Universidade Federal do Rio de Janeiro
CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE UM
LUTEOVIRIDAE ASSOCIADO À DOENÇA AZUL DO
ALGODOEIRO E IDENTIFICAÇÃO DE FATORES DE
PATOGENICIDADE NA FAMÍLIA VIRAL ENVOLVIDOS
COM A SUPRESSÃO DE SILENCIAMENTO POR RNA
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CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE UM LUTEOVIRIDAE ASSOCIADO À DOENÇA AZUL DO ALGODOEIRO E IDENTIFICAÇÃO DE FATORES DE PATOGENICIDADE NA FAMÍLIA VIRAL ENVOLVIDOS COM A SUPRESSÃO
DE SILENCIAMENTO POR RNA
Régis Lopes Corrêa
Rio de Janeiro
Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-graduação em Ciências (Microbiologia), Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes, da Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Doutor em Ciências (Microbiologia).
Orientadora:
Dra. Maité Vaslin de Freitas Silva
Co-orientador:
CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE UM LUTEOVIRIDAE ASSOCIADO À DOENÇA AZUL DO ALGODOEIRO E IDENTIFICAÇÃO DE FATORES DE PATOGENICIDADE NA FAMÍLIA VIRAL ENVOLVIDOS COM A SUPRESSÃO
DE SILENCIAMENTO POR RNA
Régis Lopes Corrêa
Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-graduação em Ciências (Microbiologia), Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes, da Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Doutor em Ciências (Microbiologia).
Aprovada por:
_______________________________
Presidente, Prof. Maité Vaslin de Freitas Silva
_______________________________ Prof. Davis Ferreira
_______________________________ Prof. Francisco Murilo Zerbini
_______________________________ Prof. Luciana Jesus da Costa
_______________________________ Prof. Renato de Oliveira Resende
_______________________________ Prof. Marcelo Bozza
_______________________________ Prof. Paulo Cavalcanti Gomes Ferreira
Rio de Janeiro Fevereiro de 2008
Corrêa, Régis Lopes.
Caracterização Molecular de um Luteoviridae associado com a doença azul do algodoeiro e identificação de fatores de patogenicidade na família viral envolvidos com a supressão de silenciamento por RNA/ Régis Lopes Corrêa.- Rio de Janeiro: UFRJ/ IMPPG, 2008.
xi, 166f.: il.; 31 cm.
Orientador: Maité Vaslin de Freitas Silva
Tese (doutorado) – UFRJ/ Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes/Programa de Pós-graduação em Ciências (Microbiologia), 2008. Referências Bibliográficas: f. 140-161.
1. Doença azul do algodoeiro. 2. Cotton leafroll dwarf virus. 3. Luteoviridae. 4. Polerovirus. 5. Luteovirus. 6. Enamovirus. 7. Silenciamento gênico. 8. Supressão viral de silenciamento. 9. RNAi. 10. Potato leafroll virus. 11. Pea enation mosaic virus-1. 12. Argonautes. 13. Arabidopsis thaliana. I. Vaslin, Maité Freitas Silva. II. Universidade Federal do Rio de Janeiro,
Microbiologia Prof. Paulo de Góes/Programa de Pós-graduação em Ciências (Microbiologia). III. Título.
RESUMO
CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE UM LUTEOVIRIDAE ASSOCIADO À DOENÇA AZUL DO ALGODOEIRO E IDENTIFICAÇÃO DE FATORES DE PATOGENICIDADE NA FAMÍLIA VIRAL ENVOLVIDOS COM A SU PRESSÃO DE
SILENCIAMENTO POR RNA
A família viral Luteoviridae é dividida nos gêneros Luteovirus, Polerovirus e Enamovirus, todos apresentando genoma de RNA fita simples positiva. Nesse trabalho, oligonucleotídeos degenerados foram desenhados com o intuito de identificar membros desse grupo viral associados com a doença azul do algodoeiro. A doença azul é transmitida pelo afídeo Aphis gossypii e causa danos à agricultura em diversas partes do mundo. Reações de RT-PCR foram capazes de amplificar um fragmento em plantas doentes utilizando-se oligos específicos para o gênero Polerovirus. A análise das seqüências obtidas indica que o vírus, denominado Cotton leafroll dwarf virus (CLRDV), deve ser considerado um membro definitivo do gênero Polerovirus. Para melhor entender a biologia dessa família viral, uma busca por genes supressores de silenciamento por RNA foi realizada. Silenciamento gênico é um mecanismo de controle da expressão gênica conservado em diversos reinos biológicos e, em plantas, está associado com a defesa antiviral. Nenhuma supressora foi encontrada no gênero Luteovirus. No entanto, a P0 do Enamovirus apresenta atividade supressora, assim como já tinha sido observado para membros do gênero Polerovirus. A expressão dessa proteína em Arabidopsis causa alterações no desenvolvimento da planta que estão associados com redução nos níveis de pequenos RNAs endógenos e aumento na concentração de seus alvos. Foi observado também que a P0 interage com SKIP2 e que sua atuação depende de um domínio tipo F-Box. Dados indicam que a proteína suprime a resposta antiviral através da indução da degradação de genes importantes no processo, tais como Argonaute e Dicer.
Palavras-chave: doença azul do algodoeiro; Luteoviridae; RNAi; ubiqüitinação.
Rio de Janeiro Fevereiro de 2008
ABSTRACT
MOLECULAR CHARACTERIZATION OF A LUTEOVIRIDAE ASSOCIATED WITH COTTON BLUE DISEASE AND IDENTIFICATION OF FACTORS IN THE FAMILY
INVOLVED WITH SUPPRESSION OF RNA SILENCING
The family Luteoviridae is grouped in three genera: Luteovirus, Polerovirus and Enamovirus and all members have positive single-stranded RNA genomes. In this work degenerated primers were designed to identify members of this family associated with cotton blue disease. Blue disease is transmitted by the aphid Aphis gossypii and causes economically important losses in cotton crops around the world. Polerovirus-specific primers were able to amplify part of the genome of a virus associated with this disease. Sequence analysis indicates that the named Cotton leafroll dwarf virus (CLDV) should be considered as a permanent member of the genus Polerovirus. To help understanding the biology of this group of virus, a search for suppressors of RNA silencing in the family was also done. Gene silencing is a conserved mechanism for controlling gene expression and in plants is associated with viral defense. No suppressor was found in the genus Luteovirus. However, the P0 from the Enamovirus proved to be a strong suppressor of silencing, as already stated for P0s of the genus Polerovirus. Expression of the suppressor in Arabidopsis induced several developmental problems that were associated with a reduction in the levels of endogenous small RNAs and an increase in the level of their targets. It was also observed that the action of P0 depends on the interaction with the SKIP2 through an F-Box-like domain. It is proposed that the P0 protein from the Enamovirus group is able to suppress gene silencing by targeting Argonaute and Dicers proteins for degradation.
AGRADECIMENTOS
Aos meus pais, Valdira e Walkyrio, por toda educação, apoio incondicional e suporte para completar mais essa etapa acadêmica.
Aos meus irmãos, Marcelo e Milena, pela amizade, apoio e alegrias que trazem para a minha vida.
À minha orientadora, Maité Vaslin, por ter-me “criado” desde os primórdios da iniciação científica. Por todas as etapas e momentos vividos. Por todo conhecimento transmitido, tanto profissional, quanto pessoal. Pela confiança em meu trabalho. Pela oportunidade de trabalhar nesse belo projeto de tese. Pelo exemplo de determinação profissional e de vida.
À Márcia Vidal pelo suporte teórico, técnico e financeiro nas fases iniciais do projeto.
I would like to thank my supervisor Dr. Peter Waterhouse for the opportunity to join his group at CSIRO. I am deeply indebted for all scientific, laboratorial and personal support he gave me in Australia. His expertise and passion for science have influenced me greatly.
Aos demais professores do LGMV Gilberto Sachetto, Márcia Margis, Márcio Ferreira e Rogério Margis pelo suporte material e teórico, discussões e pelo constante exemplo de amor e dedicação à ciência.
Ao Dr. Jean Araújo por disponibilizar o seqüenciador automático de DNA.
Aos doutores Jean Belot, Nelson Suassuna, Paulo Barroso e Pierre Silvie pela colaboração e envio de plantas para o início do projeto da doença azul.
Aos grandes amigos que passaram na “família LGMV” ao longo desses quatro anos, em especial para Alexandre, Adriana Arongaus (Adrianinha), Adriana Menezes (Adrianinhaninha), Aline, Anna Cristina, Danilo, Elisson Romanel, Emília Pires, Érica Duarte, Fabiano Salgueiro, Fátima, Felipe Karan, Fernanda Cruz (@hotmail.com), Graça, Isabel, Itamar, Kelly, Lina, Luis, Mariana, Roberto, Tati, Vanessa Cardeal, Vinícius e Yamá.
