Brazilian Journal of Development
Contribuição técnica sobre a identificação de anomalias espermáticas no
sêmen in natura de curimatã, Prochilodus lacustris Steindachner, 1907
Technical contribution on identifying anomalies sperm in the semen in natura
curimatã, Prochilodus lacustris Steindachner, 1907
DOI:10.34117/bjdv6n3-064Recebimento dos originais: 29/02/2020 Aceitação para publicação: 05/03/2020
Jackellynne Fernanda Farias Fernandes
Programa de Pós-Graduação em Recursos Aquáticos e Pesca. Universidade Estadual do Maranhão, Cidade Universitária Paulo VI, Av. Lourenço Vieira da Silva, 1000, Jardim São Cristóvão, 65055-
310 São Luís, MA, Brasil
Email: jackellynnefffernandes@gmail.com
Caroline Lopes França
Programa de Pós-Graduação em Recursos Aquáticos e Pesca. Universidade Estadual do Maranhão, Cidade Universitária Paulo VI, Av. Lourenço Vieira da Silva, 1000, Jardim São Cristóvão, 65055-
310 São Luís, MA, Brasil
Thiago Campos de Santana
Programa de Pós-Graduação em Recursos Aquáticos e Pesca. Universidade Estadual do Maranhão, Cidade Universitária Paulo VI, Av. Lourenço Vieira da Silva, 1000, Jardim São Cristóvão, 65055-
310 São Luís, MA, Brasil
Rafael Santos Lobato
Laboratorio de Gerenciamento Costeiro Integrado do Maranhão; Departamento de Engenharia de Pesca. Universidade Estadual do Maranhão, Cidade Universitária Paulo VI, Av. Lourenço Vieira da
Silva, 1000, Jardim São Cristóvão, 65055-310 São Luís, MA, Brasil
Erivânia Gomes Teixeira
Laboratório de Reprodução de Recursos Aquáticos; Departamento de Engenharia de Pesca; Programa de Pós-Graduação em Recursos Aquáticos e Pesca. Universidade Estadual do Maranhão,
Cidade Universitária Paulo VI, Av. Lourenço Vieira da Silva, 1000, Jardim São Cristóvão, 65055- 310 São Luís, MA, Brasil
RESUMO
O objetivo do presente estudo foi avaliar a ocorrência de alterações morfológicas dos espermatozoides no sêmen in natura do curimatã P. Lacustris. O experimento foi conduzido no Laboratório de Reprodução de Recursos Aquáticos/UEMA, durante o período de outubro de 2016 e maio de 2017. Foram capturados 10 espécimes machos de curimatã para realização de biometria e caracterização seminal. Os espécimes capturados apresentaram comprimento total 37,79±1,99 cm, com peso total médio de 927,10±55,02 g. O sêmen apresentou coloração branco-leitosa e textura com consistência viscosa. O volume apresentou coeficiente de variação elevado. O valor da concentração foi de 4,1±2,0x106 espermatozoides por ml-1 de sêmen. As análises do sêmen in natura revelaram um percentual de espermatozoides normais de 62,24 %. A alteração mais frequente para sêmen de curimatã foi espermatozoide sem cauda. Os espécimes de P. Lacustris, possuem características seminais in natura, quantitativas e qualitativas condizentes aos padrões seminais descritos em peixes teleósteos.
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Palavras-Chave: espermatozoide; motilidade; reprodução. ABSTRACTThe objective of the present study was to evaluate the occurrence of morphological alterations in the sperm in natura of curimatã P. lacustris. The experiment was conducted at the Aquatic Resources Reproduction Laboratory / UEMA, during the period from October 2016 to May 2017. Ten male curimatã specimens were captured for biometry and seminal characterization. The captured specimens had a total length of 37.79±1.99 cm, with an average total weight of 927.10±55.02 g. The semen showed milky-white color and texture with a viscous consistency. The volume presented a high coefficient of variation. The concentration value was 4.1±2.0x106sperm per ml-1 of semen. The analysis of fresh semen revealed a percentage of normal sperm of 62.24 %. The most common alteration for curimatã semen was sperm without a tail. The specimens of P. lacustris, have natural seminal characteristics, quantitative and qualitative consistent with the seminal patterns described in teleost fish.
