Caracterização taxonômica e potencial de biodegradação de hidrocarbonetos por bactérias isoladas de efluentes salinos associados a petróleo

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ELMER ERASMO GONZALES LIMACHE

“CARACTERIZAÇÃO TAXONÔMICA E POTENCIAL DE

BIODEGRADAÇÃO DE HIDROCARBONETOS POR

BACTÉRIAS ISOLADAS DE EFLUENTES SALINOS

ASSOCIADOS A PETRÓLEO”

Campinas

2015

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RESUMO

A água residuária da extração de petróleo é altamente salina e contém uma mistura complexa de hidrocarbonetos, muitos dos quais são altamente tóxicos.Com o aumento da preocupação em preservar o meio ambiente, as tecnologias baseadas em processos biológicos para o tratamento das águas de efluentes estão recebendo atenção especial por serem mais econômicas e versáteis. No entanto, tais processos são influenciados por fatores, tais como: pH, temperatura, salinidade e pressão. Condições extremas destes fatores podem matar ou inibir espécies que não estejam adaptadas. O presente trabalho teve como objetivos identificar e caracterizar 141 bactérias isoladas de águas de produção e lodos ativados do Terminal Marítimo Almirante Barroso (TEBAR-SP) utilizando técnicas de taxonomia molecular, e avaliar o potencial de biodegradação frente a distintos hidrocarbonetos do petróleo, sob condições de hipersalinidade. O DNA genômico extraído de todos os isolados foi utilizado em reação de PCR para amplificação do gene que codifica para o RNAr 16S. O sequenciamento e a análise filogenética do gene RNAr 16S revelaram que estes isolados pertenciam a 20 gêneros distintos, Idiomarina (48), Halomonas (32), Marinobacter (20), Modicisalibacter (3), Arhodomonas (2), Vibrio (1), Pseudoalteromonas (1), Shewanella (1), Alcanivorax (3), Nitratireductor (2), Marispirillum (2), Thioclava (1), Martelella (2), Pusillimonas (2), Brevibacterium (6), Dietzia (3), Rhodococcus (2), Bacillus (2), Staphylococcus (2) e Salegentibacter (4). O método de tipagem molecular RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) foi utilizado para diferenciar os isolados em nível infra-específico, permitindo identificar 49 perfis genéticos diferentes entre os 141 isolados. Os resultados obtidos no presente estudo demonstraram uma alta diversidade taxonômica da fração cultivada da comunidade de bactérias aeróbias presente em águas de produção e lodos ativados, assim como uma alta capacidade dos isolados para suportar concentrações elevadas de salinidade. A habilidade dos isolados para degradar hidrocarbonetos sob condições de hipersalinidade foi avaliada por cromatografia gasosa. Os resultados evidenciaram a preferência das bactérias pela biodegradação de hidrocarbonetos aromáticos.

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ABSTRACT

The wastewater from oil extraction is highly saline and contains a complex mixture of hydrocarbons, many of which are highly toxic. With the increasing concern to preserve the environment, technologies based on biological processes for the treatment of wastewater are receiving special attention, since they are more economical and versatile, however, such processes are influenced by factors such as pH, temperature, salinity and pressure. Extreme conditions of these factors can kill or inhibit species not adapted to such environments. This study aimed to identify and characterize 141 bacteria isolated from production water and activated sludge derived from Ferry Terminal Almirante Barroso (TEBAR-SP) using molecular taxonomy techniques, and to evaluate the potential for biodegradation of distinct oil hydrocarbons under hypersaline conditions. Genomic DNA extracted from all isolates were used in PCR reactions for amplification of the gene coding for 16S rRNA. The sequencing and phylogenetic analysis of the 16S rRNA gene revealed that these isolates belonged to the following 20 different genera: Idiomarina (48), Halomonas (32), Marinobacter (20), Modicisalibacter (3), Arhodomonas (2), Vibrio (1), Pseudoalteromonas (1), Shewanella (1), Alcanivorax (3), Nitratireductor (2), Marispirillum (2), Thioclava (1), Martelella (2), Pusillimonas (2), Brevibacterium (6), Dietzia (3), Rhodococcus (2), Bacillus (2), Staphylococcus (2) and Salegentibacter (4). The molecular typing method RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) was used to differentiate isolates at the infra-specific level, allowing the identification of 49 different genetic profiles out of 141 isolates. The results obtained in this study demonstrated a high taxonomic diversity of the cultivated fraction of the aerobic bacterial community present in production waters and activated sludge, as well as a high capacity of the individual members to support high levels of salinity. The ability of the isolates to degrade hydrocarbons under hypersaline conditions was evaluated by gas chromatography. The results showed the preference of bacteria by biodegradation aromatic hydrocarbon compounds.

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SUMÁRIO

RESUMO... VII ABSTRACT ... IX DEDICATÓRIA ... XIII AGRADECIMENTOS ... XV 1. INTRODUÇÃO ... 1 2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ... 4

2.1. Tratamento Biológico de Efluentes ... 4

2.1.1. Microbiologia de Lodos Ativados ... 6

2.2. Micro-organismos Halofílicos ... 7

2.2.1. Micro-organismos Halofílicos Extremos ... 8

2.3. Genes Envolvidos na Biodegradação ... 10

2.3.1. Alcano Monoxigenases - alk ... 10

2.3.2. Dioxigenases que Hidroxilam Anéis Aromáticos (ARHDs) ... 12

2.4. Biodegradação microbiana de hidrocarbonetos do petróleo e seu potencial biotecnológico ... 13

2.4.1. Potencial Biotecnológico ... 14

2.5. Técnicas Moleculares no Estudo dos Micro-organismos ... 17

2.5.1. RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) ... 18

2.6. Características da área de coleta ... 19

3. OBJETIVOS ... 21

3.1. Objetivo geral ... 21

3.2. Objetivos específicos ... 21

4. MATERIAL E MÉTODOS ... 22

4.1. Isolamento e repique das bactérias ... 22

4.1.1. Isolamento Bacteriano ... 22

4.1.2. Repique das Bactérias ... 23

4.2. Caractericação Filogenetica dos Micro-organismos ... 26

4.2.1. Extração de DNA genômico ... 26

4.2.2. Amplificação e Purificação de genes RNAr 16S ... 26

4.2.3. Sequenciamento dos genes RNAr 16S ... 27

4.2.4. Montagem dos contigs e análise filogenética ... 27

4.2.5. Tipagem por RAPD ... 28

4.3. Triagem dos genes catabólicos ... 28

4.4. Triagem para atividade de degradação de hidrocarbonetos ... 29

4.5. Ensaios de biodegradação... 30

5. RESULTADOS ... 31

5.1. Identificação do isolados ... 31

5.2. Tipagem por RAPD ... 37

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5.4. Triagem funcional para atividade de degradação de hidrocarbonetos .. 43

5.5. Biodegradação de hidrocarbonetos pelos isolados selecionados ... 45

6. DISCUSSÃO ... 50

7. CONCLUSÃO ... 57

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DEDICO

A minha querida família, minha mãe Rosa, meu pai Erasmo, meus irmãos Miguel, Mariela, Rolf e Renato, a meus queridos sobrinhos Arnold e Erika. Que sempre me deram força mesmo na distancia ... vocês são o mais importante para mim.