Aos técnicos do LGMV Fátima, Itamar e Luis por todo o imprescindível auxílio laboratorial.
À Tatiane Franca pela excelente companhia profissional e pessoal ao longo dos quatro anos. Pelas conversas, minipreps, PCRs, clonagens etc. Pela continuação do estudo da doença azul no Brasil. Por não levar a sério nenhuma das milhares de brincadeiras que falava quase que diariamente. E, claro, pela oportunidade única de visitar o internacionalmente conhecido “Palácio do 400”.
Ao grande companheiro Felipe Karam pela eterna disponibilidade em discutir detalhadamente cada micro resultado da tese. Por todas as sugestões que contribuíram significativamente para o aumento da qualidade do trabalho. Pela ajuda na busca da resposta para a pergunta mais primordial de todo cientista brasileiro: “existe vida após o doutorado?”.
Ao camarada Elisson Romanel pela amizade e por todas as discussões sobre trabalho, ciência e filosofia.
I am deeply thankful to all members of CSIRO Plant Industry for availability to help anytime I needed. The friendly and supportive atmosphere inherent to the whole Plant Industry group contributed greatly to my personal and professional progress. My special thanks go to Adriana Fusaro, Adriane Machado, Andrew Eamens, Carl Davis, Chris Helliwell, Craig Wood, Donna Bond, Geoff Ellacott, Janice Norman, Judith Gaudron, Jean Finnegan, John Watson, José Maria Barrero, Limin Wu, Liz Dennis, Louisa Matthew, Mark Talbot, Masumi Robertson, Ming-Bo Wang, Niel Smith, Narayana Upadhyaya, Peter Waterhouse and Rosemary White.
À Adriana Fusaro tenho profunda e eterna gratidão por toda ajuda que me deu para concretizar o sonho de ir à Austrália. Pela força na adaptação ao novo país e ao novo laboratório. Pelos momentos de alegria. Pelo consolo nos momentos de tristeza. Por me ensinar grande parte das técnicas que aprendi na Austrália, incluindo “o grande mundo dos pequenos RNAs”. Por acreditar e abraçar o projeto da P0. Pelos de experimentos de northern blot, western blot, agro-infiltração, PCR em tempo real e imunoprecipitação que realizou para a tese e para o artigo que será submetido. Pelo exemplo de ser humano e de vida.
I am particularly grateful to Dr. Masumi Robertson for helping me with the yeast two hybrid experiments; Shaun Curtin for providing protocols, plasmids, clones and
tips for FLAG immunoprecipitation; Dr. Rosemary White and Dr. Mark Talbot for excellent microscope support; Kerrie Ramm for teaching me how to bombard onion cells with GFP and Geoff Ellacott for support with Arabidopsis work.
A los nuevos amigos aussie-hablantes que conocí en Austrália. Estoy muy agradecido a Agustín Zsogon, José Maria Barrero, Juan Pablo, Lucía Yañez, Luciana Porfírio, Marga Garcia, Maria Alonso, Hernano Alonso (Nano) y Salva Herrero por todos los momentos mágicos que tuvimos juntos alli. Gracias por todas las conversaciones, apoyo, viajes, fiestas, wine tastings, cafés, cenas, bailes, acrobacias, buen humor, la lengua española y gallega, películas, cines, woolis, helados, pubs, canciones, salsa, cultura, Tato, campings, patatas (o papas) de limón, abrazos, besos, palabras, en fin por todos los capítulos compartidos en el gran libro de la vida. Amigos para siempre!
Aos amigos da vida, de todas as épocas: Alvim, Caroço, Claire, Guerra, Kátia, Leco, Léo, Levedo, Patrícia, Roberta Rodrigues (Robertinha) e Rodrigo Barros. Obrigado por todo apoio incondicional.
Aos amigos de caminhadas, por todas as conversas, por todos os desafios vencidos e a serem vencidos. Em especial para Allyson, Ana Diório, Clara, Fernanda Mandarini, Henrique Castelletti, João, José Luis, Luis Cristo, Paulo, Wanderley e Zélia.
SUMÁRIO Resumo iv Abstract v Lista de Abreviaturas 001 Lista de Figuras 002 Lista de Tabelas 004 Capítulo I 005 I.1 Introdução 006
I.1.1 Cultura do algodão 006
I.1.2 Doença azul 007
I.1.3 Família Luteoviridae 009
I.2 Objetivos 016
I.3 Material e Métodos 018
I.3.1 Propagação viral em casa de vegetação 018
I.3.2 Desenho de oligonucleotídeos 018
I.3.3 Amplificação do genoma viral por PCR 020
I.3.4 Clonagem dos fragmentos amplificados em vetores
pGEMT-Easy 020
I.3.5 Seqüenciamento de nucleotídeos 021
I.3.6 Análise das seqüências de nucleotídeos 021
I.3.7 Southern blot 022
I.3.8 Northern blot 023
I.4 Resultados 025
I.4.1 Reprodução dos sintomas da doença azul em
casa de vegetação 025
I.4.2 Identificação do Cotton leafroll dwarf virus (CLRDV), um
Polerovirus associado à doença azul do algodoeiro 027 I.4.3 Seqüências da proteína do movimento, polimerase e
I.4.5 Diagnóstico molecular da doença azul 038
I.4.6 Detecção por northern blot 041
I.5 Discussão e Perspectivas 044
I.6 Conclusões 050
Capítulo II 050
II.1 Introdução 052
II.1.1 Silenciamento gênico por RNA em animais 053
II.1.1.1 Via dos siRNAs em animais 054
II.1.1.2 Via dos microRNAs em animais 056
II.1.2 Silenciamento gênico em plantas 060
II.1.2.1 Silenciamento gênico pós-transcricional 062
II.1.2.1.1 Descoberta e indução 062
II.1.2.1.2 Manutenção da degradação 065
II.1.2.1.3 Amplificação e transitividade 067
II.1.2.2 Silenciamento gênico transcricional 068
II.1.2.3 Via de microRNAs 069
II.1.2.4 Via de tasiRNAs 072
II.1.2.5 Via de disseminação da RNAi 075
II.1.3 Supressão de silenciamento gênico 077
II.1.3.1 Identificação de supressores 078
II.1.3.2 Supressores de silenciamento bem caracterizados 079
II.1.3.2.1 HC-Pro 080
II.1.3.2.2 P19 081
II.1.3.2.3 2b 081
II.1.3.3 Supressores de silenciamento na família Luteoviridae 082
II.2 Objetivos 086
II.3 Material e Métodos 088
II.3.1 Obtenção das construções plasmidiais: clonagens
GATEWAY 088
II.3.2 Mutagênese via PCR 092
II.3.4 Transformação de Arabidopsis thaliana 095
II.3.5 Northern blot 096
II.3.6 Detecção de pequenos RNAs 096
II.3.7 Co-Imunoprecipitação 098
II.3.8 Western blot 099
II.3.9 PCR em tempo real 100
II.3.10 Duplo híbrido em leveduras 102
II.3.11 Bombardeamento em célula de cebola 103
II.3.12 Microscopia ótica 104
II.3.13 Microscopia eletrônica de varredura 104
II.4 Resultados 106
II.4.1 Procura de novas proteínas supressoras de
silenciamento na família Luteoviridae 106
II.4.2 PEP0 atua como uma proteína F-Box 109
II.4.3 Expressão das supressoras PLP0 e PEP0 em
Arabidopsis thaliana 114
II.4.4 Supressoras PLP0 e PEP0 alteram acúmulo e
função dos pequenos RNAs 120
II.4.5 PLP0 e PEP0 desestabilizam AGO1 126
II.4.6 PEP0 interage com DCL1, AGO4, AGO6 e DRB5 128 II.4.7 PLP0 e PEP0 apresentam localização nuclear 130
II.5 Discussão e Perspectivas 133
II.6 Conclusões 142
LISTA DE ABREVIATURAS A – adenina
b - base C – citosina
cDNA – DNA complementar Da - dalton
DNA – Ácido desoxirribonucléico
dNTP – desoxirribonucleotídeos trifosfato EDTA – ácido etilenodianimotetracético g – grama G – guanina k – quilo L – litro m - mili M – molar n – nano N – qualquer nucleotídeo nt – nucleotídeo ºC – graus Celsius p – pico pb – par de base
PCR – reação da polimerase em cadeia pH – potencial hidrogenionte
RNA – ácido ribonucléico RPM – rotações por minuto SDS – dodecil sulfato de sódio T – timina
U – uracila
UV – ultravioleta µ − micro
LISTA DE FIGURAS
Página Figura 1: Esquema do genoma dos gêneros Luteovirus, Polerovirus
e Enamovirus 012
Figura 2: Sintomas da doença azul do algodoeiro reproduzidos em casa de vegetação via inoculação com o inseto transmissor
Aphis gossypii 026
Figura 3: Representação esquemática do genoma dos Polerovirus 028 Figura 4: Amplificação parcial do genoma do CLRDV 028 Figura 5: Alinhamento da seqüência de aminoácidos da CP do CLRDV com
CPs de outros Luteoviridae 032
Figura 6: Análise filogenética do CLRDV e outros membros da família
Luteoviridae 034
Figura 7: Filogenia com parte da proteína de transmissão (ORF5) do
CLRDV e demais membros da família Luteoviridae 037 Figura 8: Desenho de oligos específicos para o diagnóstico molecular
do CLRDV 039
Figura 9: Eficiência do diagnóstico molecular para a doença azul 040 Figura 10: Detecção do RNA genômico do CLRDV por Northern blot
em plantas apresentando sintomas da doença azul 042 Figura 11: Principais vias de silenciamento por RNA em plantas 061
Figura 12: Vetores de destino GATEWAY 091