Keywords: sperm; motility; reproduction 1 INTRODUÇÃO
A curimatã Prochilodus lacustris é um peixe teleósteo, nativo das bacias do Parnaíba e do Mearim, Nordeste do Brasil e atualmente encontra-se disseminada nas bacias hidrográficas em todo país (Piorski, 2010). Esta espécie desempenha migrações por longas distâncias, consegue atravessar obstáculos naturais e seu hábito alimentar detritívoro contribui como fator importante para condições ecológicas das comunidades nectônica tropicais (Goodinho; Kynard, 2006).
Estudos que contemplem a biologia reprodutiva da P. Lacustris são escassos, especialmente quando se trata das características dos seus gametas e emprego de biotecnologias, como a criopreservação seminal, uma área que vem se destacando em relação a aquicultura e conservação do material genético de diferentes espécies (Carolsfeld et al., 2003).
As análises sobre as características seminais são essenciais para o estudo da reprodução de organismos aquáticos, pois através de dados a respeito dos parâmetros do fluido seminal é possível obter conhecimentos sobre a biologia reprodutiva de algumas espécies, de tal modo que seja útil para fins de conservação, quanto para propagação artificial em cativeiros (Lahnsteiner, 2000). Contudo, o conhecimento sobre a caracterização de gametas masculinos de peixes está limitado a algumas espécies, mesmo que, dentre os vertebrados, os peixes disponham à maior hábito reprodutivo e características seminais (Schulz et al., 2010).
Lahnsteiner (2000) evidencia o interesse em se conhecer as particularidades morfológicas e funcionais dos espermatozoides para aperfeiçoar a produtividade de espécies de peixes quando condicionado em ambientes reclusos. Dessa forma, para se determinar o sucesso nas pisciculturas continentais e de forma eficiente é necessário monitorar as etapas da reprodução dos peixes nativos, para obtenção de gametas de boa qualidade para uma produção sistemática de planteis originários de
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matrizes selecionadas mantidas sob observações (De Oliveira et al., 2015).
Kavamoto et al. (1997) analisando algumas espécies do gênero Prochilodus, destacou que o uso racional de machos confinados e indicado à reprodução induzida é essencial para o conhecimento da capacidade de produção do material fecundante dos espécimes durante o período reprodutivo.
Poucas informações estão disponíveis sobre as características, conservação, produção e avaliação da qualidade do sêmen in natura da P. lacustris e para obter sucesso nos estudos sobre reprodução in vitro é fundamental a incorporação de substâncias diluidores e crioprotetoras que proporcione à qualidade das células. Sendo assim, para se estabelecer condições ótimas que um diluidor ou crioprotetor possua é necessário o conhecimento sobre os parâmetros seminais naturais.
Diante do exposto, o presente artigo objetiva avaliar ocorrência de anomalias morfológicas nos espermatozoides do curimatã através do sêmen in natura visando o possível incremento para futuras técnicas e protocolos de conservação.
2 MATERIAL E MÉTODOS
O experimento foi conduzido na Piscicultura São José (3°40’48’’ S e 45°49’29’’W), localizada em Alto Alegre do Pindaré - Maranhão, Brasil e no Laboratório de Reprodução de Recursos Aquáticos na Universidade Estadual do Maranhão (LARAQUA), no período de outubro de 2016 a maio de 2017. Foram utilizados dez reprodutores de P. Lacustris livres de indução hormonal, pertencentes ao plantel da fazenda. Os exemplares foram submetidos a biometria (peso e comprimento) e posteriormente realizada a coleta do sêmen individualmente em microtubos graduados de 1,5 ml. O volume foi aferido por meio de micropipeta de volume variável e o pH com utilização de fitas reagentes.
Para determinar o percentual de espermatozoides móveis, uma alíquota de 2 µL de sêmen foi diluída em 20 µl de água destilada e avaliada subjetivamente em microscópio de luz convencional (Objetiva 40x). Os valores atribuídos foram de 0 a 100 % para a motilidade em função da movimentação dos espermatozoides e o tempo de motilidade foi cronometrado.
