PROGRAMA DE APRIMORAMENTO
PROFISSIONAL
SECRETARIA DE ESTADO DA SAÚDE COORDENADORIA DE RECURSOS HUMANOS FUNDAÇÃO DO DESENVOLVIMENTO ADMINISTRATIVO -
FUNDAP
THAÍS HELENA ROSSATO SIQUEIRA
COMPARAÇÃO DE RESULTADOS SOROLÓGICOS E MOLECULARES PARA O DIAGNÓSTICO DA HEPATITE C EM PACIENTES ATENDIDOS NO HOSPITAL
DAS CLÍNICAS DA FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO- SÃO PAULO.
RIBEIRÃO PRETO 2015
PROFISSIONAL
SECRETARIA DE ESTADO DA SAÚDE COORDENADORIA DE RECURSOS HUMANOS FUNDAÇÃO DO DESENVOLVIMENTO ADMINISTRATIVO –
FUNDAP
THAÍS HELENA ROSSATO SIQUEIRA
COMPARAÇÃO DE RESULTADOS SOROLÓGICOS E MOLECULARES PARA O DIAGNÓSTICO DA HEPATITE C EM PACIENTES ATENDIDOS NO HOSPITAL
DAS CLÍNICAS DA FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO- SÃO PAULO.
Monografia apresentada ao Programa de Aprimoramento Profissional/CRH/SES-SP e FUNDAP, elaborada no Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo – USP/ Departamento de Apoio Médico.
Área: Imunologia Aplicada/ Sorologia
Orientador: Dr. Roberto Martinez
Supervisor Titular e Co- orientador: David Falango
RIBEIRÃO PRETO 2015
convencional ou eletrônico, para fins de estudo e pesquisa, desde que citada a fonte.
Catalogação da Publicação
Programa de Aprimoramento Profissional – FUNDAP.
Siqueira, Thais Helena Rossato.
Comparação de resultados sorológicos e moleculares para diagnóstico da Hepatite C em pacientes atendidos no Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto – SP.
Monografia apresentada ao Programa de Aprimoramento Profissional da FUNDAP, Programa de Imunologia Aplicada/ Sorologia.
Orientador: Prof. Dr. Roberto Martinez
Co-orientador e supervisor titular: David Falango
RESUMO
A infecção pelo vírus da Hepatite C (HCV) apresenta-se como um problema mundial de saúde pública. Estima-se que aproximadamente 2% - 3% da população mundial (cerca de 170 milhões de pessoas) seja infectada pelo vírus. A doença é geralmente assintomática e a evolução para a forma crônica depende de fatores de risco associados, como idade, sexo masculino, por exemplo. O diagnóstico precoce da infecção pelo HCV é de fundamental importância para a prevenção da progressão para as formas mais graves da doença, como cirrose e hepatocarcinoma. Geralmente, o diagnóstico laboratorial da infecção pelo HCV é realizado através de uma triagem sorológica inicial seguida por confirmação por testes moleculares em resultados positivos. Contudo, resultados falso-positivos podem ocorrer quando a prevalência da doença na população pesquisada é baixa, como ocorre com os doadores sanguíneos. Devido a esses resultados falso-positivos e falso-negativos deve-se confirmar o diagnóstico através da pesquisa do RNA viral por meio de técnicas moleculares, como a PCR (reação em cadeia da polimerase). Assim sendo, o intuito do trabalho foi comparar os resultados obtidos em sorologia para HCV através dos ensaios quimioluminescentes (ARCHITECT- ABBOTT ®) com os resultados confirmatórios de biologia molecular (ABBOTT® Real
Time HCV e COBAS AMPLICOR® HCV) dos pacientes atendidos no Hospital das
Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (HCRP-USP) no
período de 2006 a 2013.
A análise foi feita através de um estudo retrospectivo no banco de dados do HCRP, o qual proporcionou 1200 resultados sorológicos positivos para posterior avaliação. Os resultados obtidos ao final do trabalho contemplaram o objetivo desse estudo, uma vez que se observou maior freqüência de resultados discordantes entre a sorologia e a biologia molecular para HCV em títulos sorológicos mais baixos. Em conclusão, teste sorológico positivo para anticorpos anti- HCV com títulos baixos corresponde geralmente a falso-positivo quando se toma o teste molecular como referência.