Figura 13: Estratégia para a introdução de mutações pontuais na P0 do
Pea enation mosaic virus-1. 094
Figura 14: Identificação de possíveis proteínas supressoras de silenciamento
no gênero Luteovirus. 107
Figura 15: P0 do Pea enation mosaic virus-1 é uma supressora de
silenciamento gênico e atua através de um domínio tipo F-Box 108 Figura 16: Mutações pontuais no domínio F-Box da P0 do
Figura 17: Infiltração de P0 do Pea enation mosaic virus-1 em
N. benthamiana 16c elimina siRNAs. 112
Figura 18: P0 do Pea enation mosiac virus-1 interage com SKIP2 de
Arabidopsis 113
Figura 19: Alteração no desenvolvimento vegetal de plantas de Arabidopsis
thaliana transformadas com o gene P0 do Potato leafroll virus 116 Figura 20: Alteração no desenvolvimento vegetal de plantas de Arabidopsis
thaliana transformadas com o gene P0 do
Pea enation mosaic virus-1. 119
Figura 21: Acúmulo de pequenos RNAs em plantas de Arabidosis thaliana expressando as supressoras P0 do Potato leafroll virus e P0 do
Pea enation mosaic virus-1 123
Figura 22: Acúmulo dos alvos dos pequenos RNAs em plantas de Arabidopsis thaliana expressando as supressoras P0 do
Potato leafroll virus e P0 do Pea enation mosaic virus-1 124 Figura 23: Detecção do acúmulo de mRNA do gene AGO1 em plantas
transgênicas de Arabidopsis thaliana expressando P0 do
Potato leafroll virus ou P0 do Pea enation mosaic virus-1. 125 Figura 24: Avaliação da expressão das supressoras P0 do
Potato leafroll virus e P0 do Pea enation mosaic virus-1
no acúmulo de AGO1 127
Figura 25: Duplo híbrido em leveduras mostrando a interação de P0 do Pea enation mosaic virus-1 com proteínas da via de silenciamento
por RNA 129
Figura 26: Bombardeamento de células de cebola com os genes PLP0, PEP0 e PEP0∆LPP fusionados com a sequência
codificadora da GFP 131
Figura 27: Modelo proposto por Baumberger et al., 2007 para a
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Oligonucleotídeos desenhados para amplificar o genoma do vírus associado com a doença azul do algodoeiro baseado no alinhameto completo de
membros da família viral Luteoviridae 019
Tabela 2: Identidade entre seqüências de aminoácidos do capsídeo (CP), proteína do movimento (MP) e polimerase (RdRp) do CLRDV e regiões correspondentes em outros luteovirus 031
Capítulo I
_________________________________________________________________________
I.1 – Introdução
I.1.1 – Cultura do algodão
O algodão (Gossypium hirsutum L.) é uma planta dicotiledônea da família Malvaceae de porte arbóreo ou herbáceo. Há indícios de que sua domesticação para fabricação de tecidos se iniciou na índia, cerca de 3.500 anos atrás. Atualmente, a China, os Estados Unidos e Índia são os maiores produtores, respondendo por mais de 60% da produção mundial, segundo dados do departamento de agricultura Norte Americano. O Brasil é o quinto maior produtor, logo após o Paquistão. O país também se encontra entre os cinco maiores exportadores da fibra, atrás dos Estados Unidos, Uzbequistão, Índia e Austrália.
A cotonicultura nacional iniciou-se no Nordeste e em seguida migrou para regiões do Sudeste, especialmente no estado de São Paulo (Buainain & Batalha, 2007). Nos últimos 17 anos, no entanto, houve uma migração da atividade para áreas do cerrado, especialmente no Centro-Oeste. Houve também, nas últimas décadas, uma grande mudança no perfil de produção. O cultivo do algodão deixou de ser baseado na pequena propriedade e no regime familiar, passando a ser realizado em grandes plantações, com áreas que se estendem de 100 a 3.000 hectares (Buainain & Batalha, 2007). Além disso, uma alta mecanização foi introduzida, contando com o emprego de adubação, herbicidas, fungicidas, inseticidas e reguladores de crescimento.
O cultivo do algodão no Brasil tem hoje um importante impacto sócio-econômico. Estima-se, por exemplo, que na safra 2006/2007, o cultivo da planta represente 2.7% do Produto Interno Bruto (PIB) do agronegócio nacional e irá gerar mais de 430 mil empregos (Corrêa, 2007). Segundo estimativas da Companhia Nacional de Abastecimento (Conab), a safra 2006/2007 deverá ser 40% maior do que a obtida no ano anterior e representará um recorde para a produção brasileira, com exportações atingindo 470 mil toneladas de pluma.
Os estados de Mato Grosso, Bahia e Goiás são atualmente os maiores produtores nacionais, somando sozinhos cerca de 90% de todo o algodão processado. Por ser produzido prioritariamente em zonas de cerrado, diversas variedades de algodão adaptadas
cultivadas (Freire, 1998). Esta variedade apresenta alta produtividade e fornece uma fibra que atende padrões nacionais e internacionais de consumo. No entanto, a variedade apresenta alta susceptibilidade a viroses e outros agentes infecciosos.
I.1.2 - Doença azul
Existem seis patógenos economicamente importantes nas plantações de algodão ao redor do mundo, sendo quatro deles de origem viral (Cia & Salgado, 1997). As doenças do algodoeiro reduzem sensivelmente a produtividade e geram de moderadas a graves perdas econômicas. No Brasil, quatro doenças já foram relacionadas com viroses: o mosaico comum, causado pelo Abutilon mosaic virus (AbMV), um Geminivirus transmitido por mosca branca (Bemisia tabaci); o mosaico tardio, causado pelo Tobacco streak virus (TSV), um Bromovirus; o vermelhão, causado pelo Cotton anthocyanosis virus (CAV) e o mosaico das nervuras ou doença azul, cujo vírus responsável ainda não havia sido identificado até o início deste trabalho.
A doença azul é transmitida pelo pulgão Aphis gossypii e os sintomas caracterizam-se pela redução do porte devido ao encurtamento dos entrenós, precaracterizam-sença de mosaico/ amarelecimento nas nervuras, folhas rugosas e com curvatura nos bordos, enrolamento das folhas em sua superfície inferior, associados a uma coloração verde-escura com tonalidade azulada. A folha adquire uma consistência quebradiça ao toque e os órgãos florais e frutíferos se reduzem em tamanho e número, podendo, em alguns casos, serem abortados ou a planta apresentar esterilidade total (Cauquil & Vaissayre, 1971; Takimoto, 2003). A gravidade dos sintomas depende em grande parte da idade de infecção e também do estado fisiológico da planta (Takimoto, 2003; Michelotto & Busoli, 2006). Em casos extremos de infecções precoces e intensas as plantas podem reduzir seu porte normal e tornarem-se rasteiras (Cia & Salgado 1997).
A doença azul foi pela primeira vez descrita em campos de cultivo na República Centro-Africana, em 1949 (Cauquil & Vaissayre 1971). Vinte anos mais tarde houve relatos de severas perdas em várias regiões da África. Sintomas semelhantes aos encontrados na África foram relatados também nas Filipinas em 1963, na Tailândia e no Paraguai em 1977 (Halliwell e Cauquil, 1981), na Argentina, em diversas regiões da África
(Tchad, Camarões, Zaire, Benin) e na antiga União Soviética (Azerbaijão, Turquistão, Armênia) (Cauquil, 1977). Ainda não se sabe ao certo, no entanto, quando a doença foi detectada pela primeira vez no Brasil. Em 1937, uma doença do algodoeiro chamada de mosaico das nervuras foi identificada (Costa & Foster, 1938). Posteriormente, em 1962, foi detectada uma outra doença que apresentava sintomas parecidos com o mosaico das nervuras, porém muito mais severos (Costa & Carvalho, 1962). Essa doença foi chamada de mosaico das nervuras - Ribeirão Bonito, nome da cidade onde foi observada pela primeira vez. Acreditava-se que a variante Ribeirão Bonito era uma forma mais virulenta da mesma doença observada em 1937. Mais ou menos ao mesmo tempo, na década de 60, sintomas semelhantes foram observados em outros países da América do Sul, onde receberam o nome de “enfermedad azul” ou “mal de misiones”. No entanto, essas doenças observadas na América apresentavam sintomas muito semelhantes aos descritos para a doença azul no resto do mundo. Além disso, a transmissão ocorria através do mesmo vetor, o pulgão Aphis Gossypii. Esses dados evidenciaram que as doenças observadas no continente americano eram, na realidade, a mesma doença e que estavam fortemente relacionadas com a doença azul identificada em campos africanos desde 1949.
