A meus. A meus e e. e e. meus

(1)

ao

(2)

A

meus

A meus

e

A

meus

e

A

e

(3)

A a

e

eu o cursava a

e

e,

o

com os

e

a meu A

a

o

e

E a os meus contribuíram

(4)

1 1.1 em 3 7 8 8 9

(5)

(6)

(7)

nos

9

(8)

como

e

(100%)

e

em no feocromocitoma ou (65%).

o

mesma de 2 ou 3 membros na presença e as outras com o momento a intestinal CMT isolado

(9)

16

o

e

as

a no exon 11 ( códon

e nas famílias com no exon 1 O ( códon 618,

portador da foi detectada uma mutação

Nas 17'=1\l~rn_<:,,!l no exon 11 formas 634, carcinoma ou 2 numa

(10)

(11)

occur

(CLA),

with in 2 or 3

or hyperparathyroídism.

mutations in the ret proto-oncogene, which

is

neuromas

a

cause MEN 2 and recent studies suggest a relationship between

(12)

were as

was 8, exon 16

(13)

(14)

(3) (6,9). A subtipos casos. O ou se a é ,,...,,..,.,.,.,.,,,. a hiperplasia (6,9). A (tabela 1 ), baseando-se na

nos indivíduos que

feocromocitoma e hiperparatireoidismo);

NEM

a

subdivida em é

a

nT<:>I~"'n clínica (4 '10'11): a) (1 ), componentes (2), que que

(15)

e

h N raras com (B, 16> _,no entanto estes _as (18) em menos mesma ou (8,10) 1 é um tumor as

c

uma adrenocorticotrófico prostaglandinas, e outras <16'19-23>. A é

o

mais importante na no pós

(16)

com a ou

em

(17)

1 -1 1

e

torv•r.rtrrii"\1"'11FI"IIYI~

e

menos em 4 2 ou 3 CMT é unilateral e surge

quinta ou sexta década de vida <8>. As manifestações

linfadenomegalia cervical ou outros cervicais locais,

aparecimento de ou doença metastática <8l.

(8)

na ou massa raro o

o

é usualmente multifocal e bilateral, em torno da

no NEM e CMTF e precocemente no NEM

ou quarta década infância ser observados neuromas) (8 '15'17>. freqüentemente o CMTé

ponto de vista anatômico, a forma hereditária

superior e médio de cada lobo tireoidiano <8>

e

encapsulado e na microscopia,

sob aspecto de uma rede de células neoplásicas uniformes, podendo observar-se a

presença de amilóide e de calcificações (8>. Os padrões de crescimento tumoral mais

comumente encontrado são o trabecular e o alveolar. O CMT esporádico usualmente não é precedido por hiperplasia celular, enquanto que na forma hereditária a hiperplasia é

(18)

como a 10 anos em é 1 (31) sem sucesso. o inuvu'ir<:llnto~ na !Clemnncc:lcao {36,37)

e

11 (36-3B) . apresenta

e

(10) (33) cromossoma 1 1 meses exons

nas células derivadas neural <39>, incluindo tumores

como CMT e feocromocitoma. A com uma estrutura homóloga ao

o

(19)

em com na

e

o

identificado, é o denominado

crescimento neuronal <41l, membro

factor-{3) <42>. a é (42)

1111111111111111111111

;

iia

I

""có~~~"oi~

Códon 609, 611, 618, 620 Exon 14 Códon 804 Exon 15 Códon 883, 891 e no

Figura 1 - Estrutura do proto-oncogene ret. Os exons e os respectivos códons nos quais foram identificadas

mutações associadas a Neoplasía Endócrina Múltipla Tipo 2 estão assinaladas.

