UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA FACULDADE DE MEDICINA DA BAHIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
Camilla Sampaio Paixão
Dissertação de mestrado Salvador (Bahia), 2016
CONTRIBUIÇÃO DAS METALOPROTEINASES1 E 3 PARA A
RE-EPITELIZAÇÃO DAS LESÕES DE PACIENTES COM
UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA FACULDADE DE MEDICINA DA BAHIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
Camilla Sampaio Paixão
Professor-orientador: Sara Timóteo Passos Professor Co-orientador: Lucas Pedreira de Carvalho
Salvador (Bahia),2016
Dissertação apresentada ao Colegiado
do PROGRAMA DE
PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE, da Faculdade de Medicina da Universidade Federal da Bahia, como pré- requisito obrigatório para a obtenção do grau de Mestre em Ciências da Saúde, da área de concentração em Imunologia. Salvador (Bahia), 2016.2
CONTRIBUIÇÃO DAS METALOPROTEINASES1 E 3 PARA A
RE-EPITELIZAÇÃO DAS LESÕES DE PACIENTES COM
FONTES DE FINANCIAMENTO
- Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq - National Institutes of Health - NIH – AI088650
COMISSÃO EXAMINADORA
Membros Titulares:
Dra. Alda Maria da Cruz, Possui graduação em Medicina pela Fundação Técnico Educacional Souza Marques (1986), mestrado (1993) e doutorado (1999) em Medicina Tropical pela Fundação Oswaldo Cruz (1993). Pesquisadora do Laboratório Interdisciplinar de Pesquisas Médicas do Instituto Oswaldo Cruz/FIOCRUZ e professora associada da Disciplina de Parasitologia da Faculdade de Ciências Médicas/UERJ. Chefe do Laboratório Interdisciplinar de Pesquisas Médicas, IOC/FICRUZ.
Dra. Camila Indiani de Oliveira, possui graduação em Ciências Biológicas pela Universidade de São Paulo (1995) e doutorado em Ciências (Biologia da Relação Patógeno-Hospedeiro) pela Universidade de São Paulo (2000). Pesquisadora do Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz/FIOCRUZ e professora permanente dos cursos de pós-graduação em Patologia e em Ciências da Saúde. Professora adjunta da Fundação Bahiana para o Desenvolvimento das Ciências.
Dra. Silvane Braga, professora Adjunto da Universidade Estadual de Feira de Santana (UEFS), Farmacêutica Bioquímica do Complexo Hospitalar Universitário Professor Edgard Santos da Universidade Federal da Bahia (Com-HUPES-UFBA) e Pesquisadora Associada do Serviço de Imunologia do Com-HUPES-UFBA. Mestre e Doutora em Imunologia pela Universidade Federal da Bahia.
Membro Suplente:
Dr. Lucas Pedreira de Carvalho, possui graduação em Ciências Biológicas pela Universidade Católica do Salvador (2001), professor adjunto de Imunologia, do Instituto de Ciências da Saúde da Universidade Federal da Bahia, professor do Curso de
Pós Graduação em Ciências da Saúde da Universidade Federal da Bahia e pesquisador do Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz/FIOCRUZ.
Dra. Sara Passos, possui graduação em Ciências Biológicas pela Universidade Católica do Salvador (2001), mestrado em Imunologia pela Universidade Federal da Bahia (2004) e doutorado em Imunologia pela Universidade Federal da Bahia (2006). Professora permanente dos cursos de pós-graduação em imunologia e em Ciências da Saúde. Pesquisadora associada da Universidade Federal da Bahia e Houston Methodist Research Institute.
“A recompensa da humildade e do temor do Senhor são a riqueza, a honra e a vida.”
DEDICATÓRIA
Àquele que me criou, me deu vida, e tem me conduzido durante toda essa caminhada. A Jesus Cristo, meu Senhor e Deus.
Aos meus amados pais Eliana e Manoel, por toda força e ensinamentos que me ajudaram a chegar até aqui.
Ao meu irmão, Danilo e minha cunhada Ariane, por todo suporte, paciência e incentivo.
À meu irmão Murilo e Wendia por todo carinho e amizade.
AGRADECIMENTO ESPECIAL
À minha orientadora, Dra Sara Passos, pela confiança no desenvolvimento do projeto; pelo aprendizado e crescimento que me proporcionou. Agradeço por ser uma peça chave em tornar esta jornada agradável e enriquecedora.
Ao meu co-orientador, Dr. Lucas Carvalho, pelas palavras de orientação, sabedoria, ensinamentos, críticas e sugestões. Serei eternamente grata.
A minha querida amiga Rúbia, agradeço de coração por ter acreditado no meu potencial. Pela confiança, paciência, suporte e apoio que teve comigo. Tenha minha eterna admiração e gratidão.
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente à Deus, pela permissão de concluir este trabalho. Pela paciência e encorajamento para nunca desistir. Por ter colocado pessoas maravilhosas em meu caminho na qual fizeram parte desta realização.
À todos os familiares e amigos por estarem ao meu lado e me darem força. A todos estes que tornaram essa caminhada mais leve e feliz, e fizeram tudo valer à pena.
Aos Dr. Edgar Carvalho e Dr. Paulo Machado, pela oportunidade de desenvolver este projeto no Serviço de Imunologia e pelas valiosas contribuições para este estudo.
Aos colegas do Laboratório Imunologia e Biologia Molecular:
Às minhas queridas amigas Rúbia Costa, Tais Brito e Andrea pela amizade na qual construímos. Pelos ensinamentos, ajuda e compreensão prestada.
Aos colegas do Posto de Saúde de Corte de Pedra, em especial a Ednaldo e Neusa Lago e Dr. Luiz Henrique Guimarães que foram importantes no recrutamento e inclusão dos pacientes no estudo. À equipe de funcionários do Serviço de Imunologia que viaja quinzenalmente para Corte de Pedra diagnosticando e acompanhando o tratamento dos pacientes.
A cada um dos colegas do Serviço de Imunologia, por colaboraram direta ou indiretamente com o progresso deste trabalho. Aos professores e funcionários do Programa de Graduação em Ciências da Saúde. Aos colegas do Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, por tornarem o ambiente de aprendizado mais prazeroso e pelas contribuições profissionais e pessoais.
ÍNDICE
Índice de tabelas Lista de abreviaturas e siglas 14
Índice de figuras 16
I. RESUMO 17
II. OBJETIVOS 18
II.1 Objetivo geral 18
II.2 Objetivos específicos 18
III. INTRODUÇÃO 19
IV. REFERENCIAL TEÓRICO 21
IV.1 Leishmaniose tegumentar americana (LTA) 21
IV.1.1 Aspectos Epidemiológicos e Clínicos da Leishmaniose tegumentar americana (LTA)
21
IV.1.2 Resposta imune e lesão tecidual na leishmaniose 23 IV.1.3Participação dos monócitos/macrófagos na leishmaniose 25
IV.1.3 Participação dos linfócitos na leishmaniose 26
IV. 1.4 Metaloproteinases de matriz 26
V. CASUÍSTICA, MATERIAL E MÉTODOS 28
V.1 Area de estudo 28
V.2 Desenho de estudo 29
V.3 DEFINILÇOES DE CASOS 29
V.3.1 Leishmaniose cutânea (LC) 29
V.3.2 Indivíduos Sadios (IS) 29
V.4 CRITÉRIOS DE INCLUSÃO 30
V.5 CRITÉRIOS DE EXCLUSÃO 30
V.6 METODOLOGIA 30
V.6.1 Separação de células mononucleares do sangue periférico (CMSP) para culturas
30
V.6.2 Preparação do antígeno solúvel de Leishmania (SLA) 31
V.6.3 Marcação de superfície celular para FACS 31
V.6.4 Cultura de células mononucleares do sangue periférico 31
V.6.3 Dosagens de MMP-1, MMP-3 e TIMP-1 32
V.7 ANÁLISES ESTATÍSTICA 33
V.8 CONSIDERAÇÕES ÉTICAS DA PESQUISA 33
VI. ARTIGO 34
VII. RESULTADOS 49
Figura 1. Produção de MMP-1 e MMP-3 em CMSP de pacientes com Leishmaniose Cutânea e Indivíduos Sadios.
49
Figura 2. Produção de MMP-1, MMP-3 e do inibidor TIMP-1 em biópsias de pacientes com Leishmaniose Cutânea e Indivíduos Sadios.