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AGRADECIMENTOS

Quero expressar os meus mais sinceros agradecimentos a todas as pessoas que me acompanharam e me ajudaram neste caminho.

Agradeço primeiramente a Deus que me acompanhou a cada momento durante estes anos.

A minha prezada orientadora Dra Valéria Maia de Oliveira pela oportunidade e toda a contribuição para minha formação profissional. Pelos conselhos, exemplo e o carinho que sempre mostrou com todos seus alunos, muito obrigado.

Às professoras Dra. Fabiana Fantinatti, Dra. Derlene Attili, Dra. Cynthia Canedo da Silva, Dra. Virginia Medeiros de Siqueira, Dra Lucélia Cabral, pela ajuda e amizade de todos esses anos de convivência.

Ao Dr. Adilson Sartorato, e toda equipe do laboratório de Química Organica e farmacêutica, em especial a Sinécio e Adriana pela ajuda constante.

A todo o equipe da DRM:

À todos os membros da banca examinadora Profa. Dra. Lucélia Cabral, Profa. Dra. Suzan Pantarato de Vasconcellos, Dra. Lara Durães Sette, Dra. Marta Cristina Texeira Duarte.

Ao Programa PEC-PG pelo auxilio financeiro e à UNICAMP pela excelente educação publica e dequalidade.

À Profa. Dra. Lisa Gieg que me orientou na Universidade de Calgary, pelas técnicas ensinadas e pela preocupação com a minha formação.

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Especialmente quero agradecer aos meus amigos do Laboratório de Recursos Microbianos, Sanderson, Gileno, Milene, Virginia, Leandro, Maria Raphaella, Alysson, Raphaella, Bruna, Natalia, Natali, Mariana Bueno, Mariana Barato, Jackeline, Fernando, os dois Thiagos, Renan, Douglas, Dani, Samantha, Daiane, Babu, Claudia, Paula, Marcela, Patricia, por todos os momentos vividos, pelas ajudas e trocas de conhecimento. A Viviane, pela ajuda em Biologia Molecular e por cada momento compartilhado dentro e fora dolaboratório e por sua sincera amizade e apoio. A Milena, por toda a ajuda em Microbiologia, a Ericka, pelos inumeráveis momentos engraçados, você fez o laboratório mais feliz. A todos vocês por terem tornado estes anos mais bonitos e coloridos.

Finalmente quero agradecer a todos meus amigos que fiz durante esta larga jornada em Campinas, e que fizeram meus finais de semana mais alegres, a Elias, a Benedito, a Stellen, a Melissa, que me alegraram nos momentos mais difíceis com sua amizade, a toda a comunidade Peruana da UNICAMP, a todos meus amigos Brasileiros e mineiros (Giovanni, Maria Jose, Jose Mari, Leandro, Hugo, Alex, Athila).

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1. INTRODUÇÃO

A indústria do petróleo é um grande consumidor de água, gerando em contrapartida, grandes quantidades de despejos líquidos, alguns de difícil tratamento (Barcellos, 1986). Praticamente todas as operações, desde o refino até os tratamentos finais, requerem grandes volumes de água (da ordem de 2,5 m3 de água/m3 de óleo refinado) (Nemerow, 1971).

As crescentes exigências ambientais e a mudança na legislação relativa ao pagamento pelo uso da água têm estimulado muitas indústrias a buscar meios de reduzir o consumo de água e considerar a possibilidade de reutilizar os efluentes tratados. No decorrer deste século, vários tipos de tratamento de efluentes industriais foram desenvolvidos e aperfeiçoados, com a finalidade de atenuar a poluição causada pelo lançamento de águas residuais industriais em corpos de água receptores (Abed et al., 2006).

A indústria petroleira tem aumentado gradativamente a capacidade de explorar águas profundas. A consequência deste avanço na produção é a geração de resíduos advindos desse processo, tais como compostos orgânicos, e tendo como agravante uma alta concentração salina (Freire et al., 1998).

A salinidade e a temperatura são os parâmetros chave que influenciam no processo de degradação de compostos derivados do petróleo, pois influenciam na estrutura e fisiologia das comunidades microbianas existentes e mudam as propriedades físico-químicas dos contaminantes, como por exemplo a solubilidade e viscosidade (Abed et al., 2006).

O alto teor de sal, a mistura complexa de compostos orgânicos e inorgânicos, e o óleo presente na agua de produção representam desafios ao emprego de tratamentos biológicos, sendo, nos últimos anos, estudadas tecnologias alternativas para degradação de seus contaminantes orgânicos. Os componentes deste efluente geralmente incluem minerais dissolvidos, constituintes oleosos dissolvidos e dispersos, produtos químicos

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empregados durante o processo de produção, sólidos e gases dissolvidos (Oliveira & Oliveira, 2000).

Os lodos ativados consistem em um método biológico utilizado nesta indústria para o tratamento das águas de produção, mas em alguns casos a presença de contaminantes com alto grau de toxicidade e persistência pode inibir a aplicação de tratamentos biológicos. Os lodos ativados são um sistema geralmente capaz de prover um tratamento adequado para a indústria do petróleo, mas tem sido reportados vários casos de problemas operacionais, principalmente com respeito à estabilidade e carga microbiana (Aboulhassan et al. 2006).

A água de produção de petróleo é um efluente salino gerado durante a extração de petróleo, tanto onshore quanto offshore. Volumes substanciais de água salina são produzidos juntamente com o petróleo. A quantidade de água gerada aumenta consideravelmente com a idade do poço e pode variar de 0,6 L água de produção/ L petróleo produzido (Sauer, 1991), e até exceder em 10 vezes o volume de óleo produzido (Ribeiro, 1995).

As águas de produção coletadas em reservatórios de petróleo podem conter bactérias halófilas e halotolerantes, as quais constituem linhagens promissoras com elevado potencial de degradação sob condições extremas de salinidade e temperatura (Nazina et al. 2005; Da Cunha et al. 2006).

Em geral, a diversidade e o potencial metabólico das bactérias degradadoras de hidrocarbonetos tendem a diminuir à medida que as condições ambientais se tornam mais extremas (Margesin & Schinner, 2001). Segundo os estudos de Rhykerd et al. (1995), a taxa de degradação de hidrocarbonetos diminuiucom o aumento da salinidade, e a biodegradação não pôde ser detectada acima de 15% de sal.

