Alexandre Funck
EFEITOS ANTI
-
OBESIDADE DA ERVA-
MATE(Ilex paraguariensis)
EM CAMUNDONGOSii
Alexandre Funck
EFEITOS ANTI
-
OBESIDADE DA ERVA-
MATE(Ilex paraguariensis)
EM CAMUNDONGOS
ORIENTADOR
Prof. Dr. Marcelo Lima Ribeiro
Dissertação apresentada ao Curso de Pós-Graduação Stricto Sensu em Ciências da
Saúde da Universidade São Francisco (USF) para a obtenção do título de Mestre em Ciências da Saúde.
Ficha catalográfica elaborada pelas bibliotecárias do Setor de Processamento Técnico da Universidade São Francisco. WD 210 Funck, Alexandre.
F977e Efeitos anti-obesidade da Erva Mate (Ilex
paraguariensis) em camundongos / Alexandre Funck --
Bragança Paulista, 2008. 55 p.
Dissertação (Mestrado) – Programa de Pós-Graduação Stricto Sensu em Ciências da Saúde da Universidade São
Francisco.
Orientação de: Marcelo Lima Ribeiro.
1. Erva Mate. 2. Ilex paraguariensis. 3. Fitoterapia.
iii
BANCA EXAMINADORA DA DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
Orientador: Prof. Dr. Marcelo Lima Ribeiro
Membros:
1. Prof. Dr. Marcelo Lima Ribeiro
2. Prof. Dr. Carlos Augusto Real Martinez 3. Prof. Dr. Lúcio Fábio Caldas Ferraz
Suplentes:
1. Prof. Dr. Denise Gonçalves Priolli 2. Prof. Dr. Alessandra Gambero
Programa de Pós-Graduação Stricto Sensu em Ciências da Saúde da Universidade São Francisco.
iv
v
AGRADECIMENTOS
Ao Prof. Dr. Marcelo Lima Ribeiro, pela maneira gentil e competente com que norteou os meus estudos.
Ao amigo Demétrius pelo interesse na colaboração desta dissertação.
vi
SUMÁRIO
RESUMO...VIII
ABSTRACT...IX
1–INTRODUÇÃO...10
1.1 – A obesidade e a saúde pública...10
1.2 – Síndrome metabólica...10
1.3 – Adipocitocinas...12
1.4 – Balanço energético...13
1.5 – Modelos experimentais de obesidade...15
1.6 – Compostos fenólicos...15
1.7 – Erva-mate (Ilex paraguariensis)...18
1.8 – Principais produtos comerciais...19
1.9 – Propriedades funcionais da erva-mate...21
2- OBJETIVOS...22
3- MATERIAIS E MÉTODOS...23
3.1 – Material vegetal...23
3.2 – Preparo dos extratos aquosos...23
3.3 – Animais...23
3.4 – Modelo de obesidade induzido por dieta...23
3.5 – Desenho do experimento...24
3.6 – Testes bioquímicos...25
3.7 – Teste de tolerância a insulina...26
3.8 – Ganho de peso e crescimento...26
vii
3.10 – Análise estatística...27
4 – RESULTADOS...28
4.1 – Modelo experimental de obesidade...28
4.2 – Intervenção com Ilex paraguariensis e parâmetros antropométricos e bioquímicos...28
4.3 – Determinação dos níveis de oxidação ao DNA – Ensaio cometa...31
5 – DISCUSSÃO...33
6- CONCLUSÃO...39
viii
RESUMO
Nos dias atuais onde a obesidade tem atingido proporções epidêmicas, surgem cada vez mais evidências científicas, que a associam ao aumento do risco para o desenvolvimento de doenças, tais como as doenças cardíacas, diabetes, hipertensão e resistência à insulina. Trabalhos recentes sugerem que a erva-mate (Ilex paraguariensis)
seja um adjuvante no controle da obesidade, motivo pelo qual avaliou-se neste trabalho os efeitos anti-obesidade da erva-mate em camundongos submetidos a uma dieta hiperlipídica. Noventa animais foram distribuídos aleatoriamente entre os grupos de acordo com a dieta e a intervenção (erva-mate ou água) por 16 semanas. Após a intervenção, as análises bioquímicas foram realizadas com o sistema Cobas-Mira, o teste de tolerância à insulina foi determinado pela média do KITT e a atividade antioxidante foi testada utilizando-se o ensaio cometa. Para análise estatística foi utilizado análise de variância (ANOVA) para um critério, segundo do teste de Bonferroni. A intervenção com erva-mate reduziu os seguintes parâmetros avaliados: peso, glicemia, colesterol, triglicerídeos, LDL-colesterol e a enzima hepática AST. O nível de dano ao DNA foi significativamente menor nos animais obesos tratados com mate em todas as doses utilizadas. Este estudo demonstra que a erva-mate tem efeitos protetores contra a obesidade induzida por dieta em camundongos.
Palavras chave: Erva-mate; Ilex paraguariensis; Fitoterapia; Obesidade; Atividade
ix
ABSTRACT
Nowadays obesity has reached epidemic proportions, and there is a lot of evidence supporting an association between the obesity and major health risks such as cardiovascular disease, diabetes, hypertension, and insulin resistance. Since it has been suggested the potential of Ilex paraguariensis in the management of obesity, we evaluated the
anti-obesity effects of Ilex paraguariensis in a high-fat diet in mice. Ninety animals were
randomly assigned in different groups according to the diet and the intervention (Ilex paraguariensis or water), for sixteen weeks. After intervention, the biochemical analysis
was performed with Cobas-Mira system, the insulin test tolerance was determined by means of KITT and antioxidant activity was tested using comet assay. Statistical analysis was done using one-way ANOVA followed by unpaired Bonferroni. Ilex paraguariensis
intervention decreases weight and the following biochemical parameters: glucose blood level, cholesterol, triglycerides, LDL-cholesterol, and AST. The DNA damage levels were significantly lower in obesity animals treated with mate tea in all doses. In conclusion, this study reports that Ilex paraguariensis can have protective effects against high-fat diet
induced obesity in mice.
Key words: Ilex paraguariensis; Yerba maté, Phytotherapy; Obesity; Antioxidant activity;
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1. INTRODUÇÃO
1.1. A Obesidade e a Saúde Pública
A obesidade é um dos maiores problemas enfrentados pela saúde pública na atualidade (Guzik et al., 2006). No Brasil, as mudanças demográficas, sócio-econômicas e epidemiológicas ao longo do tempo permitiram que ocorresse a denominada transição nos padrões nutricionais, com diminuição progressiva da desnutrição e aumento da obesidade (Monteiro et al.,1995; Francisch et al.,2001). Isso se torna um problema de saúde pública, uma vez que as conseqüências da obesidade para a saúde são muitas, e variam do risco aumentado de morte prematura a graves doenças não letais, mas debilitantes que afetam diretamente a qualidade de vida dos indivíduos. De acordo com a classificação estabelecida pela Organização Mundial de Saúde (WHO,1998), 54% dos adultos nos Estados Unidos estão com sobrepeso (índice de massa corporal - IMC 25kg/m²) e 22% estão obesos (IMC 30kg/m²). O primeiro, segundo e terceiro National Health and Nutrition Examination Surveys (NHANES-I a III), conduzidos nos Estados Unidos de 1971-74, 1976-80 e
1988-91, respectivamente, mostraram que, apesar dos 33 bilhões de dólares movidos pela indústria de “como perder peso”, o número de casos de obesidade vem aumentando significativamente sem diferenças raciais ou sociais. Entre 1976 e 1980, a estimativa feita pelo NHANES mostrou que 25,4% dos adultos entre 20-74 anos apresentavam IMC > 27,5kg/m², enquanto a estimativa realizada em 1988-91 aumentou para 33,3% (Kuczmarski et al.,1994).