O mecanismo molecular pelo qual as mutações no proto-oncogene ret

desencadeariam o processo neoplásico foi determinado através de elegantes estudos in

(20)

mesmo nos

um

na é (9) 8 ao se e menos

(21)

9 A Normal B flffLlftc::n ... a v

no

rnr ... .nn

"""'''"'"''"""' no

{NEM2A) (NEM2B) Cist-+ Met-+ Thr (NEM

ausência de dímerização, (adaptado <5>).

Principais Mutações no Proto-oncogene

ret

As mutações descritas estão localizadas basicamente nos exons 10, 11 e 16 <38,46-52),

no entanto foram relatadas mutações com menor freqüência nos exons 13, 14 e 15 <50•53•54l.

No CMTF e NEM 2A, as mutações mais freqüentes afetam um dos cinco resíduos de

(22)

comum ocorre A uma (48) (50) uma maior '"""'"'"''"" em outros é do subtipo no exon 3 <53l (55,56) no ao

e

ou (8} nos exons

13

e

16 (

43 '48'53). segundo (43,45,48)

pacientes com no códon 634,

e híperparatireoidismo

que o hiperparatireoidismo

é

comum

(23)

ser

o

reatnz<:mo um ,..;:;>,,uuv com 1 e em casos 8 a (10} _{ao líquen} _(CLA}_<10 l, a

ocorre no os casos relatados o momento e na

à de os no exon 10 8

(24)

2-exons 1 11, 13, 14 e 16

o

3 1 2 (1 2 1 é uma com

o

5 4 1 10 18 (1 2 com no

o

2

o

12 (1

o

9

o

5 (1 9 3 (1

o

e de alta mortalidade quando diagnosticada

Tireóide é de

terapêutica e o

o

doença no afetado e em seus

nos (1

o

(10)

a

(25)

1

uma nn<"C!'lBCI r n ! T C I I Q I

as

(26)

(27)

A consulta ao prontuário e ter,aOE3Ut!ICO.

e

(rastreamento com citopatológico e anatomopatológico paciente, 5

e

uma hiperparatireoidismo e a obtidos

(28)

no ou probando nas

o

A utilizada no ao ilustrado na 3 -ambas

2A(1) Famílias com

e

NEM com e feocromocitoma, rastreamento

doença paratireoidiana no afetado e nos familiares de

com CMT e doença rastreamento

para feocromocitoma no afetado e nos familiares de risco

NEM Famílias com CMT, com ou sem feocromocitoma, com anormalidades

clínicas específicas, usualmente sem doença paratireoidiana

CMTF Famílias com pelo menos 4 membros afetados com CMT, sem

evidências de feocromocitoma ou doença paratireoidiana no afetado e nos familiares em risco

Outros tipos Famílias com menos de 4 membros afetados com CMT, sem

evidências de feocromocitoma ou doença paratireoidiana no afetado e nos familiares em risco

16

(29)

ou

os exons

10, 11

e

1

o

novas ou

1'7 L I

os

eram

casos

(30)

18

o

1 é -14 1 no com es~sus;oenaE~-Io em

e

a menos a (pH mM e1U

(31)

os exons

foram: 3 minutos à

EXON PRIMER FRAG, TEMPERATURA

ANELAMENTO

10 RET10F 5'- GGCAGC ATT GTT GGG GGA CAC-3' 173 64PC

RET10R 5'- GTT GAG ACC TCT GTG GGG CT -'3 62°

11 RET11F 5'- ATG AGG CAG AGC ATA CGCAGC C -3' 347

wc

RET1 5'- CTT GAA GGC ATC CAC GGA GAC C -3'

oooc

13 INT12F 5'- AAC TTG GGC AAG GCG ATG CA -3' 276pb 57°C

INT13R 5'- AGA ACA GGG CTG TAT GGA GC -3' _57°C

16 M2BF 5'- AGG GAT AGG GCC TGG GCT TC -3' 192pb 57°C

M2BR 5'- TAA CCT CCA CCC CAA GAG AG -3' _57°C

2.3.4

Restrição Enzimática

O princípio deste método consiste no fato de que uma mutação pode criar ou destruir o sítio de restrição de uma determinada enzima de restrição (endonuclease), Ou seja, a