Em elevada salinidade, a biodegradação de hidrocarbonetos é diminuída devido à menor diversidade microbiana e à reduzida solubilidade dos hidrocarbonetos e do oxigênio (Patzelt, 2005; Mnif et al., 2009).

Nos últimos anos, diversos gêneros halofílicos e halotolerantes pertencentes ao domínio Bacteria tem sido relatados, entre estesHalomonas (Wang et al. 2007),

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Alcanivorax (Yakimov et al. 1998), Marinobacter (Gauthier et al. 1992), Dietzia (Borzenkov et al. 2006), Oleiphilus (Golyshin et al. 2002), Oleispira (Yakimov et al. 2003), Bacillus(Kumar et al. 2007; Sass et al. 2008), Geobacillus (Chamkha et al. 2008), dentre outros. Até o momento, a espécie de que se tem conhecimento que apresenta maior potencial para degradação de hidrocarbonetos em condições de alta salinidade (30%) é Streptomyces albiaxialis K-3959 (Kuznetsov et al. 1992).

Neste sentido, o objetivo deste trabalho foi identificar e caracterizargeneticameneete linhagens halofílicas isoladas de terminal petrolífero, e avaliar qualitativa e quantitativamente o seu potencial de degradação de hidrocarbonetos em condições de alta salinidade.

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2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1. Tratamento Biológico de Efluentes

Os tratamentos baseados em processos biológicos permitem tratar grandes volumes de efluente, apresentam menor custo e simplicidade operacional (Freire et al., 2000; Da Motta et al., 2003), sendo que para efluentes complexos, o processo biológico mais amplamente usado é o tratamento por lodos ativados, cujo nível de eficiência é elevado (Jenkins et al., 2003). O lodo ativado pode ser definido como o floco produzido num esgoto bruto ou decantado mais micro-organismos, na presença de oxigênio dissolvido, e acumulado em concentração suficiente, graças ao retorno de outros flocos previamente formados (Jordão & Pessôa, 1995).

Os flocos são formados por fragmentos orgânicos não digeridos, por uma fração inorgânica (por exemplo, grãos de areia), por células mortas e, principalmente, uma grande variedade de bactérias (Figura 1) (Silveira & Bazzanella, 2013). A composição microbiana do lodo ativado não é constante, refletindo as condições àsquais o lodo ativado é exposto durante a operação do sistema (Kiang & Metry, 1982).

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Segundo Jordão & Pessôa (1995), o princípio geral do tratamento microbiológico de efluentes consiste em acelerar o processo de degradação dos compostos orgânicos que serão removidos pelos microrganismos, através de processos aeróbios ou anaeróbios, transformando-os em compostos menos tóxicos e de baixo peso molecular. A matéria orgânica oxidada é utilizada na síntese de macromoléculas e na formação de novas células microbianas. A oxidação bioquímica dos compostos orgânicos e inorgânicos presentes nos efluentes é mediada por uma população microbiana diversificada e mantida, geralmente, em suspensão num meio aeróbio ou anaeróbio.

Para um sistema aeróbio, o processo biológico de degradação da matéria orgânica ocorre no tanque de aeração, onde entra em contato com o efluente a ser tratado, sendo este mantido sob agitação e aeração. O fluxo de ar no reator deve suprir a necessidade de oxigênio dos micro-organismos e manter os sólidos em suspensão; após um tempo circulando pelo reator, o efluente segue para o tanque de sedimentação secundária, onde os sólidos são separados do efluente pela ação da gravidade. Parte dos sólidos é então recirculada para o tanque de aeração, a fim de garantir a reposição da biomassa no reator e sua alta concentração. A outra parte é descartada e enviada para tratamento específico (estabilização do lodo), secagem e destino final (Figura 2) (Seviour & Blackall, 1999).

Figura 2: Esquema convencional de tratamento por lodos ativados.

A eficiência da tecnologia dos lodos ativados depende do bom funcionamento do tanque de sedimentação, grandes volumes são necessários para garantir a adequada separação dos sólidos da fase líquida. A quantidade de bactérias presentes no lodo varia ao longo do tempo de acordo com a disponibilidade de substrato, assim, por exemplo,

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com um excesso de substrato o crescimento será exponencial, e com escassez de substrato a taxa de crescimento bacteriano se tornará igual à taxa de mortalidade (Jordão & Pessôa, 1995).

2.1.1. Microbiologia de Lodos Ativados

As bactérias são os principais constituintes dos flocos biológicos, o equilíbrio entre bactérias formadoras de flocos e as filamentosas é determinante para os mesmos apresentarem estrutura compacta e robusta (Rosa & Bazzanella, 2013). Os organismos presentes em um sistema de tratamento biológico (lodos ativados) são extremamente sensíveis às modificações no processo, alternando-se no sistema em resposta às mudanças das condições biológicas, físico-químicas e ambientais (Saar, 2007). A comunidade estabelecida nesse sistema é dinâmica e fundamental ao tratamento, sendo que cada espécie tem sua importância para o bom funcionamento do sistema (Amman et al., 1997). A estrutura dessa comunidade está diretamente ligada às condições operacionais e com a qualidade e quantidade de efluente que alimenta o processo (Vazoller, 1989).

Dos quatro grupos de organismos comumente encontrados em sistemas biológicos aerados (bactérias, algas, protozoários e metazoários), as bactérias são os principais agentes de remoção da poluição dissolvida nos efluentes líquidos, aproximadamente 95% do total. Bactérias adsorvem os sólidos suspensos e dissolvidos do efluente e produzem enzimas que degradam estas substâncias em fragmentos que possam ser assimilados pelas células. Estes fragmentos finalmente são absorvidos pelas células e servem como nutrientes para promover o crescimento das bactérias (Rosa & Bazzanella, 2013).

É importante diferenciar três tipos de bactérias: em suspensão (bactérias livres), formadoras de flocos e filamentosas (Rosa & Bazzanella, 2013). As bactérias livres: são responsáveis pela maioria dos casos em que o efluente apresenta elevados teores de turbidez. Elas se multiplicam na fase líquida do sistema biológico sem associar-se ao floco biológico. Embora ocorram normalmente no início da sucessão da microbiota dos lodos ativados, podem prejudicar o processo de depuração dos efluentes pela elevada demanda

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de oxigênio que provocam (Rosa & Bazzanella, 2013). Asbactérias formadoras de flocos: têm a tendência de agregar-se em grupos, formando desta maneira o floco biológico pesado e bem formado, o qual sedimenta com rapidez e pode ser removido do sistema. Tratam-se de bactérias de diferentes espécies, incluindo Pseudomonas, Achromobacter, Flavobacterium, Alcaligenes, Arthrobacter, Citromonas, entre outras. Algumas destas bactérias produzem um polímero de exopolissacarídeos, cuja característica “gosmenta” mantém as bactérias juntas e facilita a adsorção das partículas em suspensão (Rosa & Bazzanella, 2013). As bactérias filamentosas: são frequentemente responsáveis pela má formação do floco biológico, causando problemas como o intumescimento (“bulking”) e o “floco aberto” (Von Speling, 1997). É importante ressaltar, entretanto, que a presença destes é essencial para a formação de um floco estruturalmente firme e estável.