50
Figura 3. Participação de TNF e IFN-γ na produção de MMP1 e MMP3 em pacientes com Leishmaniose Cutânea.
51
Figura 4. Participação de IL-1β e IL-6 na produção de MMP-1 e MMP-3 em pacientes com Leishmaniose Cutânea.
53
Figura 5. Expressão de CD147 nas sub-populações de monócitos clássicos e Intermediários de pacientes com Leishmaniose Cutânea e Indivíduos Sadios.
54
Figura 6. Expressão de CD147 em linfócitos TCD4+ e TCD8+ de pacientes com Leishmaniose Cutânea e Indivíduos Sadios.
Figura 7. Correlação entre os níveis de MMP1 e 3 em CMSP e biópsiase o tamanho da lesão de pacientes com LC.
56
57
VIII. DISCUSSÃO 59
XIX. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 63
ANEXOS 75
Anexo I – Normas para elaboração do artigo da revista Plos One 75 Anexo II – Termo de Consentimento Livre e Esclarecido para pacientes 82 Anexo III – Termo de Consentimento Livre e Esclarecido para menores de
18 anos
Anexo IV – Termo de Consentimento Livre e Esclarecido para responsáveis de menores de 18 anos
86
Anexo V – Termo de Consentimento Livre e Esclarecido para controles sadios
14
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
IFN- Interferon-gamma
IL Interleucina
IL-1β “Interleukin1 beta” Interleucina 1- beta (IL-1β) IL-6 “Interleukin6” Interleucina (IL-6)
LPS Lipopolissacárideo
OMS Organização Mundial de Saúde
Complexo-HUPES Complexo Hospitalar Universitário Professor Edgar Santos CMSP Células mononucleares do sangue periférico
Th1 Células T auxiliadoras do tipo 1
Th2 Células T auxiliadoras do tipo 2
TNF Fator de Necrose Tumoral
NK Células matadoras naturais
ON Óxido nítrico CD14 Grupo de diferenciação 14 CD16 Grupo de diferenciação 16 CD14++CD16- Monócitos Clássicos CD14++CD16+ Monócitos Intermediários CD14+CD16++ Monócitos Não-clássicos CD147 Indutor de Metaloproteinases
MIF Média de Intensidade de Fluorescência MHC II (HLA-DR) Complexo de histocompatibilidade principal TCLE Termo de consentimento livre e esclarecido
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IS Indivíduos sadios
LCR Leishmaniose Cutânea Recente
LC Leishmaniose Cutânea
LM Leishmaniose Mucosa
LD Leishmaniose Disseminada
SSC Tamanho da célula
FSC Granulosidade da célula
RPM Rotações por minuto
MEC Matriz Extracelular
MMP Matriz Metaloproteinase
MMP-1 “Metalloproteinase1” Metaloproteinase 1 MMP-3 “Metalloproteinase3” Metaloproteinase 3 MMP-9 “Metalloproteinase9” Metaloproteinase 9 TIMP Inibidor Tecidual de Metaloproteinases TCD4+ Linfócitos T auxiliares CD4+
TCD8+ Linfócitos T citotóxicos CD8+
TGFβ “Transforming growth factor beta (TGF-β)” Th1 Linfócitos T “helper” auxiliar tipo 1
16
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1.Produção de MMP-1 e MMP-3 em CMSP de pacientes com Leishmaniose Cutânea e Indivíduos Sadios.
19
Figura 2.Produção de MMP-1, MMP-3 e do inibidor TIMP-1 em biópsias de pacientes com Leishmaniose Cutânea e Indivíduos Sadios.
20
Figura 3.Participação de TNF e IFN-γ na produção de MMP-1 e MMP-3 em pacientes com Leishmaniose Cutânea.
21
Figura 4. Participação de IL-1β e IL-6 na produção de MMP-1 e MMP-3 em pacientes com Leishmaniose Cutânea.
23
Figura 5. Expressão de CD147 nas sub-populações de monócitos clássicos e Intermediários de pacientes com Leishmaniose Cutânea e Indivíduos Sadios.
26
Figura 6. Expressão de CD147 em linfócitos TCD4+ e TCD8+ de pacientes com Leishmaniose Cutânea e Indivíduos Sadios.
28
Figura 7. Correlação entre a produção de MMP-1 e MMP-3 em sobrenadantes de CMSP e biópsia com o maior tamanho da lesão de pacientes com LC.
17
I. RESUMO
CONTRIBUIÇÃO DAS METALOPROTEINASES 1 E 3 PARA A
RE-EPITELIZAÇÃO DAS LESÕES DE PACIENTES COM
LEISHMANIOSE CUTÂNEA
Introdução: A leishmaniose cutânea (LC) devido à infecção por Leishmania
braziliensis é caracterizada por níveis elevados de TNF e IFN- e infiltrado celular composto por macrófagos, monócitos, células dendríticas e linfócitos T CD4+ e T CD8+. Além destas células, as metaloproteinases com sua capacidade de degradação de componentes da Matriz Extracelular (MEC) podem participar na formação da lesão. A atividade das MMPs é extremamente regulada e sua ação é controlada pelo inibidor TIMP. Objetivo: avaliar a produção de MMP-1 e MMP-3 e os efeitos de TNF, IL-6, IL-1β, IFN na produção de MMP-1 e MMP-3 em pacientes com LC. Metodologia: Células mononucleares do sangue periférico (CMSP) foram obtidas de indivíduos sadios (IS) e de pacientes com LC para determinar a frequência de linfócitos TCD4+ e TCD8+, sub-populações de monócitos e expressão do indutor de MMPs, CD147. Foi realizada cultura celular na presença ou ausência de SLA, IFN-γ, TNF, IL-6 e anti-IL-1β e de biópsia por 12h e os níveis de MMP-1 e MMP-3 foram determinados por ELISA. Resultados: A produção de MMP-3 foi mais elevada em culturas estimuladas com SLA em pacientes com LC quando comparados com indivíduos sadios, embora não tenha sido observada diferença na produção de MMP1 entre os grupos. As culturas CMSP de pacientes com LC na presença de anti-IFN- produz mais MMP-1 quando comparadas com indivíduos sadios. Também foi observado aumento de MMP-1 e TIMP-1 em biópsias de pacientes com LC. Após neutralização de TNF, IL-6 e IL-1β foi observado aumento de MMP-1 em pacientes com LC, no entanto não houve aumento de MMP-3 quando neutralizamos estas citocinas. Foi documentada uma correlação negativa entre a produção de MMP-1 e MMP-3 com o tamanho da lesão de pacientes com LC e a expressão de CD147 está mais evidente nos linfócitos TCD8+ de pacientes com LC em relação aos indivíduos sadios. Conclusão: Estas observações sugerem que estas MMPs podem participar do processo de remodelamento tecidual na infecção por L. braziliensis.
18
II. OBJETIVOS II.1. GERAL
Avaliar o papel das metaloproteinases1 e 3 na re-epitelização das lesões de pacientes com leishmaniase cutânea
II.2. ESPECÍFICOS
1. Determinar a produção de MMP-1 e MMP-3 em sobrenadantes de CMSP e em biópsias de pacientes com Leishmaniose Cutânea (LC);
2. Avaliar o efeito de TNF, IFN-, IL-6, IL-1β e CD147 na produção de MMP-1 e MMP-3 em CMSP de indivíduos sadios (IS) e pacientes com LC;
3. Determinar a expressão de CD147 em CMSP de indivíduos sadios e pacientes com LC;
4. Correlacionar a produção de MMP-1 e MMP-3 com o tamanho da lesão de pacientes com LC.
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III. Introdução
A Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA) é uma doença infecciosa causada por protozoários do gênero Leishmania, transmitida ao homem pela picada de flebótomos infectados com o parasita (Desjeux, 1996) e caracterizada pelo aparecimento de lesões ulcerativas que acometem a pele e as mucosas. As lesões em pacientes com leishmaniose cutânea (LC) são caracterizadas pela presença de infiltrado inflamatório composto por linfócitos T e B, macrófagos, células de Langerhans e plasmócitos (Pirmez, Cooper et al., 1990; Da-Cruz, Bertho et al., 2005); Maretti-Mira, et al., 2011). Nestas lesões são encontradas alta produção de TNF e IFN-, citocinas que contribuem para a destruição da
Leishmania sp e, devido a resposta exacerbada induzem dano tecidual,
participando assim da patogênese da doença (Gomes-Silva 2007, Bacellar 2002, Da-Cruz 2002, Ribeiro De Jesus 1998). TNF é uma citocina conhecida por mediar a patologia da LC utilizando mecanismos como a indução de óxido nítrico (NO), expressão de metaloproteinases de matriz (MMPs) e aumento de citotoxidade. As MMPs são enzimas conhecidas pela capacidade de degradação de componentes da Matriz Extracelular (MEC), participando tanto de processos fisiológicos, como morfogênese, desenvolvimento e reparo de tecidos, quanto em processos patológicos, como a inflamação. A atividade das MMPs é extremamente regulada, pois um desequilíbrio entre a produção de metaloproteinase e seus inibidores TIMPs pode levar a degradação excessiva da matriz com conseqüente destruição tecidual (Murphy, 2008), sendo a disseminação ou persistência dos patógenos decorrentes da quebra das barreiras dos tecidos no hospedeiro.