1.2. Síndrome Metabólica
11 hiperuricemia e microalbuminúria, integrantes da síndrome metabólica “ampliada” (Defronzo et al., 1991; Reaven, 1994; Timar et al., 2000). A prevalência da síndrome metabólica é estimada entre 20 a 25% da população geral, com comportamento crescente nas últimas décadas (Dunstan et al., 2002). Esta prevalência é ainda maior entre homens e mulheres mais velhos, chegando a 42% entre indivíduos com idade superior a 60 anos (Isomaa et al., 2001). Indivíduos com síndrome metabólica apresentam risco duas a três vezes maiores de morbidade cardiovascular que indivíduos sem a síndrome (Isomaa et al., 2001). Os dados de prevalência mundial da síndrome metabólica são muito preocupantes, já que esta síndrome é precursora de diabetes e doenças cardiovasculares (Isomaa et al., 2001). Considerando que existam cerca de 200 milhões de pacientes diabéticos em todo o mundo e que 80% vão falecer devido a doenças cardiovasculares, há um enorme apelo médico e sócio-econômico para se identificar marcadores da síndrome metabólica que possam auxiliar no combate à progressão da atual epidemia (Diabetes atlas, 2003).
Quadro 1 – Doenças associadas à obesidade (modificado de Jung, 1997)
Cardiovasculares
Hipertensão Doença coronariana Acidente vascular cerebral Veias varicosas
Trombose venosa profunda
Região Torácica
Câncer de mama Ginecomastia
Respiratórias
Falta de ar
Apnéia durante o sono Síndrome da
hipoventilação
Útero Câncer endometrial Câncer cervical
Gastrointestinais
Hérnia de hiato
Cálculo na vesícula biliar Cirrose e Esteatose hepática
Hemorróida Câncer colorretal
Urológico Câncer de próstata Incontinência urinária
Metabólicas Hiperlipidemia Resistência à insulina
Diabetes Mellitus Pele
Micoses Linfedemas Celulites Acantose
Neurológica Bloqueio Nervoso Endócrinas
Redução na resposta à prolactina
Aumento do cortisol livre na urina
Hiperandrogenismo Síndrome do ovário policístico
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1.3. Adipocitocinas
Os adipócitos produzem uma variedade de moléculas biologicamente ativas conhecidas como: adipocitocinas ou adipocinas (Furukawa et al., 2004). Alguns estudos mostram que a produção desregulada das adipocitocinas “ofensivas” como o PAI-1 (Plasminogen Activator Inhibitor 1) (Shimomura et al., 1996), TNF-α (Fator Alfa da
Necrose Tumoral) (Hotamisligil et al. 1993; Uysal et al., 1997), IL-6 (Interleucina 6) (Fried et al., 1998), MCP-1 (Monocyte Chemotactic Protein-1) (Sartipy e Loskutoff, 2003) e angiotensina (Hainault et al., 2002), e as adipocitocinas “defensivas”, como a adiponectina (Berg et al., 2002; Tsao et al., 2002; Matsuzawa et al., 2004) e leptina (Friedman e Halaas, 1998; Faroogi et al. 2001; Unger, 2003), estão envolvidas na patogenicidade da síndrome metabólica. Algumas destas, além de exercer sua atividade pró-inflamatória também poderiam afetar a ação da insulina. O TNF-α, por exemplo, inibe a fosforilação da
tirosina-kinase do receptor da insulina, resultando em defeitos na sinalização da insulina que conseqüentemente levará à resistência à insulina afetando o transporte de glicose (Feistein et al., 1993). Além disso, o TNF-α ativa a transcrição do fator nuclear κB (nuclear factor),
que orquestra uma série de alterações inflamatórias promovendo a transcrição de outros genes envolvidos com o processo inflamatório tais como a COX-2 (ciclooginase) e iNOS, (forma induzível de óxidi nítrico) por exemplo (Bayon et al., 2003).
No entanto, Furukawa et al. (2004) mostra uma relação direta entre o acúmulo de gordura nos adipócitos e o aumento do estresse oxidativo, mostrando que o aumento de ácido graxo armazenado nos adipócitos estimula a produção de espécies reativas de oxigênio (EROs) pela ativação da via NADPH oxidase, além de reduzir a produção de enzimas antioxidantes.
13
1.4. Balanço energético
A obesidade não é uma doença singular, e sim um grupo heterogêneo de condições com múltiplas causas que, em última análise, refletem no fenótipo obeso (Jebb, 1999). O balanço energético positivo, que ocorre quando o valor calórico ingerido é superior ao gasto, é um fator importante para o desenvolvimento da obesidade, promovendo aumento nos estoques de energia e peso corporal. O início da manutenção de um balanço calórico positivo relativo às necessidades do organismo pode ser conseqüência tanto de aumento na ingestão calórica, como redução do total calórico gasto, ou os dois fatores combinados (Pereira et al., 1999a). Estudos realizados por Freitas et al., (1998) indicam a alta incidência de sedentarismo na população obesa. Além disto, o processo de modernização e transição econômica observado na maioria dos países tem promovido alterações na industrialização da produção alimentícia, que colabora para o consumo de dietas ricas em proteína e gordura e baixa em carboidratos complexos (Mahan e Escott-Stump, 1998).
14 A tendência secular no aumento da obesidade parece ocorrer paralelamente à redução na prática de atividade física e aumento do sedentarismo (Martinez, 2000). O hábito da prática de atividade física é influenciado na criança pelos pais, e quando desenvolvidos nesta fase, tendem a se manter do mesmo modo até a fase adulta (Strauss, 1999). Além disso, uma redução natural no gasto energético é observada com a modernização, ocasionando estilo de vida mais sedentário com transporte motorizado, equipamentos mecanizados que diminuem o esforço físico de homens e mulheres tanto no trabalho como em casa (WHO, 1998). Já foi demonstrada uma redução de aproximadamente 600 kcal com a diminuição do tempo despendido com brincadeiras de rua e o aumento do tempo assistindo televisão; do mesmo modo, cortar grama com as mãos gastava aproximadamente 500 kcal/h, enquanto que a utilização de cortadores elétricos de grama diminuiu para 180 kcal/h; lavar as roupas no tanque consumia aproximadamente 1500 kcal/dia enquanto usar a máquina de lavar requer apenas 270 kcal/2h para a mesma quantidade de roupas (Martinez, 2000). De fato, poucas atividades hoje em dia são classificadas como muito ativas, enquanto há algumas décadas atrás, várias atividades tinham esta característica (WHO, 1998). No entanto, é muito difícil estabelecer uma relação de causa e efeito entre o IMC e o grau de atividade física, mas sabe-se que a redução na atividade física diária afeta direta e indiretamente, através da taxa metabólica basal (TMB), o gasto energético diário do indivíduo. Os três principais componentes do gasto energético diário são: TMB, o efeito térmico dos alimentos (ETA) e a prática de atividade física (AT) (Schutz, 1995). Vários autores já demonstraram relação inversa entre TMB e IMC em animais (Yoshioka et al., 1992) e entre redução da TMB e aumento de peso corporal em humanos (Albu, 1997; Weinsier et al., 1998).
