Funcional de Saccharomyces cerevisiae durante fermentação

(1)

Bioenerg

é

tica

e

Gen

é

tica

Funcional

de

Saccharomyces

cerevisiae

_cerevisiae

durante

a

fermenta

ç

ão

vin

á

ria

(Functional Genomics and Bioenergetics of

Saccharomyces

cerevisiae

during winemaking)

100º Curso de Vinificação EVB Anadia, 5 de Setembro de 2006

(2)

Bioenergética e Genética Funcional de Saccharomyces

cerevisiae durante a

fermentação vinária

Saccharomyces cerevisiae

,

uma “fábrica de álcool” complexa

Muito complexa internamente

Simples morfologicamente

(3)

Fermentação alcoólica,

uma defesa contra o stress

9 Rendimento energético muito baixo 9 Forma de conservação de energia

9 Fermentação completa conduz à estabilidade microbiológica do

mosto de uva

9 Acumulação de álcool e o esgotamento da glucose agravam o stress

ambiental

9 Mais útil ao Homem que à levedura

C

₆

H

₁₂

O

₆ +

6O

₂

6CO

₂ +

6H

₂

O

+

36ATP

+

Calor

+

Células

Equação da Respiração:

Equação da Fermentação Alcoólica:

(4)

Saccharomyces

A fermentação alcoólica e a fermentação

vinária, dois conceitos totalmente diferentes

Bioenergética e Genética Funcional de

Fermentação alcoólica:

Meio sintético

Glucose 20g/L

Processo bioquímico

dentro da célula

(5)

(6)

Bioenergética e Genética Funcional de Saccharomyces cerevisiae durante a fermentação vinária

Fermentação alcoólica

CH₃ ı HC - OH Desidrogenase alcoólica CH₃ ı C=O ı COOH CH₃ I HC=O Descarboxilase + CO₂

(7)

fermentação vinária Desidrogenase alcoólica CH₃ ı C=O ı COOH CH₃ I HC=O Descarboxilase + CO₂

Glicerol

Glicerol-P Dihidroxiacetona desidrogenase NADH NAD+ Glicerol cinase

Fermentação alcoólica

CH₃ ı HC - OH

(8)

fermentação vinária >600 compostos _{químicos !}

(glucose+frutose) > 200g/L

(9)

Resíduos de Pestícidas Leveduras

Fungos

Fermentação vinária

Processo

microbiológico

dentro da cuba

SO₂ Bactérias acéticas Bactérias Lácticas

(10)

A gestão da fermentação vinária

Na óptica da levedura:

9 Garantir o domínio de S. c.

9 Assegurar uma boa nutrição

das células

9 Garantir a integridade das

membranas e outros alvos

celulares

9 Evitar a presença ou

acumulação de toxinas

celulares

(11)

A gestão da fermentação vinária

Na óptica do enólogo:

9 Garantir a fermentação completa dos

açúcares

9 Evitar oxidações e reduções intensas

9 Evitar desvios da fermentação alcoólica

9 Dar especial atenção aos outros processos

bioquímicos e químicos

9 Evitar a actividade de bactérias acéticas

9 Controlar a actividade de bactérias lácticas

9 Controlar extracção de matéria corante

(12)

Descrição do projecto

Caracterizar a

performance

da levedura

durante a fermentação vinária

Caracterizar a

performance

da levedura

durante a fermentação vinária

Objectivo Geral:

Bioenerg

é

tica

e

Gen

é

tica

Funcional

de

Saccharomyces

cerevisiae

durante

a

fermenta

ç

_ç

ão

_ão

vin

_vin

á

_á

ria

_ria

(Functional Genomics and Bioenergetics of

Saccharomyces

_{Saccharomyces}

cerevisiae

(13)

Condições experimentais

1. Mosto de uva

• Branco, tratado com 50 ppm de SO₂, decantado e guardado a –80ºC

• Descongelado, centrifugado e filtrado sucessivamente por membranas de • 1,2µm, 0,45µm e 0.22µm

• pH 3,32 ; Glucose 109 g/L e Frutose 145 g/L

2. Levedura

• Estirpe: S. cerevisiae ISA 1000 (isolada a partir de Fermivin)

• Inóculo: feito a partir de culturas frescas em YPD sólido, em mosto estéril, incubado a 25ºC com agitação orbital durante 15h

• Inoculação: 1x106 _células/ml

3. Ensaios

• Balão de 1L com 800mL de mosto estéril, termostatizado a 25ºC. • Agitação magnética fraca

(14)

Bioenergética e Genética Funcional de Saccharomyces cerevisiae durante a fermentação vinária

Condições experimentais

0 20 40 60 80 100 120 140 160 0,01 0,1 1 10 0,1 1 10 100 D.O. 640nm Tempo (h) início fase exponencial fase exponencial início fase estacionaria final da fermentação

(15)