A doença azul é um problema fitopatológico importante no Brasil, especialmente pela utilização de variedades de algodão susceptíveis à virose, como as CNPA ITA-90 e Deltapine Acala 90. Perdas severas decorrentes da doença já foram relatadas no território brasileiro e no Paraguai (Freire, 1998). Por exemplo, na safra 1997/1998 registrou-se uma perda de 34 mil toneladas de pluma em função da doença. Reduções de até 90% na produção por planta também já foram observadas em algumas safras (Freire, 1998). A forma de controle mais comumente adotada pelos agricultores é a redução das populações de pulgões. Recomenda-se nunca permitir que a população dos insetos passe de 10% de plantas infestadas nos primeiros 100 dias após a germinação das plantas. Em seguida, recomenda-se manter as populações em torno de 30% de plantas infestadas, até o fim da colheita. Dessa forma, mesmo não havendo surto da doença em determinadas safras, o controle dos pulgões ocasionam um aumento no custo de produção. Outra estratégia adotada é o uso de variedades de algodão com resistência natural à doença azul. Cultivares nacionais e importadas resistentes à virose, tais como CEDRO, DeltaOpal e CD404, já
estão disponíveis no mercado. Além disso, recomenda-se o controle de plantas daninhas e a rotação de culturas.
Os sintomas descritos para a doença azul são muito semelhantes aos sintomas observados para viroses causadas por membros da família Luteoviridae. De fato, testes sorológicos em plantas doentes apresentaram reação positiva para o Barley yellow dwarf virus RPV (BYDV-RPV), Barley yellow dwarf virus PAV (BYDV-PAV) (Lenardon, 1994) e para o Beet western yellows virus (BWYV) (Takimoto, 2003), três membros bem caracterizados da família Luteoviridae.
I.1.3 – Família Luteoviridae
A família Luteoviridae é composta por vírus transmitidos por afídeos, todos apresentando genoma de RNA fita simples com polaridade positiva, sem a presença de cauda poli(A), encapsulados em uma partícula icosaédrica não envelopada e divididos em três gêneros: Luteovirus, Polerovirus e Enamovirus (Mayo & Ziegler-Graff, 1996). Os primeiros sintomas atribuídos a membros desse grupo foram relatados em plantas de batata na Europa em 1790 (Harrison, 1999). Esses primeiros sintomas reportados possivelmente foram causados pelo Potato leafroll virus (PLRV), o vírus tipo do gênero Polerovirus e um dos mais bem caracterizados da família.
Uma das características mais peculiares desse grupo de vírus é a sua restrição ao floema (Esau et al., 1967). As partículas acumulam-se principalmente no citoplasma das células companheiras do vaso condutor e por esse motivo apresentam baixa concentração na planta, tornando a purificação mais complexa. Assim, o desenvolvimento de anticorpos para a detecção de membros da família ocorreu mais tarde do que para a maioria dos outros grupos vegetais. Dados de sorologia, no entanto, permitiram um maior entendimento da biologia desse grupo de vírus. O primeiro desafio enfrentado foi a diferenciação dos isolados envolvidos na doença do amarelecimento da cevada. Acreditava-se que a doença era causada por um único vírus, que foi denominado de Barley yellow dwarf virus (BYDV). Ficou claro mais tarde, no entanto, que o amarelecimento da cevada era causado por cinco vírus diferentes, todos distinguíveis por sorologia. Os isolados receberam o nome RPV, RMV, MAV, SGV e PAV (Miller & Rasochová, 1997). Em função da grande diferença
entre os isolados, o Comitê Internacional de Taxonomia de Vírus (ICTV) decidiu trocar o nome dos isolados RPV e RMV para Cereal yellow dwarf virus (CYDV) (Miller & Rasochová, 1997). Hoje em dia os vírus BYDV-MAV, BYDV-SGV e BYDV-PAV são classificados dentro do gênero Luteovirus e os vírus CYDV-RPV e CYDV-RMV estão classificados no gênero Polerovirus.
No entanto, somente após a obtenção dos primeiros genomas completos, a taxonomia e a biologia dos membros da família passaram a ficar mais claros. O primeiro vírus da família a ter seu genoma todo seqüenciado foi o BYDV-PAV (Miller et al., 1988). O vírus apresenta um genoma com cerca de seis mil bases, possuindo cinco grandes fases abertas de leitura, que foram denominadas com números de 1 a 5, comumente representadas como ORF1 a ORF5 (ou P1 a P5, em se tratando das proteínas codificadas). Ficou claro que o genoma é dividido em duas partes distintas, separadas por uma região intergênica. A região 5’ apresenta genes que codificam as proteínas não estruturais e a 3’ contém os genes codificantes de proteínas estruturais (Figura 1). A região 5’ contém as ORFs sobreopstas 1 e 2 e apresenta alta similaridade com genes envolvidos na replicação em membros do gênero Carmovirus, da família Tombusviridae, fornecendo a primeira evidência de que a família teria surgido de um evento de recombinação (Miller et al., 1988). Em seguida, a obtenção dos genomas do BWYV (Veidt et al., 1988) e do PLRV (van der Wilk et al., 1989), contribuiu ainda mais para o entendimento taxonômico e evolutivo da família. Em linhas gerais, os dois novos genomas obtidos apresentavam uma organização muito parecida com a do BYDV-PAV (Figura 1). No entanto, algumas diferenças foram observadas. Os dois vírus apresentam um gene extra na porção 5’ do genoma e este foi denominado de ORF0 (ou P0). Observou-se que a ORF0 apresenta alta sobreposição de seqüência com a ORF1 e, assim como ocorre com o BYDV-PAV, a ORF1 dos novos genomas também está sobreposta com a ORF2. No entanto, o bloco 5’ do genoma dos dois novos vírus apresenta similaridade com genes de replicação dos Sobemovirus e não com os Carlavirus, como observado para o vírus da cevada. Assim, ficou evidente que os três vírus eram muito semelhantes na região 3’ do genoma, mas que apresentavam diferenças evolutivas importantes na porção 5’. Em seguida, o seqüenciamento completo do genoma do RNA1 do Pea enation mosaic virus (PEMV-1)
para o PLRV, apresentando uma ORF0 e possuindo genes de replicação semelhantes aos Sobemovirus (Demler & Zoeten, 1991). A principal diferença estrutural observada foi a ausência da ORF4, presente no genoma dos três vírus seqüenciados até aquele momento (Figura 1). O PEMV-1, no entanto, apresenta características biológicas fundamentais que o diferencia dos demais vírus. A principal delas é o fato do vírus conseguir sair do floema durante a infecção viral. Além disso, o vírus é capaz de ser transmitido mecanicamente e está sempre associado com um outro RNA, comumente denominado de PEMV-2. Análise do genoma do RNA2 do PEMV mostrou que este apresenta similaridade com membros do gênero Umbravirus (Demler et al., 1993). Foi observado ainda que os dois RNAs são replicados de forma independente, mas que o encapsulamento do RNA2 depende de produtos gênicos do RNA1 e que os dois RNAs são necessários para a evasão do floema e para a transmissão mecânica (Demler et al., 1993). Acredita-se, portanto, que os RNAs1 e 2 do PEMV apresentem uma relação de simbiose durante a infecção viral.
Apesar de todas as diferenças genômicas e biológicas observadas nesses vírus, todos eram agrupados em um único táxon denominado Luteovirus. Em 1997, no entanto, o ICTV decidiu criar a família Luteoviridae e a dividiu nos atuais gêneros Luteovirus (tendo o BYDV-PAV como vírus tipo), Polerovirus (tendo o PLRV como vírus tipo) e Enamovirus (apresentando apenas o PEMV-1 como membro) (D’Arcy & Mayo, 1997). Já foram observados também alguns vírus que são recombinantes entre os gêneros Luteovirus e Polerovirus (Rathjen et al., 1994; Maia et al., 2000; Moonan et al., 2000; Domier et al., 2002; Siepen et al., 2005). Nesses casos, recomendou-se usar os genes de replicação (ORF1 e ORF2) como critério para classificação. Vírus que apresentassem genes semelhantes ao Carmovirus seriam considerados como Luteovirus e os que apresentassem genes de replicação semelhante aos Sobemovirus seriam considerados como Polerovirus.
