UNIVERSIDADE DO SUL DE SANTA CATARINA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE ANA CAROLINE HEYMANNS
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTI-INFLAMATÓRIA TÓPICA DA Casearia sylvestris EM MODELOS DE EDEMA DE ORELHA EM CAMUNDONGOS
Palhoça 2019
ANA CAROLINE HEYMANNS
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTI-INFLAMATÓRIA TÓPICA DA Casearia sylvestris EM MODELOS DE EDEMA DE ORELHA EM CAMUNDONGOS
LINHA DE PESQUISA: Processos inflamatórios e alérgicos
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde para obtenção do título de Mestra em Ciências da Saúde.
Orientadora:Profa. Anna Paula Piovezan Dra.
Palhoça 2019
AGRADECIMENTOS
A felicidade notoriamente não encontra-se no fim da jornada, mas sim em cada conquista, aprendizado, a cada pedacinho de conhecimento adquirido. Um amontoado de pequenas alegrias e momentos singelos com enormes significados definem o meu mestrado. As metas grandiosas são importantes, mas as flores que colhemos no trajeto são ainda mais especiais. Por isso sou imensamente grata a professora e orientadora deste trabalho, Anna Paula Piovezan, por me ensinar a apreciar o trajeto, meus colegas de laboratório que foram peças fundamentais, dividindo o peso em dias de experimentos, oferecendo ajuda e auxilio quando necessitei. Obrigada Daiana Salm, por ser minha maior mentora em grande parte do meu conhecimento dentro do laboratório, sou grata pela paciência em ensinar mais de uma vez técnicas e conceitos, e principalmente por me inspirar a ser uma pessoa mais prestativa e correta. Obrigada Bruna Hofmann por ser minha parceira de turma e grande amiga, as risadas, noites de estudos e desesperos em comum me deram alivio em muitos momentos. Não esquecendo da Daniela Ludtke que tenho grande admiração e que sempre que pode sanou dúvidas e dividiu experiências. Obrigada professores que foram cruciais e que tive a honra de conviver e aprender, Franciane Bobinski e Daniel Martins. E, por fim, obrigada a toda a família Lanex.
Não posso deixar de agradecer minha família, que sempre incentivaram meus estudos, loucuras e afins. Sem vocês nada disso seria possível. Á minha mãe que renunciou muitos de seus sonhos para que eu pudesse realizar os meus, a conquista deste momento é nossa. Ao meu tio Luciano que nunca se negou a me auxiliar em finais de semanas e até mesmo em limpezas do biotério, obrigada por deixar a vida mais leve. A minha vó (in memory) que é exemplo de determinação, de força e honestidade, sou grata por me alfabetizar durante as tardes com toda sua paciência, e com seus bolinhos de chuva.
Obrigada as minhas amigas queridas Débora Fiedler de Oliveira, Maira Gaulke e Ana Flávia Ajuz, que, mesmo quando distantes, se faziam ainda presentes me incentivando frente a cada desanimo e me parabenizando a cada vitória.
Agradeço meu técnico Júlio César de Araújo que abriu as portas da Universidade quando tinha ainda 17 anos, você não imaginava o quanto seria importante na minha vida, obrigada por ser a pessoa certa, no momento certo.
Obrigada a todos que direta ou indiretamente contribuíram para a conclusão deste estudo. Diante da imensidão do tempo e da enormidade do universo, é um gigantesco prazer dividir um planeta e uma época com vocês.
Vale ainda ressaltar os agradecimentos às instituições que financiaram este ensino e pesquisa. O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001, bem como do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico e da Fundação de Amparo à Pesquisa e Inovação do estado de Santa Catarina.
RESUMO
Introdução: Doenças inflamatórias da pele como a psoríase e a dermatite atópica apresentam alta prevalência e carecem de alternativas para o auto-cuidado pela população. A planta Casearia sylvestris é utilizada topicamente em diferentes comunidades do Brasil, para tratar feridas ou promover a cicatrização cutânea. Objetivo: Avaliar a atividade anti-inflamatória tópica do extrato bruto hidroalcoólico da
Casearia sylvestris (EBHA-CS) nos modelos de edema de orelha induzido aguda ou
cronicamente pela aplicação de óleo de cróton em camundongos. Métodos: Estudo experimental utilizando camundongos Swiss machos (25-35g) mantidos em condições semelhantes e constantes, no Laboratório de Neurociência Experimental (LaNEx) da UNISUL. Os edemas de orelha agudo ou crônico foram induzidos, respectivamente, pela aplicação única ou múltiplas de óleo de cróton (CO, 2,5%, em 20μl) na superfície externa da orelha. Os diferentes grupos de animais (n=8) receberam como tratamento veículo, dexametasona (DEXA) ou diferentes doses de EBHA-CS. O edema foi avaliado macroscopicamente 6 h (agudo) ou 8 dias (crônico) após a primeira aplicação do OC e imediatamente após os animais foram submetidos a eutanásia para coleta das orelhas tratadas. No modelo de edema agudo, o tecido foi avaliado bioquimicamente quanto atividade da mieloperoxidase (MPO) e os níveis de nitrito/nitrato. No modelo crônico, as orelhas foram avaliadas histologicamente quanto à morfometria geral, mastócitos degranulados e não-degranulados, além de acantose. Resultados: O tratamento dos animais com EBHA-CS reduziu significativamente e em extensão similar à DEXA os edemas agudo e crônico, bem como a atividade da MPO e dos níveis de nitrito/nitrato teciduais no edema agudo. Finalmente, no modelo de edema crônico registrou-se menor densidade de mastócitos degranulados em relação ao grupo tratado com veículo, além de diminuição da espessura da epiderme (acantose). Conclusão: Estes resultados sugerem um possível benefício do tratamento tópico com EBHA-CS em condições inflamatórias da pele.
ABSTRACT
Introduction: Inflammatory skin diseases, such as psoriasis and atopic dermatitis, are found in high prevalence around the world and needs alternative tools for its self-care by population. Casearia sylvestris is a plant used topically in different communities in Brazil, to treat wounds or promote cutaneous healing. Objective: To evaluate the topical anti-inflammatory activity for the crude hydroalcoholic extract of Casearia
sylvestris (HCE-CS) in the models of acute or chronically induced ear edema by the
application of chroton oil in mice. Methods: Experimental study using male Swiss mice (25-35g) kept under constant conditions in the Laboratory of Experimental Neuroscience (LaNEx)-UNISUL. The acute or chronic ear edemas were induced, respectively, by the single or multiple application of croton oil (CO, 2.5%, in 20μl) on the external surface of the ear. The different groups of animals (n= 8) received different treatments: vehicle, dexamethasone (DEXA) or different doses of HCE-CS. Edema was evaluated macroscopically for 6 h (acute) or 8 days (chronic) after the first application of the CO and immediately after the animals were submitted to euthanasia for the collection of the samples (treated ears). In the acute edema model, the tissue was biochemically evaluated for myeloperoxidase activity (MPO) and levels of nitrite/nitrate levels. In the chronic model the ears were histologically evaluated for general morphometry, degranulated and non-degranulated mast cells, as well as acanthosis. Results: Topic treatment with HCE-CS significantly reduced the acute and chronic edemas, as well as MPO activity and tissue levels of nitrite/nitrate in acute edema. Finally, in the chronic edema model there was a lower density of degranulated mast cells in relation to the vehicle treated group and decreased thickness of the epidermis (acanthosis). Conclusion: These results suggest a possible benefit of topical treatment with EBHA-CS in inflammatory conditions of the skin.