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1.5. Modelos experimentais de obesidade
O estudo da obesidade em humanos provavelmente responderia muitas dúvidas correntes neste tópico. No entanto, pesquisas com humanos têm óbvias limitações éticas e financeiras, além de estudo em animais permitir grande quantidade de pesquisas e resultados. Além disto, animais de laboratório podem ser mantidos em condições rigidamente controladas consumindo dieta controlada e mantidos livres de patógenos e germes. O fato de animais de laboratório também se tornarem obesos espontaneamente, alimentando-se de ração comercial, ou através de outras manipulações, abriu novas áreas para a pesquisa na área da obesidade. Mesmo que estes modelos animais não possam ser considerados exatamente os modelos de obesidade em humanos, eles ainda são de grande valor no estudo das condições bioquímicas, fisiológicas e patológicas necessárias para o acúmulo excessivo de adiposidade. Nos últimos 20 anos, aumentou muito o conhecimento sobre diversos fatores que contribuem para o desenvolvimento da obesidade, e as conseqüências endócrinas e metabólicas desta doença. Muito deste conhecimento foi derivado de estudos em modelos de obesidade animal. Estudos sobre as causas e tratamentos da obesidade têm sido desenvolvidos em animais que apresentam esta característica através de lesão neural, alterações endócrinas, anormalidades genéticas e alterações alimentares (Sclafani e Springer, 1976).
1.6. Compostos Fenólicos
Os compostos fenólicos estão amplamente distribuídos no reino vegetal, sendo conhecida atualmente mais de 8.000 estruturas. São metabólitos secundários de plantas, que possuem um anel aromático com um ou mais substituintes hidroxílicos, incluindo seus grupos funcionais. Tais substâncias ocorrem naturalmente em frutas frescas, vegetais, nos chás e nos vinhos tintos e fazem parte integral da dieta humana (Manach et al., 2004).
16 e a extensão da absorção e a natureza dos metabólitos circulantes no plasma (Scalbert & Williamson, 2000). A medida direta da concentração destes compostos na circulação e urina e o aumento da capacidade antioxidante do plasma após sua ingestão, podem fornecer evidências de sua absorção no trato gastrointestinal (Manach et al., 2004).
Após a ingestão, os fenólicos são conjugados no intestino delgado e mais tarde no fígado. Aparecem no plasma de uma a sete horas após sua ingestão, geralmente conjugados com ácido glucurônico ou como compostos sulfatados e metilados (Manach et al., 2004; Nardini et al., 2002; Scalbert et al., 2005).
Acredita-se que a biodisponibilidade e atividade biológica dos polifenóis estejam diretamente relacionada com sua estrutura química e, além disso, exista uma variabilidade individual sobre o metabolismo e biodistribuição desses compostos em humanos (Monteiro et al., 2007).
Os polifenóis têm sido objeto de estudo de muitas pesquisas por estarem associados à prevenção de doenças crônico-degenerativas, como aterosclerose e câncer. A bioatividade dos fenólicos pode estar relacionada com potencial antioxidante, que é associada à própria natureza química deste grupo de compostos: devido à sua estrutura, polifenóis são em geral bons agentes redutores e, juntamente com outros agentes redutores encontrados na dieta tais como vitamina C, vitamina E e carotenóides, podem proteger tecidos e estruturas celulares contra danos oxidativos (Vinson e Dabbag, 1998). Tais substâncias são capazes de inibir a oxidação de diversos substratos através da captação de radicais livres, bloqueando reações em cadeia e algumas vezes agindo como quelantes de metais (Shahidi & Wanasundara, 1992), atuando tanto na etapa de iniciação como na de propagação do processo oxidativo. Os produtos intermediários, formados pela ação destes antioxidantes, são relativamente estáveis devido à ressonância do anel aromático apresentada por estas substâncias (Soares, 2002). Além do potencial antioxidante, os fenólicos possuem outras propriedades, dentre elas, atividade antiinflamatória, anti-agregação plaquetária, diurética, antiviral e anticarcinogênica, sendo também benéficos ao sistema cardiovascular por sua participação na vasodilatação (Rice-Evans et al., 1996; Neiva et al., 1999).
17 apresentam a estrutura química descrita como C 6-C 3-C 6, sendo estes os compostos mais diversificados no reino vegetal. Podem ser representados pelas antocianinas, flavonas, flavonóis, catequinas, taninos e isoflavonas. A distribuição dos flavonóides nos vegetais depende de diversos fatores de acordo com a fila/ordem/família do vegetal, bem como da variação das espécies. Os flavonóides são formados da combinação de derivados sintetizados da fenilalanina (via metabólica do ácido chiquímico) e ácido acético. Os padrões de distribuição dependem do grau de acesso à luminosidade, especialmente raios ultravioletas, pois a formação dos flavonóides é acelerada pela luz (Degáspari e Waszczynskyj, 2004).
Os flavonóides atuam como antioxidantes na inativação dos radicais livres, em ambos os compartimentos celulares lipofílico e hidrofílico. Esses compostos têm a capacidade de doar átomos de hidrogênio e, portanto, inibir as reações em cadeia provocadas pelos radicais livres (Bianchi e Antunes, 1999). Os ácidos fenólicos caracterizam-se por terem um anel benzênico, um grupamento carboxílico e um ou mais grupamentos de hidroxila e/ou metoxila na molécula, conferindo propriedades antioxidantes tanto para os alimentos como para o organismo, sendo, por isso, indicados para o tratamento e prevenção do câncer, de doenças cardiovasculares e de outras doenças (Manach et al., 2004).
Os ácidos fenólicos podem ser divididos em três grupos. O primeiro é composto pelos ácidos benzóicos, que possuem sete átomos de carbono (C6-C1) e são os ácidos fenólicos mais simples encontrados na natureza. O segundo é formado pelos ácidos cinâmicos, que possuem nove átomos de carbono (C6-C3). O terceiro grupo é representado pelos ácidos fenólicos que, além de se apresentarem sob sua forma natural, podem também se ligar entre si ou com outros compostos. A combinação mais importante destes ácidos ocorre com o ácido caféico, o qual, associado a um álcool-ácido cíclico, denominado álcool-ácido quínico, origina o álcool-ácido clorogênico (Soares, 2002).