Os mecanismos que levam a produção das MMPs e a sua contribuição para o desenvolvimento da lesão tecidual na leishmaniose cutânea ainda não estão bem esclarecidos. Citocinas como TNF, TGF-β (Marreti-Mira, 2010; Costa, 2008) e IL-1 (Costa et al, 2008) são conhecidas por estimularem a expressão e ativação das MMPs, enquanto que IL-10 diminui a expressão e ativação, IL-1β (Prato et al, 2008; Nee et al, 2004) e IFN-γ (Maretti-Mira, 2011) possuem efeitos
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variados. Em um estudo com microarranjo em biópsia de pacientes com LC foi demonstrado alta expressão de MMP-1, MMP-3, MMP-9 e MMP-12 estavam altamente expressas em pacientes com LC (Campos, Passos et al., 2014). A identificação dos mecanismos de atuação das metaloproteinases para o desenvolvimento da lesão na LC é de grande importância para o entendimento da patogênese da doença e o desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas. Como as MMPs participam tanto de processos fisiológicos como de processos patológicos, é de grande importância a identificação de células produtoras dessa enzima na infecção por L. braziliensis, bem como o efeito de citocinas pró-inflamatórias na expressão de MMP1 e MMP-3 em pacientes com leishmaniose cutânea.
Um possível mecanismo de produção das MMPs é através da interação CyPA-CD147 (Yurchenko et al, 2010). CyPA-CD147 é conhecida como o principal receptor de sinalização para ciclofilinas extracelulares. Ciclofilina (CyPA) é uma proteína que induz eventos de sinalização intracelular e quimiotaxia, e é secretada por leucócitos em resposta a estímulos inflamatórios e estresse oxidativo. Um estudo em pacientes diagnosticados com Artrite Reumatóide, Yang et al, 2008 encontrou que em monócitos/macrófagos estimulados com CyPA, a produção e ativação de MMP-9 estava aumentada, enquanto que o bloqueio de CD147, na presença ou ausência de CyPA, diminuiu drasticamente a expressão de MMP-9. Ainda foi observado que a interação CyPA-CD147 aumentou a produção de MMP-9 e a adesão dos monócitos/macrófagos à MEC, o que pode contribuir para a destruição da cartilagem e do osso na Artrite Reumatóide.
Às metaloproteinases foram atribuidas atividades dicotômicas, como capacidade de degradação de componentes da matriz extracelular de acordo com o substrato. Por isso, é de grande importância conhecermos a contribuição da MMP-1 e MMP-3 na infecção por L. braziliensis.
21
IV. REFERENCIAL TEÓRICO
IV- 1. LEISHMANIOSE TEGUMENTAR AMERICANA (LTA)
IV- 1.1. Aspectos Epidemiológicos e Clínicos da Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA)
As leishmanioses constituem um complexo grupo de doenças de caráter infeccioso causadas por parasitos do gênero Leishmania, representam um complexo de doenças infecciosas e não contagiosas, com importante espectro clínico e diversidade epidemiológica (Alvar et al., 2012). As leishmanias são protozoários intracelulares obrigatórios que são transmitidos aos mamíferos por flebotomíneos infectados.
Os seus altos números de incidência e taxas de mortalidade e dificuldades no manejo fizeram com que a Organização Mundial da Saúde (OMS) incluísse a leishmaniose entre os seis problemas de saúde de interesse prioritário para a instituição. Atualmente são registrados cerca de 1,6 milhões de novos casos por ano, sendo a leishmaniose cutânea responsável por 1,2 milhões desses casos (Alvar et al., 2012). A leishmaniose ainda está presente em 98 países, afetando grande parte do continente americano, Ásia, África, Europa e Oriente Médio (Alvar et al., 2012). No Novo Mundo a principal forma da leishmaniose é a leishmaniose tegumentar americana (LTA), que se apresenta sob as formas clínicas: cutânea, mucosa, disseminada e cutânea difusa. A manifestação de cada uma dessas formas dependerá de vários fatores que vão desde fatores relacionados ao hospedeiro, quanto aos intrínsecos do patógeno, além de fatores relacionados ao meio que também exercem papel importante (Bray et al., 1980). Desde que o jovem médico Juliano Moreira descreveu em 1895 a existência de um botão endêmico, o primeiro relato de Leishmaniose Tegumentar Americana até então, o Ministério da Saúde só iniciou um programa oficial de controle da LTA nos anos 1980 (Costa, Jakson 1992). Devido a esta medida o número de notificações anuais saltou de 5.000 para 36.000 em 1995 (Ministério da saúde, 2007). Tal fato também pode ser relacionado não somente com o aumento do número de notificações, mas também à invasão do homem às florestas
22
culminando com a sua inserção no ciclo silvestre do parasito. Atualmente o Ministério da Saúde relata cerca de 30.000 casos de LTA em várias das unidades federativas do país. Contudo, sua maior incidência encontra-se nas regiões norte e nordeste (Ministério da saúde, 2009).
Corte de Pedra é uma área endêmica para leishmaniose tegumentar americana situada em uma vila do município de Presidente Tancredo Neves, localizada à 260 km ao Sul de Salvador – BA, a margem da BR 101 que liga as cidades de Salvador e Rio de Janeiro (Ibge., 2016). A área endêmica para leishmaniose tegumentar americana com abrangência muito além do vilarejo englobando uma população de aproximadamente 20 municípios, reconhecida como uma das mais importantes áreas de transmissão do protozoário Leishmania (Schriefer, Guimaraes et al., 2009). Esta área possui atualmente uma população de 2.700 indivíduos na zona urbana e zona rural do município (Prefeitura de Tancredo Neves, 2016). Corte de Pedra, local onde as maiores incidências anuais de leishmaniose tegumentar do Estado são registradas, com um aumento importante nos últimos vinte anos, no ano de 2012 registrou 1.814 casos, um aumento de quase 15% em relação ao ano de 2010 (1.556) (Jirmanus et al., 2012). A leishmaniose visceral não ocorre nesta região, que é uma área de transmissão de Leishmania braziliensis. Embora a Leishmania amazonensis tenha sido identificada na vila de Corte de Pedra, apenas L. braziliensis tem sido isolada nos últimos 15 anos (Jirmanus et al., 2012).
Sendo considerada de grande importância para a saúde pública no Brasil e no mundo (Da-Cruz, Bittar et al., 2002), destaca se também como uma doença negligenciada em vários países da Europa, Ásia, África, e América (Desjeux, 1996b; Alvar, Yactayo et al., 2006). A espécie Leishmania (Viannia)
braziliensis é o principal agente etiológico da LTA no Brasil, distribuído em
diversas regiões do país (Carvalho, Johnson et al., 1985; Costa, Barrios et al., 1986; Carvalho, Barralet al., 1994; De Oliveira-Neto, Mattos et al., 2000; Oliveira-Neto, Martins et al., 2000; Turetz, Machado et al., 2002).
As formas clínicas da infecção por L. braziliensis incluem leishmaniose cutânea localizada (LC), leishmaniose mucosa (LM) e leishmaniose disseminada (LD). Mais recentemente, as formas atípicas da doença têm sido descritas, tais como lesões verrucosas e múltiplas lesões nodulares em uma área específica do corpo
23
(Guimarães et al., 2009).