LISTAS
Lista de abreviaturas
DA Dermatite Atópica
SUS Sistema Único de Saúde APS Atenção Primária a Saúde
EBHA-CS Extrato bruto hidroalcoólico de Casearia sylvestris OC Óleo de cróton
TPA 12-O-Tetradecanoylphorbol-13-acetate
IGE Imunoglobulinas do tipo E UBS Unidades Básicas de Saúde AA Ácido araquidônico
PG Prostaglandinas
PPGCS Programa de Pós Graduação em Ciências da Saúde UNISUL Universidade do Sul de Santa Catarina
MPO Mieloperoxidase
LANEX Laboratório de Neurociências Experimental CEUA Comissão de Ética no Uso de Animais MIA Morte Indolor Assistida
DEXA Dexametasona ATO Azul de Toluidina
Lista de figuras
Figura 1- Diferenças entre as estruturas e componentes celulares da pele em
camundongos e humanos... 17 Figura 2- Delineamento experimental do modelo de edema de orelha agudo,
induzido por aplicação única de OC... 33 Figura 3- Delineamento experimental do modelo de edema de orelha crônico, induzido por múltiplas aplicações de OC... 34
Lista de Quadros
Quadro 1- Principais diferenças clínicas entre psoríase e DA... 20 Quadro 2- Principais diferenças macroscópicas da pele entre psoríase e DA... 20 Quadro 3- Variáveis de estudo... 39 Lista de Tabelas
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ... 12
1.1 REFERÊNCIAL TEÓRICO ... 15
1.1.1 Pele: função, origem e composição tecidual ...15
1.1.2 Doenças da Pele: epidemiologia e classificação de acordo com agentes causais... 18
1.1.3 Fisiopatologia das doenças da pele - foco na psoríase e na DA e a importância do modelo do OC para o estudo destas doenças ...20
1.1.4 Auto-cuidado no tratamento da psoríase e da DA e investigação pré-clínica de novas terapias... 23
1.1.5 Casearia sylvestris e propriedades de interesse para tratamento da psoríase e da DA... 27 2. OBJETIVOS ... 30 2.1 OBJETIVO GERAL ... 30 2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ... 30 3. MÉTODOS ... 31 3.1 TIPO DE ESTUDO ... 31 3.2 MATERIAIS E EQUIPAMENTOS ... 31 3.3 ANIMAIS ... 31 3.4 DELINEAMENTO DO ESTUDO ... 31 3.5 ENSAIOS/TESTES/TÉCNICAS ... 34
3.5.1 Coleta do material vegetal e confecção do EBHA-CS... 34
3.5.2 Análise do edema de orelha...35
3.5.2.1. Influência do tratamento tópico com EBHA-CS no modelo de edema de orelha induzido por aplicação única de OC...34
3.5.2.2. Influência do tratamento tópico com EBHA-CS no modelo de edema de orelha induzido por múltiplas aplicações de OC... 36
3.5.3 Influência do tratamento tópico com EBHA-CS sobre os níveis de nitrito/nitrato e sobre a atividade de MPO no modelo de edema induzido por aplicação única de OC ... 37
3.5.4 Influência do tratamento tópico com EBHA-CS sobre os parâmetros
inflamatórios e de reorganização da epiderme... 37
3.5.4.1 Análise histomorfométrica das orelhas... 38
3.5.4.2 Análise da densidade de mastócitos degranulados e não-degranulados... 38
3.5.4.3 Análise da acantose...38
3.6 VARIÁVEIS DE ESTUDO ... 39
3.7 ANÁLISE DE DADOS ... 39
3.8 ASPECTOS ÉTICOS DA PESQUISA ... 40
4. RESULTADOS...41
5. CONCLUSÕES ... 42
6. PERSPECTIVAS ... 43
1. INTRODUÇÃO
No Brasil há uma diversidade de plantas que possuem propriedades benéficas atribuídas aos seus fitoconstituintes, chegando a ser o país com maior variedade de espécies vegetais no mundo1,2. Entretanto, menos de 10% destas são catalogadas e
apenas cerca de 5% contém seus perfis fitoquímicos traçados3. Nosso país
atualmente possui legislação e políticas públicas que incentivam o uso de produtos oriundos de plantas em diversos tratamentos fisiopatológicos4.
As lesões da pele encontram-se entre as patologias contempladas neste rol de tratamentos, sendo as mesmas também o foco do presente estudo. Trabalho recente registrou dados obtidos de todos os continentes, mostrando que as lesões cutâneas estão entre os principais motivos que levam os indivíduos a buscarem atendimento no serviço de saúde pública5,6, acometendo todas as faixas etárias da população7,8.
Através da pele são manifestados diversos sinais e sintomas que permitem detectar e diagnosticar uma série de doenças, sendo as mais comuns a psoríase9 e a
dermatite atópica (DA). Quando a pele tem sua barreira de proteção em desequilíbrio ou incapacitada de exercer suas funções fisiológicas, como ocorre nestas duas condições, alterações ocorrem e diferentes tipos de agressões cutâneas são desencadeadas, iniciam-se processos com o objetivo de restaurar a integridade deste órgão; dentre estes, as inflamações são particularmente significantes na perspectiva deste trabalho.
Conhecendo a importância da pele para o organismo, compreende-se o grau de significância em promover tratamentos aos indivíduos que possuam doenças da pele. O surgimento de medicamentos registrados no Brasil na perspectiva do Sistema Único de Saúde (SUS) para pessoas acometidas por doenças da pele representou apenas 1,3% dentre os anos de 2003 e 2013, perdendo para doenças com as cardíacas com 20,4% e as condições neuropsiquiátricas com 19,6%10; por outro lado,
a utilização de plantas medicinais no auto-cuidado das pessoas, para o tratamento de sinais e sintomas auto-limitados, em doenças que não sejam consideradas graves, é estimulada por órgãos nacionais e internacionais de saúde11 podendo constituir
importante ação a ser estimulada, por exemplo, na Atenção Primária a Saúde (APS). Esta ideia é reforçada pelo conhecimento de que o tratamento de doenças com plantas, através da medicina popular é uma prática comum no Brasil e em outros
lugares ao redor do mundo. Em tribos indígenas e outras comunidades isto é bastante comum. A Casearia sylvestris é empregada popularmente para o auxílio terapêutico destas enfermidades, tanto em humanos quanto em animais12. A escolha da planta Casearia sylvestris para esta pesquisa, baseou-se no fato de que esta possui
propriedades anti-inflamatórias já registradas na literatura13,14, mas também pelos
estudos que vem sendo realizados em nosso grupo de pesquisa15,16. Inicialmente, De
Mattos e colaboradores (2007)15 observaram efeito antinociceptivo da planta em
modelos de dor inflamatória e induzida por reação alérgica por sensibilização à ovalbumina. Posteriormente, Albano e colaboradores (2013)16 identificaram as
propriedades anti-inflamatórias (redução de edema e de migração celular) e antioxidantes do extrato bruto hidroalcoólico de Casearia sylvestris (EBHA-CS) em modelos de edema ou de pleurisia induzidos por carragenina.
A Casearia sylvestris é um arbusto encontrado em florestas do sul do Brasil, mas também em outras regiões do país. Do ponto de vista deste estudo, importante destacar ainda que em diferentes comunidades do Brasil, observa-se o uso da
Casearia sylvestris, popularmente chamada de "guaçatonga", topicamente para tratar
a cicatrização cutânea17. Nestes casos, geralmente o uso da planta é associado ao
tratamento de feridas resultantes de mordidas de cobras, tanto em animais quanto em seres humanos, na forma de bandagens preparadas com as folhas maceradas da planta12. Este uso tradicional está de acordo com demonstrações científicas de suas
ações antibotrópica18, anti-inflamatória16 e anti-hiperalgésica19 bem como da ação
inibitória sobre a enzima fosfolipase A2, uma enzima crucial na cascata de geração de
mediadores inflamatórios20. Apesar disto, estudos mais consistentes sobre o efeito
anti-inflamatório tópico da planta, não foram encontrados.
Para se desenvolver tratamentos mais eficazes para as doenças da pele que são complexas, e ainda, que envolvam fenômenos multifatoriais complexos como os observados na inflamação, é necessário a utilização de modelos experimentais com animais21. Estes modelos, visam mimetizar uma real exposição da doença para uma
nova abordagem terapêutica. O modelo animal de aplicação tópica de óleo de cróton (OC) é um modelo que serve de triagem para a atividade anti-inflamatória tópica de substâncias. Isto porque sua aplicação, aguda ou crônica, promove diversos sinais e sintomas macroscópicos e histológicos que podem ser similares aos observados em condições inflamatórias da pele tais como a psoríase e a DA, estando assim
consolidado na literatura22,23. O OC é obtido da planta Croton tiglium L. e possui, além
de outros compostos, um principal componente denominado acetato de tetradecanoil-forbol (ou TPA, do inglês 12-O-Tetradecanoylphorbol-13-acetate)24. Este é o principal
componente nocivo ao tecido cutâneo, desencadeando uma resposta inflamatória que pode ser característica de um processo crônico ou agudo25.
