LGN 5799 - SEMINÁRIOS EM
GENÉTICA E MELHORAMENTO DE PLANTAS
Programa de Pós-Graduação em
Genética e Melhoramento de Plantas
Departamento de Genética
Avenida Pádua Dias, 11 - Caixa Postal 83, CEP: 13400-970 - Piracicaba - São Paulo - Brasil
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METABOLISMO DE AMINOÁCIDOS
Aluna: Bertha Dévora Agurto Berdejo
Orientador: Ricardo Antunes Azevedo
SUMÁRIO
Introdução
Aminoácidos
Vias Metabólicas
Diferentes vias
Via Metabólica do Aspartato
Quatro essenciais
Estratégias de Pesquisa
Três formas
O que são aminoácidos
Molécula que contém os grupos funcionais amina e
ácido carboxílico.
Formam a estrutura das proteínas
Aminoácidos Essencias
São vinte tipos de aminoácidos incorporados nas
proteínas,
nove (lisina, treonina, metionina, fenilalanina, triptofano,
isoleucina, leucina, valina e histidina) são denominados
essenciais
não são sintetizados por humanos e animais monogástricos, sendo
adquiridos nas dietas alimentares.
INTRODUÇÃO
Características
As enzimas que atuam na síntese destes aminoácidos estão
normalmente localizadas dentro dos cloroplastos das folhas ou
em plastídeos de órgãos não fotossintéticos, como raiz e
sementes.
Principais moléculas de acumulo de nitrogênio para as plantas.
Mais de 300 aminoácidos não protéicos foram isolados de
plantas, os quais tem papel importante na medicina, nutrição e
agricultura
Importância
Desempenham importantes funções
transportadores de nitrogênio para diferentes partes nos vegetais,
reguladores em diversos processos envolvidos em resposta a
diferentes condições ambientais,
relacionados também com a qualidade nutricional das proteínas
presentes nas sementes.
Síntese
São sintetizados nos vegetais em complexas vias metabólicas
sujeitas a uma regulação muito complexa e restrita para evitar
o desperdício de energia e de nutrientes importantes como,
carbono, nitrogênio e enxofre.
A regulação das vias metabólicas é feita por enzimas,
substratos e pelos próprios aminoácidos obtidos como
produtos finais
Assimilação de Nitrogênio
Normalmente, o nitrato é a principal fonte de nitrogênio
disponível para as plantas.
O nitrato absorvido pelas raízes é reduzido e incorporado na
célula através de uma série de reações catalisadas por enzimas
assimilatórias.
Inicialmente, o nitrato absorvido é reduzido a nitrito em uma
reação catalisada pela enzima nitrato redutase (NR, EC 1.6.6.1).
Posteriormente, o nitrito é reduzido a amônio pela ação da
enzima nitrito redutase (NiR, EC 1.7.7.1),
O amônio é convertido em aminoácidos pela ação das enzimas
glutamina sintetase e glutamato sintase (GS - GOGAT; EC
6.3.1.2 e EC 1.4.7.1, respectivamente)
COO
-C
H
R
+H
3N
aminoácidos
NH
4 +amônia
N
2Intermediários
da via glicolítica
Intermediários
do ciclo do
ácido cítrico
Intermediários
da via
das pentoses
COO
-C
H
R
Esqueleto
carbônico
BIOSÍNTESE DE AMINOÁCIDOS
Ser Gly Cys
As sínteses de serina e glicina
estão intimamente relacionadas
com a via de fotorrespiração nos
vegetais. São transportados para
outros órgãos e usados como
precursores da cisteína
e da
glutationa.
Na ausência de fotorrespiração a serina também é sintetizada a partir de fosfoglicerato, uma vez sintetizado, o aminoácido serina é convertido em glicina.
• Serina
O aminoácido glicina formado é, então, utilizado para a síntese de serina nas mitocôndrias.