LISTA DE TABELAS
TABELA PÁGINA
1- Frequência de resultados positivos e negativos no teste molecular por intervalo de título
LISTA DE FIGURAS
FIGURA PÁGINA 1- Processo de RT- PCR... 4
LISTA DE GRÁFICOS
GRÁFICO PÁGINA
SUMÁRIO
Assunto Página
1. INTRODUÇÃO... 1
1.1- Ensaios Quimioluminescentes... 4
1.2- Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)... 4
1.3- Ensaio COBAS® AMPLICOR HCV Test v.2.0... 5
1.4- Tratamento ... 6 2- JUSTIFICATIVA ... 7 3- OBJETIVO... 8 4- MATERIAIS E MÉTODOS... 9 4.1- Critérios de Inclusão ... 9 4.2- Análise de Dados ... 9 4.3- Ensaios Quimioluminescentes... 9 4.4- Testes moleculares... 10 4.5- Ensaios Qualitativos... 10 4.6- Ensaios Quantitativos... 11 5- RESULTADOS E DISCUSSÃO... 12 6- CONCLUSÃO... 14 7- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS... 15
1- INTRODUÇÃO
A infecção pelo vírus da Hepatite C (HCV) apresenta-se como um problema mundial de saúde pública. Estima-se que aproximadamente 2%- 3% da população mundial (cerca de 170 milhões de pessoas) seja infectada pelo vírus (ANTONELLI et al., 2008).Sabe-se que as regiões mais afetadas, segundo a Organização Mundial da Saúde, são Leste da Ásia e norte da África. No Brasil, até o ano de 2010 foram notificados 10.321 casos de hepatite C, sendo as regiões Sul (24,8%) e Sudeste (63,2%) com maior prevalência (BOLETIM EPIDEMIOLÓGICO DAS HEPATITES VIRAIS NO BRASIL, 2012). Segundo ANTONELLI et al a hepatite C é a principal causa de transplante hepático em países desenvolvidos e subdesenvolvidos, além de ser a doença hepática com
maiores índices de morbidade e mortalidade.
A infecção hepática decursa para a forma crônica na maioria dos portadores (cerca de75%) (SHORT GUIDE TO HEPATITIS C, 2013), desses, 25 % apresentam risco de desenvolver cirrose hepática, considerada a forma grave da doença (ANTONELLI et al., 2008). O desenvolvimento de hepatocarcinoma ocorre em cerca de 1%-4% dos que possuem cirrose estabelecida por um ano. A persistência de viremia após seis meses de infecção caracteriza a forma crônica (NARCISO- SCHIAVON et al., 2008), ou seja, pacientes que apresentam clareamento viral (carga viral indetectável) após este período são consideradoscurados.
A doença é geralmente assintomática e a evolução para a forma crônica depende de fatores de risco associados, como idade, sexo masculino, uso de álcool e co-infecção com o vírus da hepatite B principalmente (MASSERD et al., 2006). O vírus da hepatite C pertence à família Flaviviridae (KESLI et al., 2009), é do tipo RNA fita simples e possui cerca de 10.000 nucleotídeos e um envoltório nuclear com polaridade positiva (Suzuki et al., 2007). O vírus foi descoberto em 1989 por Choo et al., como sendo o principal causador da hepatite crônica ( HEPATITES VIRAIS O
BRASIL ESTÁ ATENTO, 2005).