Figura 1: Esquema do genoma dos gêneros Luteovirus, Polerovirus e Enamovirus. ORF0 – Supressora de silenciamento gênico; ORF 1 e ORF2 – Polimerase; ORF3 – Proteína do capsídeo; ORF4 – Proteína de movimento; ORF3 e ORF5 – Proteína de transmissão. Adaptado de http://www.scri.sari.ac.uk/TiPP/documents/luteo.pdf (último acesso em março de 2006).
- Genoma com P0 - RNA com VPg
- Polimerase é tipo Sobemovirus - Região intergênica com 200 nts - P1 e P2 com muita sobreposição
- Genoma sem P0 - RNA sem VPg
- Polimerase é tipo Carmovirus - Região intergênica com 100 nts - P1 e P2 com pouca sobreposição
- Genoma como Polerovirus, mas: - Sem P4
- Dependente de Umbravirus
Estudos funcionais dos genes presentes na família Luteoviridae evidenciaram fascinantes mecanismos de regulação gênica. Trabalhos recentes mostraram que a proteína PO dos Polerovirus é uma forte supressora de silenciamento gênico, um mecanismo genético de defesa anti-viral (Pfeffer et al., 2002). A ORF1 codifica uma proteína com função de helicase e a proteína P2 apresenta domínios típicos das polimerases de RNA dependente de RNA. Na região de interseção entre os genes, no entanto, existe uma seqüência rica em uracila que promove uma mudança de fase de leitura dos códons do RNA (Prüfer et al., 1992). Assim, a síntese protéica inicia-se na ORF1, troca de fase na região de interseção e passa a sintetizar a ORF2, criando uma proteína de fusão envolvida na replicação viral (Brault & Miller, 1992; Reutenauer et al., 1993). Logo após a ORF2 existe uma região intergênica que apresenta cerca de 100 nucleotídeos em Luteovirus e 200 nucleotídeos em Polerovirus e Enamovirus. Essa região apresenta seqüências regulatórias que iniciam a síntese de um RNA subgenômico contendo as ORFs 3, 4, 5, todas codificantes de proteínas estruturais (Tacke et al., 1990; Dinesh-Kumar et al., 1992). A ORF3 codifica a proteína do capsídeo viral, a única envolvida na morfogênese viral (Reutenauer et al., 1993). Dentro do gene do capsídeo existe uma outra fase aberta de leitura denominada de ORF4. Esse gene é traduzido em taxas muito mais elevadas do que a própria CP (Tacke et al., 1990; Dinesh-Kumar et al., 1992) e acredita-se que a proteína resultante esteja envolvida no movimento viral célula a célula ou que seja parte da estrutura VPg observada na região 5’ do RNA dos Polerovirus e Enamovirus (van der Wilk et al., 1989; Tacke et al. 1991). Observou-se também que algumas vezes o códon de término do gene do capsídeo não é lido, gerando uma proteína de fusão com a ORF5 geralmente denominada de RTD (“Readthrough Domain”) que está envolvida na transmissão do vírus por afídeos (Brault et al., 2000; Brault et al., 2002).
Uma outra característica que distingue os membros da família Luteoviridae das demais famílias de vírus vegetais é a alta especificidade pelo vetor de transmissão e a restrita gama de hospedeiros. Quando adquiridos pelo inseto, os Luteoviridae circulam, mas não replicam no vetor. Por esse motivo a transmissão é dita circulativa e não propagativa. Inicialmente os vírus são sugados e transportados para o lúmen do trato digestivo do inseto, atravessam as células do tubo digestivo com a ajuda de proteínas bacterianas chamadas GroEl, se acumulam nas glândulas salivares e em seguida são injetados no floema vegetal
(Gray & Gildow, 2003). Estima-se que 30 minutos após da aquisição viral em uma planta infectada, os insetos já estejam aptos a transmití-los para outras plantas. A especificidade da transmissão ocorre em duas etapas: primeiro no reconhecimento da proteína GroEl e em seguida no acesso do vírus às células das glândulas salivares. Especula-se que possivelmente a RTD viral possa interagir de forma específica com genes presentes na membrana das células salivares. Um trabalho recente comparando insetos transmissores e não transmissores de um isolado de BYDV-PAV indicou que possivelmente apenas um gene do inseto pode estar envolvido nessa interação (Burrows et al., 2007).
Assim como observado para os membros da família, a transmissão da doença azul do algodoeiro ocorre de forma circulativa não-propagativa. O vetor da doença, Aphis gossypii, é transmissor de outras luteoviroses, como as causadas pelo Cucurbit aphid-borne yellows virus (CABYV), um Polerovirus. Além disso, os sintomas de enrolamento de folha são muito parecidos com os desenvolvidos pelo PLRV em barata e o amarelecimento de nervuras semelhante ao provocado pelo BWYV em diversas plantas. As semelhanças biológicas entre as doenças, aliadas aos resultados preliminares de sorologia indicam fortemente, portanto, que a doença azul esteja associada com um vírus da família Luteoviridae.
Capítulo I
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I.2 – Objetivos
A primeira parte deste trabalho de tese teve como objetivo geral identificar e caracterizar molecularmente o vírus responsável pela doença azul do algodoeiro. Os objetivos específicos foram:
• Propagar a doença azul do algodoeiro em casa de vegetação;
• Desenhar oligonucleotídeos degenerados para a amplificação de regiões conservadas no genoma dos membros dos gêneros Luteovirus e Polerovirus;
• Amplificar, clonar e seqüênciar parte do genoma viral, compreendendo parte dos genes coficadores da polimerase e da proteína de transmissão, toda a região codificadora do capsídeo viral e proteína do movimento e toda a região intergênica; • Determinar a relação filogenética com demais membros da família Luteoviridae; • Analisar filogenia com seqüências amplificadas;
Capítulo I
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MATERIAL
E
I.3 – Material e Métodos
I.3.1 – Propagação viral em casa de vegetação
Plantas de algodão (Gossypium hirsutum L) cultivar CNPA ITA 90 da safra 2003/2004 apresentando sintomas típicos da doença azul foram coletadas em campo no município de Primavera do Leste, Mato Grosso, e enviadas pelo pesquisador Paulo Augusto Vianna Barroso (CNPA – Embrapa Algodão – Campina Grande – PB). Pulgões (Aphis gossypii) coletados em plantas apresentando sintoma característico da doença azul foram utilizados como fonte para a transmissão do vírus para plantas jovens de algodão da mesma cultivar, crescidas e mantidas em casa de vegetação. Estas plantas foram acompanhadas diariamente para a observação do aparecimento de sintomas e evolução da doença. A casa de vegetação utilizada é fechada por vidros e totalmente vedada, tendo a temperatura ajustada a 28 ± 2 oC e mantida constante por compressores.
Para a propagação da doença, plantas doentes foram infestadas por pulgões não infectados durante dois dias para a aquisição viral. Cerca de dez pulgões infectados foram transferidos para cada planta jovem da variedade CNPA ITA 90. Os insetos foram mantidos nestas plantas por dois dias e em seguida eliminados através da pulverização do inseticida Orthene. Plantas infectadas foram mantidas em isolamento dentro de caixas de madeira, vidro e telado de voil.
I.3.2 – Desenho de oligonucleotídeos
Com o objetivo de verificar a existência de luteovirus e/ou polerovirus associados à doença azul, genomas de membros da família Luteoviridae foram obtidos no GeneBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) e suas seqüências alinhadas através do programa ClustalW. Os genomas utilizados nos alinhamentos para membros do gênero Luteovirus foram: Soybean dwarf virus (SbDV), NC 003056; Bean leafroll virus (BLRV), NC 003369; Barley yellow dwarf virus-PAV (BYDV-PAV), NC 004750; Barley yellow dwarf virus-PAS (BYDV-PAS), NC 002160; Barley yellow dwarf virus-GAV (BYDV-GAV), NC 004666;
alinhamentos para membros do gênero Polerovirus foram: Turnip yellows virus (TYV), NC 003743; Beet mild yellowing virus (BMYV), NC 003491; Beet chlorosis virus (BChV), NC 002766; Beet western yellows virus (BWYV), NC 004756; Cucurbit aphid-borne yellows virus (CAbYV), NC 003688; Potato leafroll virus (PLRV), NC 001747; Cereal yellow dwarf virus-RPV (CYDV-RPV),NC 004751; Cereal yellow dwarf virus-RPS (CYDV-RPS), NC 002198. Os alinhamentos foram analisados e as seqüências com maiores níveis de conservação foram selecionadas para o desenho de iniciadores degenerados. As seqüências de todos os oligos desenhados para amplificar o genoma viral estão listadas na Tabela 1.
Tabela 1: Oligonucleotídeos desenhados para amplificar o genoma do vírus associado com a doença azul do algodoeiro baseado no alinhameto completo de membros da família viral Luteoviridae.
