hidrólise, o hidrolisado foi caracterizado quanto ao pH, à concentração dos açúcares xilose, glicose e arabinose e à concentração dos compostos tóxicos furfural, hidroximetilfurfural, ácido acético e compostos fenólicos. Em seguida este foi submetido ao processo de concentração à vácuo.
O fator de concentração do hidrolisado foi de 3, ou seja, correspondente a 3 vezes o seu teor inicial de açúcares com a finalidade de aumentar a concentração inicial de xilose e reduzir o teor de compostos tóxicos voláteis. A metodologia foi estabelecida por Rodrigues et al. (2001), a qual consistiu de utilização de um concentrador à vácuo com aquecimento por fluido térmico em banho termostático, dotado de um sistema de condensação e coleta de frações, empregando-se
temperatura de 70 oC e hidrolisado com pH ajustado para 0,92 com H2SO4, quando
necessário.
3.1.3- Tratamento do Hidrolisado
O tratamento, realizado segundo metodologia estabelecida por MARTON (2002), foi feito pelo ajuste do pH inicial do hidrolisado para pH 7,0 adicionando-se óxido de cálcio (CaO), seguido pela sua diminuição até 2,5 utilizando-se ácido fosfórico (H3PO4). Após esta etapa, 1% de carvão ativo foi adicionado ao hidrolisado,
sendo a mistura submetida a agitação em incubadora de movimento rotatório (New Brunswick, Scientific Co.) a 200 rpm, a 60 oC durante 30 minutos. A cada etapa de alteração de pH e adição de carvão o hidrolisado foi filtrado em papel de filtro Whatmann para remoção do precipitado formado.
O hidrolisado concentrado e tratado foi autoclavado a 111 °C por 15 minutos e em seguida foi novamente caracterizado quanto ao pH e à concentração de xilose, glicose, arabinose, furfural, hidroximetilfurfural, ácido acético e fenóis totais.
3.2- MICRORGANISMO
Os experimentos foram realizados com a levedura Candida guilliermondii FTI 20037. Foi utilizada uma cultura-estoque do Debiq, mantida em ágar extrato de malte à 4 oC.
Cabe informar que em trabalho recente, Lima, Felipe e Torres (2003) propuseram a reclassificação taxonômica desta levedura para Candida tropicalis, baseada em análise filogenética molecular (análise de seqüências do rDNA e do gene xyl 1).
3.3- PREPARO DO INÓCULO
Para as fermentações foram preparados inóculos cultivados em meios contendo (NH4)2SO4 (2 g/L), CaCl2.2H2O (0,1 g/L) e solução de extrato de farelo de