De cada amostra também foi retirada uma alíquota de 200 µl para leitura da osmolaridade (mOsm/kg) (Osmometer Automatic, Roebling, Alemanha). Já a concentração espermática, foi determinada da seguinte forma: cada amostra de sêmen foi diluída em formol citrato na proporção de 1:1000 e uma alíquota de 10 µl de cada amostra foi colocada em câmara de Neubauer para contagem de espermatozoides. O número de espermatozoides foi determinado segundo Tiba et al. (2009) e os resultados expressos em espermatozoides ml-1.
Para se determinar a melhor combinação entre fixador e corante para o estudo das alterações morfológicas dos espermatozoides, as amostras de sêmen foram divididas em duas porções e
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submetidas a dois tratamentos: Tratamento 1 – sêmen diluído em formol-citrato + rosa bengala; Tratamento 2 – sêmen diluído em solução salina formolizada a 1 % + rosa bengala. O esfregaço foi realizado pela deposição de 10 µl de sêmen diluído em 3µl de corante rosa bengala. Foram observados 150 espermatozoides em duas lâminas por meio de microscopia de luz convencional (Objetiva 40x). A eficiência do corante foi avaliada conforme metodologia proposta por Streit-Jr et al. (2008) que estabeleceram escores seguindo notas e pontuações (tabela 1). Para cada lâmina somou-se os escores atribuídos às variáveis analisadas de acordo com a fórmula: Σ= Alteração anatômica dos espermatozoides + Aglutinação + Eficiência do corante + Sujidade, em seguida as anormalidades morfológicas foram quantificadas conforme Kavamoto et al. (1999).
Tabela 1- Análise e pontuação atribuída aos critérios de avaliação do corante utilizado na coloração do sêmen in natura de Prochilodus lacustris.
Critérios Avaliação Pontuação
Alteração anatômica
Sim / Não 0 ponto / 3 pontos
Eficiência do corante
Boa / Regular / Ruim 3 pontos / 1,5 pontos / 0 ponto
Aglutinação Sim / Não 0 ponto / 3 pontos
Sujidade Baixa / Suja 1 ponto / 0 ponto
Fonte: Adaptada de Streit-Jr et al., (2004).
Para a verificação das alterações morfológicas dos espermatozoides, o sêmen da P. Lacustris foi diluído em uma solução de formol citrato tamponado a 1 %, na proporção de 1:1000 (sêmen:solução diluente). Em seguida, foi realizado um esfregaço em lâmina de vidro, utilizando uma alíquota de 10 µl de sêmen diluído e 3 µl do corante rosa bengala. De cada amostra foram observados 150 espermatozoides em microscopia de luz convencional (40x) e as alterações morfológicas foram registradas e quantificadas de acordo com a metodologia de Kavamoto et al. (1999): defeito na cabeça (irregularidade na membrana) e na peça intermediária, peça intermediária em forma de saca rolha, defeitos na cabeça, espermatozoide sem cauda e gameta contendo peça intermediária em posição retro-axial. Caracterizando-se como uma contribuição técnica, os resultados foram expressos em média ± desvio padrão, e aplicados testes estatísticos através do programada Statistica 7.0.
3 RESULTADOS
Os peixes utilizados no experimento apresentaram comprimento médio de 37,79 ± 1,99 cm e peso médio de 927,10 ± 55,02 cm. O sêmen in natura da P. lacustris apresentou coloração branca
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leitosa e aspecto denso para todas as amostras obtidas, apresentando coeficiente de variação elevado entre os espécimes capturados. A concentração espermática variou de 1,7x106 a 4,4x106 espermatozoides/ml, osmolaridade de 248,8±12,6 mOsmol e de pH 8,0±0,4. A porcentagem média de espermatozoides móveis do sêmen in natura do curimatã, logo após ativação foi de 98±2,0 % e o tempo de motilidade espermática apresentou média de 55,8±8,3s (tabela 2).
Tabela 2- Estatística descritiva das características seminais (n=10) de curimatã, Prochilodus lacustris.