18 décadas, os efeitos protetores do ácido clorogênico (ACG) sobre os sistemas biológicos foram abordados em diferentes estudos in vitro e in vivo. Há diversos estudos que
avaliaram produtos ricos em ACG na prevenção do câncer e doenças cardiovasculares, entre outras (Waterman e Mole, 1994; Bravo, 1998; Karakayas, 2001; Soares, 2002; Mancine-Filho e Moreira, 2003; Giada e Mancine-Filho, 2004). Alguns autores verificaram seu efeito antioxidante na diminuição da oxidação in vitro de L.D.L., sendo
comparado ao poder encontrado para a Vitamina E, C e ß-Caroteno (Laranjinha et al., 1994; Vinson e Dabbagh, 1998). Essa ação antioxidante é devida à presença de um grupamento orto-di-hidroxila no anel aromático do ácido caféico, que atuaria como um aceptor de radicais livres, participando na fase de iniciação e de propagação do processo oxidativo (Monteiro e Trugo, 2005). Em outro trabalho, foi relatado que o 5-CQA apresentou propriedades anti-inflamatórias devido a sua capacidade de inibição do processo inflamatório mediado por citocinas (Tatefuji et al., 1996). No estudo conduzido por Parker et al. (1998) e Herling et al., (1999) observou-se uma diminuição dos níveis sanguíneos de glicose, por meio da inibição da enzima glicose-6-fosfatase após uso de injeções de ACG. Essa variedade de efeitos benéficos atribuídos ao ACG, preponderantemente ao 5-CQA, tem encorajado muitos pesquisadores a trabalhar com essa família de compostos fenólicos (Clifford e Ramirez-Martinez, 1990; Gugliucci e Menini, 2002; Nardine et al., 2002; Olthoff et al., 2003; Bastos et al., 2005).
1.7. Erva-mate - Ilex paraguariensis
A Ilex paraguariensis é uma árvore da família das aqüifoliáceas, originária da
19 como chá quente ou gelado, como chimarrão (Brasil) ou tererê (Mato Grosso do Sul e Paraguai) (Esmelindro et al., 2002; Bastos e Torres, 2003).
A Ilex paraguariensis é utilizada na medicina popular e por herboristas, sendo
recomendada para artrite, dor de cabeça, constipação, reumatismo, hemorróidas, obesidade, fadiga, retenção de líquido, hipertensão, digestão lenta e desordens hepáticas. Devido a estas propriedades, a erva-mate encontra-se inclusa em importantes farmacopéias como a Martingdale e a British Herbal Pharmacopoeia (Anesini et al., 2006).
Os principais fitoquímicos presentes na erva-mate são os compostos fenólicos, as saponinas e as metilxantinas. Nesta última classe de compostos podemos citar a cafeína, a teobromina e a teofilina (Alikaridis, 1987), componentes de reconhecida ação sobre o sistema nervoso central, aos quais é atribuída a ação estimulante do mate. Dentre a classe de saponinas encontram-se as agliconas, os ácidos ursólico e oleanólico (Gnoatto et al., 2007). Tais substâncias são responsáveis pelo amargor e espuma do mate e pela atividade antiinflamatória além de outras inúmeras propriedades biológicas (Gnoatto et al., 2007). Entre os compostos fenólicos destaca-se o elevado conteúdo de derivados cafeoilquínicos, como o ACG e seus isômeros, aos quais se atribui a ação adstringente e antioxidante do produto (Clifford, 1990; Cardozo-Junior et al., 2007). Além do ACG, os flavonóides rutina, quercetina, diglicosídeo de luteolina, taninos e a cafeoilglicose também estão presentes no extrato aquoso de Ilex paraguariensis (Ricco et al., 1991; Carini et al., 1998; Filip et al., 2001).
1.8. Principais produtos comerciais
Chimarrão e Tererê
20 realizado junto ao fogo direto e consiste na passagem rápida dos ramos com folhas sobre as chamas do sapecador. O equipamento consiste de um cilindro metálico, perfurado e inclinado através do qual a erva colhida passa recebendo as chamas. Esta etapa tem por função a retirada da umidade superficial e inativação de enzimas (peroxidase e polifenoloxidase) que causam a oxidação do produto. A temperatura média da erva na entrada do sapecador é de 400°C e na saída é de 65°C. O tempo de residência oscila em torno de 8 minutos. O tempo de residência e a temperatura média da erva nos secadores dependem das características operacionais de cada sistema. No secador de esteira, o tempo médio é de 3 horas e a temperatura varia entre 90 e 110°C. No secador rotativo, o produto permanece em contato direto com a fumaça por aproximadamente 30 minutos. No entanto, a temperatura não apresenta a mesma uniformidade da utilizada no secador de esteira, sendo que na entrada do secador a temperatura média é de 350°C e na saída 110°C. O cancheamento consiste na trituração da erva após o processo de secagem. Em seguida, a erva é peneirada e o material coletado passa a denominar-se erva cancheada. Esta pode ser usada diretamente como matéria-prima para a produção de chás ou, após passar por um processo de soque, de chimarrão (Esmelindro et al., 2002; Bastos e Torres, 2003; Embrapa, 2006).
Chá mate tostado
A erva-mate padronizada para preparação do chá mate tostado é um produto beneficiado constituído somente de folhas ou de folhas e de galhos, triturados e tostados em equipamentos apropriados. A erva-mate passa por um sistema de forno com fogo indireto semelhante ao que se usa para torrefação de café, para então dar origem ao chá mate tostado. Depois de tostado, o mate passa por um processo de extração, por água quente e vapor sob pressão, em colunas extratoras, onde são retirados os sólidos solúveis. O líquido extraído (extrato) é adoçado transformando-se em xarope. O extrato é desidratado em contato com ar quente transformando-se em mate solúvel (Bastos e Torres, 2003; Embrapa, 2006).
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1.9. Propriedades funcionais da Erva-mate
O interesse no potencial uso da erva-mate para a promoção de saúde é relativamente recente. Em meados da década de 90 foram publicados os primeiros trabalhos que demonstraram a atividade antioxidante in vitro e in vivo de infusões de
erva-mate verde e seca (chimarrão) (Glugliucci, 1996; Glugliucci e Stahl, 1995; Campos et al., 1996). Filip et al. (2000) e Filip et al. (2001) observaram um maior potencial antioxidante da erva-mate quando comparada a diferentes espécies de Ilex
consumidas na América do sul. No estudo realizado por Bastos et al. (2007), os extratos de erva-mate tanto verde quanto tostada apresentaram atividade antioxidante
in vitro superior à do chá verde (Camellia sinesis). Em outra pesquisa verificou-se
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2.OBJETIVOS
OBJETIVO GERAL
O objetivo deste estudo é avaliar a atividade biológica da infusão de erva mate tostada.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Após conduzir ensaio em que camundongos (obesos e não obesos) consomem chá mate em duas diferentes concentrações:
Avaliar a possível reversão da resistência a insulina induzida pela obesidade através do Teste de Tolerância a Insulina (TTI);
Avaliar o perfil lipídico por meio dos níveis de colesterol e frações (HDL, LDL) e níveis de triacilgliceróis;
Determinar as concentrações das enzimas hepáticas aspartato (AST) e alanina (ALT) amino transferases;
Avaliar a capacidade quimioprotetora do D.N.A. das duas concentrações através do ensaio cometa em linfócitos;
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3. MATERIAISEMÉTODOS
3.1. Material vegetal
A erva-mate tostada solúvel foi doada pela empresa Leão Jr. Curitiba, Paraná. Um único lote foi utilizado para todo o experimento. O teor de fenólicos do chá utilizado foi determinado pelo método de folin, sendo 350mg/g.