2.2. Micro-organismos Halofílicos

São aqueles micro-organismos extremófilos especializados em viver em ambientes salinos, enquanto que, aqueles capazes de crescer melhor em ausência de sal, mas que toleram concentrações elevadas, são conhecidos como halotolerantes (Kushner, 1978). Cabe destacar que, ao longo dos anos, os conceitos ´´halofílico`` e ´´halotolerante`` estiveram sujeitos a inúmeras interpretações. Por este motivo, Kushner & Kamekura (1988) classificaram os micro‐organimos em diversos grupos em função da capacidade ótima de crescimento em diferentes concentrações salinas:

 Não halofílicos. Crescem otimamente em meios com aproximadamente 1% de NaCl.

 Halotolerantes.Micro‐organimos que podem tolerar elevadas concentrações de sal, mas crescem melhor na ausência ou em baixas concentrações de sal. No caso de tolerarem uma concentração de 15% de NaCl, são denominados halotolerantes extremos;

 Halofílicos débeis.Possuem um crescimento ótimo em meios contendo

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 Halofílicos moderados.Apresentam crescimento ótimo em meios com

aproximadamente 3‐15% de NaCl;

 Halofílicos extremos.O crescimento ótimo é obtido em meios que contenham de 15 – 30% (próximo à saturação) de NaCl.

Os micro‐organismos halofílicos moderados e halofílicos extremos constituem os dois grupos predominantes nos ambientes salinos. Em concentrações salinas entre 3 – 15% de NaCl, os mais abundantes são as bactérias halofílicas moderadas, enquanto que os micro-organismos halofílicos extremos, representados fundamentalmente pelas bactérias halofílicas extremas ou arquéias, predominam em ambientes com salinidade superior a 15% de NaCl. Não obstante, existe uma faixa de salinidade na qual coexistem ambos os grupos de micro-organismos (Kushner & Kamekura, 1988).

Os primeiros estudos sobre micro‐organismos halofílicos foramfocados na sua fisiologia, ecologia e metabolismo, principalmente de halofílicos extremos (Larsen, 1962; Lanyi, 1974; Dundas, 1978). Além disso, os estudos destes micro-organismos despertaram um maior interesse ao descobrirem que as arquéiasconstituíam um novo domínio da vida denominado Archaea (Woese & Fox, 1977; Woese, 1987). Dentro desta abordagem, a introdução de novas técnicas aplicadas ao campo da taxonomia, como o uso de sondas específicas e técnicas de PCR, acrescentaram dados importantes sobre a diversidade microbiana nos ambientes salinos (Porro et al., 2003).

2.2.1. Micro-organismos Halofílicos Extremos

Os micro-organimos halofílicos extremos podem ser encontrados em qualquer dos três domínios descritos para os seres vivos: Archaea, Bacteria e Eukarya.

 Domínio Archaea

Um dos grupos mais frequentes encontrados em ambientes salinos são os micro-organismos do domínio Archaea, entre os quais podemos mencionar:Methanohalobium evestigatum, Methanohalophilus mahii; Methanohalophilus portucalensis (Boone, et al.,

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1993) e Halomethanococcus doii (Yu & Kawamura, 1988), isolados de ambientes metanogênicos;Halobacterium salinarum (Gruber et al., 2004), isolado pela primeira vez de alimentos salgados.Além destes, foram isoladas diferentes arquéias de diversos ambientes em todo o mundo: Haloarcula marismortui (Oren et al., 1990), Haloarcula vallismortis (González et al., 1978; Torreblanca et al., 1986), Haloferax volcanii (Mullakhanbhai & Larsen, 1975;Torreblanca et al.,1986), Haloferax mediterranei (Valera,1983),Halorubrum saccharovorum (Tomlinson & Hochstein 1976) e Halorubrum lacusprofundi (Franzmann, et al., 1988).

A classificação das arquéias está baseada nas características morfológicas, fenotípicas e análises das sequências do gene RNAr 16S, assim como em características quimiotaxonômicas, como a composição dos lipídios polares, que mostrou ser um marcador taxonômico para diferenciar micro‐organismos em nível de gênero (Grant et al., 2001).

 Domínio Bacteria

Não foram caracterizados muitos membros deste domínio capazes de crescer em condições extremas de salinidade. Entre eles, podemos citar espécies dos gêneros Halorhodospira (Hischler et al., 2003)e Salicola (Maturrano et al., 2006),ou as espécies Halovibrio denitrificans, Halospina denitrificans (Sorokin et al., 2006), Thiohalospira halophila e Thiohalorhabdus denitrificans (Gammaproteobacteria) (Sorokin et al., 2008); aespécie Actinopolyspora halophila (Actinobacteria) (Antón et al., 2002) e o gênero Salinibacter (Bacteroidetes)(Oren, 2002), assim como a espécie Lentibacillus halophilus (Firmicutes) (Tanasupawat et al., 2006). Halomonas (García et al., 2004), que compreende mais de 20 espécies é considerado um modelo de bactéria halofílica moderada por possuir mecanismos osmorregulatórios e adaptações fisiológicas que lhe permitem viver em ambientes extremos.

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 Domínio Eukarya

Ainda que exista uma predominância de procariotos (bactérias e arquéias) nos ambientessalinos, também foram isoladas espécies de organismos eucariotos de ambientes com salinidade mais baixa. Em geral, a presença e a abundância de eucariotos diminuem com o aumento da salinidade (Ventosa, 2006). Foram encontradas, na sua maioria, espécies do gênero Dunaliella (Cimermanet al., 2004; Borowitzka & Silva, 2007), um organismo fotossintético unicelular que acumula glicerol em seu citoplasma como soluto compatível.

2.3. Genes Envolvidos na Biodegradação

Muitos micro-organismos com capacidade de degradar hidrocarbonetos estão amplamente distribuídos no ambiente e têm sido isolados de locais contaminados ou não com hidrocarbonetos (Marchantet al., 2006).

Os genes que codificam as enzimas de degradação estão relativamente bem compreendidos para organismos aeróbios e cultiváveis, principalmente para os isolados de Pseudomonas putida GPo1, Acinetobacter sp. ADP1 e Mycobacterium tuberculosis H37Rv (Funhooff, 2007; Wentzelet al., 2007). Muitos organismos que não são usualmente considerados como bactérias degradadoras de hidrocarbonetos possuem genes homólogos aos genes alcano monoxigenases (Headet al., 2006).