Diante do exposto, entende-se a importância de estudar novas ferramentas terapêuticas para o tratamento dos sinais e sintomas associados às doenças da pele, sendo que os compostos obtidos de plantas são fontes promissoras de agentes anti-inflamatórios. Desta forma a pergunta de pesquisa do presente estudo é “O EBHA-CS apresenta ação anti-inflamatória tópica em modelo de edema de orelha agudo ou crônico induzido por OC?”
1.1 REFERÊNCIAL TEÓRICO
1.1.1 Pele: função, origem e composição tecidual
A pele é um órgão único que serve como uma área de interação entre o hospedeiro e o ambiente, proporcionando uma barreira mecânica e biológica contra insultos químicos, físicos e patogênicos26,27. Ela cobre uma área de 1,5 - 2,0 m2 do nosso corpo, representando quase 15% do peso corporal de um indivíduo. Faz parte do sistema tegumentar, que é composto, além dela, por seus anexos como unhas, pelos, glândulas sebáceas, sudoríferas e mamárias28.
A função da pele vai além do revestimento e da proteção do organismo29.
Outras funções exercidas por este órgão dizem respeito à regulação térmica, secreção de suor e sebo, aspectos sensoriais, síntese de vitamina D e a relação com a autoimagem, conforme detalha-se a seguir. A temperatura compõem um dos sinais vitais do organismo, influenciando atividades bioquímicas e fisiológicas que são integralmente vinculadas a temperatura corpórea, sendo, portanto, de crucial importância30. Em segundo lugar, a secreção de suor pelas glândulas sudoríparas
dissipa o calor e auxilia no refrigeramento do corpo, enquanto o sebo e a cera auxiliam na lubrificação da pele e do pelo, acrescendo o aspecto hidrofóbico da queratina e protegendo o pelo30.
Já a percepção sensorial, como do tato, da temperatura e do processamento da dor são aspectos de vital importância para a manutenção da integridade e da homeostasia orgânicas. A pele ainda é a maior fonte de vitamina D após a exposição à radiação ultravioleta B e após a formação desta vitamina nas camadas mais profundas da derme, seu metabólito calcitriol tem participação na inibição da proliferação e na estimulação da diferenciação dos queratinócitos, que por fim dão origem a unhas e cabelos31. Finalmente, a pele possui uma função em relação à
autoimagem dos indivíduos, uma vez que é reflexo de saúde e bem-estar27,
interferindo sobremaneira na qualidade de vida dos mesmos.
Conforme pode ser observado na Figura 1, os tecidos que compõem a pele se organizam em camadas distintas, a epiderme e a derme, cada uma constituída de diferentes tipos celulares predominantes. A epiderme se constitui de diferentes camadas, sendo a camada basal a porção mais profunda, formada por células cubóides, responsáveis pela frequente renovação do epitélio32; o estrato espinhoso é
a camada intermediária, que é formado por células poliédricas irregulares e responsáveis pela comunicação com células adjacentes; a camada granulosa, que possui células contendo grânulos de querato-hialina e, finalmente, o estrato córneo, que é mais exteriorizado e composto por queratina e células escamosas anucleadas33.
As principais estruturas que compõem a epiderme são os queratinócitos, além dos melanócitos, das células de Langerhans, das células T CD8+, dos receptores
sensoriais e das terminações nervosas livres 34. Enquanto os queratinócitos são
responsáveis pela síntese de queratina e pelas funções imunorreguladoras que auxiliam no equilíbrio imunológico e nas atividades imunes e inflamatórias na pele35,
os melanócitos produzem a melanina e as células de Langerhans funcionam como apresentadores de antígenos para outras células da pele. Por sua vez, os discos de Merkel possuem função sensorial, sendo ativadas por estímulo de toque fino27 e as
células T CD8+ são células do sistema imune com função citotóxica, quando
ativadas35. Coletivamente, estas células funcionam fazendo desta camada uma
barreira física com propriedades imunológicas complexas36.
Por sua vez a derme é formada por duas camadas que se fundem, a camada da derme papilar, que é mais externa e mais delgada, além da camada da derme reticular, que é mais profunda, com menor densidade células e composta por estruturas que compõem o tecido conectivo, tais como feixes de fibras de colágeno e elastina37. A derme é rica em matriz extracelular e é nela que acomodam-se estruturas
como as glândulas sudoríferas, sebáceas e o pelo, além dos vasos sanguíneos34. Esta
camada também possui numerosos tipos celulares, como fibroblastos, fibrócitos e células estruturais dos vasos sanguíneos e linfoides. Além disso, possui células imunitárias35, tais como células dendríticas, macrófagos, mastócitos, células linfoides
e linfócitos residentes33.
As células dendríticas dão origem à uma linhagem mieloide que forma as células de Langerhans, que são bastante importantes pois predominam na área epidérmica entre as células do estrato espinhoso e participam de reações imunológicas como apresentadoras de antígenos, sendo responsáveis por fagocitar o material antigênico e apresentá-lo às células especializadas do sistema imunitário38.
Depois disto, são liberadas grandes quantidades da citocina fator de necrose tumoral e outros mediadores inflamatórios, formando um sistema de vigilância e atuando como “sentinelas” do organismo, tendo como objetivo principal detectar e capturar antígenos externos39.
Quanto às demais, as células dendríticas são recrutadas para a pele em estados de inflamação durante condições como o lúpus eritematoso sistêmico e a psoríase35,40. Os monócitos e os macrófagos são ativados nas reações inflamatórias
de natureza imunológica, colaborando para a detecção precoce de agentes nocivos41.
Os mastócitos, em particular, possuem grande quantidade de mediadores pré-formados no interior de seus grânulos citoplasmáticos e, na presença de antígeos aos quais já estejam sensibilizados por imunoglobulinas do tipo E (IGE)s, podem rapidamente ser degranulados e contribuir com a inflamação aguda ou ainda, suprimir a inflamação crônica por meio da produção de interleucina-235,42.
Finalmente a hipoderme, que faz parte do sistema tegumentar, possui em sua composição predominantemente células adiposas e folículos pilosos, tendo as principais funções de reservatório energético e isolamento térmico, entre outros43. Os
principais componentes da pele humana são destacados na Figura 1B a seguir. No entanto, uma vez que neste estudo foi utilizado um modelo animal em camundongos, algumas diferenças entre a pele das duas espécies são destacadas, comparando-se a pele do humano com a dos camundongos (Painel A).
Figura 1- Diferenças entre as estruturas e componentes celulares da pele em camundongos e humanos.
Legenda: DETC: células dendríticas da pele tipo T (do inglês: dendritic epidermal T cells); células
TCD8: células T reguladora com função citotóxica; células TCD4: células T reguladora com função auxiliar; ILC: células linfoides inatas (do inglês, innate lymphoid cells); CD dermais: células dendríticas da pele; gd Tcell: células T não convencionais. Fonte: Adaptado de Pasparakis, 201435.
A pele humana tem a epiderme e a derme mais espessas do que a do camundongo, com projeções descendentes das cristas epidermais. Os tipos de células imunes mais prevalentes na epiderme humana são as células de Langerhans e as células T CD8+, enquanto na epiderme do camundongo, há uma população
proeminente de células T epidérmicas dendríticas Vγ5+, que estão ausentes da
epiderme humana; estas contribuem para a vigilância imunológica da pele e a produção de interleucina-17. Como características similares, tanto a derme humana quanto a do camundongo são povoadas por macrófagos, mastócitos, células Tαβ convencionais e uma pequena população de células linfoides inatas35.
1.1.2 Doenças da Pele: epidemiologia e classificação de acordo com agentes causais
As lesões da pele constituem, mundialmente, uma das grandes causas que levam as pessoas a consultarem-se na saúde pública. Um estudo na Espanha relatou que 3.084 pacientes atendidos em atendimentos de urgência naquele país no decorrer de um ano (2013-2014) buscavam auxilio por lesões de pele; as doenças mais frequentes foram às infecciosas (23%) e o eczema (15,1%)5. Em outro estudo, três
condições da pele ficaram entre as 10 principais doenças mais prevalentes no mundo no ano de 2010, sendo que dentre estas, as doenças fúngicas da pele obtiveram o 4º lugar, enquanto outras doenças subcutâneas atingiram o 5º lugar e, por fim, a acne alcançou o 8º lugar6. Neste último estudo ainda, na lista encontravam-se mais cinco
doenças da pele que estão entre as 50 doenças mais comuns, dentre elas vemos o prurido, o eczema, o impetigo, as verrugas e a sarna6.