• Glicina
O glicolato formado nos cloroplastos é oxidado a glioxalato e convertido a glicina nos peroxissomos.
• Cisteína
Regula a estrutura e a função das proteínas.
O mais importante constituinte da glutationa.
O esqueleto de carbono é cedido pela serina.
• Via do Shikimato
-20% do carbono fixado pela planta passa por esta via. -Todas as enzimas estão localizadas no cloroplasto, mas há evidências de que ocorre uma segunda via no
citoplasma.
-EPSPS penúltimo passo da via alvo do glifosato
aumenta a concentração de shikimato • Aromáticos
-Reguladores de crescimento -Agentes químicos de defesa -Atrativos para polinizadores
• Leucina e Valina
As reações ocorrem no cloroplasto, o carbono é derivado apenas de duas moléculas de piruvato.
Provavelmente estão relacionados à degradação de aminoácidos.
As vias metabólicas de síntese de leucina e valina são consideradas bioquimicamente paralelas.
• Alanina
Um dos aminoácidos mais simples
Pouco reativo quimicamente Reconhecimento de
substratos em sítios ativos ou de regulação enzimática
• Glutamato e Glutamina
Inicialmente o amônio absorvido do solo ou reduzido a partir de nitrato via NR e NiR é assimilado em glutamina e glutamato via ciclo GS-GOGAT:
- GS: glutamina sintetase
- GOGAT: glutamato
sintase
O Glutamato formado origina a Glutamina com o auxílio de amônio.
• Prolina
A prolina é sintetizada em outro ramo em quatro reações enzimáticas;
O principal aminoácido das proteínas de sementes;
Papel importante como osmoprotetor na resistência à seca;
Estoque de energia para o crescimento do tubo polínico;
Fixação de nitrogênio nos nódulos das raízes de leguminosas.
Glu Gln Pro Arg His
•Arginina
A síntese de arginina representa um conveniente mecanismo de armazenamento de nitrogênio, cada molécula é composta por 4 átomos de nitrogênio. As sementes freqüentemente contêm uma alta concentração deste aminoácido.
Este aminoácido é acumulado em diferentes tecidos da planta e tem um papel importante em sua diferenciação, incluindo o florescimento, a nodulação da raiz e também a resistência ao estresse.
•Histidina:
- Aminoácido não essencial que apresenta funções essenciais como a manutenção do status de oxi-redução (Boldyrev, 1999).
- A quelação dos metais através de biomolécula serve como um mecanismo de defesa utilizado por algumas espécies para resistir a exposição a íons de metais tóxicos. Nas plantas denominadas hiperacumuladoras, por exemplo, a histidina é conhecido por iniciar a principal função da quelação e transporte de metais como zinco, níquel, cobalto e cobre lidando com a intolerância do metal (Lasat, 2000).
VIA METABÓLICA DO ÁCIDO ASPÁRTICO
Devido a baixa concentração de lisina e treonina nas
sementes de cereais, e sua importância como
aminoácidos essenciais, estudos tem sido realizados para
se obter um melhor entendimento da regulação da via
metabólica.
• O
Aspartato
Aspartato
atua como
precursor comum em duas
vias metabólicas
A primeira conduz
à
síntese do aminoácido
asparagina
,
A segunda conduz à
síntese de quatro dos nove
aminoácidos
essenciais:
lisina, treonina, metionina
e
isoleucina
.
Aspartato
β-Aspartil fosfato
Asparagina
AK
HSDH
DHDPS
Lisina
HomoserinaTreonina
Metionina
Isoleucina
TS
β-aspartil fosfato
• Asparagina
-Composto usado no armazenamento e transporte de nitrogênio na planta
-As enzimas do metabolismo da asparagina estão localizadas no citosol, embora estudos de seqüenciamento genético recentes confirmaram que as enzimas envolvidas na síntese dos restantes dos aminoácidos derivados do aspartato estão localizados no cloroplasto das folhas, ou em plastídeos dos orgãos não fotossintetizantes como as sementes e a raíz.