Na LTA a forma mais frequente da doença é a leishmaniose cutânea, representando em cerca 95% dos casos (Bittencourt e Barral, 1991).
Nesta forma da doença, os locais mais afetados pelas úlceras são os membros superiores e inferiores de adultos masculinos devido às exposições de atividades rurais. Embora a resposta imune destes pacientes seja definida por alta proliferação de linfócitos, produção elevada das citocinas INF-γ e TNF, nas úlceras destes pacientes encontra-se pouco ou nenhum parasito na lesão (Bittencourt e Barral, 1991) Cerca de 3% dos indivíduos portadores da LC em conseqüência da habilidade de alguns parasitos sobreviverem na pele depois da cura clínica podem levar ao desenvolvimento da forma mucosa (Jones, Johnson
et al., 1987; Marsden, 1994; Bacellar, Lessa et al., 2002).
IV-1.2 RESPOSTA IMUNE E LESÃO TECIDUAL NA LEISHMANIOSE
As interações entre a Leishmania e hospedeiro são essenciais para entender a patogênese e progressão da leishmaniose. É conhecido que a produção de IFN- é importante para estimulação da produção de óxido nítrico e para o controle da infecção por Leishmania (Murray, Rubin et al. 1983; Liewand Cox 1991; Bogdan, Rollinghoff et al. 2000). Um dos primeiros sinais após a infecção por
L. braziliensis é a presença da linfadenopatia e a formação de uma pápula
seguida de uma exoulceração no local da inoculação do parasito (Barral, Barral-Netto et al., 1992; Barral, Guerreiro et al., 1995).
Alguns pesquisadores evidenciam que a lesão tecidual na LTA decorre da resposta imune, sendo que os pacientes com LC são altos produtores de IFN- e TNF, IL-6 e NO e por sua vez auxiliam na formação de úlceras cutâneas e não colaboram no controle da infecção (Ribeiro-de-Jesus, Almeida et al. 1998; Bacellar et al., 2002). Após o tratamento foi observada uma diminuição significativa na produção de TNF e IFN- no soro e em sobrenadante de culturas de células mononucleares do sangue periférico (CMSP) de pacientes com LC, estimuladas com o antígeno de Leishmania (Da Cruz, de Oliveira et al. 1996; Ribeiro-de-Jesus, Almeida et al. 1998). TNF é uma citocina conhecida por
24
mediar a patologia da LTA utilizando mecanismos como a indução de óxido nítrico (NO), expressão de metaloproteinases de matriz (MMPs) e aumento de citotoxidade. No local da inflamação as principais células que participam na defesa contra a Leishmania, são os macrófagos e neutrófilos, estas células liberam citocinas e quimiocinas, que recrutam monócitos e linfócitos para o sitio inflamatório (Scapini, Lapinet-Vera et al., 2000).
(Novais, Carvalho et al., 2015) mostrou que em lesões de pacientes infectados por L. braziliensis genes associados com a via dos inflamasomas e secreção de IL-1β, como a expressão de NLRP3 e AIM2, as principais vias relacionadas com o aparecimento da lesão é ativada antes da abertura lesão. Foi demonstrado também uma alta produção de IL-1 na infecção por L. major e L. mexicana, que se associa com a severidade da doença. (Voronov, Dotan et al. 2010; (Fernández-Figueroa, Rangel-Escareño et al., 2012). Outra citocina importante que influencia no tipo de resposta do hospedeiro à infecção por Leishmania é a interleucina -17. Produzida predominantemente pela célula Th17 (Aggarwal S et al., 2003), envolvida na patogênese de doenças inflamatórias e auto-imunes crônicas, a IL-17 estimula a produção de células T, células endoteliais, fibroblastos, neutrófilos e macrófagos além, da secreção de mediadores como IL-1, IL-6, TNF, metaloproteinases e quimiocinas (Kolls JK; Linden A 2004). Na infecção por L. braziliensis, foi demonstrada a produção de IL-17 e uma correlação positiva com TNF indicando seu envolvimento na patogênese da leishmaniose (Bacellar et al., 2009).
Estudos vêm dando atenção ao envolvimento das metaloproteinases (MMPs) para o desenvolvimento de lesões cutâneas. Campos, Passos et al., 2014, mostrou que a expressão in situ dos genes de MMP-1 e MMP-3 aparece aumentada na LC quando comparada com biópsia de pele de indivíduos sadios. CD147 é uma molécula presente na superfície celular de leucócitos e células epiteliais e apresenta a função de induzir a produção de metaloproteinases (Yurchenko et al, 2010).
25
IV-1.3 PARTICIPAÇÃO DOS MONÓCITOS NA LEISHMANIOSE
Os monócitos são células fagocíticas que representam cerca de 10% dos leucócitos circulantes (Auffray, Siewekeet al., 2009). Participam da imunidade inata contra patógenos intracelulares, onde estas células migram para o sítio da infecção podendo se diferenciar em macrófagos, principais células destruidoras de patógenos intracelulares, ou células dendríticas, principais células apresentadoras de antígeno. O envolvimento dos monócitos na leishmaniose tem sido investigado. Distintas subpopulações dentro da linhagem monocítica tem sido consideradas como importantes células efetoras do sistema imune. Estas subpopulações atribuem características referentes à produção de citocinas, quimiocinas e expressão de moléculas de ativação celular resultante à invasão de agentes infecciosos (Geissmann, Jung et al., 2003; Serbina, Jia et al., 2008) e servem também como reservatório para renovação de macrófagos teciduais e células dendríticas (Serbina e Pamer, 2006).
Os monócitos são caracterizados no sangue periférico de acordo com a expressão de anticorpos fluorescentes por citometria de fluxo (Tallone, Turconiet al., 2011; Zeigler-Heitbrock, Ancuta et al., 2010) onde nos permite, através da alta sensibilidade diferenciar estas células também pelo tamanho e granulosidade.
Estudos têm demonstrado a participação dessas diferentes subpopulações de monócitos nas doenças inflamatórias, de acordo com a expressão CD14+ e CD16+ durante o desenvolvimento da patologia.
Monócitos, macrófagos e células T são as principais fontes produtora de TNF. Na infecção por L. braziliensis TNF é uma importante citocina envolvida em processos inflamatórios, participa no desenvolvimento de lesões teciduais observada nos pacientes com leishmaniose cutânea desde a fase inicial, onde é observado um aumento da expressão de MHC II e moléculas de adesão de monócitos e macrófagos.
Antonelli et al., 2005, mostrou que pacientes com LC apresentam frequência significantemente elevada de monócitos que expressam CD16+ e correlação com o tamanho da lesão. Foi visto também que a produção de TNF e IL-10 produzidos por monócitos se correlacionam positivamente em pacientes com
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LC, o que não é observado em pacientes com LM (Gaze, Dutra et al., 2006).
V-1.4 PARTICIPAÇÃO DOS LINFÓCITOS NA LEISHMANIOSE
Além dos monócitos, os linfócitos tem um papel muito importante na leishmaniose. Dentre as formas clínicas da LTA, os linfócitos (TCD4+ e TCD8+) apresentam capacidade de mediar a resposta inflamatória envolvida na susceptibilidade ou resistência à doença, bem como são células produtoras de citocinas que participam da ativação de monócitos/ macrófragos, TNF e INF-γ (Scott, et al., 1988; Pirmez, Yamamura et al., 1993; Da Cruz, Bittar et al., 2002). A participação das células TCD4+ e TCD8+ está bem documentada na progressão e desenvolvimento da lesão (Bacellar et al., 2002), bem como por serem fontes produtoras importantes de IFN- em pacientes com LC (Carvalho, Johnson et al., 1985; Pirmez, Yamamura et al., 1993; Antonelli, Dutra et al., 2005).
Na infecção ativa por L. braziliensis os pacientes apresentam maior frequência células TCD4+ quando comparados com pacientes curados e também foi observado um equilíbrio das células CD4 e CD8 durante o processo de repitalização (Da-Cruz, Conceicao-Silva et al. 1994). Portanto, no infiltrado inflamatório das lesões, são encontradas células TCD8+ em maior expressão, inversamente do achado em sangue periférico (Da-Cruz, Bertho et al., 2005). Isto é demonstrado também na infecção por L. major durante o processo de cicatrização (Gaafar, Veress et al. 1999).