(32)

20

com

os

e

(33)

o

a

(34)

(35)

num 14 com

a

catecolaminas

hiperpatireoidismo foi determinado ,.1:,.,"'".:::•~

e

7

a

com

(36)

24

e

(37)

25 serem como A

e

os fenótipos an,f"I'U~tr<:lf'in,<::!'

com menos ...,,.._..,,.,.,..,. afeitacjos com

ou no e nos

(38)

26 com caso com um com em nosso os novo.

diagnosticadas a infância, com carcinoma medular de tireóide diagnosticado aos 14

com de metástases e alguns anos aparecimento

(39)

com ou com sugestivos

e

no 2 e no

7

em ou com 3 uma aos 2

7

anos e

6

meses. sem ou

(40)

ou (tabela a no anexo com !:lr't"\ffll"'

a

"'"'ier ... ieôn as com NEM 2 28 A os

(41)

com NEM

os casos NEM 2A descritos na literatura, a

nosso estudo,

utilizando a

mutações, a troca amino-ácido

triptofano com A Rsal 347pb -+ TGG). A figura 3 demonstra um

utilizando a de restrição Rsa I.

3 4 ou de agarose em uma B Alelo normal 5' 3' Alelo afetado 5' 3' 5' GTiAC 3' ou

Figura 3 - A Gel de agarose ilustrativo da utilização diagnóstica da enzima de restrição Rsa 1. Os indivíduos 1

e 2 são os afetados (positivos) enquanto que 3 e 4 são os não portadores da mutação (negativos). Nos indivíduos afetados, a mutação cria um sítio de restrição para esta enzima, levando a clivagem do fragmento de DNA. B.

(42)

30

Famílias com NEM à

2 famílias com a rara 2A à a

no domínio _{exon 11' com a}

-+ arginina

na A B 1 Hhal 347pb Alelo normal Alelo afetado 5' 5' 3'

Figura 4-A. Gel de agarose ilustrativo da (negativo)

cria um sítio de restrição para esta

esquemática de sequenciamento, a seta representa os picos concomitantes da troca de nucletídeos. B. Sítio de reconhecimento da enzima Hha I.

Famílias com CMTF:

Nas 2 famílias portadoras da síndrome de CMTF, as mutações encontradas situaram-se no domínio extracelular, no códon 618 do exon 10, troca do amino-ácido

(43)

com com a se no 8 do exon 1 troca ilustração na 5. A 3 4 B Fokl 192 Alelo nonnal 5' 3'

Aielo afetado 5' GGATG

5' 3'

mutação destrói o sítio de restrição para esta enzima. B. Sítio de reconhecimento da enzima Fok I.

Outras formas hereditárias:

Foram analisadas 3 famílias com outras formas hereditárias do CMT, as

localizavam no domínio extracelular. No entanto, em uma família, a mutação se localizava

no códon 634 do exon 11, troca do amino-ácido cisteína ~ arginina (TGC ~ TAC) ou do

amino-ácido cisteína ~ triptofano (TGC~ TGG), na outra no códon 618 do exon 1 O, troca do

(44)

ou 8 ao Comitê CMTF exon 10, nesses

5-CMT esporádico 3 3 2 1 2 3 7 AFETADO /11 I 1 /11 8/16 618/10 /11 618/10 8 ou 620/10 5. AluI I I I I -r tre -r ser -? eis -r ser -?

