Caracterização do Biofilme sobre Alumínio em Meio Citrato
Thays Nogueira da Rocha¹, Felipe Diógenes de Abreu ¹, Gledson Vieira Lima1 e Rui Carlos Barros da Silva ¹.
Laboratório de Eletroquímica e Corrosão Microbiana (LECOM), Departamento de Química, Universidade Estadual do Ceará. Av. Paranjana, 1700 60740-020 Campus do Itaperi, Fortaleza-CE.
RESUMO
A biocorrosão de metais consiste na formação de depósitos produzidos por microrganismos aderidos sobre a superfície de um metal, formando biofilme sobre esta. Em vista disso, o presente trabalho tem por objetivo avaliar o comportamento das bactérias Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa e Escherichia coli e o fungo Cândida albicans na solução de citrato e observar se ocorre a corrosão do metal alumínio, através do MEV. Para este estudo, fez-se o uso de testes microbiológicos, bem como, medidas de pH e de análises microscópica da superfície metálica. Foi observado que houve acúmulo crescente de material nas soluções, havendo uma leve turbidez nas soluções contendo as bactérias e nas soluções contendo o fungo, apresentando também uma formação macromorfológica das colônias fúngicas. Verificou-se que o pH das soluções contendo as amostras de bactéria tiveram uma variação de 7,0 para aproximadamente 9,0, enquanto que o pH das soluções contendo o fungo manteve-se constante, em torno de 5,5 ao longo de 30 dias. Conclui-se que as bactérias utilizadas nesse trabalho e o fungo Cândida albicans adaptaram-se à solução de citrato, havendo também a formação de biofilme na superfície do metal alumínio, incrementando dessa forma, a corrosão uniforme.
INTRODUÇÃO
A biodeteriorização de metais pode ser definida como uma “mudança indesejável nas propriedades de um material por atividade vital de microorganismos” [1]. A corrosão metálica é a transformação de um material metálico ou liga metálica pela sua interação química ou eletroquímica num determinado meio de exposição, processo que resulta na formação de produtos de corrosão e na liberação de energia. Ela manifesta-se em diferentes tipos de meios, porém o meio em que ela ocorre com maior freqüência é o aquoso. Nesse meio o mecanismo da corrosão é essencialmente eletroquímico [2]. A natureza eletroquímica da corrosão metálica continua presente na corrosão microbiológica. Os microrganismos participam de forma ativa no processo, mas sem modificar as características da reação eletroquímica, mas sim a interfase metal/ solução, induzindo, acelerando e/ou inibindo o processo anódico ou catódico que controla a reação de corrosão.
Um biofilme é constituído por células imobilizadas sobre um substrato, incluídas numa matriz orgânica de polímeros extracelulares produzidos pelos microorganismos,
e genericamente denominada material polimérico extracelular (MPE). O biofilme resulta de um acúmulo superficial que não é uniforme nem no tempo nem no espaço [3]. A presença de biofilmes sobre a superfície metálica é capaz de introduzir importantes mudanças no tipo e concentração de íons, pH, níveis de oxigênio, velocidade de fluxo de líquidos e capacidade tampão do meio nas proximidades do metal [4].
Sobre um metal em contato com águas industriais ou naturais, ocorrem processos biológicos, que produzem o biofouling (que se refere ao acúmulo indesejável de depósitos biológicos sobre uma superfície [5], e processos inorgânicos, cujo resultado é a corrosão. Ambos os fenômenos modificam de forma intensa o comportamento da interfase metal/ solução. Os processos biológicos ocorrem de acordo com uma seqüência de eventos, que tem início imediatamente no contato entre o meio líquido e o metal, segundo Characklis [6]. Os processos biológicos (biofouling) e os processos inorgânicos (corrosão), ocorrem de forma simultânea, mas seguem direções opostas. O biofouling é, como foi dito anteriormente, um processo de acumulação que se dirige do seio do líquido para a superfície metálica; já a corrosão transcorre no sentido oposto, da superfície metálica (que se dissolve) para o seio do fluido [7].
A biocorrosão e o biofouling das superfícies metálicas têm origens em processos biológicos que ocorrem pela participação de microorganismos aderidos às superfícies, por meio do MPE, formando biofilmes na interfase metal/ solução [8].