No Brasil, um estudo realizado em São Paulo - Campinas, mostrou que uma em cada quatro pessoas que procuraram atendimentos nas Unidades Básicas de Saúde (UBS) durante os meses de novembro e dezembro de 2004 foram levados por queixas de lesões dermatológicas44. Ainda, corroborando com os estudos já citados,
uma coorte retrospectiva avaliou os prontuários do serviço de dermatologia da Universidade Estadual Paulista de São Paulo - Botucatu, de pacientes com faixa etária variada que foram atendidos em dois momentos distintos, no ano de 2003 e de 2014, contanto com um total de 1.170 e 1.078 atendimentos, respectivamente. Destes atendidos, a maior parte apresentava dermatoses inflamatórias, com risco relativo
para apresentação de rosácea igual a 1,9, para erupções liquenóides igual a 1,8, para acne e DA igual 1,4 e, finalmente, para psoríase igual a 1,245.
Já com relação aos indivíduos em idade escolar, outros estudos46,47 foram
conduzidos em outras cidades do país. Os resultados epidemiológicos de um estudo transversal realizado de julho de 2006 a dezembro de 2007 na cidade de Taubaté, com a faixa etária de 6 a 7 anos de idade, apontaram valores de prevalência para dermatoses inflamatórias e alérgicas igual a 32,6%, para dermatite seborreica igual a 22,4% e para psoríase igual a 20,4%46. Para a DA, nos Estados Unidos da América
estimativas recentes de prevalência na infância variam de 6% a 13,0%, dependendo do desenho do estudo e da abordagem usada para avaliar a DA48. Estes dados são
particularmente importantes se considerarmos que um estudo, realizado a partir de resultados de 187 países, chamou a atenção para o fato de que as doenças da pele são a quarta causa de maior carga de doença no mundo, perdendo apenas para dor lombar, transtorno depressivo maior e anemia ferropriva49.
Quanto à classificação das afecções que acometem a pele, de acordo com Sampaio e Rivitii50, temos a seguinte classificação em função do agente etiológico
causador: as afecções dos anexos cutâneos: as alterações do colágeno, hipoderme, cartilagens e vasos; as infecções e infestações; as dermatoses por substâncias químicas, físicas e mecânica; inflamações e granulomas não-infecciosos; as dermatoses metabólicas; as afecções psicogênicas, psicossomáticas e neurogênicas; as dermatoses por imunodeficiências; as afecções congênitas e hereditárias; os cistos e neoplasias e, finalmente, as alterações morfológicas cutâneas epidermo-dérmicas. Dentre todas estas condições, as mesmas podem diferir quanto ao agente causal, por exemplo quando a pele tiver rompida sua integridade por feridas cirúrgicas, que podem ser divididas em incisão, quando há corte e o mesmo é fechado por sutura ou, ainda, excisão, quando uma área do tecido é removido, como por enxerto51. As
feridas também se dividem em agudas e crônicas, de acordo com o tempo necessário para que ocorra a cicatrização52. Apesar destas diferentes causas, a maioria possui
como característica fisiopatológica os processos inflamatórios, o que é particularmente importantes do ponto de vista deste estudo que objetiva uma tiagem da atividade anti-inflamatória tópica para o EBHA-CS.
1.1.3 Fisiopatologia das doenças da pele - foco na psoríase e na DA e a importância do modelo do OC para o estudo destas doenças
A pele sofre constantemente agressões que afetam sua integridade, a partir das quais ocorrem modificações na sua estrutura micro e/ou macroscópicas, iniciando distintas respostas neste local53. Tais mudanças poderão dar origem aos processos
anatomopatológicos de degenerações, alterações metabólicas, proliferações, malformações, disfunções ou inflamações54. Uma vez que como apresentado
anteriormente a psoríase e a DA são as condições inflamatórias da pele foram as mais prevalentes em estudos nacionais e internacionais, as principais diferenças clínicas (Quadro 1) e de aspectos macroscópicos da pele (Quadro 2) entre as duas condições são apresentadas a seguir.
Quadro 1 - Principais diferenças clínicas entre psoríase e DA
Principais Diferenças entre as duas doenças inflamatórias da pele
Características Inflamações cutâneas Prurido Edema Biomarcador
Psoríase hiperproliferativa e Crônica,
descamativa - Principalmente nas articulações (sistêmica) - DA Recorrente Intenso - IGE aumentada (rinite alérgica) Fonte: Retirado de Rao, Khandpur & Kalaivani (2018)55.
Quadro 2 -Principais diferenças macroscópicas da pele entre psoríase e DA
Do ponto de vista deste trabalho, o componente inflamatório destas doenças é particularmente importante e compreende um conjunto complexo de ações no tecido lesionado, compreendendo as atividades teciduais e as alterações dos vasos sanguíneos e do tecido conjuntivo, todas estas atuando contra agentes nocivos que podem incluir bactérias, fungos, agentes químico-físicos ou autoimunes53. No início
deste processo ocorre o fluxo aumentado de sangue na região afetada, por conta da rápida vasodilatação que permite a permeação de fluido e células para o tecido conjuntivo56. O resultante disto é o edema, que pode ser promovido por agentes tais
como histamina, leucotrienos, cininas e serotonina57.
Posteriormente, mastócitos e demais células residentes sintetizam mediadores químicos que iniciam o recrutamento de neutrófilos para o local, além de controlarem e induzirem os processos de aumento da permeabilidade dos vasos sanguíneos, que leva ao extravasamento de líquido e a transmigração de células dos vasos sanguíneos para o interstício, iniciando assim o processo de inflamação aguda58. Os leucócitos
são as primeiras células a fazerem o processo de transmigração, ou seja, deixam o compartimento vascular por diapedese e atravessam o endotélio e a membrana basal dos vasos para chegarem no interstício; fazem isto com auxílio de moléculas de adesão como as integrinas e selectinas presentes nas paredes da membrana celular das células, que irão interagir com moléculas de adesão no endotélio vascular59,60. As
primeiras células a migrarem são os neutrófilos (polimorfonucleares), que, posteriormente, serão fagocitados por células como os macrófagos, levando à depuração dos mesmos59.
Assim, a inflamação aguda é compreendida como uma resposta fisiológica para defender o hospedeiro e manter a homeostase e que, nas doenças da pele como a psoríase, a DA e a dermatite de contato, se manifestará a partir dos sinais inflamatórios clássicos de eritema, edema e dor, sendo esta última produzida por irritação química das terminações nervosas e por compressão61,62. Apesar da resposta
inflamatória aguda ser de cunho protetor, a falha na remoção de materiais nocivos produzidos pelos neutrófilos via fagocitose, na remoção de células inflamatórias apoptóticas ou o atraso na apoptose, bem como a permanência do agente causal, dão lugar a fase subaguda e crônica da inflamação61, resultando em uma resposta
inflamatória exacerbada.
A fase crônica da inflamação da pele repercute diferentemente sobre a camada germinativa, produzindo-se a acantose e a hiperqueratose, também características
das duas doenças inflamatórias da pele mais prevalentes (psoríase e DA). A acantose se caracteriza por uma hiperplasia epidérmica, mais conhecida como o aumento da espessura da epiderme, resultando na formação de pápulas ou placas63; por sua vez,
as queratoses são representadas por crescimento anormal do espessamento do estrato córneo, que o torna descamativo63. A partir destas alterações, um resumo das
principais observações histológicas encontradas entre a psoríase e a DA a partir de diferentes estudos foi publicado por Rao, Khandpur & Kalaivani (2018)55, conforme
pode ser observado na Tabela 1, a seguir.
Tabela 1 - Principais diferenças histológicas entre a psoríase e a DA em humanos.
Fonte: Traduzido e adaptado de Rao, Khandpur & Kalaivani (2018)55. Histopatologia
encontrada Caesinaro et al. Hesari et al. Aydin et al.