2.3.1. Alcano Monoxigenases - alk

Em organismos aeróbicos, o ataque inicial de hidrocarbonetos sempre requer a molécula de oxigênio como um co-substrato (Rojo, 2009). Na maioria das vias de degradação descritas, o substrato n-alcano é oxidado ao correspondente álcool por uma enzima monoxigenase terminal, em seguida, o álcool é oxidado ao aldeído correspondente, e transformado em um ácido graxo (Van Hammeet al., 2003). Os ácidos graxos são conjugados à CoA e posteriormente processados pela β–oxidação para gerar Acetil-CoA (Wentzelet al., 2007).

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O sistema alcano hidroxilase consiste de três componentes: a alcano hidroxilase (monoxigenase), rubredoxina e rubredoxina redutase. A alcano hidroxilase está localizada na membrana citoplasmática e tem como função a transferência de um átomo de oxigênio da molécula de oxigênio para o substrato alcano. A rubredoxina redutase transfere elétrons de NADH para a rubredoxina, a qual por sua vez, transfere os elétrons para o componente catalítico, alcano hidroxilase (Van Hammeet al., 2003).

A via de degradação de n-alcanos de cadeia média (C6 a C12) esta bem caracterizada para a bactéria Pseudomonas putida Gpo1. Esta linhagem carrega o plasmídeo OCT, o qual possui dois operons. O operon alkBFGHJKL codifica dois componentes do sistema alcano hidroxilase e enzimas envolvidas na via metabólica. Os produtos destes genes alk incluem uma alcano hidroxilase (AlkB), rubredoxinas (AlkF e AlkG), aldeído desidrogenase (AlkH), álcool desidrogenase (AlkJ), acil-CoA sintase (AlkK), e uma proteína de membrana externa provavelmente envolvida na captação do hidrocarboneto (AlkL). O outro operon alkST codifica um terceiro componente do sistema alcano hidroxilase, a rubredoxina redutase (AlkT), e um regulador positivo da expressão do operon alkBFGHJKL (AlkS) (Canosa et al., 1999).

Genes que estão estritamente relacionados ao gene alcano hidroxilase (alkB) de P. putida GPo1 têm sido detectados em grande parte da comunidade microbiana (Van Beilen & Funhoff, 2005). Os genes alkB foram encontrados em várias bactérias que habitam ambientes diversos, incluindo sedimentos solos contaminados, locais contaminados com óleo, aqüíferos superficiais e solos do Ártico e da Antártica (Knaebel & Crawford, 1995; Guoet al., 1997; Stapleton & Sayler, 1998; Whyteet al., 2002; Kuhnet al., 2009; Panickeret al., 2010; Bellet al., 2013).

A organização dos genes alk em Acinetobacter sp. ADP1 é completamente diferente. Eles não estão contidos em um grande operon e nem agrupados ou localizados em um plasmídeo, mas ocorrem em uma aparente desordem no cromossomo de Acinetobacter (Graltonet al., 1997). Acinetobacter sp. ADP1 é capaz de usar alcanos de cadeia longa com pelo menos 12 átomos de carbono como única fonte de carbono e energia. Isto requer pelo menos 5 genes essenciais: rubAB, que codifica rubredoxina e

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rubredoxina redutase; alkM, que codifica a alcano hidroxilase; alkR, que codifica uma proteína com similaridade a um regulador transcricional e xcpR, o qual é parte da via geral de secreção (Ratajczaket al., 1998).

As alcano monoxigenases já tiveram seu sistema genético decifrado em uma grande variedade de bactérias, incluindo bactérias gram positivas e negativas como: Rhodococcus erythropolis NRRL B-16531, Rhodococcus sp. Q15, Mycobacterium tuberculosis H37Rv, Pseudomonas putida GPo1, Acinetobacter sp. ADP1 e Acinetobacter sp. M-1 (Van Beilen et al., 2002). Os estudos indicam que novas alcano hidroxilases ainda não foram identificadas e que poderiam incluir novas funções que ainda são desconhecidas, mas que são importantes para o metabolismo microbiano (Rojo, 2009).

2.3.2. Dioxigenases que Hidroxilam Anéis Aromáticos (ARHDs)

A degradação de hidrocarbonetos aromáticos por bactérias, sob condições aeróbicas, começa com a adição da molécula de oxigênio ao anel aromático pela enzima dioxigenase. Estas enzimas pertencem a uma grande família conhecida como dioxigenases que hidroxilam anéis aromáticos (Aromatic Ring Hydroxylating Dioxigenases - ARHD). Todos os membros dessa família possuem uma ou duas proteínas transportadoras de elétron, dependendo do substrato e da origem da enzima. Estes complexos catalisam uma reação redox na qual dois oxigênios moleculares são incorporados ao anel aromático do substrato à custa da oxidação de NADH (Gibson & Parales, 2000).

O processo de degradação de compostos aromáticos resulta na produção de succinato, acetil-CoA, ácido pirúvico, ácido acético e aldeídos, todos eles utilizados por micro-organismos na síntese de constituintes celulares e energia, e com os subprodutos dessas reações sendo CO2 e água (Mishraet al., 2001).

Enzimas que pertencem à mesma família de dioxigenase evoluíram de um único ancestral comum para adquirir uma nova função catabólica através de vários eventos genéticos, como transferência gênica horizontal, dada por plasmídeos conjugativos, plasmídeos integrativos e transposons, recombinação, duplicação, mutação pontual múltipla, deleção e integração gênica (Hartnettet al., 1990; Springael & Top, 2004).

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Na natureza, a aquisição de genes pela transferência gênica horizontal é uma das principais formas de evolução constante dos micro-organismos para a degradação de diversos substratos através de novas vias metabólicas. Chadhain et al. (2006) avaliaram a degradação de hidrocarbonetos aromáticos, como naftaleno, fenantreno e pireno, em uma série de experimentos de enriquecimentos. Para tal, os autores desenvolveram primers tendo como alvo o conservado centro Rieske da dioxigenase que oxida os HPAs estudados. Os resultados sugerem que ambientes contaminados podem abrigar uma ampla diversidade do perfil de genes funcionais durante a biodegradação de uma variedade de HPAs.

Recentemente, genes que codificam dioxigenases foram encontrados em várias bactérias que habitam ambientes diversos, incluindo reservatórios de petróleo, solos de praia e sedimentos profundos contaminados com óleo, detritos em canos de petróleo, lodos ativados e solos do Ártico (Verdeet al., 2013; Lamedellaet al., 2014; Joshiet al., 2014; Fanget al., 2013; Yergeauet al., 2012).