O vírus da hepatite C é classificado em seis principais genótipos (designados de 1 a 6), diversos subtipos e cerca de 100 tipos diferentes de cepas. Os genótipos 1,2 e 3 têm distribuição mundial, entre os quais se encontram os genótipos 1a e 1b que são os mais frequentes, representando 60% das infecções no mundo. No Brasil, são
encontrados, principalmente os genótipos 1a, 1b, 2a, 2b e 3. Um estudo realizado por ALVES et al com pacientes portadores da hepatite crônica pelo vírus C na região Sul do Brasil demonstrou prevalência similar entre os genótipos 1 e 3. A transmissão do HCV se dá por exposição parenteral tendo como principais fontes de infecção o uso de drogas injetáveis e transfusão sanguínea (SHORT GUIDE TO HEPATITIS C, 2013). A transmissão por via sexual ou vertical é menos frequente quando comparada a hepatite B, ocorrendo somente quando há co-infecção com o HIV.
A prevalência de HCV em pacientes infectados com o HIV é cerca de 10 a 30%. As populações que apresentam maiores riscos a essa coinfecção são a de homens que fazem sexo com homens e usuários de drogas injetáveis, sendo que essa apresenta
prevalência de 75%. (SULKOWSKI, 2007).
A infecção pelo HIV exacerba os sinais clínicos da infecção pelo HCV, podendo piorar o prognóstico, aumentando o risco de progressão para cirrose e/ ou carcinoma hepatocelular. A coinfecção do HCV com o vírus da hepatite B apresenta riscos semelhantes à coinfecção HCV/HIV (PUOTI et al,2004). Estudos realizados na Europa e Estados Unidos demonstraram que as hepatopatias (cirrose, hepatocarcinoma e insuficiência hepática) têm se tornado importante causa de hospitalização e óbito entre os pacientes portadores do HIV (HEPATITES VIRAIS O
BRASIL ESTÁ ATENTO, 2005).
Atualmente, entre os doadores sanguíneos a prevalência de anti-HCV é de 1,6% nos Estados Unidos, 0,08% no Reino Unido e em países em desenvolvimento como o Brasil a prevalência chega a 2,6% (JANAINA et al.,2008). Estudos levantados até 1991 relataram que 5 a 15% dos indivíduos que receberam transfusão sanguínea
foram infectados com o HCV (ALTER, 1991).
No Brasil, os testes sorológicos de triagem nos bancos de sangue foram implantados em 1993 e até hoje vêm se aprimorando a fim de que se obtenha uma redução na quantidade de resultados falso-positivos (JANAINA et al.,2008). Geralmente, o diagnóstico laboratorial da infecção pelo HCV é realizado através de uma triagem sorológica (pesquisa de anticorpos anti- HCV) inicial seguida por confirmação por testes moleculares (HCV-RNA) em resultados positivosna primeira etapa. Os primeiros testes ELISA de primeira geração possuíam a fração antigênica c100-3 da região não estrutural NS4 do vírus, porém foram rapidamente abandonados devido à falta de sensibilidade e especificidade conferidas apenas por
essas frações. Os testes de segunda geração passaram a incorporar além da fração c100-3, as frações c33c(NS3) e C22-3 do core-estrutural. A figura 1 mostra a localização genômica das proteínas estruturais e não estruturais do vírus. Atualmente, já existem os testes ELISA de terceira geração que incorporam frações antigênicas melhoradas do core viral, NS3 e NS4 de genótipos diferentes melhorando a especificidade e sensibilidade para detecção qualitativa de anticorpos
anti-HCV (KESLI et al., 2009).
Os testes sorológicos mais utilizados atualmente são ELISA (“Enzyme-linkedimmunosorbentassay”) e Ensaios de micropartículas quimioluminescentes (CLIAs), este último apresenta especificidade e sensibilidade melhoradas quando comparado ao ELISA de terceira geração, contudo resultados falso-positivos podem ocorrer quando a prevalência da doença na população pesquisada é baixa, como ocorre com os doadores sanguíneos (PEREIRA et al.,2014).
Figura 1- Modelo Esquemático do Genoma do HCV (Adaptado de MARTINS, 2010).