O alumínio é um metal leve e macio, porém resistente, de aspecto cinza prateado; e fosco, devido à fina camada de oxidação que se forma rapidamente quando exposto ao ar. O alumínio não é tóxico (como metal), não-magnético, e não cria faíscas quando exposto a atrito. É muito maleável dúctil e apto para a mecanização e para a fundição, além de ter uma excelente resistência à corrosão e durabilidade devido à camada protetora de óxido. É o segundo metal mais maleável (o primeiro é o ouro) e o sexto mais dúctil. Por ser um bom condutor de calor, é muito utilizado na indústria de aeronáutica. O comportamento da corrosão de ligas de alumínio em meio ácido foi estudado largamente na literatura [9-10], em meio neutro
[11-13] e em meio alcalino [14-15]. O alumínio e suas ligas são atrativos em uma variedade de aplicações técnicas. Em alguns casos - por exemplo, em refrigerar, em se aquecer ou em redes elétricas - o alumínio ocorre em tal ambiente onde o cobre está também presente. Em tais sistemas bimetálicos, a corrosão galvânica é sempre uma ameaça [16-18], porém - como pode ser experimentado na prática - em determinados casos, estes sistemas trabalham durante um longo período do tempo sem uns danos consideráveis da corrosão. Como foi relatado [19], uma concentração baixa dos íons de cobre pode mesmo resultar na inibição da corrosão do alumínio.
Os representantes do mundo procariótico compõem um vasto grupo heterogêneo de organismos unicelulares muito pequenos, pertencentes ao reino Monera. Os milhares de espécies de bactérias são diferenciados por muitos fatores, incluindo a morfologia (forma), a composição química (freqüentemente detectada por reações de coloração), as necessidades nutricionais, as atividades bioquímicas e a fonte de energia (luz solar ou química).
Os fungos são microorganismos eucarióticos e, embora apresentem paredes rígidas como os vegetais, não possuem clorofila [20]. Estão incluídos neste grupo
organismos de dimensões consideráveis, como os cogumelos, mas também muitas formas microscópicas, como bolores e leveduras [21].
Em vista disso, o presente trabalho tem por objetivo avaliar o comportamento das bactérias Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa e Escherichia coli e o fungo Cândida albicans na solução de citrato, observando se ocorre a corrosão do metal alumínio, através do MEV caracterizar os elementos presentes na superfície do alumínio através da Análise de Energia Dispersiva por Raio X (EDX). Para este estudo, fez-se o uso de testes microbiológicos, bem como, medidas de pH e de análises microscópica da superfície metálica.
MATERIAIS E MÉTODOS
O metal utilizado foi o alumínio, tendo área aproximada de 1cm2, sendo as amostras polidas, na politriz de bancada, da Maxiplan, antes de serem imersas nos tubos contendo solução e tratadas com álcool etílico absoluto, para retirar possíveis sujidades.
Os microorganismos empregados foram às bactérias Pseudomonas aeruginosa ATCC27853, Escherichea coli ATCC35218, Staphylococcus aureus ATCC25923 e o fungo Cândida albicans ATCC11006, doados gentilmente pela FIOCRUZ-RJ. Foram utilizados um total de 40 tubos de ensaio contendo 30 mL de solução cada, sendo 10 tubos para cada bactéria e 10 tubos para o fungo. Todas as amostras foram utilizadas em duplicata. As vidrarias empregadas, tanto os tubos de ensaio como as placas de petri, foram devidamente esterilizadas na autoclave da Stermax, modelo 12 EHA.
Antes de serem imersas nos tubos contendo solução, tanto as bactérias, como o fungo, vindos liofilizados, foram imersos em caldo nutritivo BHI e após 3 dias, foram colocados em placas de petri contendo os meios de cultura seletivo Ágar MacConkey, para o cultivo da Pseudomonas aeruginosa, a temperatura de 37°C em estufa bacteriológica , Escherichea coli à temperatura de 46°C aproximadamente; Ágar Baird Parker para Staphylococcus aureus a temperatura de 37°C e Ágar Batata Dextrose para o cultivo do fungo Cândida albicans à temperatura de 37°C. Após estarem adaptadas em seus respectivos meios, os microorganismos foram inoculados nas soluções.
A solução de citrato utilizada tinha como constituintes: NaCl(0,8g/L), C6H5Na3O7(0,2g/L), Na2HPO4(0,02g/L), sacarose(0,12g/L), caseína(0,12g/L), tiamina(0,004g/L), MgCl2(0,012g/L) e FeSO4(0,012g/L) no qual o pH inicial era de 6,0, sendo ajustado com HCl 0,1 M para 5,0 para o fungo e com NaOH 0,1 M ajustado para 7,0 para as bactérias.
Para verificação do crescimento bacteriano e fúngico nas soluções, foram retiradas alíquotas no intervalo de 30 dias. Estas foram despejadas em placas de Petri e postas em estufa bacteriológica por 24 horas para ser observado se houve o crescimento dos microorganimos nos tubos e a conseqüente corrosão do metal. O pH das soluções foi medido através do pHmetro, da Marconi PA 200.