(45)

33

(46)

_,

(47)

35

com

no

tumores

a

"""''"v""''a"'.au com neuromas.

em 1

síndrome ou nec:>olasla onrt•"~"rtn<> _as

(48)

(28) quando no e os casos re1c:mmc>s no o no a

o

fat"\f"'l"nrr•f"\r•ifnrr>""'

e

!1'0ir"<:>f"•!:ln genética (61). IVIUilCI\,V<:;I;;>

identificadas em ... ,.,...,,.,... famílias com

(49)

um anos antes com casos. (61) a um Q t.::.rlnt'~~"'" aS!SOC:taCIO à ) em presente em em

o

8 é

o

como sem como em 38 as

e NEM 2A(3) em apenas 1 A

o CMTF em 1% e os casos que se

(50)

no 8 exon exon 10 e nas 8 ou 11}, com a os

o

(10) os na ou menor

e

é comum

o

nas com a a mutação é

paciente com incluída em nosso ~;,Luu1u

no códon 8 ( exon

39

no

uma

(51)

genético

a

o

ao resumo, nossos

o

a

no 8 1

a

11 ). 8 nesses casos é

e

em nosso em

a

diagnóstico precoce, fundamental na conduta terapêutica e no

indivíduo afetado e em seus O rastreamento genético identifica a

4U nas A outras 5 anos. a outras o no

com doença hereditária, permitindo o tratamento precoce, através da tireoidectomia. Bem como, a análise permitiu diagnosticar a hereditariedade do CMT em 2 indivíduos previamente encaminhados como portadores de CMT esporádico.

(52)

no na 8 centros A

o

com o o com

(53)

(54)

A rastreamento é

a

_{e o}

(55)

(56)

45 1. 1 J D 2 1 _{' 1}

(57)

in in 1 1 1 1 mucosas neuromas,

a

1

(58)

47

1

os un

J

(59)

48 A J 1 in in 2 neuromas: a N 1,1

a

1 D 1

a

(60)

to 1 Kilkenny C 996. 49 1 1 in

(61)

is are A in in multi pie :1

(62)

5

in

8

in

s

J

A

in

8 1

(63)

1

a

disease: 11,

(64)

(65)

6 novos casos e com 8

2 -e

I. com com

a

com anos ao com com exon 11, os ICL.IUICIII em 3

anos ao com confirmação

e gastrinoma. evolução, o

8

(66)

55 no com com exon 1 , troca I. a 11! ou

6-

anos ao

A mutação foi 634, exon 11, troca

(67)

? ?

2 com

7 - Probando anos ao com

CMT

"""'T"'\1"" em acompanhamento realizando terapia supressiva por nódulo de

anos. Posteriormente, realizado e tireoidectomia. Foi diagnosticado

nódulo num familiar, encaminhado a tireoidectomia, com hiperplasia A

molecular demonstrou mutação no códon 634, exon 11, troca TGC--+CGC, enzima

restrição utilizada foi Hha I.

56

no

2

8 - Probando 45 anos ao diagnóstico, com rastreamento positivo, com CMT

associada à CLA, posteriormente sua filha desenvolveu CMT e a lesão de pele. A mutação

localizava-se no códon 634, exon 11, troca TGC--+CGC, enzima de restrição utilizada foi

(68)

57

uma com

com 14 anos ao

intestinal sintomática nos primeiros anos de vida, durante a infância

anos idade neuromas na cavidade

uma novo no exon 16,

roc::+rír•i::lr. utilizada foi /.

(69)

58

2 com ou sem a

ou

Família 1 com anos ao

... ,..,. .... ..,, aparecimento CMT em 6

no exon 1 troca I.

11

no 8, exon 10, troca L

(70)

outras com anos ou no ou 1 anos 1 com anos no entanto com como e o a e A no exon 1 L

(71)

em 8 com

anos a

a

(72)

nome ou

venoso meu

os meu

(73)

e

meu os em

e

o

suas atribuições. manter a

e

acesso ao em seu acesso a ter um

e

aos meus como

(74)

(75)

esse meu nome ou

e

os

a

tireóide nódulo ou aumento exames 10 com venoso meu 64 em os meu e em caso

(76)

os sem suas

o

e

a

ter acesso a mim

65

um

e

(77)

(78)

(79)