Rao, Khandpur & Kalaivani Psoríase Dermatite Psoríase Dermatite Psoríase Dermatite Psoríase Dermatite
N:22% N:20% N:36% N:16% N:17% N:25% N:31% N:24% Paraqueratose Focal 9,1 25 11,1 31,3 - - 70,9 62,5 Confluente 50 20 33,3* 6,3* 29,4 44 19,4* 0* Neutrófilos no estrato córneo 45,50 35 72,2* 0* 5,9 4 6,9 0 Glóbulos de fibrina no estrato córneo 81,8 95 72,2* 100* 11,8 4 38,7 33,3 Hipogranulose 909 80 75* 18,8 41,2 36 22,6 4,2 Acantose Regular 68,5* 35* 30,5 25 88,2 80 27,6 9,1 Irregular 34,5 35 69,4 75 11,8 20 72,4 90,9 Neutrófilos no estrato espinhoso - - 22,2* 0* - - 10 0 Espongiose 77,3 95 61,3 29,2 44,4 12,5 - - 35,5 29,2 Suave 38,9 56,3 76,5 60 9,7 20,8 Severa (vesícula espongiosa) 22,7 35 Diluição suprapapilar - - 72,2* 25* 58,8 40 51,7* 22,7* Rete redges Normal - - - 44,8 81,9 Cônico - - - - 52,9 52 13,8 0 Ampla - - - 6,9 4,5 Normal a cônico - - - 6,9 0 Normal a amplo - - - 6,9 0 Cônico a amplo - - - - 20,7 13,6 Vascularidade Dilatada ectática 22,7 22,7 30 6,3* 76,5 72 38,7 50 Eosinófilos dérmicos 86,4 86,4 90 38,9 11,8 12 3,85 0* Edema dérmico - - - 83,3 29,4 12 9,3* 0 *P<0,05
A partir dos aspectos retratados na Tabela 1, podemos também correlacionar os mediadores inflamatórios mais importantes para a manifestação destas características histológicas. Os principais mediadores são a histamina, os leucotrienos, os prostanóides, as cininas, o fator agregador e ativador plaquetário, os fatores quimiotáticos para eosinófilos e neutrófilos, além dos derivados do ácido araquidônico (AA)64. A histamina, os leucotrienos e os prostanóides são responsáveis
pela vasodilatação que é acompanhada de vermelhidão, além de ativarem a maturação dos mastócitos e recrutarem basófilos e eosinófilos para o local da lesão65.
Além destes, as cininas dão origem à bradicinina, que é responsável por induzir inflamação através da liberação de citocinas pró-inflamatórias e aumentar a permeabilidade vascular, bem como são capazes de sensibilizar terminais periféricos dos nociceptores, estando esta ação relacionada ao processo de dor64. Finalmente, o
fator agregador plaquetário é ativado por complexos imunes, influenciando a permeabilidade e estimulando as plaquetas a secretarem mediadores inflamatórios, resultando na ativação dos neutrófilos65.
Outra classe de mediadores bastante importante nas inflamações da pele é a dos derivados do AA, que são produzidos após a liberação de fosfolipídeos de membrana celular pela enzima fosfolipase A266. Dentre estes mediadores, as
prostaglandinas (PG) promovem ações como vasodilatação (PGD2, PGE1, PGE2, PGI2) e aumento da permeabilidade vascular (PGD2, PGE1, PGE2, juntamente com histamina e leucotrienos), além dos tromboxanos que levam à agregação plaquetária. Os derivados do AA promovem ainda quimiotaxia de leucócitos, ativação de neutrófilos e inibição de linfócitos T (neste caso, principalmente os leucotrienos), entre outros66. Todos estes mediadores são, portanto, de grande importância não somente
nos mecanismos de inflamação, mas também nos mecanismos fisiológicos normais e na reparação das lesões, pelo estímulo à proliferação de fibroblastos e queratinócitos, sendo que sua quantidade ou função também podem encontrar-se alterados durante as doenças inflamatórias crônicas da pele67.
1.1.4 Auto-cuidado no tratamento da psoríase e da DA e investigação pré-clínica de novas terapias
Percebe-se a partir do que foi exposto até o momento, que as inflamações podem ocorrer isoladamente ou secundariamente a outros processos patológicos54.
Por outro lado, as inflamações são o ponto final de processos fisiopatológicos, sendo importantíssimo o papel que assumem como via final dos processos de ordem imune, bem como do reparo total da pele lesionada. Desta forma, estudos sobre novas estratégias para o manejo e o controle efetivo de doenças de pele, como o uso de agentes com propriedades anti-inflamatórias, são promissores e necessários para esta área da saúde. Isto porque se o processo final de reparo depende de que a inflamação seja controlada de maneira adequada, uma vez que seja possível atuar sobre a fase inflamatória aguda para evitar sua ampliação e/ou cronificação, pode-se melhorar o desfecho destas doenças.
Isso nos faz lembrar da importância do auto-cuidado nas lesões de peles. Uma vez que as mesmas são bastante prevalentes e que, no Brasil, a principal porta de entrada para este tipo de transtornos é a das UBS68, nos distritos municipais.
Atualmente, nestas UBS as medidas farmacológicas para o tratamento das doenças da pele incluem diferentes classes de substâncias que são empregadas de acordo com a sintomatologia ou etiologia da dermatose, compreendendo drogas com indicações terapêuticas tais como50 detergentes, calmantes, umectantes,
anti-microbianos, descamantes, redutores e queratoplásticos, rubefascientes, descorantes, desseborréicos e anti-inflamatórios, entre outras, sendo estas empregados principalmente em formulações para uso tópico como loções, cremes e pomadas 43,69,70. A aplicação de medicamentos diretamente nos locais comprometidos
nestas doenças se insere com grande vantagem no campo do auto-cuidado, já que permite a liberação direta do agente terapêutico no órgão-alvo, com menor chance de absorção sistêmica e de ocorrerem efeitos adversos decorrentes desta50.
Do ponto de vista do presente estudo, a promoção do auto-cuidado no âmbito da APS nas UBS é também relevante uma vez que pesquisadores do Programa de Pós Graduação em Ciências da Saúde (PPGCS) da Universidade do Sul de Santa Catarina (UNISUL) desenvolvem, desde o ano de 2016, ao lado de professores de diferentes cursos de graduação da área da saúde, ações de ensino-pesquisa- extensão por meio do projeto institucional de extensão denominado FITOSUS, junto à comunidade atendida pela UBS do Bairro São Sebastião, Palhoça/SC. A equipe coordenadora do projeto é composta por professores da UNISUL, por profissionais da equipe de saúde da família da referida UBS, bem como por profissionais da Secretaria de Saúde do município de Palhoça/SC.
Entre os objetivos pretendidos para a população, este projeto de extensão visa orientar a população sobre o plantio adequado e sustentável das plantas medicinais; ensinar a população sobre as principais indicações das plantas medicinais e uso adequado; orientar a população sobre a coleta, a desidratação e o empacotamento das plantas medicinais; orientar a população sobre a forma adequada de preparo de remédios simples a partir de plantas tradicionalmente conhecidas da medicina popular e, desenvolver a capacidade da população para o auto-cuidado em saúde. Parte da atuação dos professores da UNISUL que compõem a equipe coordenadora deste projeto envolveu a implantação de uma horta comunitária anexa a esta UBS e, neste local, são realizadas ações de promoção do uso de plantas medicinais no auto-cuidado, onde futuramente poderia ser estimulado o uso de plantas com reconhecida ação anti-inflamatória tópica no auto-cuidado de doenças de pele.
Esta questão ganha uma conotação ainda mais importante do ponto de vista dos gastos públicos, quando avaliada a carga de doença relacionadas às mesmas, conforme já mencionado anteriormente. De acordo com Hay e colaboradores (2014)49,
a alta carga de incapacidade de algumas doenças como o eczema permanece globalmente consistente, enquanto em parte, reflete a crescente prevalência de DA, mesmo em áreas onde antes era incomum. Os autores ainda discorrem que estas doenças vêm assumindo importância mesmo em faixas etárias como a de crianças em torno de um ano de idade ou idosos acima dos 70 anos, que sofrem com eczemas, ulcerações, infecções e pruridos. Além disso, altas taxas de prevalência de certas doenças de pele, particularmente infecções, podem ocorrer em ambientes comunitários ou institucionais, como por exemplo por escabiose, que pode afetar mais de 60% das pessoas que vivem em certas comunidades71.