IV. 1.5 METALOPROTEINASES DE MATRIZ
A pele é um órgão mais extenso do corpo humano, composta por células endoteliais, queratinócitos, fibroblastos e pela matriz extracelular (MEC), tendo a capacidade de proteção ao corpo contra agentes externos. De certo modo quando há uma agressão na pele e a mesma é lesionada, uma gama de agentes dinâmicos é ativado, como ocorre na interação entre os receptores de superfície e complexo de moléculas que favorece a proliferação, diferenciação e apoptose
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celular. A matriz extracelular (MEC) é constituída por um conjunto de proteínas e polissacarídeos, secretados por vários tipos celulares, que se organizam em redes e preenchem os espaços extracelulares dando suporte as células para a formação dos tecidos (Sorokin, 2010). O reparo tecidual de lesões cutâneas pode ser constituído em alguns fatores, como a formação de tecido de degranulação, resposta inflamatória e remodelamento da MEC (Li J et al., 2007; Reink ; Sorg, 2012).
As metaloproteinases correspondem a cerca de 25% de todas as proteínas conhecidas e pertence a uma família de enzimas dependes de zinco, capazes de degradar componentes da MEC. (Maret W; Li Y et al., 2009). Estas proteases participam de vários processos fisiológicos como morfogênese, desenvolvimento e reparo de tecidos (Murphy; Nagase, 2008) e são divididas em subgrupos de acordo com o substrato que degradam (Mokrzyckiet al., 1997). Já foram descritas 25 MMPs, onde 22 são homólogas em humanos (Sternlicht e Werb, 2001). Visto que elas são classificadas de acordo com as especificidades dos substratos que degradam, estas proteaes são distribuídas em: MMPs tipo-membrana (MT-MMPs), colagenases, gelatinases, estromelisinas, matrilisinas, e outras (Nagase, Ogata et al., 1991; Murphy e Nagase, 2008).
As MMPs são produzidas por vários tipos celulares, incluindo linfócitos, monócitos, neutrófilos, mas em particular por macrófagos ativados (Birkedal-Hansen, Moore et al., 1993; Goetzl, Banda et al., 1996). Geralmente são expressas em formas latentes na forma solúvel ou de membrana. No soro ou tecidos são encontradas proteases serínicas, que são responsáveis pela clivagem e ativação das MMPs, onde se é removido o domínio pro-peptídico e posteriormente é induzida a ativação catalítica das MMPs. São enzimas fundamentais para a progressão tumoral, como crescimento, invasão e metástase, sendo que o aumento da sua produção esteja geralmente associado o pior prognóstico (Nakopoulou et al., 2002).
A metaloproteinase 1 foi a primeira enzima a ser descoberta e estudada, pertence ao grupo das colagenases devido a sua atividade colagenolítica descoberta por Gross e Lapiere. Esta metaloproteinase é expressa in vivo em
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áreas de romodelamento tecidual patológicos ou fisiológico acelerados, é expressa por monócitos, macrófagos, condrócitos, fibroblastos com a capacidade de clivar colágeno tipo I, II e III (Gross e Lapiere, 1962; Visse e Nagase, 2003).
A MMP-3 é produzida por tecido conjuntivo e quando clivada participa da ativação de outras MMPs. Esta enzima pertence a família das estromelisinas, com a capacidade de degradar colágeno do tipo II, III, IV, IX e X, proteoglicanos, fibronectina, laminina, e elastina (Ye et al., 1996). As MMPs apresentam uma resposta regulatória, quando ativam citocinas, quimiocinas e fatores de crescimento que estão envolvidos no processo regulatório (Bauvois, Brigitte, 2012).
Visto a ampla participação das metaloproteinases em processos fisiológicos e patológicos, estas proteases necessitam ser reguladas e esta regulação se dá em nível de transcrição gênica, ação do inibidor (TIMP), e da ativação das MMPs latentes. Habitualmente, a atividade das MMPs ativadas é controlada pelos inibidores endógenos das MMP, ou TIMPs (tissue inhibitors of
metalloproteinases). Os TIMPs são proteínas eucarióticas, constituinte de uma
família de quatro proteínas secretadas (TIMPs 1 a 4), que se apresentam em diferentes níveis de afinidade, mas não é específico a uma MMP (Schulz, 2007). Foi identificado também que os TIMPs conseguem inibir as pro-MMPs, o que impede a sua ativação (Yu e Han, 2006). No entanto, quando há um desequilíbrio entre estas MMPs e seu inibidor, elas podem está envolvidas no desenvolvimento da inflamação, doenças cardiovasculares, crancro e neurodegeneração (Sbardella, et al., 2012). No entanto o equilíbrio entre as MMPs e os TIMPs é necessário para que haja a manutenção da homeostase da matriz extracelular (Yu e Han, 2006).
V. CASUÍSTICA, MATERIAL E MÉTODOS.
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Corte de Pedra é um vilarejo pertencente ao município de Presidente Tancredo Neves, localizado no Sudeste do estado da Bahia, há 280 km de Salvador, possui um posto de saúde que é referência para o diagnóstico e tratamento da Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA) e que atende a população local e municípios vizinhos.
A cada duas semanas, uma equipe de médicos e pesquisadores vinculados ao Serviço de Imunologia do Complexo Hospitalar Prof. Edgard Santos (C-HUPES), visita esta região e presta assistência aos indivíduos acometidos por esta doença, sendo nesta ocasião selecionados os casos que participarão deste projeto de pesquisa. Além disso, agentes de saúde, residentes na área endêmica, são treinados para visitar famílias e recrutar pacientes para realização de pesquisas e acompanhamento clínico. Anualmente, cerca de 1000 pacientes são atendidos no Posto de Saúde de Corte de Pedra, sendo 80% (N=800) com leishmaniose cutânea, 13% (N=130) leishmaniose mucosa, 4% (N=40) com leishmaniose disseminada e 3% (N=30) com leishmaniose cutânea recente.
V.2 DESENHO DO ESTUDO
Trata-se de um estudo de corte transversal com pacientes residentes na área endêmica de Corte de Pedra e indivíduos sadios não residentes nesta área. A amostra foi composta por 09 indivíduos sadios, 27 pacientes com diagnóstico para LC.
V.3 DEFINIÇÕES DOS CASOS
V.3.1 Leishmaniose Cutânea (LC)
Esta forma clínica da leishmaniose caracteriza-se pela presença de lesão ulcerativa na pele, sem comprometimento da mucosa nasal com tempo maior que 30 dias. Sendo o diagnóstico definido pela identificação do parasita em cultura a partir do aspirado de lesão ou pela lesão típica e característica de LC acompanhada do teste de hipersensibilidade tardia positiva (DTH+) ao antígeno solúvel de Leishmania (Teste de Montenegro) e histopatologia compatível com Leishmaniose Tegumentar americana.
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Este grupo é caracterizado por indivíduos sadios, não residentes na área endêmica de Corte de Pedra.
V.4 CRITÉRIOS DE INCLUSÃO
Foram incluídos indivíduos de ambos os gêneros, com idade superior a 15 anos e inferior a 60, residentes na área endêmica que apresentaram diagnóstico de leishmaniose baseados nos critérios de definições de casos descritos acima.
Para o grupo controle foram incluídos indivíduos sadios de ambos os gêneros, com idade superior a 15 anos e inferior a 60, não residentes na área endêmica e sem história prévia de leishmaniose.
V.5 CRITÉRIOS DE EXCLUSÃO
Foram excluídos do estudo pacientes com história prévia de LTA, mulheres grávidas e pacientes com outras doenças infecciosas ou com deficiência imunológica.