1.1- Ensaios Quimioluminescentes
Os ensaios quimioluminescentes são uma variação do princípio do Imunoensaio enzimático (EIA). Esses ensaios de fase sólida, descritos pela primeira vez na década de 70, utilizam superfícies revestidas de antígeno e/ou anticorpos para analitos complementares (ENGVALL, 1971). Os ensaios EIAs mais utilizados no mercado são Abbott, Chicago e Illinois (SHULAMITH et al., 1996). Os resultados falso-negativos podem ocorrer em pacientes com baixa resposta imunológica, como os portadores do HIV ou ainda em pacientes transplantados. Devido a resultados positivos e falso-negativos deve-se confirmar o diagnóstico através da pesquisa do RNA viral por meio de técnicas de PCR (reação em cadeia da polimerase) convencional ou tempo real, ou ainda por técnicas Immunoblot (stripimmunoblotassay ou RIBA).
1.2- Reação em Cadeia da Polimersase (PCR)
A Reação em cadeia da Polimerase (PCR) é uma técnica de biologia molecular que consiste na amplificação “in vitro” de fragmentos de DNA. A técnica de PCR permite através de quantidades mínimas de material genético a obtenção de milhões de cópias de DNA de interesse em poucas horas. A PCR consiste na amplificação do DNA através de repetidos ciclos de: desnaturação (separação da fita dupla de DNA) anelamento (ligação de oligonucleotideos/ primers à seqüência complementar) e extensão da fita de DNA molde feita pela enzima termoestável TaqPolimerase. Esses ciclos da reação são determinados pela temperatura, a qual é alterada a cada ciclo
(MARTINS, 2010).
A metodologia analisada neste trabalho foi a RT- PCR a qual se baseia na obtenção do DNA através do RNA por meio da enzima transcriptase reversa (Figura 2) Essa enzima é capaz de converter RNA em cDNA ( DNA complementar) para que esse possa ser submetido a amplificação ( MARTINS, 2010).
Figura 2- Processo de RT- PCR
1.3- Ensaio COBAS® AMPLICOR HCV Test v.2.0
Este ensaio da ROCHE® permite, de forma simultânea, a transcrição reversa e amplificação do HCV-RNA-alvo e do RNA de um controle interno do HCV presente no ensaio. O reagente da mistura principal contém um par de iniciadores específicos para o RNA do HCV da amostra analisada e outro para o RNA do controle interno do HCV. A detecção de DNA amplificado é efetuada por meio de sondas específicas marcadas que permitem a
identificação independente do produto amplificado do HCV e do controle interno do HCV (LEE et al., 2000).
1.4- Tratamento
Atualmente, o tratamento para a infecção crônica pelo HCV consiste na administração da combinação de interferon alfa e ribavirina (FRIED et al., 2002). O efeito exato de ação dessas drogas não é conhecido com detalhes, porém é sabido que ambas as drogas possuem um importante efeito antiviral e imunomodulador. A resposta ao tratamento depende fundamentalmente do genótipo infectante, uma vez que diferenças mínimas de sequências entre genótipos influenciam a susceptibilidade a esses medicamentos. Ao término da terapia antiviral, é necessária a realização de um teste qualitativo para a avaliação da resposta virológica sustentada (RNA indetectável após seis meses de tratamento). Caso o resultado do exame qualitativo seja “indetectável”, o mesmo exame deverá ser repetido após 24 semanas para nova avaliação da resposta virológica sustentada (MARTINS, 2010).
2- JUSTIFICATIVA
A rotina diagnóstica de triagem da infecção pelo vírus da hepatite C baseia-se na detecção de anticorpos nos testes sorológicos. No entanto, estes testes não confirmam se o indivíduo está com infecção ativa (presente), visto que os anticorpos que são pesquisados não induzem imunidade (YOUNG et al., 1993; WOLFE et al., 1994). Ademais, como citado anteriormente, resultados sorológicos anti-HCV apresentam falsa-positividade quando aplicados em populações cuja prevalência da hepatite C é baixa. Por este motivo a detecção do RNA do HCV como método confirmatório é considerada padrão-ouro para diagnóstico e monitoramento terapêutico da infecção pelo HCV, segundo as diretrizes de consenso da Associação Européia para o Estudo do Fígado (European Association for the Study of Liver, 1999).