Assim, a utilização de estratégias terapêuticas baratas, eficazes e seguras no cuidado da população, visando abrandar sinais e sintomas de ordem auto-limitada e de baixa gravidade (irritação, coceira, descamação), como é o caso da inflamação observada em muitas destas doenças da pele, poderia ser uma alternativa importante a ser explorada neste nível de baixa complexidade do nosso sistema de saúde, da APS. Esta hipótese é reforçada pelo autor Hay e seus colaboradores (2014)49 que mencionam que o impacto das doenças da pele deve ser visto em termos
de necessidades locais de saúde, uma vez que as variações regionais de incapacidade pelas mesmas podem refletir diferenças na prevalência e na disponibilidade de cuidados de saúde. Estudos que avaliem a eficácia e a segurança
de tais estratégias terapêuticas anti-inflamatórias como as plantas são, portanto, importantes como parte da etapa pré-clínica de uma investigação.
Assim, modelos animais que servem para a triagem da atividade anti-inflamatória tópica de diferentes compostos são importantes nesta etapa pré-clínica de desenvolvimento de ferramentas terapêuticas porque, ainda que o progresso recente com métodos alternativos ao uso de animais como as análises com células-tronco tenha avançado, nenhum modelo atualmente translaciona integralmente os resultados das pesquisas para o que pode ser esperado na fase clínica com estudos do tipo ensaios clínicos72,73. Apesar dos modelos in vitro abordarem vias de reparo de
populações celulares específicas, eles não são capazes de mimetizar a complexidade do processo de uma lesão tecidual em um ser vivo73. Nesse contexto, entende-se que
os modelos animais ainda são necessários para elucidar os mecanismos fisiopatológicos de todo processo que leva ao reparo tecidual esperado nas doenças de pele21.
O modelo de edema de orelha induzido por OC vem sendo empregado na literatura para estudo de doenças inflamatórias da pele74-77. Este óleo é extraído da
planta Croton tiglium L. e é mais conhecido em seus usos como poderoso purgante e como irritante da pele78. No tecido cutâneo produz eritema, erisipela, eczema e
pústulas de herpes. Os principais constituintes do óleo desta planta incluem os forbol-ésteres, dentre os quais o TPA se destaca25. Um dos principais motivos para a escolha
deste modelo leva em consideração aspectos de custo-benefício, principalmente por que este é um modelo no qual o processo inflamatório se desenvolve de maneira rápida, não invasiva e com manejo simples da técnica, além de ser de fácil reprodutibilidade e apresentar baixos custo e risco, o que torna possível reduzir o número de animais a serem empregados nas pesquisas24.
No entanto, apesar destas vantagens, do ponto de vista da especificidade é importante ressaltar que o edema de orelha induzido por óleo de cróton não é o melhor modelo, uma vez que o mesmo não reproduz características macroscópicas, histológicas e bioquímicas (mediadores inflamatórios específicos) análogas às observadas na psoríase e na DA, por exemplo, estando mais voltado para a triagem inicial da atividade anti-inflamatória dos compostos a partir da análise de sua ação sobre aspectos tais como o edema, a descamação, a infiltração celular e as alterações na derme e nos vasos sanguíneos.
As ações do TPA são baseadas na sua capacidade de ativar a proteína quinase C, que por sua vez aciona outras cascatas enzimáticas como proteína quinases ativadas por mitógenos e fosfolipase A2 ocorrendo à liberação do fator de ativação
plaquetária79. Esta sequência de episódios, em diferentes células, é responsável por
efeitos como o aumento da permeabilidade vascular, a vasodilatação, a migração de leucócitos polimorfonucleares (principalmente neutrófilos), a liberação de histamina e serotonina e a síntese de derivados do AA, as PGs, os tromboxanos, além de leucotrienos79. A partir disto, utiliza-se experimentalmente a administração do OC na
orelha de animais, geralmente camundongos, com administrações aguda ou crônica. A aplicação única do OC mimetiza a fase precoce da inflamação, por gerar atividade edematogênica importante e possibilitam predizer o efeito de substâncias sobre condições de inflamação aguda da pele. Por outro lado, após múltiplas aplicações do OC sobre a pele, possibilitando predizer o efeito de substâncias sobre condições de inflamação crônica da pele, nas quais ocorrem mudanças no perfil de células presentes no local, bem como no grau de ativação e diferenciação destas células, além de ser possível visualizar-se a hiperplasia epidérmica, ou acantose, de maneira mais intensa79,80.
1.1.5. Casearia sylvestris e propriedades de interesse para tratamento da psoríase e da DA
Os tópicos apresentados anteriormente ressaltaram a importância de novas alternativas terapêuticas com propriedades anti-inflamatórias tópicas, que possam ser empregadas no auto-cuidado da população, como as plantas medicinais. As plantas medicinais podem ser promissoras dentro das práticas integrativas e complementares do SUS, mas necessitam de comprovação de eficácia a partir de estudos pré-clínicos que comprovem os possíveis benefícios que podemos esperar para estas novas terapias.
A planta Casearia sylvestris é conhecida popularmente como guaçatonga, erva-de-lagarto e café-bravo, sendo um arbusto que pode atingir até seis metros de altura e que faz parte da família Salicaceae12. É encontrada em muitos biomas, incluindo a
Mata Atlântica e o Cerrado brasileiro81, além de ser vista em países como México,
Argentina, Uruguai, Cuba, Porto Rico, Bolívia e Peru12. Entre seus constituintes
(di e sesquiterpenos) que são encontrados em várias partes da plant, principalmente nas folhas82.
A Casearia sylvestris é habitualmente utilizada por algumas tribos indígenas, principalmente no tratamento de processos patológicos inflamatórios13, lesões
cutâneas83 e infecções microbianas84. Uma revisão recente também registrou outros
usos populares incluindo tanto o uso oral quanto tópico no tratamento de aftas, herpes simples, úlceras gástricas, feridas, picadas de insetos, entre outros12. Do ponto de
vista do uso tópico da Casearia sylvestris no tratamento das doenças da pele cuja fisiopatologia inclui aspectos inflamatórios, é importante ressaltar algumas propriedades da planta observadas em estudos pré-clínicos que poderiam se correlacionar com um possível benefício da planta nestas condições.
Primeiramente, diferentes estudos20,85 observaram atividade do extrato aquoso
bruto das folhas da planta como inibidores de enzimas da família das fosfolipase A2.
Conforme revisão publicada por Yamamoto e colaboradores (2015)86, a família das
fosfolipases A2 estão envolvidas no fornecimento de ácidos graxos que são
importantes para a homeostasia da pele, sendo que perturbações do metabolismo lipídico cutâneo pode afetar o funcionamento do estrato córneo ou dos queratinócitos, levando a distúrbios da pele como a psoríase e a DA, entre outras doenças. Ainda nesta revisão, os autores registraram que em estudo com camundongos transgênicos para se obter overexpression de uma classe de fosfolipase A2 apresentaram
perturbações robustas da pele, incluindo hiperplasia das glândulas epidérmica e sebácea, distorções de folículos pilosos e formação de cisto, mas, principalmente, exibiram a epiderme com hiperqueratose e espessamento do estrato córneo. A partir disto, podemos pensar que a inibição da atividade de enzimas da família das fosfolipases A2 pelo extrato da Casearia sylvestris no modelo do OC, poderia causar
redução destas anormalidades, uma vez que neste modelo é possível visualizar-se estes dois parâmetros (hiperqueratose e acantose) com o uso de técnicas de histologia.
Além disso, quanto ao edema e à infiltração celular, trabalho prévio realizado em nosso laboratório16 demonstrou a capacidade do EBHA das folhas da planta Casearia sylvestris em reduzir a migração de leucócitos para o lavado bronco alveolar
em modelo de pleurisia em ratos, além de diminuir a atividade da enzima mieloperoxidase (MPO) que sugere que dentre estes leucócitos os neutrófilos sejam as principais células afetadas. No mesmo estudo ainda, observou-se que o tratamento
prévio dos animais, por via oral, reduziu a produção de marcadores relacionados ao estresse oxidativo. Estes dados, somados ao conhecimento sobre o uso popular das folhas da planta em bandagens na pele para tratamentos de feridas, úlceras e picadas de serpentes12 sugerem que o extrato da planta poderia também apresentar ações
benéficas quando empregado topicamente em condições inflamatórias da pele, sendo que dados sobre estes efeitos não foram encontrados na literatura até o momento.