V.6 METODOLOGIA
V.6.1 Separação de células mononucleares do sangue periférico para cultura
Foi coletado 20 mL de sangue de indivíduos sadios e de pacientes com LC. O sangue foi coletado em tubo Falcon estéril contendo heparina (1000U/ml). As células mononucleares do sangue periférico (CMSP) foram isoladas através de gradiente de concentração com FicollPaqueTM Plus (GE healthcare, Biosciences AB Durhman, NC, USA). Após centrifugação a 1450 rpm durante 30 minutos a 25º C, um anel de CMSP foi obtido entre a mistura de Ficoll-Hypaque e o plasma. Em seguida, as CMSP foram centrifugadas duas vezes a 1290 rpm durante 10 minutos, com solução salina (0,9% de NaCl). As CMSP foram contadas em câmera de Newbauer, ajustando-se a concentração de interesse de acordo com cada ensaio realizado. CMSP foram ressuspensas em 1 ml de meio de cultura RPMI-1640 (GibcoLaboratories, Grand Island, NY, USA) suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB 12657 GibcoLaboratories,
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InvitrogenTM América do Sul), 10 IU/ml de penicilina e 100µg/ml de streptamicina e ajustadas para concentração 3x106 células/ml, colocadas em placas com 24 poços. Cultura por 72 horas foi realizada na presença ou ausência de SLA (5ug/ml), de anticorpo anti-TNF (10ug/ml), anti-IL-6 (10ug/ml), anti-TGFβ (10ug/ml), anti-IL-1β (10ug/ml), anti-IFNy (10ug/ml).
V.6.2 Preparação do antígeno solúvel de Leishmania (SLA)
O antígeno solúvel de Leishmania (SLA) foi preparado a partir de um isolado de
L. braziliensis de um paciente com LC, através de sonicação e centrifugação tal como
anteriormente descrito (Reed, Badaro et al., 1986). Foi testado para endotoxina utilizando o teste de amebócitos de Limulus lisado e utilizado a uma concentração de 5ug / ml.
V.6.3 Marcação de superfície celular para FACS
As CMSP foram ressuspensas em solução salina e ajustadas para a concentração de 0,5x106 células/ml, colocadas em tubos de poliestireno de 5 ml. Foi realizada a marcação de superfície celular ex-vivo utilizando os anticorpos monoclonais anti-CD14 – APC (BD PhamingenTM), anti-CD16 – PE (BD PhamingenTM) e anti-CD147 – FITC (BD PhamingenTM) após a adição dos anticorpos diluídos na concentração 1:10 os tubos foram deixados a 4ºC, protegidos da luz, por 15 minutos. Em seguida, as CMSP foram lavadas com solução salina (0,9% NaCl) e fixadas com paraformoldeído a 2%.
V.6.4 Cultura de células mononucleares do sangue periférico
CMSP foram ressuspensas em 1 ml de meio de cultura RPMI-1640 (GibcoLaboratories, Grand Island, NY, USA) suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB 12657 GibcoLaboratories, InvitrogenTM América do Sul), 10 IU/ml de penicilina e 100µg/ml de streptamicina e ajustadas para concentração 3x106 células/ml, colocadas em placas com 24 poços. Cultura por 72 horas foi realizada na presença ou
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ausência de SLA (5ug/ml), de anticorpo TNF (10ug/ml), IL-6 (10ug/ml), anti-IL-1β (10ug/ml) e anti-IFN-y (10ug/ml).
V.6.5 Cultura de células de biópsias
As biópsias de indivíduos sadios e de pacientes com LC foram extraídas da borda da lesão, utilizando um punch de 4mm e colocadas inteiras, sem nenhum procedimento de maceração, em tubos estéreis com 1ml de RPMI-1640 (GibcoLaboratories, Grand Island, NY, USA) suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB 12657 GibcoLaboratories, InvitrogenTM América do Sul), 10 IU/ml de penicilina e 100µg/ml de streptamicina. A cultura foi realizada por 12 horas a 37ºC e 5% de CO2.
V.6.6 Dosagem dos níveis de MMP-1, MMP-3 e TIMP-1
Os níveis de MMP-1, MMP-3 e TIMP-1 foram determinados nos sobrenadantes de cultura de CMSP pela técnica de ELISA. Para as dosagens de MMP-1, MMP-3 e TIMP-1 foram utilizados Kits da R&D Systems (R&D Systems Inc. Minneapolis, MN, USA) utilizando o protocolo recomendado pelo fabricante, descrito brevemente a seguir. As placas foram sensibilizadas com anticorpo anti-MMP-1, anti-MMP-3, anti- anti-TIMP-1 e incubadas overnight em temperatura ambiente. Após incubação as placas foram bloqueadas com Reagente Diluente (1% BSA em PBS pH 7.4) em temperatura ambiente por 1 hora. Após o bloqueio os sobrenadantes (100ul/poço) foram adicionados à placa e incubados em temperatura ambiente por duas horas. Após esse período, as placas foram incubadas com anticorpo de detecção por duas horas em temperatura ambiente. Em seguida, adicionou-se Streptavidina por 20 minutos em temperatura ambiente. Entre cada etapa foram realizadas três lavagens com tampão de lavagem (Tween 0,05% em PBS pH 7.4). A reação foi revelada com uma solução de substrato enzimático (TMB) e interrompida com uma solução de ácido sulfúrico (H2SO4). Os
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V.7 ANÁLISES ESTATÍSTICAS
Os dados de citometreia de fluxo foram analisados através do software Flowjo versão 7.6.5. As análises estatísticas foram realizadas através do programa Graphpadprism 5.0 (Graphpad software, San Diego, CA, USA). Segundo o teste da normalidade de D'Agostino-Pearson os dados apresentaram distribuição não-paramétrica. Comparações entre duas variáveis contínuas independentes foram realizadas utilizando o teste de Mann-Whitney, para as variáveis contínuas dependentes foi utilizado o teste U de Wilcoxon. O teste de Kruskal-Wallis e o pós-teste de Dunn foram utilizados para a comparação de três variáveis contínuas. As diferenças foram consideradas estatisticamente significantes quando o valor de P foi menor que 0.05.
V.8 CONSIDERAÇÕES ÉTICAS DA PESQUISA
Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética e Pesquisa do Complexo Hospitalar Universitário Professor Edgar Santos (protocolo – 10/10). Todos os participantes assinaram o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido e a confidencialidade dos dados foi preservada de acordo com o disposto da Resolução 196/96 do CONEP. Este estudo foi financiado pelo NHI através do grant ICIDR AI088650-01.
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VI. Manuscrito em preparação
Contribution of metalloproteinase 1 and 3 in remodeling tissue of lesions in cutaneous leishmaniasis patients
Plos One (manuscrito em preparação, vide Normas de Publicação no ANEXO I e a carta ao Editor, no ANEXO II).
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Contribution of metalloproteinase 1 and 3 in remodeling tissue of lesions in cutaneous leishmaniasis patients
Camilla S Paixão1, Rúbia S Costa1, Tais Campos1, Andréa S Magalhães1, Juliana Almeida1, Paulo R L Machado1,2, Edgar M. Carvalho1,2,3, Lucas P Carvalho1,2,3 and Sara Passos1,2
1
Serviço de Imunologia, Complexo Hospitalar Professor Edgard Santos, Universidade Federal da Bahia.
2
Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, Universidade Federal da Bahia.
3
Instituto Gonçalo Moniz, Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ), Salvador, Bahia.
Corresponding Author: Sara Passos. Rua João das Botas, S/N 5andar. Canela. Salvador-Bahia – Brazil. CEP 40.110-160. saratpassos@hotmail.com
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ABSTRACT.
Cutaneous leishmaniasis (CL) due to infection by Leishmania braziliensis is characterized by high levels of TNF, IFN and cell infiltrate composed by macrophages, monocytes, dendritic cells, CD4+T and CD8+T cells. In addition to these cells, the metalloproteinases, with its ability to degrade extracellular matrix components, can participate in the formation of the lesion. The activity of MMPs is extremely regulated, and its action is controlled by the inhibitor TIMP. To evaluate the production of MMP-1 and MMP-3 and the effects of TNF, IL-6, IL-MMP-1β, IFN on the production of them in patients with CL. Peripheral blood mononuclear cells were obtained from healthy subjects and patients with CL to determine the frequency of CD4+, CD8+ cells and subsets of monocytes and the expression of MMPs and CD147 inducer. Cell culture was performed in the presence or absence of SLA, IFN-γ, TNF, IL-6 and anti-IL-1β and, levels of MMP-1 and MMP-3 were determined by ELISA. Production of MMP-3 was higher in cultures stimulated with SLA from CL patients compared to healthy subjects, although no difference was observed in the production of MMP-1 between these groups. PBMC cultured from patients with CL in the presence of anti-IFN- produces more MMP-1 compared to healthy individuals and, an increase of MMP-1 and TIMP-1 in biopsies from patients with CL. After neutralization of TNF, IL-6 and IL-1β the level of MMP-1 was increased in patients with CL, however no increase of MMP-3 was observed when we neutralize those cytokines. Meanwhile, CD147 is more expressed in CD8+T cells from CL patients compared to healthy subjects. These observations suggest that these MMPs can participate in the process of tissue remodeling in lesions from patients with L. braziliensis infection.