3- OBJETIVO
Comparar os resultados obtidos em sorologia para vírus da hepatite C com os resultados confirmatórios de biologia molecular (RNA). O intuito foi avaliar a proporção de resultados possivelmente falso-positivos obtidos nos testes sorológicos.
4- MATERIAIS E MÉTODOS
Realizamos estudo retrospectivo com dados obtidos de pacientes do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo (HCRP-USP). Os resultados foram selecionados através de uma triagem em banco de dados do Sistema de Informações Laboratoriais (‘’LIS“) do HCRP. Por se tratar de dados de origem secundária, os pacientes foram isentos do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE). Foram selecionados resultados sorológicos positivos para anti-HCV (Cut off igual ou superior a 1,0) entre os anos de 2006 e 2013 de pacientes do HCRP.
4.1- Critérios de inclusão
Pacientes submetidos à sorologia anti- HCV que possuíam, em algum momento, resultados de exame confirmatório (PCR Real Time). Em um total de 1200 pacientes, somente 700 foram incluídos neste estudo.
4.2- Análise de Dados
As amostras que possuíam resultados de biologia molecular (quantitativa ou qualitativa) foram segregadas em 14 intervalos de título sorológico que variam de 1,0 a 20,0. Os resultados foram analisados em forma de percentual e posteriormente plotados em tabelas e gráficos por meio do programa Microsoft Office Excel (versão 2007).
4.3- Ensaios Quimioluminescentes
O ensaio ARCHITECT® (ABBOTT) anti- HCV referido neste trabalho é um imunoensaio de dois passos para a detecção qualitativa de anticorpos contra o HCV em soro e plasma humanos (JONAS et al., 2005). A presença ou ausência desses anticorpos na amostra é determinada por comparação entre o sinal
quimioluminescente da reação e o sinal de corte estabelecido em calibração prévia, o qual é denominado Cut-Off e nesse caso é igual a 1,0. Os ensaios ARCHITECT® anti- HCV incorporam frações do core, frações antigênicas estruturais e não estruturais do vírus ( NS3 e NS4 ) (JONAS et al., 2005) possuindo especificidade ( 99,60%) e sensibilidade ( 99,10%) melhoradas, no entanto, como dito anteriormente, resultados falso-positivos podem ocorrer devido à baixa prevalência da doença na população estudada.
4.4- Testes moleculares
Os testes de amplificação de ácidos nucléicos denominados RNA-HCV (quantitativos ou qualitativos) são empregados em protocolos diagnósticos e de monitoramento terapêutico, além de sua utilização para caracterizar transmissão vertical e definir transmissão em casos de acidentes com materiais biológicos.
4.5- Ensaios Quantitativos
As diretrizes atuais para a administração e tratamento da hepatite C recomendam os testes quantitativos RNA-HCV antes do início da terapia anti-retroviral, durante e
depois (STRADER et al., 2004).
O ensaio quantitativo ABBOTT® Real time HCV referido neste trabalho como teste confirmatório, utiliza a tecnologia de RT-PCR ( reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa) combinada com a detecção fluorescente em tempo real homogêneo para a quantificação de RNA-HCV. A seleção de uma região conservada do genoma viral proporciona a detecção dos genótipos 1 a 6 (MYERS e
GELFAND, 1991).
O ciclo de amplificação, ao qual o sinal fluorescente é detectado, é proporcional ao log da concentração de RNA-HCV presente na amostra. É importante ressaltar que os resultados quantitativos neste trabalho foram analisados de forma qualitativa, pois consideramos apenas se eram positivos ou não.
4.6- Ensaios Qualitativos
O ensaio qualitativo COBAS AMPLICOR (HCV) da ROCHE® versão 2.0 foi utilizado pelo Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão da USP até o ano de 2012, sendo substituído posteriormente pelos ensaios ABBOTT® Real Time HCV.
Esse teste da ROCHE® é baseado na detecção qualitativa do HCV através da técnica de RT-PCR em amostra de soro ou plasma humanos.