2.4. Biodegradação microbiana de hidrocarbonetos do petróleo e seu potencial biotecnológico

Os hidrocarbonetos de petróleo são os contaminantes mais amplamente distribuídos em quase todos os ecossistemas. Atmosfera, solos, ambientes marinhos, águas superficiais e subterrâneas têm sido continuamente afetados pela poluição produzida durante a extração, refino, transporte e uso do petróleo (Margesin et al., 2003; Le Borgne et al., 2008). O petróleo contém uma mistura de centenas de compostos individuais, os quais são geralmente agrupados em quatro frações de acordo com sua solubilidade em solventes orgânicos: hidrocarbonetos alifáticos, hidrocarbonetos aromáticos, resinas e asfaltenos (Sugiura et al., 1997).

A poluição ambiental com hidrocarbonetos de petróleo é estimada em vários milhões de toneladas por ano (Xu et al., 2008), e tornou-se um problema grave em todo o mundo. A limpeza destes locais poluídos pode ser realizada por micro-organismos degradadores de petróleo, processo conhecido como biorremediação, o que constitui

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uma alternativa biológica para a descontaminação de locais impactados com petróleo (Van Hamme et al., 2003). A biorremediação é baseada na habilidade metabólica de micro-organismos para transformar ou mineralizar contaminantes orgânicos em substâncias menos nocivas, as quais são logo integradas aos ciclos naturais biogeoquímicos. A extensão da biodegradação é influenciada por vários fatores, tais como nutrientes, oxigênio, pH, composição, concentração e biodisponibilidade dos contaminantes, assim como pelas características físicas e químicas do ambiente contaminado (Margesin & Schinner, 2001).

Vários autores têm apontado que as frações constituintes do petróleo apresentam suscetibilidade diferenciada à biodegradação. A degradação ocorre primeiramente nos hidrocarbonetos alifáticos, seguida dos hidrocarbonetos aromáticos de 1 a 3 anéis e, finalmente, em direção aos poliaromáticos, asfaltenos e resinas (Sugiura et al., 1997; Capelli et al., 2001). No entanto, esta degradação depende de fatores como a concentração do hidrocarboneto, estado físico do hidrocarboneto, temperatura, oxigênio dissolvido disponível, nutrientes, e em menor grau, a salinidade, pressão e pH (Leahy e Colwell, 1990).

2.4.1. Potencial Biotecnológico

Nos últimos anos, os micro‐organismos halofílicos despertaram um grande interesse por sua enorme capacidade biotecnológica. Suas principais aplicações incluem a produção de enzimas hidrolíticas que podem ser utilizadas como biocatalisadores em condições extremas, não somente em altas salinidades, mas também em condições elevadas de temperatura e pH. Outra importante aplicação é a produção de polissacarídeos ou diversos compostos orgânicos que estes micro-organismos acumulam intracelularmente. Além disso, esses micro-organismos possuem um papel de grande importância nos processos de biodegradação de compostos recalcitrantes presentes em ambientes salinos, advindos não somente de atividades industriais como de acidentes causados pelas indústrias petroquímicas (Oren, 2010).

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 Produção de enzimas

Muitos processos industriais, como a produção de corantes, são desenvolvidos em condições extremas, portanto, oferecem um amplo campo de aplicação para as enzimas produzidas por micro‐organismos extremófilos, capazes de atuarem em condições extremas de temperatura, pH ou salinidade, proporcionando desta maneira novas possibilidades nos processos biocatalíticos (Adams & Kelly, 1995). As propriedades e funções destas enzimas foram extensamente estudadas, já que oferecem importantes aplicações biotecnológicas: biorremediação ambiental, processos biossintéticos ou produção de alimentos (Kamekura, 1986).

 Produção de polissacarídeos

Os polissacarídeos são de grande interesse industrial devido às suas propriedades estabilizantes, emulsionantes e gelificantes. São formados principalmente por carboidratos cuja composição e estrutura podem apresentar variações (Sutherland, 1990). Numerosos micro-organismos produzem os chamados exopolissacarídeos ou EPS, esses polímeros extracelulares proporcionam a esses micro‐organismos uma série de vantagens como a adesão microbiana na superfície ou o aumento da captação de nutrientes.O estudo das bactérias halofílicas produtoras de EPS está adquirindo grande interesse nos últimos anos, já que seus EPS possuem múltiplas aplicações nas indústrias alimentícia, farmacêutica, médica, cosmética, petroquímica, entre outras (Sutherland, 1998; Quesada et al., 2004).

 Solutos compatíveis

A natureza dos solutos compatíveis é variável, compreendendo poliálcoois, aminoácidos, aminas quaternárias, tetrahidropiridina, entre outros (Roberts, 2005). Cada micro‐organismo possui o potencial de acumular preferencialmente determinados solutos compatíveis. Assim, por exemplo, as arquéias metanogênicas hipertermófilas acumulam principalmente o glicerol fosfato (Muller et al.,2005). No caso de bactérias halofílicas moderadas, os principais solutos compatíveis acumulados são os polialcoóis

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(glicosilglicerol), aminoácidos (prolina), diaminoácidos N‐acetilados, aminas quaternárias (betaína e ectoína)(da Costa et al., 1998). Os solutos compatíveis despertaram enormes interesses industriais em virtude de possuírem um alto poder estabilizador e protetor de enzimas, células, ácidos nucléicos, membranas e anticorpos frente ao congelamento, dessecação, e desnaturação por calor ou salinidade (Pastoret al., 2010).

 Alimentos fermentados

No campo da alimentação, os micro‐organismos halofílicos também possuem diversas aplicações. A espécie halofílica Tetragenococcus halophila é empregada como indicador da fermentação em concentrações de aproximadamente 18% de NaCl (Uchida & Kanbe, 1993). A espécie Tetragenococcus muriatiacus foi empregada na fabricação de molhos de fermentado de lula (Satomi et al., 1997). Nos últimos anos, bactérias halofílicas moderadas têm sido isoladas de alimentos fermentados, como a espécie Halomonas alimentaria,que parece contribuir para o aroma e sabor do ´´Jeotgal``, uma comida tradicionalmente coreana baseada em mariscos fermentados (Yoon et al.,2002). Também a partir destes alimentos foram isoladas outras bactérias halofílicas moderadas, como Psychrobacter alimentarius (Yoon et al., 2005) e Paenibacillus tyraminigenes (Mah et al., 2008). A bactéria Marinospirillum insulare foi isolada do molho´´kusaya`` que é uma salmoura fermentada utilizada para a produção do tradicional pescado seco na ilha Izu no Japão (Satomi et al.,2004). Sabe‐se que as arquéias produzem proteases extracelulares estáveis em sal, o que lhes confere grande importância nos processos de fermentação e na produção de aroma e sabor (Phithakpol et al.,1995).