INTRODUCTION.
Leishmaniasis is an infectious disease caused by protozoa of the genus Leishmania, transmitted to humans by the bite of sandflies infected with the parasite (DESJEUX, 1996) and characterized by ulcerative lesions of the skin and mucous membranes. The lesions in patients with cutaneous leishmaniasis (CL) are characterized by the presence of inflammatory infiltrate composed by T and B cells, macrophages, Langerhans cells and plasmocytes (MARETTI-MIRA, et al., 2010). In those lesions high production of TNF and IFN are found and these cytokines can contribute to the destruction of Leishmania sp and due to exacerbated the response inducing tissue damage and
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participating in the pathogenesis of the disease (GOMES-SILVA 2007, BACELLAR, 2002-2002 CROSS, RIBEIRO DE JESUS 1998). TNF is a cytokine known for mediating the pathology of LC using mechanisms such as expression of matrix metalloproteinases (MMPs) and increase in citotoxicity. The MMPs are enzymes known to their ability to degrade extracellular matrix components (MEC), participating in both physiological processes, such as morphogenesis, development and repair of tissues, as in pathological processes, such as inflammation (Nagase H 1991, Baugh JA 2001, Gupta S 2002, Lehmann W 2005). The activity of MMPs is extremely regulated, because an imbalance between the production of metalloproteinase and its inhibitors TIMPs can lead to excessive degradation of matrix with subsequent tissue destruction (MURPHY, 2008), being the dissemination or persistence of pathogens arising from the breakdown of tissue barriers and the creation of places bad accessed by host immune cells.
The mechanisms that lead to production of MMPs and its contribution to the development of tissue lesions in cutaneous leishmaniasis are not yet well understood. The identification of the mechanisms of action of MMPs in the development of the lesion in CL is very important for the understanding of the pathogenesis of the disease (CAMPOS et al., 2014).) and the development of new therapeutic approaches. As the MMPs participate in both physiological and pathological processes, is very important identify the MMPs producing cells in infection by L. braziliensis, as well as the effect of pro-inflammatory cytokines in expression of MMP-1 and MMP-3 in cutaneous leishmaniasis patients.
MATERIAL and METHODS.
Patients. Participants of the present study includes 27 cutaneous leishmaniasis (CL) patients from the L. braziliensis transmission area of Corte de Pedra, Bahia state, Brazil, and 09 healthy subjects (HS) living in areas not exposure to Leishmania. Diagnosis for CL was performed by a positive parasite culture or PCR as previously described (Machado PR, 2010).
Soluble Leishmania Antigen (SLA) preparation. SLA was prepared with an isolate of L.
braziliensis as previously described (Reed, SG 1987). Briefly, promastigotes
ressuspended in lysis solution (Tris, HCL, EDTA and leupeptin) were immersed in liquid nitrogen, and thawed at 37uC. After freezer-thaw procedure, they were sonicated
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and the disrupted parasites were centrifuged at 14,000G. The supernatant was filtered and assayed for protein concentration. SLA was used at a concentration of (5 mg/ml). Cultures of peripheral blood mononuclear cells and biopsies. Peripheral blood mononuclear cells (PBMC) were isolated from heparinized venous blood by Ficoll-Hypaque (GE Healthcare Biosciences AB, Sweden) gradient centrifugation. After washing three times in 0.9% NaCl, PBMC was adjusted to 3x106 cells/ml in 1 ml of RPMI-1640 (Gibco Laboratories, Grand Island, NY, USA) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) (Gibco Laboratories, South America Invitrogen), 10 IU/ml penicillin and 100 mg/ml streptomycin. Cells were placed on 24 wells plates and incubated for 72 hours in the presence or absence of SLA (5 mg/ml) or anti-TNF antibody (5 ug/ml) or anti-IFN antibody (10 ug/ml) or anti-IL-6 antibody (10 ug/ml) or anti-IL-1β antibody (10 ug/ml) (R&D systems, Minneapolis, MN), as indicated in figures. Biopsies from L. braziliensis patients and HS were cultured in complete RPMI media without stimuli. Tissue from CL patients and HS were cultured in RPMI for 12 hours. Supernatants from PBMC and biopsies were collected and stored at -70C. The levels of MMP-1, MMP-3 and TIMP-1 (R&D Systems, Minneapolis, MN) were measured by ELISA (R&D Systems) according to the manufactures instructions. The results are expressed in pg/ml.
Statistical analysis. Mann-Whitney was used to compare HS and CL groups; Kruskal-Wallis test (nonparametric test) was used to compare the CL and HS groups; Wilcoxon matched pair test (paired and nonparametric t test) was used to analyze PBMC cultures in different conditions within the same group of individuals. Comparisons were considered statistically significant when P< 0.05. All p values represented are two-sided.
Ethical considerations. This work was approved by the Ethics and Research Committee from Federal University of Bahia. All subjects provided witted informed consent; in case of illiterate subjects, a thumb print plus signature of an independent witness were used.
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RESULTS.
MMP-1 and MMP-3 are produced by PBMC and biopsy cells from CL patients and healthy subjects. MMPs are enzymes that degrade extracellular matrix and in high levels MMPs may cause tissue damage (Elkington PT 2005). Exaggerated inflammatory responses lead to tissue damage and ulcer development in CL (Ribeiro-de-Jesus A 1998). MMP-1 and MMP-3 levels were determined in supernatants of peripheral blood mononuclear cells of healthy subjects and patients with CL (Figure 1A and B) and biopsy from the same groups (Figure 1C, D and E). Soluble Antigen of Leishmania (SLA) was added to cultures of PBMC and observe that the production of MMP-3 was greater in cultures stimulated with SLA in CL patients compared to healthy subjects (HS), however there was no statistical difference in the production of MMP-1 between CL and HS. When we compare the production of metalloproteinasis in the presence or absence of SLA, we observed a significant increase in the stimulated cultures with CL patients (Figure A and B). Evaluating the production of MMP-1, MMP-3 and TIMP-1 on the biopsies from CL patients and HS we found a significance of MMP-1 and TIMP-1 producing in CL patients compared with HS (Figure TIMP-1C and E).
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Figure 1. Production of MMP-1, MMP-3 and TIMP-1 in PBMC and biopsy from cutaneous leishmaniasis patients and healthy subjects. Levels of 1 (A) and MMP-3 (B), were determined in culture of PBMC with media or Soluble Leishmania Antigen (SLA) (5ug/ml) for 72 hours in patients with CL (n = 19) and healthy subjects (n = 09). The levels of MMP-1(C), MMP-3 (D) and TIMP-1 (E) were determined by ELISA in culture of biopsy from patients with CL (N = 11) and healthy subjects biopsy (N = 4). The results were presented in pg/mL. Mann-Whitney U test *P < 0.05 **P < 0.01.
Relevant contribution of TNF and IFN- in the production of MMP-1 and MMP-3 in healthy subjects and patients with CL. CL patients presents high levels of TNF and IFN- during infection (Ribeiro-de-Jesus A 1998). The production of MMP-1 and MMP-3 were determined by ELISA in the presence or absence of SLA and SLA adding anti-TNF (Figure 2A) and anti-IFN-γ (Figure 2B). We observed that production of MMP-1 was greater in cultures stimulated with SLA with anti-IFN-γ in CL patients compared to healthy subjects. However there was no statistical difference in the production of these cytokines MMP-3 when neutralized. When we compare the production of MMP-1 and MMP-3 in patients with LC under different conditions of
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stimuli, noted increased levels of MMP-1 in culture stimulated with SLA and SLA with anti-TNF and SLA with anti-IFN-γ.
Figure 2. Contribution of TNF and IFN-γ in the production of MMP-1 and MMP-3 in patients with cutaneous leishmaniasis. PBMC from patients with CL (n = 11) and HS (n = 05) cultured with media or stimulated with SLA (Soluble Leishmania Antigen) (5ug/ml) with anti-TNF (10ug/mL) and anti-IFN-(10ug/mL)for 72 hours and MMPs present in the supernatant of cultures were measured by ELISA. The results were presented in pg/ml. Statistical comparisons were performed using the Kruskal-Wallis test and post-test Dunns and Willcoxon test *P<0.05, ** P<0.01, ***P<0.001.