Oligo Seqüência Degeneração Região do genoma LUTF TTTTTAGAGGGGCTCTGYDCCGMCTCYGGTT 24x Polimerase LUTR TGTTGGTCRAAKCKRCTVGCATC 48x Polimerase PLF ACDGAYTGYTCYGGTTTYGACTGG 48x Polimerase PLR TCTGAWARASWCGGCCCGAASGTGA 32x CP PL2F AACAATTAGGTTTTAAAGTCGAGG 0x Polimerase PL2R TTCTACCCACGACCGTATTCAT 0x CP PL4F TGCGACAAATAGTTAATGAATACGGT 0x CP o3R GTCTACCTATTTBGGRTTNTGGAA 24x CP P1-2F GGCTTCGGSTGGCCCMAGTTCGG 4x Polimerase PL3R ACDCTCCAGTCRAAACCRGAGCA 12x Polimerase CPstF TTTAGGGTCACAATTCGGTGCCA 0x CP o5R CCRTAHGARACRGCRTARTTRTA 192x RTD
Bases degeneradas estão representadas pelas letras R (A ou G), Y (C ou T), M (A ou C), K (G ou T), S (G ou C), W (A ou T), H (A, C ou T), H (A, C ou T), B (G, T ou C), V (G, C ou A), D (G, A ou T) e N (A, T, C ou G). A última letra no nome do oligo indica sua orientação: F são os oligos anelando em regiões 5’ e R indica o oligonucleotídeos reverso, que anela na região 3’ do DNA. O grau de degeneração de cada oligo é dado.
I.3.3 – Amplificação do genoma viral por PCR
Folhas de plantas infectadas na casa de vegetação apresentando sintomas da doença azul foram maceradas na presença de nitrogênio líquido e em seguida o RNA total foi extraído através do kit de purificação RNeasy (Qiagen Co.), seguindo as recomendações do fabricante. O RNA extraído foi quantificado através de leitura da densidade ótica (D.O.) em espectrofotômetro e gel de agarose. O cálculo da concentração de RNA foi feito utilizando-se um valor padrão onde 1 D.O. equivale a 40 µg de RNA.
Para a síntese de cDNA, cerca de 3 µg de RNA total foram misturados com 5 µM de oligonucleotídeo reverso, 1µL de dNTP 10 mM e água até atingir o volume de 10 µL. A mistura foi aquecida a 70 ºC por 10 minutos, colocada diretamente no gelo e em seguida foram adicionados 200U de transcriptase reversa Superscript II (Invitrogen), 20 mM de DTT, 1X de tampão da primeira fita, em um volume final de 20 µL. A reação foi realizada por 2 horas a 45 ºC e em seguida a enzima foi desnaturada a 70ºC por 15 minutos. A reação de PCR foi realizada com 2 µL do cDNA sintetizado, 1X de tampão da Taq polimerase, 2,5U de Taq polimerase, 2 µM de cada oligonucleotídeo, 1,5 mM de MgCl2 e 0,2 mM de dNTP, em um volume final de 50 µL. O programa utilizado para a ciclagem foi: 95 ºC por 5 minutos, 95 ºC por 1 minuto, temperatura de anelamento dos oligonucleotídeos por 1 minuto, 72 ºC por 2 minutos, repetir ciclagem por 40 vezes e finalmente uma polimerização por 10 minutos a 72 ºC.
I.3.4 – Clonagem dos fragmentos amplificados em vetores pGEMT-Easy
As seqüências amplificadas foram ligadas em vetores pGemT-Easy (Promega). Para isso, 5 µL da reação de PCR foram misturados com 5 ng de vetor, 1X de tampão de ligação e 3U de T4 DNA ligase, em um volume final de 30 µL. A ligação foi realizada por oito horas a 16 °C e em seguida precipitada por 3 horas à -80 ºC com 20 ng de glicogênio, 0,2X de NaCl 5 M e 2,5X de etanol absoluto. O precipitado foi centrifugado por 30 minutos a 12000 rpm, lavado duas vezes com etanol 70% e ressuspenso em 10 µL de água estéril.
plaqueadas em meio LB sólido (bactotriptona 10 g/l, extrato de levedo 5 g/l, NaCl 10 g/l, pH 7,2, agarose 0,8%) contendo ampicilina (50 mg/ml), 20 µl de IPTG (1M) , 100 µl de X-gal 20 mg/mL e 80 µl de LB líquido. Bactérias eletro competentes da cepa XL1 foram preparadas de acordo com o descrito em Maniatis et al. (1989). A mini-preparação plasmidial seguiu os procedimentos descritos por Feliciello & Chinali (1993). O DNA plasmidial precipitado foi ressuspenso em cerca de 100 µL de água e quantificado em gel de agarose. A confirmação da clonagem foi feita pela digestão dos vetores extraídos com a enzima EcoRI (Invitrogen).
I.3.5 – Seqüenciamento de nucleotídeos
Cerca de 200 ng de DNA plasmidial foram utilizados para o seqüenciamento através do método de terminação por di-deoxi nucleotídeos. O DNA foi misturado com 0,5 µM de iniciador específico, 3,5 µL de tampão de seqüenciamento e 1 µL de “BigDye” (mistura contendo dNTPs livres, dNTPs marcados com fluorescência e Taq polimerase), em um volume final de 10 µL. A reação foi ciclada nas seguintes condições: 95 °C por 2 minutos; 25 repetições de 95°C por 45 segundos, 50 °C por 30 segundos e 60 °C por 4 minutos. Em seguida foram adicionados 10 µL de água, 2 µL de NaCl 5M e 50 µL de etanol absoluto. A reação foi precipitada por 8 horas a -20 °C, centrifugada a 4 °C por 45 minutos a 4000 rpm, lavada com etanol 70% e ressuspensa em 10 µL de água.
Para garantir fidelidade de seqüência, de três a seis clones de cada fragmento, oriundos de diferentes reações de PCR, foram seqüenciados em ambas as direções, através dos oligonucleotídeos T7 e M13 que anelam no vetor. A reação foi processada pelo pesquisador Jean Luiz Araújo (Embrapa Agrobiologia – Seropédica – RJ) através de um seqüenciador automático MegaBACE.
I.3.6 – Análise das seqüências de nucleotídeos
As seqüências das regiões amplificadas por RT-PCR foram inicialmente comparadas com todas as seqüências depositadas no GeneBank, EMBL e DDBJ usando o programa BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST). Em seguida, seqüências
correspondentes à região amplificada de diferentes membros da família Luteoviridae foram alinhadas através do programa ClustalW (http://www.ebi.ac.uk/clustalw) e em posteriormente analisadas no programa MEGA2 (http://www.megasoftware.net) para a reconstrução filogenética. Os vírus analisados foram: Chickpea stunt disease associated virus (CpSDaV), Y11530; Groundnut rosette assistor virus (GRAV), AF195828; Tobacco vein distorting virus, AM411003; Pea enation mosaic virus-1, NC_003629 e todos os demais citados no ítem I.3.2. Árvores filogenéticas foram feitas através do método de “Neighbor-joining” com 3000 mil réplicas, usando-se a opção “p-distance” como matriz e “pairwise deletion” para a eliminação de “gaps” no alinhamento. As deduções das seqüências de aminoácido foram feitas pelo pacote de ferramentas de bioinformática do BCM (http://searchlauncher.bcm.tmc.edu/seq-util/seq-util.html). A estimativa dos pesos moleculares das proteínas foi feita pelas ferramentas disponibilizadas pelo Instituto Suíço de Bioinformática (SIB), através do site: http://br.expasy.org/tools/pi_tool.html. O cálculo das identidades entre as seqüências foi realizado através do programa GeneDoc (http://www.nrbsc.org/gfx/genedoc/index.html).
I.3.7 – Southern blot
O DNA amplificado total foi eletroforeticamente separado em gel de agarose 0,8%, com tampão de corrida TAE 0,5X e posteriormente fotografado no transiluminador e a posição do marcador molecular foi anotada. Em seguida este foi transferido para um recipiente de plástico e agitado, suavemente, em 2-3 volumes (50 – 100 ml) de solução de depurinação (0,25 M de HCl) por 7 minutos. A solução foi decantada, o gel foi lavado em água destilada e agitado novamente com uma solução de desnaturação (0,5 M de NaOH, 1,5 M de NaCl) por 30 minutos, trocando a solução duas vezes. Após decantação da solução e lavagem do gel em água destilada, uma última agitação foi feita em uma solução de neutralização (3 M de NaCl, 0,5 M Tris-HCl, pH 7,4) por 30 minutos, trocando a solução duas vezes.
A solução e o gel foram novamente decantados e lavados, respectivamente, e o aparato de transferência foi montado, utilizando-se filtro de nylon (Hybond N/ Amersham),
SSC 20X (3 M NaCl, 0,3 M citrato de sódio, pH 7,0) foi utilizado como carreador, por cerca de 16 horas. O aparato foi em seguida desmontado, o filtro foi lavado em 3X SSC e depois o DNA foi fixado à membrana por exposição à UV (GS Gene Linker UV Chamber).