 Bioplástico

Os polihidroxialcanoatos (PHA) constituem uma família heterogênea de poliésteres que consistem em uma forma de armazenamento de carbono intracelular, e são considerados termoplásticos (Ventosa & Nieto, 1995). Os PHAs bacterianos oferecem algumas vantagens sobre os outros plásticos: são biodegradáveis, resistentes a água e biocompatíveis, o que lhes confere uma grande importância farmacêutica e clínica,

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incluindo seu uso em drogas de liberação retardada, substituição de peças ósseas e suturas cirúrgicas (Laffert et al., 1988). Algumas arquéias, especialmente Haloferax mediterranei, são capazes de produzir grandes quantidades de PHA quando cultivadas em meio contendo glicose ou amido (Lillo & Valera, 1990).

2.5. Técnicas Moleculares no Estudo dos Micro-organismos

Tradicionalmente, a detecção e a identificação de bactérias eram feitas de acordo com os meios de obtenção de carbono e energia, exigências nutricionais, meio de cultivo para seu crescimento, e observação direta através do microscópio (Kennedy, 1999). No entanto, a utilização dessas metodologias fornecia informações limitadas e levava a errosde classificação microbiana, com necessidade de desenvolvimento de técnicas de maior refinamento (Zak et al., 1994).

Como alternativas para esses métodos, foram desenvolvidas várias técnicas, dentre as quais se destacam aquelas baseadas nas sequências de nucleotídeos do DNA. As limitações das técnicas tradicionais de detecção e de identificação de micro-organismos são ainda maiores quando se quer estudar a diversidade microbiana associada a determinado ambiente, como observado no sistema de lodos ativados.

Sabe-se que a diversidade das bactérias é maior que a de qualquer outro grupo de organismos, no entanto, os meios de cultivo são seletivos a grupos particulares. Até mesmo quando se utiliza um meio seletivo para determinado organismo-alvo, algumas linhagens não cultiváveis, provavelmente, são excluídas das análises (Coutinho et al., 1999). Amann et al. (1995) sugerem que apenas 1-10% das espécies bacterianas pode ser recuperada em cultivo,deixando vasta porção dessa biota desconhecida e não estudada.

A rápida expansão no campo da Biologia Molecular está contribuindo significativamente para o avanço no conhecimento sobre a variabilidade genética e perfil das comunidades de micro-organismos, e dentre as técnicas mais utilizadas destacam-se: bibliotecas de genes RNAr 16S, ARDRA (Amplified ribosomal DNA Restriction Analysis), RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA), RISA (Ribosomal Intergenic Spacer Analysis), DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis), TGGE (Temperature Gradient Gel

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Electrophoresis), T-RFLP (Terminal-Restriction Fragment Length Polymorphism), FISH (Fluorescent In Situ Hybridization), PCR Multiplex e em tempo real, SIP (Stable Isotope Probing), DNA microarray e sequenciamento de DNA em larga escala (Beller et al., 2002; Baldwin et al., 2003; Rhee et al., 2004; Sette et al., 2007; Malik et al., 2008; Bell et al., 2011).

A utilização destas metodologias vem permitindo uma avaliação mais ampla e precisa da diversidade microbiana no ambiente e a descoberta de novos grupos de organismos, especialmente dos não cultivados (Amann et al., 1995; Hugenholtz et al., 1998).

2.5.1. RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)

Segundo Ferreira e Grattapaglia (1998), um dos aspectos mais fundamentais da revolução causada pela PCR foi a possibilidade de se gerar grandes quantidades de DNA de segmentos específicos do genoma. DNA em grande quantidade pode ser facilmente detectado a olho nu diretamente em gel de eletroforese através de corantes específicos para DNA. Entretanto, a técnica de PCR ainda apresentava uma limitação significativa na obtenção de marcadores moleculares distribuídos pelo genoma, com exceção de alguns genes de seqüência conhecida.

Um grande avanço no estudo molecular baseado em PCR ocorreu em 1990, com a idéia de se utilizar iniciadores mais curtos e de seqüência arbitrária para direcionar a reação de amplificação, não se fazendo necessário o conhecimento prévio da seqüência. Esta técnica foi desenvolvida nos Estados Unidos por Williams et al. (1990) que patentearam a tecnologia com o nome mais comumente utilizado, RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA).

A técnica é uma variação da PCR que gera fragmentos de DNA polimórficos, característicos para um determinado micro-organismo. Esta técnica utiliza somente um oligonucleotídeo em vez de um par de iniciadores, e sua seqüência é construída ao acaso, o que gera a amplificação de várias seqüências desconhecidas. Assim, assume-se que diferentes indivíduos produzem distintos padrões de fragmentos amplificados com base

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nas diferentes localizações dos sítios de anelamento dos iniciadores ao longo da fita de DNA (Williams et al., 1990), conforme ilustrado na Figura 3.

Figura 3: Diagrama da reação de polimorfismos de DNA por amplificação ao acaso (RAPD) É uma técnica simples que requer pequenas quantidades de DNA, não necessitando o conhecimento prévio da seqüência de DNA dos organismos a serem estudados. Pode ser aplicada a qualquer espécie e tem sido utilizada para detecção de polimorfismo em uma grande variedade de organismos, incluindo bactérias, protozoários, plantas e animais. O polimorfismo produzido pela técnica de RAPD aparece sob a forma de presença ou ausência de fragmentos ou bandas no gel (Silveira et al., 2000).

2.6. Características da área de coleta das amostras

O Terminal Marítimo Almirante Barroso (TEBAR), sob jurisdição da PETROBRAS TRANSPORTES S.A./ TRANSPETRO, localizado no município de São Sebastião, no litoral norte de São Paulo, é o maior terminal da América Latina e responsável pelo armazenamento e distribuição de aproximadamente 55% de todo o petróleo e derivados consumidos no Brasil, movimentando 4 milhões de m3 de petróleo ao mês e uma vazão de 200 m3 por hora de efluentes tratados e descartados (Lopes et al., 1997).

O TEBAR foi inaugurado no final dos anos 1960, e atualmente as instalações do terminal consistem em três partes principais: o terminal de carga e descarga de petróleo e seus derivados; os tanques de armazenamento desses produtos localizados na planície

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litorânea, numa área limitada a leste pelo Canal de São Sebastião e a oeste pela Serra do Mar; e os oleodutos, que inicialmente só ligavam São Sebastião à refinaria Presidente Bernardes de Cubatão (RPBC) e depois foram ampliados para as demais refinarias instaladas no interior paulista, chegando até a refinaria de Capuava (RECAP), refinaria do Vale do Paraíba (REVAP), e a refinaria de Paulínia (REPLAN) (Dos Santos, 2011).