3.2. Preparo dos extratos aquosos
Os experimentos foram realizados com erva-mate solubilizada em solução fisiológica nas concentrações de 1,0 g.kg-1 e 2,0 g.kg-1, administrando-se o mesmo volume de extrato nas duas concentrações.
3.3. Animais
Foram utilizados camundongos Swiss, machos, com peso variando entre 20 e 25 g e
idade média de três meses provenientes do CEMIB (Centro de Bioterismo da UNICAMP). Todos os animais ficaram alojados no Biotério do Laboratório de Biologia Molecular e Imunofarmacologia da UNIFAG/USF e passaram por um período de adaptação às condições ambientais durante uma semana. Os animais foram mantidos em um período claro/escuro de 12 horas, temperatura 22°C ±3 e de umidade 55% ± 3, com livre acesso a
água e ração. Estes foram distribuídos em grupos experimentais de acordo com o tratamento e dose utilizada.
3.4. Modelo de obesidade induzida por dieta
O modelo experimental que mais se assemelha a grande parte da obesidade humana é o modelo de obesidade exógena, onde é oferecido ao animal um maior aporte calórico através de uma sobrecarga de carboidratos ou gordura, isoladamente ou em associações. O
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Quadro 2 – Dietas utilizadas no trabalho.
Dieta Padrão Dieta Hiperlipídica
g.kg-¹ kcal.kg-¹ g.kg-¹ kcal.kg-¹
Amido de milho 397.5 1590 115.5 462
Caseína 200 800 200 800
Sacarose 100 400 100 400
Amido dextrinado 132 528 132 528
Banha de porco - - 312 2808
Óleo de Soja 70 630 40 360
Celulose 50 - 50 -
Minerais 35 - 35 -
Vitaminas 10 - 10 -
L-Cistina 3 - 3 -
Colina 2.5 - 2.5 -
Total 1000 3948 1000 5358
3.5. Desenho do experimento
Inicialmente os animais foram divididos em dois grupos: um deles alimentados com a dieta padrão (DP), e o outro com dieta hiperlipídica (DH) por oito semanas. Depois destas oito semanas os animais foram subdivididos aleatoriamente de acordo com a dieta e a intervenção escolhida. A intervenção consistiu na administração de uma dose diária de água ou de mate (1,0 g.kg-1 e 2,0 g.kg-1) durante mais 8 semanas (Quadro 3). A administração das substâncias foi realizada com auxílio de uma cânula orogástrica que garantiu a ingestão.
25
Quadro 3 – Grupos experimentais.
Grupos Dieta Dieta Intervenção
8 Sem. 8 Semanas N°. animais
Grupo I DP DP Água 10
Grupo II DP DP Mate 1g.kg-¹ 10
Grupo III DP DP Mate 2g.kg-¹ 10
Grupo IV DH DH Água 10
Grupo V DH DH Mate 1g.kg-¹ 10
Grupo VI DH DH Mate 2g.kg-¹ 10
Grupo VII DH DP Água 10
Grupo VIII DH DP Mate 1g.kg-¹ 10
Grupo IX DH DP Mate 2g.kg-¹ 10
3.6. Testes bioquímicos
26
3.7. Teste de Tolerância a Insulina (T.T.I)
Após 12 horas de jejum, os animais foram anestesiados com uma injeção intraperitoneal (I.P) de ketamina/xilazina (1:1 v/v) e as amostras sanguíneas foram obtidas da artéria caudal. Após a coleta da glicemia basal com auxílio de um glicosímetro, foi administrado insulina (1.5 U/kg) por injeção I.P, e coletadas as amostras após 0, 10, 15, 20 e 30 minutos para determinação dos níveis séricos de glicose. A constante da curva glicêmica (KITT) foi obtida após as coletas realizadas, utilizando-se a formula 0.693/t1/2 (Bonora et al., 1987).
3.8. Ganho de peso e crescimento
A ingestão e o peso dos animais foram monitorados durante todo o experimento, para avaliar a curva de ganho de peso e crescimento.
3.9. Determinação da atividade antioxidante – Ensaio cometa
Após o sacrifício dos animais, o sangue foi isolado e congelado apropriadamente em freezer -80°C para a determinação dos danos oxidativos ao D.N.A..
A avaliação dos danos oxidativos ao D.N.A. de linfócitos foi feita por meio do ensaio cometa (comet assay). Através desta técnica foi possível detectar danos no D.N.A.
em linfócitos. A análise de danos foi feita de acordo com o Pool-Zobel et al. (1994). Resumidamente, 1,5 ml de sangue foram postos cuidadosamente sobre 1,5 ml de HISTOPAQUE -1077 (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) e centrifugados a 400 g a 20ºC por
30 min. Após descartar o plasma os linfócitos foram transferidos para um novo tubo, lavados com 4 ml de solução de Hank’s (HBSS, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) e centrifugados 100 g a 20ºC por 15 min. Descartado o sobrenadante, as amostras foram
ressuspendidas em 500 µl de Hank’s.
27 A fim de avaliar o possível efeito protetor contra danos oxidativos ao D.N.A., 200
µl da suspensão celular foi tratada com peróxido de hidrogênio (H2O2) 100 µM a 4ºC por 30 min.
A versão alcalina do ensaio do cometa foi realizada de acordo com Singh et al.
(1988). Em suma, 10 µl da suspensão celular previamente obtida foram misturados à
agarose low melting point (baixo ponto de fusão) 0.5 % (Promega), postos sobre uma
lâmina e cobertos com uma lamínula. Estas foram imersas em uma solução de lise gelada (2,5 M NaCl, 100 mM EDTA, 10mM Tris, 1% SDS, pH 10 com 1% Triton X-100 e 10% DMSO) e permaneceram a 4ºC durante a noite. Este procedimento removeu o citoplasma e a maior parte das proteínas nucleares, deixando o D.N.A. super-helicoidizado em um formato nucleóide. A presença de quebras no D.N.A. relaxa a espiralização do D.N.A. e a subseqüente eletroforese alcalina relaxa ainda mais as alças do D.N.A., que ficaram, após a eletroforese, com o aspecto de um cometa. O tamanho da cauda de cometa reflete a extensão das rupturas das hélices de D.N.A., e pode ser quantificado por métodos de intensificação de imagem e análise computacional.
Após a lise, as lâminas foram expostas a um tampão alcalino (1 mM EDTA e 300 mM NaOH, pH~13,4) por 40 min a 4ºC. A eletroforese foi realizada neste tampão a 4ºC por 30 min a 25V e 300 mA. Após a corrida as lâminas foram neutralizadas (0,4 M Tris, pH 7,5), coradas com SYBR Safe (Invitrogen) e analisadas com um microscópio de
fluorescência. Cem células foram aleatoriamente selecionadas (50 de cada réplica) e analisadas usando o programa de computador Komet 5.5 (Kinetic Imaging, USA).