Parâmetro Mín Máx Média ± DP Coeficiente de
variação (%) Volume (µL) 353,5 1.132,7 743,1 ± 389,6 52,0 pH 7,2 8,0 7,6 ± 0,4 5,3 Taxa de motilidade (%) 98,0 100,0 98,0 ± 2,0 2,0 Tempo de motilidade (s) 47,5 64,1 55,8 ± 8,3 14,9 Concentração (x106spz/ml-1) 1,7 4,4 4,1 ± 2,0 48,7 Osmolaridade (mOsm/kg) 223,6 248,8 236,2 ± 12,6 5,3
Quanto a combinação dos fixadores e corante, o sêmen fixado em formol salino combinado ao corante rosa bengala obteve escore 0, uma vez que todas as amostras grumaram. Quando fixado em formol citrato com o corante rosa bengala o escore obtido foi 7. As análises do sêmen “in natura” mostraram um percentual de espermatozoides normais de 62,0 % e permitiram a visualização de cabeça e flagelo, enquanto 38,0 % do total de espermatozoides observados apresentaram algum tipo de patologia (tabela 3). As anomalias espermáticas mais comuns observadas nos espermatozoides da
P. lacustris (figura 1) foram anomalias primarias: defeitos na cabeça e na peça intermediária com
alteração na forma e peça intermediaria em forma de saca-rolha, anomalias secundarias: peça intermediaria e cauda fortemente dobrada, espermatozoides sem cabeça e sem cauda, cauda contendo gota citoplasmática e peça intermediária em posição retro axial.
Tabela 3- Médias ± desvio padrão de espermatozoides normais, com anomalias primárias e secundárias, observadas nas análises de sêmen de curimatã, Prochilodus lacustris “in natura”.
Anomalias Média Desvio padrão
Espermatozoides normais (%) 62,0 11,1 Anomalias primárias (%) 14,0 5,9
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Anomalias secundárias (%) 24,0 12,9
Figura 1- Anomalias observadas nos espermatozoides da Prochilodus lacustris. Onde: (A e B) defeitos na cabeça, (C e
D) peça intermediária com alteração na forma e peça intermediaria em forma de saca-rolha, (E) peça intermediaria e cauda fortemente dobrada, (F) espermatozoide sem cauda, (G) cauda contendo gota
citoplasmática e (H) peça intermediária em posição retro axial.
As anomalias mais frequentes para sêmen de curimatã foi espermatozoide sem cauda, enquanto a menor frequência observada em relação às anomalias foi para peça intermediária em forma de saca rolha com 1,99 %. Apesar de ser observada a presença de macrocefalia no sêmen in
natura, houve predomínio de anomalias de cauda para essa pesquisa (figura 2).
Figura 2- Percentuais médios de anomalias encontradas no sêmen in natura de Prochilodus lacustris: Defeitos na
cabeça e na peça intermediária (DCPI); Peça intermediaria em forma de saca-rolha (PIFSR); Peça intermediaria e cauda fortemente enroladas (PICdFE); Espermatozoides sem cauda (SptzSCd); Espermatozoide com cauda contendo gota
citoplasmática (SptzCCdGC); Peça intermediaria em posição retro-axial (PIPRA).
4 DISCUSSÃO 0 2 4 6 8 10 12 14 F re quê n ci a (% ) Anomalias
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Os valores obtidos na biometria de P. lacustris confirmam que os exemplares eram adultos, pois nos estudos realizados por Loubens, Aquim e Robles (1984), espécies de Prochilodus possuem tamanho mínimo para primeira maturação sexual de 25 a 30 cm enquanto que Silva (2007) obteve tamanho mínimo de primeira maturação de 19,7 cm de comprimento total em espécies encontradas na Bacia do Rio Grande
Trabalhos referentes às características seminais de peixes reofílicos são escassos e a determinação de alguns parâmetros é fundamental para alertar sobre fatores que possam ocasionar alterações na fertilidade.
De acordo com Murgas et al. (2007) espécies do gênero Prochilodus (Prochilodus lineatus,
Prochilodus nigricans e Prochilodus brevis) apresentam um volume seminal de 0,8 a 3,8 ml. Porém
o volume do sêmen é uma característica mutável entre as espécies e até na mesma espécie, visto que esse parâmetro pode ser influenciado pela idade, época e métodos de coletas (Solis-Murgas et al., 2011). Felizardo et al. (2010) analisando a época de coleta do sêmen de P. lineatus observaram que essa variável não influenciou consideravelmente sobre o volume do sêmen da referida espécie.