As amostras de alumínio utilizadas neste trabalho, após 30 dias, foram levadas para o Laboratório de Microscopia Atômica (LMA), da UFC, com a finalidade de se obter análise da superfície do metal através da técnica de microscopia eletrônica de
varredura (MEV), após a exposição à solução de citrato de sódio na presença do microorganismo.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Observou-se que houve turvação das soluções contendo as bactérias e que as soluções contendo o fungo Candida albicans tornaram-se levemente turvas e, este fungo apresentou-se com formação macromorfológica uniforme em toda a solução, ao longo dos 30 dias. Após serem retiradas alíquotas dos tubos, estas foram inoculadas em placas contendo meio seletivo e colocadas em estufa durante 24 horas. Foi notado que houve o crescimento das bactérias e dos fungos. Portanto, pode dizer que ambos os microorganismos adaptaram-se a solução.
Tabela 1. Valores de pH em função do tempo de inoculação das bactérias Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli e o fungo Candida albicans em solução de citrato a 25oC.
Através da tabela colocada acima, pode-se observar que houve um aumento gradativo do pH do meio na presença das bactérias, tornando-se a solução alcalina no decorrer de 30 dias. É verificada a alteração dos valores; partindo de 7,0 a 9,0, em presença da bactéria Staphylococcus aureus. Por outro lado, o pH das soluções contendo o fungo Candida albicans manteve-se praticamente constante. Provavelmente, a alcalinidade das soluções contendo colônias bacterianas deve-se ao fato de ter ocorrido o incremento da dissolução do alumínio em solução, com a formação de hidróxido de alumínio, Al(OH)3, enquanto que nas soluções contendo o fungo, este aspecto deve ter acontecido também, porém, o hidróxido foi neutralizado pela ação do ácido cítrico produzido pela Candida albicans.
Na Figura 1, são exibidas as imagens micrográficas da superfíicie do alumínio submetida a imersão em solução citrato na presença da bactéria Staphylococcus aureus. Tempo de Imersão (dias) Staphylococcus aureus Pseudomonas aeruginosa Escherichea coli Candida albicans 0 3 6 12 20 30 7,0 7,4 7,9 7.6 8,5 9,0 7,0 7,2 7,9 8,0 8,5 8,5 7,0 7,9 8,0 8,2 8,5 8,7 5,0 5,3 5,3 5,3 5,8 6,0
(a) (b)
(e)
Figura 1: Micrografias da Superfície do Alumínio na Presença da bactéria Staphylococcus aureus em Meio Citrato. (a) após 3 dias de imersão. Aumento: 1000X; (b) após 6 dias. Aumento: 1000X; (c) após 12 dias. Aumento: 3000X; (d) após 20 dias. Aumento: 1000X e (e) após 30 dias. Aumento: 2000X.
Pode-se observar que a presença do biofilme é evidenciada (Figuras 1(a) a 1(e)). A partir das micrografias apresentadas nas Figuras 1(c) e 1(e), nota-se a formação de colônias bacterianas aderidas à superfície do metal e na imagem micrográfica apresentada na Figura 1(d), é possível que tenha ocorrido a formação de bolhas de ar, incrementando para o crescimento do biofilme de forma não compactada, exibindo regiões da superfície expostas a solução.
(a) (b)
(e)
Figura 2: Micrografias da superfície do alumínio na presença da bactéria Pseudomonas aeruginosa em solução de citrato. (a) após 3 dias de imersão. Aumento: 1000X; (b) após 6 dias. Aumento: 500X; (c) após 12 dias. Aumento: 5000X; (d) após 20 dias. Aumento: 500X e (d) após 30 dias. Aumento: 3000X. Nas Figuras 2(a) a 2(e) são colocadas as imagens micrográficas obtidas da superfície do alumínio em solução de citrato na presença da bactéria Pseudomonas aeruginosa. É notada a presença de óxidos sobre a superfície, como denotado pela imagens exibidas nas Figuras 2(b) e 2(d). Observa-se também que a presença de agregados de células bacterianas sobre o biofilme formado.
Nas Figuras 3(a)-(e) estão exibidas as imagens da superfície o alumínio, na presença da bactéria E. coli. O biofilme formado encontra-se distribuído homogeneamente sobre a superfície, como mostrado nas Figuras 3(a), 3(c) e 3(e); no entanto, este aspecto não é observado para o tempo de imersão de 6 dias do alumínio na solução (Figura 3(b)). É provável que haja a formação de camadas do biofilme não totalmente crescidas ao longo da superfície. Todavia, é verificada que a corrosão localizada ocorre sobre a superfície do alumínio para o tempo de imersão de 20 dias, sendo exibida a presença de possíveis óxidos aderidos a superfície do metal (Figura 3(d)).
(a) (b)
(c) (d)
(e)
Figura 3: Micrografias da superfície do alumínio na presença da bactéria Escherichea coli em solução de citrato. (a) após 3 dias de imersão. Aumento:
6000X; (b) após 6 dias de imersão. Aumento: 500X; (c) após 12 dias. Aumento: 1000X; (d) após 20 dias. Aumento: 1000X; (e) após 30 dias. Aumento: 3000X.