3.10. Análise estatística
28
4. RESULTADOS
4.1. Modelo experimental de obesidade
Após 8 semanas consumindo a DH os animais apresentaram uma alteração significativa no peso corpóreo, glicemia basal e resistência à insulina quando comparados aos animais do grupo controle. Além disso, observou-se também que os níveis de colesterol, triglicérides, LDL colesterol, bem como as concentrações das enzimas ASL e ALT foram significativamente mais elevadas nos animais tratados por oito semanas com DH (Tabela 1). Nesta etapa do projeto fomos capazes de implementar, com sucesso, o modelo de obesidade induzida por dieta hiperlipídica. Os nossos resultados indicam que a dieta aumentou significativamente o peso dos animais e, além disso, os animais obesos apresentavam resistência a insulina e alterações nos diversos parâmetros bioquímicos avaliados. Tais alterações são compatíveis com resultados descritos anteriormente e mimetizam as alterações que a obesidade gera em seres humanos (Araújo et al., 2007).
4.2. Intervenção com Ilex paraguariensis e peso e parâmetros bioquímicos
O peso dos animais bem como os resultados dos testes bioquímicos obtidos após a intervenção com erva-mate acham-se descritos na Tabela 2. Em relação aos animais que receberam a DH durante todo o experimento (GIV, GV e GVI), os resultados do presente trabalho indicam que a intervenção, em ambas as concentrações testadas, alterou algumas variáveis estudadas. Os dados obtidos mostram que o consumo de erva mate a 1,0 g.Kg-1 e 2,0 g.Kg-1 levaram a uma redução significativa no peso corpóreo total dos camundongos, na glicemia basal e resistência à insulina. Além disso, os resultados obtidos indicam uma diminuição significativa nos níveis de colesterol, triglicérides e LDL colesterol. Ao dosarmos as concentrações das enzimas hepáticas os dados deste trabalho indicam que após a intervenção houve uma redução significativa nos níveis de AST. (Tabela 2).
29 em algumas variáveis estudadas (peso corpóreo, glicemia basal, colesterol, triglicérides e LDL colesterol) em todos os grupos (Tabela 2).
Tabela 1 – Obesidade induzida por dieta após 8 semanas: parâmetros clínicos e bioquímicos. Dieta Padrão Dieta Hiperlipídica
Peso Corpóreo (g) 38,00 ± 1,39 51,81 ± 4,37*
Glicemia Basal (mg/dL) 144,37 ± 36,78 264,00 ± 24,48*
KITT 2,64 + 0,20 1,33 + 0,18*
CHOL (mg/dL) 86,37 ± 6,43 188,37 ± 9,54**
TG (mg/dL) 130,40 ± 3,61 178,73 ± 5,69*
HDL (mg/dL) 38,31 ± 3,06 48,54 ±4,58
LDL (mg/dL) 21,98 + 1,35 104,08 + 3.78**
AST (mg/dL) 79,38 ± 3,51 128,74 ± 6,11*
ALT (mg/dL) 49,61 ± 5,51 78,44 ± 9,29*
30
Tabela2–Parâmetros antropométricos e bioquímicos nos grupos estudados após 16 semanas.
Dieta Padrão Dieta Hiperlipídica Dieta Hiperlipídica/Padrão
GI
Água Mate 1g.Kg-¹GII Mate 2g.Kg-¹GIII Água GIV Mate 1g.Kg-¹ GV Mate 2g.Kg-¹ GVI GVII Água Mate 1g.Kg-¹ GVIII Mate 2g.Kg-¹GIX
Peso Corpóreo (g) 43 ± 1,41 41,5 ± 2,82 40,3 ± 2,82 54 ± 10,09* 50,08 ± 9,85# 51,91 ± 8,26# 47,60 ± 2,88* 42,80 ± 4,82@ 42,50 ± 3,70@
Glicemia Basal
(mg/dL) 154,67 ± 17,93 162 ± 13,45 149 ± 8,72
284,60 ± 24,48* 201,33 ± 30,24# 200,33 ± 25,79# 268,67 ± 41,05* 177,33 ± 13,01@ 197,00 ± 11,14@
KITT 2,75 + 0,20 ND ND 1,35 + 0,40* 2,42 ± 0,93# 2,07 ± 0,60# ND ND ND
CHOL (mg/dL) 88,67 ± 6,43 83 ± 7,81 88,33 ± 8,5 203,00 ± 9,54* 160,33 ± 7,02# 155,67 ± 14,29# 129,67 ± 4,04* 112,67 ± 7,57@ 115,33 ± 6,11@
TG (mg/dL) 132,00 ± 3,61 134,67 ± 6,51 138,67 ± 14,19 190,33 ± 5,69* 126,67 ± 8,96# 135,00 ± 8,89# 168,00 ± 4,58* 142,67 ± 5,86@ 139,67 ± 7,51@
HDL (mg/dL) 40,67 ± 3,06 38,67 ± 7,02 39 ± 3,61 52,00 ± 4,58 47,67 ± 6,03 53,33 ± 4,51 47,00 ± 2,00 40,33 ± 7,64 41,33 ± 2,89
LDL (mg/dL) 21,60 ± 8,23 17,39 ± 2,66 21,59 ± 8,63 112,93 ± 7,38* 87,32 ± 12,86# 75,34 ± 17,60# 49,07 ± 4,02* 43,80 ± 13,33 46,06 ± 3,01
AST (mg/dL) 82,33 ± 3,51 81,00 ± 4,36 81,33 ± 4,93 137,33 ± 6,11* 127,00 ± 7,00# 122,00 ± 9,85# 123,33 ± 8,33* 119,00 ± 8,89 119,00 ± 5,59
ALT (mg/dL) 53,67 ± 5,51 54,00 ± 10,82 57,67 ± 13,43 81,33 ± 9,29* 74,67 ± 6,03 69,67 ± 5,86 77,00 ± 6,24* 62,67 ± 3,51 53,67 ± 3,79
31 4.3. Determinação dos níveis de oxidação ao D.N.A. – Ensaio cometa
Os níveis de danos oxidativos ao D.N.A. de amostras oriundas dos linfócitos foram avaliados por meio do ensaio cometa. Além disso, a resistência do D.N.A. ao ataque induzido ex vivo por H2O2 foi avaliado como um indicador da capacidade
antioxidante.
Os dados referentes às análises do ensaio cometa (Tabela 3) mostram que somente os grupos submetidos à dieta hiperlipídica durante 16 semanas e que receberam a intervenção com erva-mate (GV e GVI) apresentaram uma redução significativa nos níveis de danos ao D.N.A. quando comparados ao grupo controle (GIV), independentemente da dose administrada. Além disso, nossos dados indicam que a erva mate não é genotóxica, pois os níveis de danos oxidativos ao D.N.A. (dos grupos submetidos a dieta padrão) após o período de intervenção apresentaram uma redução, não sendo porém estatisticamente significativa.
Em relação ao efeito protetor contra danos oxidativos ao D.N.A. induzidos por
H2O2 (Tabela 4) os resultados deste trabalho mostram que a intervenção foi capaz de
32
Tabela 3 – Efeito da intervenção com erva mate nos níveis de danos oxidativos ao
D.N.A..