• Aspartato
Formado pelo processo de transaminação do ácido oxaloacético, originado no ciclo de Krebs nas mitocôndrias ou através da ação da enzima fosfoenolpiruvato carboxilase no citoplasma
• HSDH
A enzima HSDH catalisa a síntese de homoserina Foi primeiramente estudada em procariotos e posteriormente em vegetais.
Duas isoenzimas da HSDH têm sido observadas em vegetais
uma sensível a treonina, no citoplasma outra resistente à inibição por treonina.
• AK
Primeira enzima da via metabólica do ácido aspártico.
Inicialmente a AK foi estudada em microrganismos e posteriormente em diversas espécies vegetais como milho, arroz, sorgo
Duas isoenzimas distintas da AK têm sido descritas:
Isoenzima monofuncional e sensível à inibição por lisina, predominante
Presente em um polipeptídeo bifuncional apresentando um domínio de AK e outro de HSDH, sendo sensível à inibição por treonina
β-aspartil fosfato
• DHDPS
Dihidropicolinato sintase Cloroplastos
Diferentemente do observado para as enzimas AK e HSDH, somente uma forma altamente sensível à inibição por baixas concentrações de lisina tem sido descrita
β-aspartil fosfato
• Lisina
É sintetizado a partir de β-aspartato semialdeído em sete reações enzimáticas iniciadas pela ação da enzima DHDPS.
LOR
SDH
Lisina
Sacaropina
2-aminoadipato semialdeído
+
glutamato
• Catabolismo de LisinaDuas enzimas estão envolvidas no catabolismo de lisina
LOR, lisina 2-oxoglutarato redutase SDH, sacaropina desidrogenase
Embora as enzimas LOR e SDH possam estar presentes em vegetais como enzimas monofuncionais, a maior atividade da LKR e SDH está presente em um polipeptídeo bifuncional
O aminoácido lisina pode regular seu próprio catabolismo com as enzimas sendo moduladas diferencialmente em uma cascata de sinais intracelular envolvendo principalmente cálcio e um processo de fosforilação-desfosforilação da proteína.
β-aspartil fosfato
• CGS e TSEnsaios realizados in vitro indicaram que em plantas a enzima TS tem de 250 a 500 vezes mais afinidade pela OPH do que a enzima CGS • Metionina -1ª enzima cistationa-γ-sintase (CGS). -Precursor de S-adenosilmetionina (SAM)
-Principal doador do grupo metil em reações de transmetilações
-Intermediário na biosintese de poliaminas e do fitohormonio etileno
• Treonina
1ª enzima treonina sintase (TS), induzida por SAM
β-aspartil fosfato
• Isoleucina
Treonina deaminase (TD) é a primeira enzima na síntese de Isoleucina.
Há duas isoformas de TD
-Biossintética: presente em tecido jovem em desenvolvimento, que sofre inibição por isoleucina
-Biodegradativa: presente em tecido velho, senescente, não sensível à inibição.
Inibição por
feedback sequencial
Multiplicidade
enzimática
Os estudos bioquímicos, genéticos e moleculares da via
do ácido aspártico levaram à compreensão de
mecanismos importantes para a manipulação metabólica
da via e para a elaboração de estratégias para produção
de cereais com alto teor de lisina nas sementes.
Quatro principais estratégias têm sido utilizadas para
produção de cereais que acumulam alta concentração de
lisina
Melhoramento genético
QPM
Identificação de mutantes naturais
Produção de plantas transgênicas
• Objetivos
Foi realizado um estudo, em sementes imaturas, com as enzimas envolvidas na biossíntese de lisina, para obter o seu padrão de atividade.
• Quinoa
Importante fonte de proteínas devido a sua digestibilidade e composição balanceada de aminoácidos.