As pré-hibridações foram feitas a 65 ºC por 2 horas, utilizando-se uma solução de hibridação contendo tampão fosfato 0,5 M, SDS 7% e EDTA 1 mM. Seguiu-se uma hibridização de 20 horas a 65º C com sondas correspondentes a CP ou a polimerase viral marcadas radioativamente através de “random primer” (PerkinElmer) com αdCTP32, previamente purificada em coluna de Sephadex G50 (Sigma) e desnaturada a 95º C por 10 minutos. As lavagens foram realizadas com 3X SSC, 1% SDS; 1X SSC, 1% SDS e 0,1X SSC, 1% SDS. As membranas foram expostas a filmes Kodak X AR (Kodak) por tempo variado em freezer a – 80º C.
I.3.8 – Northern blot
O diagnóstico viral foi realizado com experimentos de northern blot. Cerca de 30 µg de RNA total foram misturados com 2,5 µL de MOPS 10X, 5 µL de formaldeído 37%, 12,5 µL de formamida e 1 µg de brometo, atingindo um volume final de 26 µL. Em seguida as amostras foram aquecidas por 15 minutos a 55 ºC e aplicadas em um gel de agarose 1,2 %, contendo 1X MOPS e 3% de formaldeído. A migração do RNA em gel foi feita por 4 horas a 80 V, em tampão de corrida MOPS 1X.
Após o término da eletroforese, o gel foi colocado em uma ponte de transferência com SSC 20X e um filtro de náilon (Hybond N/Amersham) sobre ele. Sobre o filtro colocou-se 3-6 folhas de papel 3 MM e, por cima, várias camadas de papel toalha ou jornal até atingir uma altura de 8 cm. Colocou-se por cima de tudo uma placa de vidro com um peso e deixou-se transferindo por aproximadamente 16 horas. O aparato foi desmontado, o filtro foi lavado em 3X SSC e depois o RNA foi fixado à membrana por exposição ao UV (GS Gene Linker UV Chamber). A pré-hibridação, a hibridação e as lavagens seguiram o mesmo protocolo descrito nos experimentos de Southern blot do item III.7.
Capítulo I
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I.4 – Resultados
I.4.1 – Reprodução dos sintomas da doença azul em casa de vegetação
Pulgões coletados em plantas de algodão com sintomas da doença azul de fazendas de cultivo do município de Primavera do Leste (Mato Grosso) foram transferidos para plantas saudáveis CNPA ITA 90 em casa de vegetação; e, em seguida, eliminados através do inseticida orthene. Durante a primeira passagem foi possível observar sintomas típicos da doença, tais como encurtamento dos entrenós, folhas rugosas e com curvatura nos bordos, enrolamento das folhas em sua superfície inferior, associados a uma coloração verde-escura com tonalidade azulada (Figura 2). Os primeiros sintomas da doença foram observados aproximadamente 15 dias após a inoculação viral, caracterizando-se principalmente pelo enrolamento das folhas (Figura 2B). As folhas jovens já cresciam com fenótipo de enrolamento e, com o tempo, passavam a apresentam sintomas de amarelecimento das nervuras, muito comum em infecções associadas com membros da família Luteoviridade (Figura 2D). As fases mais tardias da infecção, cerca de 15 dias após o inóculo, caracterizaram-se por escurecimento das folhas e uma drástica redução no porte das plantas (Figura 2E).
Figura 2: Sintomas da doença azul do algodoeiro reproduzidos em casa de vegetação via inoculação com o inseto transmissor Aphis gossypii. A – Folha expandida de uma planta sadia; B – Sintomas de enrolamento de folha em planta infectada; C – Folha jovem sadia; D – Folha jovem apresentando sintoma de amarelecimento das nervuras; E – Sintoma de nanismo em fases tardias de infecção, aproximadamente 30 dias após a inoculação viral (plantas 1, 2, 3), ao lado de uma planta sadia (planta 4).
I.4.2 – Identificação do Cotton leafroll dwarf virus (CLRDV), um Polerovirus associado à doença azul do algodoeiro
Com o objetivo de verificar a existência de luteovirus e/ou polerovirus associados à doença azul, os genomas completos dos membros já sequenciados da família Luteoviridae foram obtidos no GeneBank e suas seqüências nucleotídicas alinhadas através do programa ClustalW. O alinhamento dos membros do gênero Luteovirus, realizado com os vírus SbDV, BLRV, BYDV-PAV, BYDV-PAS, BYDV-GAV, BYDV-MAV, mostrou duas regiões conservadas, ambas na polimerase (ORF2). Assim, foram desenhados dois iniciadores nessa região, chamados de LUTF, com 31 bases e degeneração de 24 vezes e LUTR, com 23 bases e degeneração de 48 vezes (Tabela 1). O par amplificaria um fragmento de aproximadamente 700 pares de base do gene da polimerase viral. No entanto, os testes realizados em RNA total de plantas doentes não apresentaram resultados positivos, indicando a ausência de membros desse gênero associados à doença (dados não mostrados). Os genomas completos de oito membros do gênero Polerovirus foram alinhados: TYV, BMYV, BWYV, BChV, CABYV, PLRV, CYDV-RPV, CYDV-RPS. A análise do alinhamento indicou a existência de regiões conservadas e, com isso, oligonucleotídeos específicos para esse gênero (PLF e PLR), foram desenhados (Tabela 1; Figura 3). O oligo PLF anela no início do gene da polimerase (OFR2) e o oligo PLR em uma região conservada na região central do gene da proteína capsidial (Figura 3). Dessa forma, o fragmento amplificado pelo par PLF/PLR teria cerca de 1100 bases, compreendendo parte do gene da polimerase, toda a região intergênica e parte do gene da CP. A análise do produto de amplificação em gel de agarose mostrou a existência de bandas com o tamanho esperado em três plantas infectadas quando amplificadas com os oligonucleotídeos específicos para Polerovirus (Figura 4A, painel superior). Algumas bandas de baixa intensidade de tamanhos não esperados foram observadas na planta não infectada utilizada como controle. No entanto, experimentos de Southern blot usando uma sonda específica para o gene do capsídeo viral mostraram que essas bandas eram amplificações inespecíficas, possivelmente resultado da degeneração dos oligos (Figura 4A, painel inferior).
Figura 3: Representação esquemática do genoma dos Polerovirus. As posições de anelamento dos oligos desenhados para amplificar segmentos do genoma do vírus associado à doença azul do algodoeiro estão indicadas por setas. ORF 1 e ORF2 – Polimerase; ORF3 – Proteína do capsídeo; ORF4 – Proteína de movimento; ORF3 e ORF5 – Proteína de transmissão.
Figura 4: Amplificação parcial do genoma do CLRDV. A – Produto de amplificação obtido pelo par de oligos PLF/PLR. O fragmento amplificado contém parte dos genes codificadores da polimerase e do capsídeo viral e toda a região intergênica. Painel superior: gel de agarose corado com brometo de etídio; Painel inferior: Southern blot hibridado com sonda específica para a CP viral. B – Amplificação da seqüência completa do gene codificador da CP viral com os oligos PL4F e o3R. Painel superior: gel de agarose corado com brometo de etídio; Painel inferior: Southern blot hibridado com sonda específica para a
Os fragmentos amplificados foram clonados em pGEMT-Easy e três a seis clones de cada amplicon foram seqüenciados. Após os primeiros resultados de seqüenciamento, que gerou seqüências correspondentes às extremidades do fragmento amplificado, oligos internos PL2F e PL2R, com seqüências específicas do vírus, foram desenhados para o seqüenciamento completo do fragmento (Tabela 1; Figura 3). Como esperado, a análise das seqüências mostraram que os amplicons apresentam alta similaridade com membros do gênero Polerovirus. Dos 1.058 nucleotídeos obtidos, 612 tinham identidade com o gene da polimerase viral, 187 com a região intergênica e 259 bases com o gene da capa protéica. As seqüências foram depositadas no GeneBank sob os números de acesso AY758560 e AY758561.
Com o intuito de melhor analisar o vírus identificado, os oligonucleotídeos PL4F (não degenerado) e o3R (degenerado) foram desenhados para a amplificação de todo o gene da capa protéica (ORF3) (Tabela 1; Figura 3). Um fragmento de 606 bases foi amplificado, clonado e seqüenciado (Figura 4B, painel superior). Experimentos de Southern blot utilizando o gene da proteína capsidial marcado radioativamente mostraram que a banda amplificada no experimento de PCR realmente corresponde a parte do genoma viral.