Resultados Preliminares

Parâmetros fisiológicos:

1. Consumo de glucose e frutose e produção de etanol

2. Viabilidade celular e capacidade de redução do azul de

metilene (25ºC)

3. Velocidade inicial de transporte de glucose e frutose

4. pH intracelular e determinação do conteúdo em

trealose e glicogénio

5. Monitorização in vivo do consumo de glucose e

frutose (13C-NMR)

1. Permeabilidade das células aos H

+

_capacidade

de bombear H

+

(16)

Saccharomyces

Parâmetros fisiológicos

1. Consumo de glucose e frutose e produção de etanol

0 20 40 60 80 100 120 140 160 0,01 0,1 1 10 0,1 1 10 100 D.O. 640nm Tempo (h) UF C/ml Ce l. to tai s/m l Cel. viáve is /ml 28.8 x106 6 6 6 ₀6 06 6 6 6 ₁₀6 _8x106 12.45x106 t (h) D.O.640nm (mg/ml)p. seco

Bioenergética e Genética Funcional de

cél. viáveis

(UFC/ml) cél. activas(cel./ml) cél. totais(cel./ml)

0,804 1,31 1,14x10 2.72x10 5.6x1

10

18 _2,6 _2,3 _3.52x1 _{10.08x10 13.28x10}

36 _15,2 _6,15 _29.7x10 _48.0x _80.

(17)

Parâmetros fisiológicos

2 .Viabilidade celular e capacidade de redução do azul de metilene (25ºC)

0 20 40 60 80 100 120 140 160 0,01 0,1 1 10 3,00 3,25 3,50 3,75 4,00 0,96 0,98 1,00 1,02 1,04 1,06 1,08 1,10 1,12 DO D.O. 640 nm Tempo (h) pHext pH ext densidade Densidade 100 120 140 160 0 20 40 60 80 0 20 40 60 80 100 120 140 160 0,01 0,1 1 10 0 20 40 60 80 100 120 140 160 Tempo (h) gl ucose (g/L) frutose (g/L) etanol (g /L ) D.O. 640 nm

(18)

Parâmetros fisiológicos

3. Velocidade inicial de transporte de glucose e frutose

0 20 40 60 80 100 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 v (mmolg -1 h -1 ) [açúcar] (mM) 0,29 21 0,39 48 1,035 100 1,44 164 Frutose 0,26 5 0,52 24 0,78 35 1,31 42 Glucose Vmax (mmol g-1 _h-1₎ Km (mM) Vmax (mmol g-1_h-1₎ Km (mM) Vmax (mmol g-1 _h-1₎ Km (mM) Vmax (mmol g-1_h-1₎ Km (mM) Final da fermentação Início fase estacionária Fase exponencial Início fase exponencial Açúcar Meio da fase exponencial Fim da fermentação Glucose( , ) Frutose ( , )

(19)

Parâmetros fisiológicos

4. pH intracelular e conteúdo em trealose e glicogénio

20 40 60 80 100 Trealose Glicogénio U n idade s arb itrárias pHin 0,381 0,079 1,027 1,297 4,755 7,474 3,409 3,749 Início fase exponencial Fase exponencial Início fase estacionária Final da fermentação Fase de crescimento Glicogénio (mg/g) Trealose (mg/g) pHin 5.34 6,21 6,47 6,40 Início f. exponencial F. exponencial Início f. estacionária Final da fermentação

(20)

Parâmetros fisiológicos

5. Monitorização in vivo do consumo de glucose e frutose (13C-NMR)

0 10 20 30 40 50 60 10 20 30 40 50 Frutose (mM) Time (min) 0 5 10 15 20 25 30 35 40 2 4 6 8 [frutose] (mM) v (mmolg -1 h -1 ) 0 5 10 15 20 25 30 35 40 2 4 6 8 v (mmolg -1 h -1 ) 0 5 10 15 20 25 30 35 40 10 20 30 40 50 Glucose (mM)

Time (min) _{[glucose] (mM)}

A

B

Consumo de Glucose e frutose, monitorizado on line por 13C-RMN in vivo.

(A) Consumo do anómero a ( ) e anómero b ( ) e açucar total ( , ). (B) Exemplo das cinéticas de consumo de glucose ( ) e frutose ( ) calculados com base no consumo do açúcar total.

(21)

Parâmetros bioenergéticos

1. Permeabilidade das células aos H

+

_{e capacidade de bombear H}

+

1. Permeabilidade das células aos H

+

_{e capacidade de bombear H}

+

Início fase exponencial Fase exponencial Início fase estacionária Final da fermentação Fase de crescimento Início f. exponencial F. exponencial Início f. estacionária Entrada passiva de H+ _{de bom} (mmol g-1_h-1₎ Capacidade bar H+ (mmol g-1_h-1₎ 0,221 _0,226 0,699 _0,559 0,083 _0,507 0,176 0,032 Final da fermentação