Danos ao D.N.A.
DP
(T.M + D.P) (T.M + D.P)DH (T.M + D.P)DH/DP
Controle 2.00 + 0.54
G I 5.91 + 0.58G IV
4.21 + 0.32 G VII
Mate 1g.kg-¹ 1.66 + 0.24
G II 4.71 + 0.86*G V 3.88 + 0.61G VIII
Mate 2g.kg-¹ 1.45 + 0.27
G III 4.48 + 0.78*G VI
3.73 + 0.57 G IX
Os valores representam a media do tail moment (TM) de 100 células em unidades arbitrárias, * p < 0,05 quando comparados ao grupo controle.
Tabela 4 – Efeito da intervenção com erva mate nos níveis de danos oxidativos ao
D.N.A.
induzidos por H2O2.
Danos ao D.N.A. induzidos por 100 µµµµM de H2O2
DP
(T.M + D.P) (T.M + D.P)DH (T.M + D.P)DH/DP
Controle 3.82 + 1.37
G I 7.97 + 0.64G IV
5.31 + 0.63 G VII
Mate 1g.kg-¹ 3.67 + 1.28
G II 5.98 + 0.97*G V
4.81 + 0.78 G VIII
Mate 2g.kg-¹ 3.53 + 0.90
G III 5.92 + 0.81*G VI
4.73 + 0.89 G IX
33 5. DISCUSSÃO
A obesidade é considerada um dos maiores problemas de saúde pública na atualidade, principalmente devido a sua associação com o desenvolvimento de algumas doenças tais como: a hipertensão, dislipidemia, aterosclerose, resistência à insulina e diabetes tipo 2 (Guzik et al., 2006). A combinação de alguns desses fatores caracterizam a Síndrome Metabólica, que é caracterizada pela hiperinsulinemia e por diferentes intensidades de resistência à insulina, que explicam a relação entre várias anormalidades e a obesidade (Weisberg et al., 2006). Além disso, sugere-se que a metabólica estaria associada ao desenvolvimento da doença hepática gordurosa não alcoólica (DHGNA) (Mulhall et al., 2002). Esta engloba um amplo espectro de doenças que abrange desde a esteatose hepática simples sem sinais inflamatórios até manifestações mais severas como a esteatohepatite não alcoólica (EHNA) e a cirrose hepática (Angulo e Lindor, 2002). Normalmente pacientes com DHGNA apresentam um processo inflamatório, levando ao aumento das concentrações plasmáticas das enzimas hepáticas como a ALT e a AST. Desta forma, as enzimas AST e ALT são utilizadas como biomarcadores para identificação de possíveis doenças hepáticas, sendo que o aumento destas pode ser associada à obesidade e à síndrome metabólica (Clark e Diehl, 2003; Clarck et al., 2003).
O presente estudo demonstra que a intervenção por 8 semanas com extrato aquoso de erva mate em camundongos submetidos a uma dieta hiperlipídica proporciona uma redução significativa no peso corpóreo, glicemia basal, resistência à insulina, níveis de colesterol e triglicérides. Ao avaliarmos as enzimas hepáticas após intervenção, os dados deste trabalho indicam que houve uma redução significativa nos níveis de AST.
Os efeitos benéficos observados neste estudo após a intervenção devem-se provavelmente à presença de diversos compostos no extrato aquoso de Ilex
paraguariensis, dentre eles destacam-se: as xantinas, a cafeína, a teobromina, a
34 Em um trabalho realizado por Andersen e Fogh (2001) utilizando cápsulas contento uma mistura de erva mate, guaraná (Paullinia cupana) e damiana (Turnera
diffusa) ministrada a voluntários humanos, estes demonstraram um retardo no
esvaziamento gástrico. Tais dados sugerem que a presença de saponinas em alguns dos compostos poderia causar uma sensação de saciedade por um tempo maior, o que poderia ocasionar uma redução no consumo alimentar e conseqüentemente uma possível redução de peso corpóreo. Entretanto, no presente trabalho as alterações no peso corpóreo dos animais tratados com erva mate não podem ser atribuídas a uma possível inibição do apetite pois em nenhum dos grupos estudados houve alteração na quantidade de ração ingerida (Tabela 5).
Tabela 5 - Controle da ingestão alimentar após a intervenção com chá mate
Os valores representam a média e o desvio padrão dos grupos avaliados.
Além disso, alguns autores descrevem que as saponinas possuem ação sobre o metabolismo do colesterol e também na redução da absorção intestinal da gordura proveniente da dieta atuando principalmente na redução da ação da lipase pancreática (Kim et al., 1996). Esses dados poderiam justificar, em parte, as reduções observadas nos parâmetros lipídicos avaliados após intervenção com erva-mate. Outros autores relataram que os ácidos clorogênicos poderiam ter uma importante ação anti-obesidade devido a redução da glicemia pós prandial, do colesterol e triglicérides plasmáticos em ratos, redução na resistência à insulina e melhora no pool de minerais também em ratos
(Herling et al., 1999; Rodriguez de Sotillo e Hadley, 2002).
Uma das vias propostas pela qual o ácido clorogênico parece influenciar na glicemia é através da inibição da ação da glicose-6-fosfatase hepática. Esse sistema enzimático é responsável pela regulação homeostática da glicose sanguínea, atuando no passo final da gliconeogênese e da glicogenólise, originando a glicose livre que é exportada para a corrente sanguínea (Arion et al., 1998). Esse sistema enzimático é um fator significante nas elevadas taxas de produção hepática de glicose no diabetes (Arion et al., 1998). Estudos in vivo em modelos animais demonstraram que o ácido
Dieta Padrão Dieta Hiperlipídica Dieta Hiperlipídica/Padrão
Controle Mt 1g Mt 2g Controle Mt 1g Mt 2g Controle Mt 1g Mt 2g
Quantidade
ingerida (g) (±6.23)39.71
35 clorogênico é capaz de reduzir a glicemia através dessa via (Herling et al., 1999; Bassoli et al., 2008).
A obesidade leva a uma inflamação generalizada caracterizada pelo aumento na produção de citocinas inflamatórias. A presença de algumas citocinas pró-inflamatórias é importante para o estabelecimento do quadro de resistência à insulina, dentre elas destaca-se a interleucina-6 (IL-6). Sabe-se que aproximadamente um terço da IL-6 circulante provém do tecido adiposo em seres humanos (Mohamed-Ali et al., 1997) e que esta desempenha papel na redução da expressão do receptor de insulina-1 (IRS-1) (Papanicolaou et al., 1998; Pradhan et al., 2001) e do transportador de glicose-4 (GLUT-4) (Espósito et al., 1999; Fasshauer et al., 2003) no tecido muscular e hepático, sendo um fator preditivo para o desenvolvimento de diabetes tipo 2 (Zhang et al., 1994; Moore et al., 2004). Adicionalmente, alguns autores mostraram que o aumento nos níveis desta citocina estaria relacionado a uma redução na secreção da adiponectina, que é uma citocina diretamente relacionada à sensibilização a insulina (Espósito et al., 1999; Fasshauer et al., 2003).