Diante do exposto, justifica-se o presente estudo uma vez que se pode perceber que a epidemiologia das doenças da pele é grave ao redor do mundo, com grande prevalência, carga de doença e impacto na qualidade de vida dos pacientes acometidos. A implantação de medidas de auto-cuidado junto à população visando abrandar sinais e sintomas de ordem auto-limitada e de baixa gravidade (irritação, coceira, descamação, inflamação) em indivíduos acometidos por doenças da pele, poderia ser uma medida importante a ser explorada no nível de baixa complexidade do nosso sistema de saúde do país.
Além disso, atualmente as medidas farmacológicas para o tratamento das doenças da pele incluem diferentes classes de substâncias que são empregadas de acordo com a sintomatologia ou etiologia da dermatose que, no caso da psoríase e da DA, incluem agentes com atividade anti-inflamatória. A utilização de estratégias terapêuticas baratas, eficazes e seguras a partir de plantas com propriedades anti-inflamatórias, como é o caso da Casearia sylvestris poderia ser uma prática integrativa e complementar a ser explorada, desde que sua eficácia e segurança seja preliminarmente avaliada em estudos pré-clínicos em modelos animais.
2. OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
Avaliar a atividade anti-inflamatória tópica para o EBHA-CS nos modelos de edema de orelha induzido aguda ou cronicamente pela aplicação de OC em camundongos.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
• Investigar macroscopicamente a influência do tratamento tópico com EBHA-CS nos dois modelos;
• Analisar parâmetros bioquímicos da influência do EBHA-CS sobre parâmetros inflamatórios do edema de orelha agudo;
• Examinar parâmetros teciduais da influência do EBHA-CS sobre parâmetros inflamatórios e de reorganização da epiderme no modelo de edema de orelha crônico.
3.MÉTODOS
3.1 TIPO DE ESTUDO
Estudo experimental, pré-clínico. O projeto foi realizado no Laboratório Experimental de Neurociência (LANEX), no Bloco I2 da Unidade Pedra Branca do Campus da Universidade do Sul de Santa Catarina.
3.2 MATERIAL E EQUIPAMENTOS
Para a mensuração do edema de orelha foi usado micrômetro Mitutoyo® Series
293 (Suzano, São Paulo, Brasil). As análises de nitrito/nitrato e de MPO, foram avaliadas em Espectrofotômetro (U2010, Hitachi®, do Laboratório de Neurobiologia de
Processos Inflamatórios e Metabólicos- UNISUL). As análises histológicas utilizaram sistema manual de inclusão em parafina, micrótomo rotativo (Leica® RM2125RT, do
Laboratório de Neirociências Experimental) e coloração com Hematoxilina & Eosina ou Tricrômio de Masson (NewProv®, Pinhais, PR). Para a aquisição das imagens
utilizou-se um Microscópio Biológico Standard 0400S da Opticam Microscopy Technologyâ acoplado a sistema de captura com software OPTHD 3.7 (São Jose dos
Campos, São Paulo, Brasil).
Além disso, foram usados as seguintes drogas, solvente e reagentes: OC e dexametasona (DEXA, Sigma, St. Louis, MO), xilol, etanol e acetona (Dynamics, Diadema, São Paulo). Para as análises bioquímicas utilizou-se ainda dinitrofenilhidrazina, hidroperóxido de tertbutila, albumina bovina, reagente de Griess (Sigma, St. Louis, MO), naftil etilenodiaminadicloridrato, sulfanilamida (Labsynth, São Paulo, Brasil).
3.3 ANIMAIS
Foram utilizados 96 camundongos machos Swiss, com peso de 25-35g e carca de 2,5 meses de idade, adquiridos na Universidade Federal de Santa Catarina. Os animais foram alojados em número de 20 animais por gaiola, mantidos num ciclo de luz claro/escuro (12:12h) e temperatura controlada (22 ± 2°C), com livre acesso a
ração e água. Os testes foram realizados das 8h00min às 18h00min, após ambientação dos animais à sala dos experimentos por pelo menos uma hora.
As pesquisas foram realizadas após a aprovação da Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA) da UNISUL (13.021.4.03.IV), sendo que os animais foram utilizados apenas uma vez. O número de animais por grupo foi calculado em n= 8, a partir da fórmula empregada para um teste bicaudal, comparação de médias de amostras independentes:
• n/grupo= 2 [(Zα/2 + Zβ) d/D]2, sendo:
• Zα: o valor de alfa foi fixado em 0,05;
• Zβ: o valor de beta foi fixado para um poder do teste de 90%;
• d= desvio-padrão esperado, sendo considerado o valor de 12,5 a partir de um estudo realizado anteriormente em nosso laboratório;
• D= diferença a ser detectada igual a 14,5; ou seja, estabelecendo-se uma margem de diferença em relação ao erro de 16% que podem ser procedentes de variações.
3.4 DELINEAMENTO DO ESTUDO
No primeiro protocolo de experimentos, a fim de avaliar uma possível ação da aplicação tópica do EBHA-CS sobre o edema de orelha agudo, foi avaliada a espessura basal das orelhas dos camundongos (em μm) e os animais foram submetidos a aplicação única do OC, conforme descrito no item 3.5.2.1. Decorridos 15 min, receberam os tratamentos de acordo com os grupos aos quais estavam alocados e seis h após foram feitas novas medidas do edema. Ao final do experimento os animais foram submetidos ao procedimento de Morte Indolor Assistida (MIA) e, imediatamente após, realizou-se a retirada de amostras das orelhas para análises bioquímicas. Um fluxograma desta etapa do estudo pode ser visualizado na Figura 2.
Figura 2 - Delineamento experimental do modelo de edema de orelha agudo, induzido por aplicação única de OC.
Legenda: OC= óleo de cróton, EBHA-CS = extrato bruto hidroalcoólico de Casearia sylvestris. DEXA= Dexametasona
No segundo protocolo de experimentos, a fim de avaliar uma possível ação da aplicação tópica do EBHA-CS sobre o edema de orelha induzido por aplicações repetidas do agente flogístico, foi avaliada a espessura basal das orelhas dos camundongos (em μm) e os animais foram submetidos a múltiplas aplicações do OC, conforme descrito no item 3.5.2.2. Ao final de oito dias, sendo os quatro últimos de tratamento de acordo com os grupos aos quais estavam alocados, foram feitas novas medidas do edema. Ao final do experimento (9º. dia) os animais foram submetidos ao procedimento de MIA e, imediatamente após, realizou-se a retirada de amostras das orelhas para análises histológicas conforme descrito no item 3.5.4. Um fluxograma desta etapa do estudo pode ser visualizado na Figura 3.
Figura 3 - Delineamento experimental do modelo de edema de orelha induzido por múltiplas aplicações do OC.
Legenda: OC= óleo de cróton, EBHA-CS = extrato bruto hidroalcoólico de Casearia sylvestris. DEXA= dexametasona. Painel A – Protocolo para análise da evoclução do edema de orelha ao longo dos oito dias de experimento. Painel B – Protocolo para comparação do efeito dos diferentes tratamentos ao final dos oito dias de experimento.
3.5 ENSAIOS/TESTES/TÉCNICAS
3.5.1 Coleta do material vegetal e confecção do EBHA-CS
As folhas de Casearia sylvestris foram coletadas no município de Tubarão, Santa Catarina, Brasil (S-28°28'00'', W-49°00'25'') em local onde a planta já foi reconhecida pelo agrônomo e professor Jasper Zanco, curador do Herbário Laelia
purpurata da UNISUL (voucher da espécie SRS-174). Como forma de garantir maior
consistência e reprodutibilidade aos estudos com extratos desta planta que se iniciaram em nosso laboratório no início nos anos 2000, o material vegetal vem sendo coletado sempre na mesma época do ano, a partir do mesmo exemplar vegetal presente no Horto da Unisul, Campus Tubarão/SC. Além disso, a equipe que prepara os extratos vem sendo coordenada pelo mesmo pesquisador desde então, mantendo-se rigorosamente a mesma técnica de preparo. Assim, as folhas foram mantendo-separadas dos
galhos e armazenadas em uma sala com desumidificador até sua total secagem durante duas semanas. Posteriormente foram moídas em liquidificador industrial e peneiradas em tamises de granulometrias diferentes para padronização do tamanho (850, 500, 425 e 250 μm). O conteúdo da planta resultante deste processo foi embalado e armazenado até a etapa seguinte. O material peneirado foi deixado em maceração em solução hidroalcoólica (70% de etanol) em agitação constante à temperatura ambiente de 21±3°C durante 10 dias. Em seguida, o etanol foi evaporado em rota-vapor até que o extrato estivesse concentrado. Um perfil cromatográfico para o EBHA-CS produzido sob estas condições, caracterizando as principais casearinas (compostos terpênicos) presentes no mesmo pode ser visualizado em artigo publicado recentemente19.