A dedução da seqüência de aminoácidos indicou que a proteína da CP, com 201 aminoácidos, tem um peso molecular de aproximadamente 22.3 kDa. A análise de seqüência indicou que a mesma apresenta 92% de identidade com a CP do Chickpea stunt disease associated virus (CpSDaV), um membro ainda não classificado da família Luteoviridae (Tabela 2). O CpSDaV é um vírus endêmico da Índia que infecta leguminosas (Reddy & Kumar, 2004). Análise do alinhamento mostrou que os vírus apresentam apenas nove substituições de aminoácido. No entanto, somente parte da seqüência do gene do capsídeo do CpSDaV está disponibilizada no banco de dados do NCBI. Dessa forma, ainda não é possível precisar corretamente o grau de parentesco entre esses dois vírus. Identidades significativas foram obtidas com outros membros do gênero Polerovirus, tais como TYV (79%), BMYV (78%), BChV (78%) e BWYV (78%) (Tabela 2). Os critérios de taxonomia da família Luteoviridae dizem que se dois vírus apresentam similaridade de seqüência na CP inferior a 90%, estes já podem ser considerados como membros de espécies diferentes (Van Regenmortel et al., 1997). O vírus associado com a doença azul
apresenta identidade abaixo de 90% com todos os membros definitivos da família e, portanto, deve constituir-se de uma nova espécie.
Em função dos sintomas observados em campo o vírus foi denominado Cotton leafroll dwarf virus (CLRDV). Um alinhamento da seqüência de aminoácido de membros da família mostrou que os resíduos expostos na superfície da CP do PLRV (Terradot et al., 2001) e do BWYV (Brault et al., 2003) também estão conservados na capa protéica do CLRDV, indicando que são potencialmente imunogênicos (Figura 5).
A análise filogenética do CLRDV mostrou que o vírus se encontra, junto com o CpSDaV, em um clado fortemente suportado que contém todos os vírus de beterraba e também o TYV (Figura 6A). O vírus se encontra claramente, portanto, no ramo específico dos Polerovirus.
Chickpea stunt disease associated virus (CpSDaV), Y11530; Turnip yellows virus (TYV), NC 003743; Beet mild yellowing virus (BMYV), NC 003491; Beet chlorosis virus (BChV), NC 002766; Beet western yellows virus (BWYV), NC 004756; Groundnut rosette assistor virus (GRAV), AF195828; Cucurbit aphid-borne yellows virus (CAbYV), NC 003688; Cereal yellow dwarf virus-RPV (CYDV-RPV),NC 004751; Cereal yellow dwarf virus-RPS (CYDV-RPS), NC 002198; Potato leafroll virus (PLRV), NC 001747; Soybean dwarf virus (SbDV), NC 003056; Tobacco vein distorting virus, AM411003; Bean leafroll virus (BLRV), NC 003369; Barley yellow dwarf virus-PAV (BYDV-PAV), NC 004750; Barley yellow dwarf virus-PAS (BYDV-PAS), NC 002160; Barley yellow dwarf virus-GAV (BYDV-GAV), NC 004666; Barley yellow dwarf virus-MAV (BYDV-MAV), NC 003680; Pea enation mosaic virus-1, NC_003629
Figura 5: Alinhamento da seqüência de aminoácidos da CP do CLRDV com CPs de outros Luteoviridae. Regiões em preto significam resíduos que estão presentes em todos os vírus do alinhamento. Colunas no alinhamento com menos de 100% de conservação e com mais de 60% estão representadas em cinza. Os resíduos E109, E170, D173, E176 e D177, presentes na superfície da CP, estão destacados. Cotton leafroll dwarf virus (CLRDV), AY758560; Chickpea stunt disease associated virus (CpSDaV), Y11530; Turnip yellows virus (TYV), NC 003743; Beet western yellows virus (BWYV), NC 004756; Beet mild yellowing virus (BMYV), NC 003491; Beet chlorosis virus (BChV), NC 002766; Potato leafroll virus (PLRV), NC 001747; Cereal yellow dwarf virus-RPS (CYDV-RPS), NC 002198; Cereal yellow dwarf virus-RPV (CYDV-RPV), NC 004751; Cucurbit aphid-borne yellows virus (CAbYV), NC 003688; Groundnut rosette assistor virus (GRAV), AF195828; Sugarcane yellows virus (ScYV), NC 000874; Tobacco vein distorting virus, AM411003; Bean leafroll virus (BLRV), NC 003369; Soybean dwarf virus (SbDV), NC 003056; Barley yellow dwarf virus-GAV (BYDV-GAV), NC 004666; Barley yellow dwarf virus-MAV (BYDV-MAV), NC 003680; Barley yellow dwarf virus-PAV (BYDV-PAV), NC 004750; Barley yellow dwarf virus-PAS (BYDV-PAS), NC 002160; Pea enation mosaic virus-1, NC_003629
Figura 6: Análise filogenética do CLRDV e outros membros da família Luteoviridae. A – Filogenia com a CP do CLRDV e outros Luteoviridae. B – Filogenia da parte C-terminal da polimerase do CLRDV e outros Luteoviridae. As filogenias foram realizadas através de Neighbor joinning, distância p, com 1000 replicatas. Chickpea stunt disease associated virus (CpSDaV), Y11530; Turnip yellows virus (TYV), NC 003743; Beet western yellows virus (BWYV), NC 004756; Beet mild yellowing virus (BMYV), NC 003491; Beet chlorosis virus (BChV), NC 002766; Potato leafroll virus (PLRV), NC 001747; Cereal yellow dwarf virus-RPS (CYDV-RPS), NC 002198; Cereal yellow dwarf virus-RPV (CYDV-RPV), NC 004751; Cucurbit aphid-borne yellows virus (CAbYV), NC 003688; Groundnut rosette assistor virus (GRAV), AF195828; Sugarcane yellows virus (ScYV), NC 000874; Tobacco vein distorting virus, AM411003; Bean leafroll virus (BLRV), NC 003369; Soybean dwarf virus (SbDV), NC 003056; Barley yellow dwarf virus-GAV (BYDV-GAV), NC 004666; Barley yellow dwarf virus-MAV (BYDV-MAV), NC 003680; Barley yellow dwarf virus-PAV (BYDV-PAV), NC 004750; Barley yellow dwarf virus-PAS (BYDV-PAS), NC 002160; Pea enation mosaic virus-1, NC_003629
I.4.3 – Seqüências da proteína do movimento, polimerase e região intergênica
A seqüência da ORF4 (ou MP, de “Movement Protein”) do CLRDV, região possivelmente codificadora de uma proteína responsável pelo movimento viral de célula a célula, também foi obtida. Essa proteína é expressa através de uma fase aberta de leitura existente dentro da seqüência da CP (Figura 1). No CLRDV a seqüência traduzida apresenta 174 aminoácidos e um peso molecular estimado de 19,8 kDa. Em geral, a MP dos Luteovirus e Polerovirus apresentam peso estimado de 17 kDa e 19 kDa, respectivamente. Dessa forma, o peso estimado para a MP do CLRDV está em acordo com o observado para os membros do gênero Polerovirus. Além disso, a análise da seqüência mostrou que, assim como na região da CP, a MP do CLRDV também apresenta identidades mais altas com membros do gênero Polerovirus, tais como TYV, BMYV, BChV e BWYV (Tabela 2).
Os 612 nucleotídeos obtidos da ORF2 viral codificam 203 aminoácidos da região C-terminal da polimerase (RdRp). A análise das identidades indica que ORF2 do CLRDV está mais relacionada com membros do gênero Polerovirus do que com membros do gênero Luteovirus (Tabela 2). Na filogenia, a seqüência agrupa com o TYV, um membro do gênero Polerovirus, confirmando, dessa forma, os dados de identidade (Figura 6B). No entanto, não foi possível determinar o grau de parentesco dessa região do CLRDV com o CpSDaV, pois somente parte da seqüência da CP está depositada no Genebank para esse vírus. Com o intuito de melhor analisar a região da polimerase viral, os oligos P1-2F e PL3R foram desenhados para clonar e seqüênciar regiões acima do fragmento inicialmente obtido pelo par de oligos PLF/PLR (Tabela 1; Figura 3). O oligo P1-2F apresenta degeneração de quatro vezes e foi desenhado alinhando-se apenas os vírus mais relacionados com o CLRDV na região da polimerase: TYV, BMYV, BWYV e CABYV (Tabela 1; Figura 3; Figura 6B). O oligo PL3R foi feito baseando-se apenas na seqüência do próprio CLRDV. No entanto, uma degeneração de 12 vezes foi introduzida nesse oligo para cobrir a diversidade de nucleotídeos observada dentro dos clones obtidos para o vírus. Vale ressaltar, no entanto, que as mudanças de nucleotídeos observadas em diferentes clones do CLRDV não promoveram alteração na seqüência de aminoácidos nessa região (dados não mostrados). Assim, foi possível seqüênciar mais 714 nucleotídeos do gene da polimerase viral, obtendo-se toda a região da ORF2 não sobreposta com a ORF1 e mais 40