Outra citocina importante é o fator de necrose tumoral alfa (TNF- ) que desempenha um papel regulador no acúmulo de gordura corporal e no transportador de glicose (GLUT-4) (Arner, 1995; Montague et al., 1998). Em indivíduos obesos, há uma forte correlação inversa entre os níveis de TNF- e o metabolismo da glicose (Winkler et al., 2003; Hsueh e Law, 2003). Este efeito ocorre em razão da supressão pelo TNF- da sinalização da insulina, reduzindo a fosforilação do IRS-1. Tal fato resulta na redução da síntese e translocação do GLUT-4 para a membrana, com conseqüente diminuição na captação de glicose pelas células mediada pela ação da insulina, levando a um quadro de hiperinsulinemia e em último estágio ao diabetes tipo 2 (Arner, 1995; Araújo et al., 2007).
36 30 kg/m2), houve correlação positiva entre níveis de TNF- e IMC, sugerindo a correlação entre níveis altos de TNF- e o acúmulo de tecido adiposo, principalmente em indivíduos obesos (Montague et al., 1998). Além disso, o TNF-α ativa a transcrição do fator nuclear Kappa B (NF-κB), que orquestra uma série de alterações inflamatórias promovendo a transcrição de outros genes envolvidos com o processo inflamatório tais como a COX-2 e iNOS, por exemplo (Bayon et al., 2003).
Outro mecanismo importante que corrobora os dados aqui apresentados refere-se à presença de cafeína na Ilex paraguariensis. Estudos em animais e estudos
epidemiológicos prospectivos sugerem que o consumo de cafeína pode reduzir o peso corpóreo e adiposidade, provavelmente pelo aumento da termogênese, oxidação lipídica e lipólise (Acheson, 2005; Westerterp-Plantenga et al., 2006). A cafeína aumenta a concentração circulante de epinefrina em humanos, acelerando desta forma o metabolismo e caracterizando seu efeito termogênico e na lipólise. Outro mecanismo proposto para a ação da cafeína na lipólise sugere que a cafeína pode inibir a fosfodiesterase. Esta enzima induz a degradação intracelular do AMP cíclico (cAMP), e sua inibição leva a um aumento na concentração de cAMP e subseqüentemente aumento da lipólise (Acheson, 2005).
As recentes descobertas sobre radicais livres estimularam o aparecimento de grande número de pesquisas sobre a ação de substâncias antioxidantes presentes naturalmente em alguns alimentos, as quais seriam capazes de agir como protetoras dos organismos vivos frente a esse processo de oxidação. Já foi relatada uma relação direta entre o aumento da obesidade, a redução na produção das enzimas antioxidantes e o aumento do estresse oxidativo, mostrando que o aumento de ácido graxo armazenados nos adipócitos estimula a produção de EROs pela ativação da via NADPH oxidase (Furukawa et al., 2004).
De maneira similar a produtos naturais ricos em compostos fenólicos e vitaminas antioxidantes, a atividade antioxidante de infusões de erva-mate tem sido objeto de estudos (Gugliucci, 1996; Filip et al., 2000; Schinella et al., 2000; Bracesco et al., 2003). Em todos os trabalhos, verificou-se a potente atividade antioxidante de infusões aquosas de erva-mate, tanto in vitro como in vivo. O mecanismo proposto relaciona-se
37 durante o processo de infusão (Gugliucci e Menini, 2002; Bastos et al., 2005; Ramirez-Mares et al., 2004).
A erva-mate pode ser considerada uma fonte de baixo custo de compostos com atividade antioxidante na dieta. No entanto a maioria das pesquisas foi realizada com a erva-mate verde e cancheada (Ilex paraguariensis) sendo escassos os trabalhos que
evidenciam se o processo de torrefação desta planta influencia na atividade antioxidante desta matéria prima.
Postula-se que agentes antioxidantes poderiam proteger o organismo contra o desenvolvimento de diversas doenças através da remoção dos EROs antes que estes tenham a chance de induzir danos ao D.N.A. (Ames, 1983). Tendo em vista que os linfócitos são excelentes marcadores das condições de saúde do corpo, vários trabalhos indicam a aplicabilidade em se avaliar os danos oxidativos ao D.N.A. nestas células (Oldham et al., 2002).
A fim de avaliar a ação protetora/antioxidante de compostos naturais e sintéticos, diversos trabalhos mostram que o ensaio cometa (comet assay, single-cell gel
electrophoreis) é um método simples, sensível e reprodutível para a avaliação de efeitos
antioxidantes in vivo e in vitro. Através desta metodologia é possível detectar quebras
em fitas simples e duplas e oxidação em bases do D.N.A. (Festa et al., 2001; Oldham et al., 2002; Porrini et al., 2005). De modo complementar, vários estudos têm avaliado os efeitos da indução de danos em D.N.A., por peróxido de hidrogênio (H2O2), para
verificar a capacidade que as células teriam em se proteger após o desafio com H2O2
(Festa et al., 2001; Shi et al., 2002).
38 Pesquisas atuais sugerem que esses metabólitos são absorvidos no trato gastrointestinal e estão biodisponíveis no plasma dentro de 0,5 a 4 horas depois de sua ingestão, cujo pico de absorção ocorre após 1h de consumo (Monteiro et al., 2007; Nardine et al., 2002).
Embora muitos trabalhos tenham sido publicados a respeito dos efeitos benéficos da erva-mate, alguns autores relatam uma associação positiva entre o seu consumo e um risco aumentado de câncer de bexiga e renal (Vassallo et al., 1985; de Stefani et al., 1990; de Stefani et al., 1998; de Stefani et al., 2007). Tal associação poderia ser atribuída a presença de alguns compostos carcinogênicos na constituição da erva-mate. Adicionalmente estudos experimentais mostraram que o ácido caféico teria um efeito carcinogênico na bexiga de camundongos (Hagiwara et al., 1991). Além disso, Fonseca et al. (2000) sugerem que a erva mate possua atividade mutagênica e clastogênica em cultura de células. Nossos dados, por outro lado, indicam que a erva mate não é genotóxica, pois os níveis de danos oxidativos ao D.N.A. dos animais submetidos à dieta padrão se mantiveram inalterados após o período de intervenção.
39 6. CONCLUSÃO
O presente trabalho demonstrou os seguintes efeitos benéficos da ingestão de erva mate por camundongos diante de um modelo de obesidade induzido por dieta:
Reversão do quadro de resistência a insulina;
Diminuição dos níveis de colesterol total, LDL colesterol e triglicérides;
Diminuição dos níveis da enzima aspartato amino transferases (AST);
Melhora da capacidade quimioprotetora do D.N.A. em linfócitos;
Melhora da capacidade de proteção celular após o desafio com peróxido de hidrogênio (H2O2).
Os resultados apresentados no presente trabalho demonstram que a erva-mate pode atuar por diferentes mecanismos: além de ocorrer diretamente, por meio da neutralização de espécies reativas, pode-se processar através de mecanismos indiretos como, por exemplo, a redução de peso que por sua vez leva a uma melhora no contexto geral do indivíduo obeso.
40
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