O volume máximo identificado para a espécie estudada foi superior à quantidade encontrada por Alves (2016) analisando o volume seminal da P. nigricans capturada na Baixada Maranhense, Brasil. Esses valores podem ser modificados com o auxílio de doses hormonais, como o extrato bruto de hipófise de carpa (EBHC), hormônio liberador de gonadotrofina (GnRH) entre outros estimulantes das gonadotrofinas.
O resultado do pH seminal da P. lacustris foram superiores quando comparados aos resultados encontrados por Bombardelli et al. (2010) para a Tilápia (Oreochromis niloticus). Essa característica seminal está relacionada diretamente com a quantidade de elementos inorgânicos presentes no sêmen, os quais quando combinados com a osmolaridade acabam influenciando na motilidade dos espermatozoides (Rurangwa et al., 2004; Alavi & Cosson, 2005).
Nesta pesquisa a osmolaridade do sêmen de P. lacustris encontrada está próxima a faixa de osmolaridade de outras espécies do gênero Prochilodus e dos valores registrados para peixes de água doce. Algumas espécies de dulcícolas podem apresentar osmolaridade em torno de 266 a 317 mOsmolkg (Morisawa & Susuki, 1983), porém os mesmos autores observaram valor de 302 mOsmolkg para Carpa (Cyprinus carpio). A osmolaridade também é uma característica seminal que age diretamente sobre a motilidade do espermatozoide, ativando de forma total ou parcial quando submetido a tonicidade dos diluentes em comparação ao plasma seminal (Shimoda, 2007). Sendo assim, o entendimento da osmolaridade de sêmen de peixe é fundamental para criação de soluções ativadoras e de conservação dos gametas, quando o mesmo pode interferir na taxa de espermatozoides móveis.
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Segundo Godinho (2007) a porcentagem de espermatozoides móveis é um dos principais parâmetros a ser analisado quanto à característica seminal de peixes, pois este parâmetro pode ser influenciado por condições ambientais, pela própria fisiologia do animal, nutrição, sanidade e manejo como soluções ativadoras. Para esta pesquisa a porcentagem média de espermatozoides móveis do sêmen in natura do curimatã, após ativação com a água destilada foi superior aos trabalhos de Kavamoto et al. (1986) para P. lineatus e Lopes et al. (2014) para espécies do mesmo gênero.
O tempo de motilidade espermática quando analisado em peixes dulcícolas pode variar entre as espécies, podendo apresentar 30-40 segundos em carpa (C. carpio), 486 segundos para pacu (Piaractus mesopotamicus), 501-1.112 segundos para tilápia (O. niloticus) (Legendre & Billard, 1980; Billard et al., 1995; Maria et al., 2004; Teixeira, 2013). O tempo de motilidade é um parâmetro fundamental para o estudo da reprodução artificial de peixes reofílicos, além de ser fator de grande importância para análise da qualidade seminal juntamente com outras variáveis como a concentração espermática.
O conhecimento sobre a concentração espermática contribui no equilíbrio da reprodução associando a proporção de espermatozoides:ovócitos corretamente (Sanches et al., 2011). O valor médio da concentração espermática encontrado para sêmen de P. lacustris quando comparada às concentrações seminais de outras espécies do gênero é considerada baixa, uma vez que Murgas et al. (2007) encontraram concentração de 27,36 ± 5,32x109sptzml-1 e Pinheiro (2013) concentração espermática de 12,87x109 sptzml-1 para outras espécies de Prochilodus, porém é superior aos dados encontrados por Sanches et al., (2011) quando analisaram a concentração espermática do cascudo preto (Rhinelepis áspera).
Diante do exposto é possível perceber uma grande variação na concentração espermática entre as espécies do mesmo gênero e espécies de gênero diferentes. Essa variação ocorre em virtude da variabilidade genética entre os indivíduos, muitas vezes pela época de coleta do sêmen, manejo e condições ambientais de cada região.
Geralmente os valores de concentrações quando obtidos em grandes quantidades principalmente em espécies dulcícolas, expressa um elevado potencial de fertilização, porém quando o mesmo se encontra muito viscoso, acaba interferindo na motilidade afetando a fertilização.