Role of IL-1β and IL-6 in the production of MMP-1 and MMP-3 in patients with cutaneous leishmaniasis. Cytokines such as TNF, TGF-β (MARRETI-MIRA, 2010; COSTA, 2008) and IL-1 (COSTA et al, 2008) are known to stimulate the expression and activation of MMPs, while IL-10 expression and activation decreases, IL-1 β (PRATO et al., 2008; NEE et al., 2004) and IFN-γ (MARETTI-MIRA, 2010) have varying effects. In a study with DNA Microarray in biopsy of patients with CL was demonstrated high expression of MMP-1, MMP-3, MMP-9 and MMP-12 highly expressed in patients with CL (CAMPOS et al., 2014). MMP-1 and MMP-3 levels were determined in peripheral blood mononuclear cells of healthy subjects and patients with
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CL by ELISA after 72 hours of culture in the presence or absence of SLA, SLA with anti-IL-1β (Figure 3A) and SLA with anti-IL-6 (Figure 3B). When we compare the production of MMP-1 in patients with CL under different conditions of stimuli we saw increased levels of MMP-1 in culture stimulated with SLA and SLA with IL-β 1 and SLA with anti-IL-6. However there was no statistical difference in the production of these cytokines MMP-3 when neutralized.
Figure 3. Production of MMP-1 and MMP-3 in patients with CL after blocking IL-1β and IL-6. PBMC from patients with CL (N = 11) and HS (N = 05) were cultured in media or stimulated with Soluble Leishmania Antigen (SLA) (5ug/ml) with anti-IL-β 1(10ug/mL) or anti-IL-6(10ug/mL) for 72 hours and MMPs present in the supernatant were measured by ELISA. The results were presented in pg/ml. Statistical comparisons were performed using the Kruskal-Wallis test and post-test Dunns and Willcoxon test *P<0.05 **P< 0.01, ***P<0.001.
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CD147 is expressed mainly by lymphocytes during CL infection. It was shown that monocytes subsets and lymphocytes are important in the immune response of cutaneous leishmaniasis patients (Coffman et al. 1985 and Passos S et al., 2014). CD147 is a molecule present on the cell surface of leukocytes and epithelial cells and has the role to induce production of metalloproteinases. Following the strategic gate for monocytes based on size and granularity of the cells (figure 4A) and the CD14 and CD16 markers for different subsets of monocytes (Figure 4B), the evaluation showed by flow citometry that CD147 expression is higher in HS compared with CL patients (Figure 4C). For instance, the same evaluation was performed for lymphocytes by flow citometry using a strategic gate (Figure 4D) and stained for CD4+ / CD8+T (Figure 4E) the evaluation showed higher expression of CD147 by CD8+T cells by CL patients (Figure 4F).
Figure 4. Expression of CD147 in monocytes and lymphocytes from CL patients and HS by flow cytometry. Ex-vivo analysis of CD147 expression in subpopulations of monocytes (A, B and C) and lymphocytes (D, E and F) from patients with CL and HS. (A) representative plot from a CL patient identifying the subpopulations of monocytes as classic (CD14+ CD16+), intermediate (CD14+ CD16+) and non-classical (CD14+
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CD16++). (B) frequency of subpopulations of monocytes in healthy subjects (HS) (N = 6) and patients with cutaneous leishmaniasis (CL) (N = 11). (C) frequency of CD147 in sub-populations of monocytes from CL patients and HS. (D) Strategic gate for lymphocytes and stain for CD4+ and CD8+ specific cells. (E) Expression of CD4+ and CD8+T cells from CL patients (N=11) and HS (N=06). (F) Expression of CD147 in lymphocytes from CL patients and HS lymphocytes. Non-parametric tests Kruskal-Waills and Dunns post test was used to compare three continuous variables and Mann-Whitney test was used to analyze the statistical differences between groups * P<0.05, ** P<0.01, *** P<0.001.
Levels of MMP-1 or MMP-3 presents a negative correlation to the size of lesion from CL patients in PBMC or biopsy of CL patients. Its already known that MMPs can be involved with tissue remodeling (…). Due to the high levels of MMP-1 and MMP-3 found in the peripheral blood from CL patients, we evaluate if there is a correlation between those metalloproteinases with size of the lesion from CL patients. We observed a negative correlation between MMP1 and MMP3 and the size of the lesion (r) (Figure 5A and B) and for the biopsies correlation between MMP1 and MMP3 and the size of the lesion (r) (Figure 5C and D).
CD8 12.7% CD4
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Figure 5. Correlation between the lesion size from PBMC and biopsy from patients with CL and the levels of MMP-1 and MMP-3. The PBMC data were obtained from 27 patients with cutaneous leishmaniasis (A and B) and 10 biopsies from CL patients (C and D). The levels of MMP-1 and 3 were expressed in pg/ml. The data were analyzed by Spearman correlation. Statistical significance with P< 0.05 and (r 0.1667, r =-0.0606, r=0.1459 and 0.0975), respectively.
DISCUSSION.
The CL caused by L. braziliensis is characterized by an inflammatory response with participation of neutrophils, mononuclear cells and high levels of IFN-γ and TNF. These cytokines contribute to the destruction of Leishmania, but induce tissue damage, participating in the development of ulcers observed in LC (Gomes-Silva 2007, Bacellar, 2002-2002, Cross of Jesus 1998). Some researchers have studied the participation of cytokines and chemokines that contribute to inflammatory response in patients with cutaneous leishmaniasis as CXCL-9, CXCL-10 and CCL-2 in the recruitment of
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leukocytes to inflammatory (Conrad, Strauss-Ayali et al., 2007; George, Zhang et al., 2011; Willenborg et al., 2012; Brito et al., 2014; Guimarães et al., 2015). While macrophages, monocytes and epithelial cells, cells are also involved in the immune response in leishmaniasis and express metalloproteinases, enzymes with properties related to degradation and remodeling of the extracellular matrix. In this study we investigated the expression of metalloproteinases MMP-1, MMP-3 and its inhibitor TIMP-1 in the peripheral blood and the injury of patients with CL, and, for the first time, we suggest how these metalloproteinases can be involved on the re-epithelization of the ulcer from cutaneous leishmaniasis patients infected by L. braziliensis. MMP-1 and MMP-3 have been documented by perform functions of tissue degradation and cell migration, as well as participate in the immune response by clivage cytokines and chemokines (Li et al., 2000; Vanhoutte et al., 2006; Kupai et al., 2010; Polyakova et al., 2010). Several studies have suggested that these metalloproteinases are involved in initial state of the tumor progression in human and murine model, although participate in inflammatory processes, they are also related to the repair of ulceration of intestinal mucosa as observed in infection caused by E. histolytica (Coussens et al., 1996; Sternlicht et al., 2000; Thibeauxet al., 2014). The MMPs are able to degrade extracellular matrix constituents, being secreted in response to external stimuli and inflammatory cytokines, mainly by macrophages and neutrophils (Brenner et al., 1989). In vitro, the migration of T cells and dendritic cells depends on specific stimuli is coordinated by metalloproteinase 9 (Xia et al., 1996). In this study, we found high production of MMP-1 and MMP-3 in PBMC of patients with CL. The expression of MMP-1 is directly related by different genetic polymorphisms. In genomic study with biopsies of patients with CL with infection by L. braziliensis was identified to 36 times higher expression of the gene for MMP-1 when compared with healthy subjects (Arakaki et al., 2009; Nancy et al., 2015). Although its role may lead to degradation of collagen (Coussens et al., 1996; Sternlicht et al., 2000; Xin, Wang et al., 2014; Almeida et al., 2016) so, an increased production of MMP-1 and MMP-3 in peripheral blood monocyte biopsies and MMP-1 and TIMP-1 is indicative for a tissue remodeling activity. This can be justified because the catalytic activity of collagenase-1 depends on the presence of MMP-1 for degradation of the injured tissue and the migration of keratinocytes over the dermal matrix for tissue reconstruction (Santoro; Galdino, 2005; Rohani & Parks, 2015). The production of MMP-3 in turn, explains one of their main actions that is releasing cell surface molecules that activate the colagenases, particularly