(a) (b)
(c) (d)
Figura 4: Micrografias da superfície do alumínio na presença do fungo Cândida albicans em solução de citrato. (a) após 3 dias de imersão. Aumento: 2000X; (b) após 6 dias. Aumento: 1.000X; (c) após 12 dias. Aumento: 1.000X; (d) após 20 dias. Aumento: 1000X; (e) após 30 dias. Aumento: 1000X.
É encontrado que a superfície de alumínio na solução de citrato na presença Cândida albicans ocorre acúmulo gradativo de colônias fúngicas, como mostrado pelas Figuras 4(a)-4(e), as quais estão distribuídas uniformemente sobre o metal. No entanto, são observadas regiões sobre a superfície que não há a deposição do biofilme e de presença de possíveis óxidos para o tempo de imersão de 6 dias (Figura 4(c) e 4(e)).
A Figura 5 ilustra os espectros de EDX obtidos para a superfície do alumínio em solução citrato na presença da bactéria Staphyloscoccus aureus. É notado que o aparecimento de picos associados aos elementos magnésio, cloro, oxigênio e alumínio, estando relacionados aos componentes da solução. As Figuras 5(a)-5(d) apresentam os perfis espectrais semelhantes, no entanto, é verificado que, para o tempo de imersão de 3 dias, os picos referentes aos elementos magnésio, oxigênio e sódio são bastante acentuados (Figura 5(a)). Este fato pode estar indicando que, inicialmente, ocorre o acúmulo dos componentes da solução sobre a superfície, os quais tendem a se aglomerar no biofilme formado, não sendo notados para tempos maiores de imersão (Figura 5(b)-5(d)).
(b)
(c)
(d)
Figura 5. Espectros de EDX obtidos para a superfície do alumínio na presença da bactéria Staphylococcus aureus em solução de citrato para o tempo de imersão de: (a) 3 dias; (b) 6 dias; (c) 20 dias e (d) 30 dias.
A Figura 6 ilustra os espectros da superfície do alumínio em solução de citrato na presença da Pseudomonas aeruginosa para os diferentes tempos de imersão. É notado que o surgimento de picos associados aos elementos sódio, cloro, oxigênio, além do alumínio. Este fato indica a possível formação de óxidos, verificando a
evidência destes elementos mais acentuadamente para os tempos de imersão de 6 e 20 dias (Figura 6(b) e 6(c)). Há também a presença de picos discretos associados aos elementos fósforo e enxofre.
(a)
(b)
(d)
Figura 6. Espectros de EDX obtidos para a superfície do alumínio na presença da bactéria Pseudomonas aeruginosa em solução de citrato para o tempo de imersão de: (a) 3 dias; (b) 6 dias; (c) 20 dias e (e) 30 dias.
Na Figura 7 são apresentados os espectros de EDX da superfície do alumínio em solução de citrato na presença da bactéria Escherichia coli. Pode ser observado que os espectros indicam picos associados aos elementos alumínio e carbono (Figuras 7(a)-7(d)). O pico associado ao elemento carbono pode estar sugerindo a adsorção de compostos orgânicos sobre a superfície do metal.
(b)
(c)
Figura 7. Espectros de EDX obtidos para a superfície do alumínio na presença da bactéria Escherichea coli em solução de citrato para tempos de imersão de: (a) 3 dias; (b) 6 dias; (c) 20 dias e (d) 30 dias.
A Figura 8 apresenta os espectros da superfície do alumínio em solução de citrato na presença do fungo Candida albicans. Nos espectros são evidenciados os picos associados ao elemento carbono, sódio, magnésio e cloro. Este aspecto sugere que o biofilme formado sobre a superfície do metal é complexo ao que tange a sua composição.
(a)
(c)
(d)
Figura 8. Espectros de EDX obtidos para a superfície do alumínio na presença da bactéria Candida albicans em solução de citrato para o tempo de imersão de: (a) 3 dias; (b) 6 dias; (c) 12 dias; (d) 20 dias e (d) 30 dias.
CONCLUSÃO
Conclui-se que ambos os microorganismos, tanto as bactérias quanto o fungo, se adaptaram à solução de citrato e se desenvolvem incrementando a formação do biofilme sobre a superfície do alumínio. A corrosão do alumínio em solução de citrato ocorre na presença de colônias bacterianas como também em colônias fúngicas.
AGRADECIMENTOS
Os autores gostariam de expressar sinceros agradecimentos ao Instituto de Pesquisas e Desenvolvimento Industrial (IPDI)/Laboratório de Microscopia Atômica (LMA), da UFC, pelas análises da superfície e ao Programa de Bolsas de Iniciação Científica IC-UECE pela concessão da bolsa de estudo.
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