3.5.2 Análise do edema de orelha
O edema foi analisado pela variação na espessura da orelha (em µm), a partir das medidas basais (antes de qualquer tratamento) e após os tratamentos; a avaliação foi realizada com um micrômetro digital, na região medial da orelha e distalmente aos cumes cartilaginosos77. Ao final dos experimentos, tanto no modelo
de edema agudo quanto crônico, amostras de orelhas foram removidas e processadas para análises conforme descrito nas seções 3.5.3 e 3.5.4.
3.5.2.1 Influência do tratamento tópico com EBHA-CS no modelo de edema de orelha induzido por aplicação única de OC
Para avaliar o efeito do EBHA-CS no modelo de edema de orelha induzido por aplicação única de OC, os procedimentos foram conduzidos com base em estudo publicado recentemente87, com todas as aplicações realizadas num volume de 20
µL/sítio. A inflamação foi induzida em diferentes grupos de animais pela administração nas superfícies externas da orelha direita com OC a 2,5% (v/v em acetona, 20 µL/sítio). Após 15 min, receberam na superfície interna da mesma orelha aplicação de acetona (veículo, volume de 20 µL/sítio), DEXA (0,05 mg/sítio, dose obtida a partir de estudo anterior77, ou EBHA da planta (EBHA-CS: 0,03 a 30 µg/sítio). Estas doses
modelo revelou que as doses de 0,1 mg/sítio (97,5 ± 11,4 µm), de 0,3 mg/sítio (142,5 ± 23,3 µm) e de 1,0 mg/sítio (144,2 ± 21,4 µm) reduziram o edema de maneira estatisticamente significante (OC: 335,8 ± 20,2 µm), sem ter havido ainda diferença de efeito entre as doses testadas. A DEXA e o EBHA-CS foram diluídos em acetona. Após seis h da administração deste agente, foi registrado o edema das orelhas conforme descrito anteriormente e os animais foram submetidos, imediatamente após esta análise, ao procedimento de MIA para retirada de amostras das orelhas para análises bioquímica, conforme descrito a seguir.
3.5.2.2 Influência do tratamento tópico com EBHA-CS no modelo de edema de orelha induzido por múltiplas aplicações de OC
Já no modelo de edema de orelha induzido por múltiplas aplicações de OC, o efeito do EBHA-CS foi avaliado em acordo com estudo publicado por outros autores75.
Brevemente, diferentes grupos de animais foram observados durante oito dias. Nos dias um, três, cinco e sete os camundongos foram tratados com aplicação tópica nas superfícies externas da orelha direita com 20μL/sítio de veículo (acetona, grupo controle negativo) ou OC (2,5% v/v em acetona, três grupos de animais).
Nos dias 2 e 4 do experimento os animais foram tratados topicamente apenas com veículo (mesmas condições), enquanto do 5º ao 8º dia, diferentes grupos de camundongos receberam, duas vezes ao dia, aplicação tópica de veículo, DEXA (0,05 mg/sítio, dose retirada de Rauh et al., 201177) ou EBHA-CS na dose que mostrou
maior eficácia no experimento de edema de orelha induzido agudamente (30 µg/sítio). Para comparação do efeito do EBHA-CS ou DEXA em relação ao grupo OC, o edema foi registrado 1 h após a última aplicação dos tratamentos (no 8º dia). No dia seguinte, (cerca de 20 h após), os animais foram submetidos a MIA e amostras das orelhas foram retiradas para análise histológica, conforme descrito em seguida.
3.5.3 Influência do tratamento tópico com EBHA-CS sobre os níveis de nitrito/nitrato e sobre a atividade de MPO no modelo de edema induzido por aplicação única de OC
A análise de nitrito/nitrato foi realizada por meio da utilização da reação de Griess, adicionando-se 100μL de reagente de Griess [0,1% (w/v) naftil etilenodiaminadicloridrato em H2O e 1% (p/v) sulfanilamida em 5% (v/v) H3PO4 em
volume concentrado (1:1)]. A densidade óptica foi medida a 550 nm usando um espectrofotômetro, com os resultados sendo expressos em nmol/mg proteína16.
Para a determinação da atividade da enzima MPO, as amostras foram homogeneizadas (50 mg/mL) em 0,5% de brometo de hexadeciltri-metilamônio e centrifugados a 15.000 g por 40 min. A suspensão foi sonicada três vezes durante 30 s. Uma alíquota da solução sobrenadante foi então misturada com tetrametilbenzidina 1,6 mM e H2O2 1 mM. A atividade de MPO foi determinada colorimetricamente usando
um espectrofotômetro, por meio de alterações na absorbância a 650 nm a uma temperatura de 37oC16 e registrada em mU/mg de proteína.
Para comparar o efeito do EBHA-CS sobre os níveis de nitrito/nitrato e sobre a atividade de MPO, os valores obtidos das amostras dos animais pertencentes aos grupos tratados com o extrato da planta foram comparados aos obtidos dos animais pertencentes ao grupo que recebeu veículo após a administração de OC.
3.5.4 Influência do tratamento tópico com EBHA-CS sobre os parâmetros inflamatórios e de reorganização da epiderme
Quanto à preparação das amostras, após o procedimento de MIA as orelhas removidas dos animais foram preparadas para análise histológica. Para isto, foram fixadas em formalina 10% tamponada com fosfato 0,1 M a pH 7,2 por 48 h. Posteriormente, foram lavadas em água corrente durante 2 h e então desidratadas em série etanólica crescente para posterior inclusão em parafina a 60ºC, seguindo a metodologia histológica de rotina de Cargnin-Ferreira e Sarasquete, 2008 88. Os
materiais foram incluídos em blocos de parafina na posição vertical. Depois foram cortados em plano transversal, em seções de 5 µm em micrótomo manual rotativo. Os cortes foram estirados e recolhidos em um banho termostático a 52ºC com gelatina dissolvida (0,2%) e dispostos sobre lâminas.
Os cortes obtidos foram então desparafinizados, hidratados e corados segundo a metodologia dos mesmos autores e submetidos a diferentes colorações, para registro dos seguintes parâmetros: morfometria geral, densidade de mastócitos não-degranulados e não-degranulados e acantose, conforme descrito nas seções 3.5.4.1 a
3.5.4.4. Foi feita então a aquisição das imagens em fotomicroscópio e as imagens foram então capturadas e analisadas em diferentes aumentos (40X, 100X ou 400X) e analisadas através do software ImageJ®, em três regiões distintas para cada lâmina,
aleatoriamente.
3.5.4.1 Análise histomorfométrica das orelhas
Para esta análise, as imagens de lâminas coradas com H&E foram avaliadas quanto aos parâmetros da epiderme, da derme, de infiltração celular e de vascularização das orelhas. Os dados são apresentados na forma de imagens representativas das alterações observadas nos diferentes grupos de animais.
3.5.4.2 Análise da densidade de mastócitos degranulados e não-degranulados
Para esta análise as imagens coradas com Azul de Toluidina (ATO) foram analisadas quanto ao número de mastócitos não-degranulados e degranulados residentes, caracterizados pela coloração metacromática (fúcsia). Os resultados são apresentados como a razão entre o número de células residentes ATO positivas, pelo comprimento total da orelha (densidade= n.o células/comprimento da orelha em µm).
3.5.4.3 Análise da acantose
Para esta análise (espessamento do epitélio), as lâminas coradas em H&E foram analisadas quanto ao comprimento da camada epidérmica. Calculou-se a média a partir de três leituras para cada animal. Os resultados são apresentados como a média ± D.P. da área total de acantose em cada grupo (em µm).
Para garantia do controle de qualidade destas análises, todas as etapas foram realizadas por um único avaliador, sob coordenação de um professor orientador. Esta decisão foi tomada com o objetivo de evitar discordância entre examinadores.