Pseudocereal
As enzimas apresentaram um resultado similar nas três etapas
de desenvolvimento indicando que qualquer uma das três
etapas pode ser usado como fonte de atividade para o estudo
das propriedades reguladoras das enzimas.
Assim para o estudo de atividade foram utilizadas as sementes
com 20 DAP
A concentração total de aminoácidos solúveis permaneceu inalterada
durante o desenvolvimento, com as folhas exibindo uma concentração
maior que a das raízes.
Lisina nas concentrações de 1 e 5 mM inibiram a atividade de AK em 19,5% e 23,8% respectivamente. Treonina nas concentrações de 1 e 5 mM inibiram a atividade de AK em 45,2% e 49,7%, respectivamente. Lys +Thr nas concentrações de 1 e 5 mM inibiram a atividade de AK 37,6% e 47,6%, respectivamente.
Controle lisina treonina metionina S-2-aminoetil L-cisteina
Sementes com 20 DAP
Lisina, Metionina e AEC não afetaram a atividade de HSDH.
Treonina nas concentrações de 1 e 5 mM inibiram a atividade de AK em 46,9% e 63,9% respectivamente.
Sementes com 20 DAP
Controle lisina treonina metionina S-2-aminoetil L-cisteina
A adição de lisina na mistura com treonina, nas concentrações de 1 e 5 mM induziu uma forte inibição da atividade de DHDPS, 65,3% e 69,9%, respectivamente.
AEC nas concentrações de 1 e 5 mM inibiram a atividade de DHDPS em 28,7%e 60,1%, respectivamente.
A treonina e a metionina não alteraram a atividade de DHPS
Sementes com 20 DAP
Controle lisina treonina metionina S-2-aminoetil L-cisteina
• Conclusões
-Presença de duas isoenzimas de AK
-Maior concentração de treonina nas sementes de Quinoa
-Presença de duas isoenzimas de HSDH
-Uma isoenzima de DHDPS altamente sensível à inibição por lisina
-Alta concentração de lisina (alta síntese de lisina e acumulo na forma
solúvel)
O estudo dos mutantes apresentando alterações na sensibilidade das
enzimas AK e DHDPS aos aminoácidos lisina, treonina e ao AEC,
contribuíram para a compreensão dos mecanismos regulatórios
envolvidos na via metabólica do ácido aspártico, principalmente aos
relacionados à regulação das enzimas chave da síntese de lisina AK
e DHDPS. O uso de plantas transgênicas se revelou como uma
importante metodologia para o estudo desta via metabólica.
• Objetivo
Aumentar o acumulo de lisina livre combinando duas vias de transformação de milho.
-CordapA (Corynebacterium glutamicum) gene com expressão resistente ao feedback de lisina.
-Supressão do gene LKR/SDH
Embriões imaturos de milho
Agrobacterium
Vetor binário pMON93066
+ de 90 indivíduos transformados R0
Cópia do gene marcador
autopolinização
16 linhas
+ de 100 sementes R1
Western blot
6 grãos por linha, aleatoriamente
• Western blot
A maioria das linhas 11/16 apresentaram expressão de
CordapA e redução de LKR/SDH (a).
Duas linhas mostraram expressão do CordapA, mas sem
redução de LKR/SDH (b).
Uma linha não apresentou expressão de CordapA, mas
redução de LKR/SDH (c).
Duas linhas não apresentaram nem expressão, nem redução.
b
a
a
c
A análise de lisina livre em sementes maduras da R2, demonstrou que não ocorre acumulo de lisina nos grãos maduros de milho, quando transformados com apenas o gene CordapA.
Na transformação M115160, na qual a expressão de CordapA não foi significativa, o acumulo de lisina foi ~ 2x menor quando comparado com o acumulo nas transformações com expressão do CordapA e redução do LKR/SDH.
M – transformãção com os
genes CordapA e LKR/SDH
S – transformação com o
gene CordapA