A combinação dos fixadores e corantes é fundamental para conservar o material celular e o uso do corante rosa bengala deve ser feito mediante fixação em formol citrato (Streit Jr. et al., 2008). A pequena formação de aglomerados na lâmina com o uso de rosa bengala, pode estar relacionado com as propriedades físico-químicas do corante utilizado (Arama, 1997). A solução de formol salino é eficiente e usual quando se pretende analisar sêmen de tilápia (O. niloticus) (Teixeira, 2013) e pirapitinga (Piaractus brachypomus) (Melo, 2010).
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O espermatozoide do P. lacustris é composto por uma cabeça arredondada sem acrossomo, peça intermediária e cauda (Valdebenito, 2009). Os espermatozoides da maioria dos teleósteos não possuem acrossomo (Borges Filho, 1987).
Herman et al. (1994) afirmaram que a presença de anomalias no espermatozoide está relacionada à idade nutricional, alterações ambientais assim como genéticas e idade dos espécimes selecionados para reprodução, enquanto Miliorini (2006) afirmou que essas alterações são provocadas por falhas ao decorrer da espermatogênese.
As análises da morfologia das células espermáticas é um fator indispensável na avaliação sobre as condições da qualidade seminal, uma vez que a grande incidência das anomalias do sêmen pode ocasionar a redução da motilidade, vigor espermática, além de ser um indicador necessário à determinação de um material de boa qualidade.
Essas análises auxiliam na caracterização da amostra, proporcionando prever sua capacidade fecundante ou explicar as “falhas” na escolha dos reprodutores considerados como aptos após análise da motilidade espermática.
Segundo Maria et al. (2010) a limitação de um percentual de morfoanomalias aceitável é um parâmetro indispensável no estudo da qualidade seminal.
Deformidades na peça intermediária e na cauda do espermatozoide influenciam negativamente o resultado da motilidade espermática provocando modificações na formação, condensação e composição final dos feixes mitocondriais, aumentando a quantidade de espermatozoides com movimentos variados ou circulares, resultando na baixa fertilização dos ovócitos (Kavamoto, 1999).
As alterações na morfologia espermática podem estar relacionadas à nutrição dos reprodutores, manejo na coleta do sêmen para análise, métodos de coloração e tempo de vida dos reprodutores.
Blom (1959) ressalva que a patologia na cauda do espermatozoide do tipo saca rolha resume- se a uma má distribuição das mitocôndrias por toda a extensão da peça intermediária, criando forma de saca rolhas. Estudos realizados por Kavamoto et al. (1999) com sêmen de P. scrofa, identificaram 9,54 % de patologia seminal e a maior frequência observada foi em espermatozoides com defeitos no flagelo. Pinheiro (2013) analisando o sêmen da P. Brevis identificou 12,0 % de potologias com predominância para defeitos na cauda, enquanto que a presente pesquisa obteve a segunda maior patologia para defeitos na cabeça e na peça intermediária (11,1 %).
5 CONCLUSÃO
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proporções, são claramente variáveis para serem testados em protocolos de criopreservação e resfriamento, distinguindo das outras espécies do mesmo gênero.
As características seminais in natura quantitativas e qualitativas, são condizentes aos padrões seminais descritos em peixes teleósteos e pode ser considerada com alta qualidade espermática para o emprego em programas de reprodução artificial e/ou bancos genéticos in vitro.
O conhecimento sobre as características seminal da P. lacustris, é fundamental pois devemos entender as características in natura do sêmen, livre de substâncias hormonais, uma vez que qualquer elemento que não esteja dentro do padrão seminal pode desenvolver alterações na estrutura morfológica do espermatozoide, ocasionando comprometimento na qualidade do material.
O uso do corante rosa bengala combinado com o fixador formol citrato pode ser utilizado para identificação de morfoanomalias espermática tendo bons resultados para coloração do sêmen de P.
lacustris.
Portanto, técnicas para análises seminais de peixes de água doce que apresentam potencial econômico e reprodutivo devem ser padronizadas para que se tenha sêmen de boa qualidade e sucesso reprodutivo.
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