5- RESULTADOS E DISCUSSÃO
Em um total de 1200 amostras com resultado positivo no teste anti-HCV, 500 amostras foram excluídas da análise, uma vez que possuíam apenas o resultado sorológico. Em um total de 700 amostras analisadas, 451 delas (64,41 %) obtiveram resultado positivo e 249 (35,7%) negativo para a pesquisa de HCV-RNA. Os resultados foram segregados em intervalos diferentes de titulo sorológico que variaram de 1,0 a 20,0. A tabela 1 mostra o total de amostras por intervalo, assim como a quantidade de resultados positivos e negativos obtidos em cada intervalo. O percentual de negatividade sinaliza que em títulos menores a quantidade de resultados discordantes (possivelmente falso-positivos) é maior. Assim, é possível observar que conforme o título aumenta, aumenta também a quantidade de resultados verdadeiros positivos, ou seja, o percentual de positividade é significativamente maior em intervalos de títulos maiores (a partir de 5,0) como observa- se no gráfico 1.
Tabela 1- Frequência de resultados positivos e negativos no teste molecular por intervalo de título sorológico
TOTAL DE AMOSTRAS POR INTERVALO DE TÍTULO SOROLÓGICO RESULTADOS POSITIVOS RESULTADOS NEGATIVOS TÍTULO 1,0-1,49 57 2 (3,5%) 55 (96,5%) 1,5-1,99 44 0 (0%) 44 (100%) 2,0-2,49 22 2 (9,09%) 20 (90,9%) 2,5-2,99 19 2 (10,5%) 17 (89,4%) 3,0-3,49 15 2 ( 13,3%) 13 (86,7 %) 3,5-3,99 14 4 (25,6%) 10 (71,4%) 4,0-4,99 18 4 (22,2%) 14 (77,7 %) 5,0-6,99 29 11(41,4%) 18 (62%) 7,0-8,99 34 26 (73,5%) 8 (23,5%) 9,0-10,99 53 34 (64,1%) 19 (35,8%) 11,0-12,99 84 68 (80,95%) 16 (19%) 13,0-14,99 146 140 (95,8%) 6 (4,1%) 15,0-16,99 103 98 (95,1%) 5 (4,85%) 17,0-20,0 62 60 (96,8%) 2 (3,22%)
Gráfico 1- Percentual de Positividade HCV- RNA por título sorológico
Em um estudo realizado por DUFOUR et al foi obtido um percentual de positividade de 11% em amostras que apresentaram títulos baixos, em contrapartida, 90% das amostras com altos títulos foram positivas para HCV- RNA. Estudos similares feitos por McHUTCHUSION et al. e PAWLOTSKY et al. também comprovam este efeito de falsa-reatividade presente em resultados sorológicos
para a pesquisa de anticorpos anti-HCV.
Assim sendo, os resultados obtidos nesse trabalho ratificam os resultados obtidos em estudos anteriores, realizados principalmente com doadores de sangue, população na qual se obtém maior prevalência de resultados falso-positivos, por ser composta em sua maioria por indivíduos saudáveis. No entanto, a hipótese de que são resultados falso- positivos não pôde ser confirmada neste trabalho, pois seria necessário um estudo mais aprofundado acerca das condições clínicas de cada paciente analisado, como por exemplo, se
são imunocomprometidos ou não.
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 TÍT U LO 1 -1,49 1,5 -1,99 2,0 -2,49 2,0 -2,99 3,0 -3,49 3,5 -3,99 4,0 -4,99 5,0 -6,99 7,0 -8,99 9,0 -10,99 11 ,0 -12 ,99 13,0 -14,99 15,0 -16,99 17,00 -20,00 PERCENTUAL DE POSITIVIDADE HCV-RNA
6- CONCLUSÃO
Observou-se maior freqüência de resultados discordantes entre a sorologia e a biologia molecular para HCV em títulos sorológicos mais baixos. Esses títulos baixos são sugestivos de falsa-positividade, uma vez que para se considerar a infecção pelo vírus da hepatite C, o mesmo deve ser detectado pelas técnicas moleculares como PCR em tempo real.
7- REFERÊNCIAS BIBLOGRÁFICAS
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