Figura 4. Mapa ilustrando a região do Terminal Marítimo Almirante Barroso (TEBAR) no município

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3. OBJETIVOS

3.1. Objetivo geral

Caracterizar taxonomicamente bactérias isoladas de efluentes salinos provenientes de terminal petrolífero e avaliar o seu potencial de biodegradação de hidrocarbonetos sob condições de hipersalinidade.

3.2. Objetivos específicos

 Identificar e caracterizar geneticamente a fração cultivada da comunidade de bactérias proveniente de efluentes salinos de terminal petrolífero (TEBAR), através de sequenciamento e análise do gene RNAr 16S;

 Detectar a presença de genes catabólicos responsáveis pela degradação de hidrocarbonetos nos isolados;

 Avaliar por cromatografia gasosa a capacidade de biodegradação de hidrocarbonetos em condições de hipersalinidade.

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4. MATERIAL E MÉTODOS

O presente estudo foi desenvolvido no âmbito do projeto “Estruturação do Acervo de Pesquisa de Petróleo e Energia (APPE) da Coleção Brasileira de Micro-organismos de Ambiente e Indústria (CBMAI/UNICAMP) e Coleção de Micro-Micro-organismos da Indústria do Petróleo (CMIP – Petrobras): caracterização, preservação e prospecção de micro-organismos provenientes de ambientes associados a petróleo”, financiado pela Petrobras, e desenvolvido na Divisão de Recursos Microbianos, no Centro Pluridisciplinar de Pesquisas Químicas Biológicas e Agrícolas (CPQBA – UNICAMP).

4.1. Isolamento e repique das bactérias

As bactérias investigadas no presente estudo foram isoladas pelo nosso grupo de pesquisa em trabalhos anteriores a partir de águas de produção e lodos ativados, coletados no Terminal Marítimo Almirante Barroso (TEBAR) (São Sebastião, São Paulo) (Figura 4). A coleta das amostras de águas de produção e lodos ativados foi realizada pela equipe técnica da Petrobras (CENPES) no âmbito do projeto “Abordagem Metagenômica no Estudo de Comunidades Microbianas Associadas ao Tratamento de Efluentes e Reuso de Água na Indústria de Petróleo”.

4.1.1. Isolamento Bacteriano

As amostras de águas de produção foram coletadas em cinco estações, as quais diferem em características como salinidade, alcalinidade, cloreto, entre outras (Tabela 1).As mesmas foram coletadas em bombonas de 50L e transportadas à temperatura ambiente para o laboratório da Divisão de Recursos Microbianos, onde foram armazenadas a 4 °C. Para o isolamento bacteriano foram utilizadas alíquotas de 1,0 mL da amostra, as quais foram submetidas a diluções seriadas de 10-1 a 10-8 em solução salina, e um volume de 100 μL de cada diluição foi inoculado nos meios R2A (Reasoner & Geldreich, 1985) e MOD (Rohban et al.,2009).

As amostras de lodo foram coletadas do sistema de lodos ativados do terminal, as quais foram acondicionadas em galão plástico de 2L à temperatura ambiente e

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transportadas até o Laboratório para o isolamento bacteriano. Uma alíquota de 1,0 mL do lodo foi submetida a diluições seriadas de 10-1 a 10-8 em solução salina, e um volume de 100 µL de cada diluição foi inoculado nos meios MCAT (Litchfield et al., 2005), R2A (Reasoner & Geldreich, 1985), MOD e SAL (Rohban et al., 2009).

Adicionalmente,foi realizado um processo de aclimatação salina para o lodo, em que 5 mL de lodo foram inoculados em frascos Erlenmeyer de 250 mL contendo 50 mL de um dos dois meios de cultivo, R2A ou MOD. Estes foram incubados a 28°C sob agitação de 150 rpm. Inicialmente, foi adicionado aos meios 4% de NaCl, esta concentração foi aumentada gradualmente em 1%, de 6 em 6 dias, até uma concentração de 20% de NaCl.

Tabela 1. Características físico-químicas das amostras de águas de produção coletadas em

diferentes estações.

Fonte: PETROBRAS

4.1.2. Repique das Bactérias

As bactérias estudadas no presente trabalho foram isoladas em estudos prévios a partir das amostras descritas acima e depositadas no acervo de pesquisa da Coleção Brasileira de Micro-organismos de Ambiente e Indústria (CBMAI/UNICAMP). Os repiques foram feitos a partir dos isolados de bactérias conservados em ultrafreezer a -80 ºC em meios apropriados acrescidos de glicerol (Tabela 2). Após o período de crescimento de aproximadamente 5 dias a 28°C, a pureza das culturas foi avaliada através de análise microscópica (coloração de Gram) e macroscópica (morfologia das colônias). As denominações dos isolados, os meios utilizados, a temperatura de incubação e a estação de origem estão listados na Tabela 3.

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Tabela 2. Meios de cultivo usados e sua composição.

MEIO COMPOSIÇÃO FORMULAÇÃO g/L

MCAT (Litchfield et al., 2005) Ácido Casamino 7.3 Extrato de levedura 0.5 Citrato de Sódio 3 FeCl3 0.02 MgSO4.7H2O 20 NaCl 4% R2A

(Reasoner & Geldreich, 1985).

Extrato de levedura 0.5 Peptona protease 0.5 Acido Casamino 0.5 Piruvato de Sódio 0.3 Glicose amino solúvel 0.5 K2HPO3 0.3 MgSO4 20 NaCl 4% - 20% MOD (Rohban et al.,2009). MgSO4.7H2O 0.1 Glicose 0.1 CaCl.2H2O 0.036 KCl 0.2 NaHCO 0.006 NaBr 0.023 FeCl.6H2O traço Protease-Peptona 0.5 Extrato de levedura 1 NaCl 4% - 20% SAL (Rohban et al.,2009). NaBr 0.026 MgSO4.7H2O 9.7 MgCl.H2O 7 CaCl2 3.6 KCl 2 NaHCO3 0.06 NaCl 81

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Tabela 3. Origem das linhagens e meios de cultivo utilizados.

Linhagem Origem Meio de cultivo Linhagem Origem Meio de cultivo

R2A 31.P Est. Flotação Pilar R2A (9% NaCl) MOD 24.8 Aclim. Salina MOD (8% NaCl) R2A 32P Est. Flotação Pilar R2A (9% NaCl) MOD 25.8 Aclim. Salina MOD (8% NaCl) R2A 33P Est. Flotação Pilar R2A (9% NaCl) MOD 26.8 Aclim. Salina MOD (8% NaCl) MOD 31.P Est. Flotação Pilar MOD (9% NaCl) MOD 27.8 Aclim. Salina MOD (8% NaCl) R2A 31.B Est. Bonsucesso R2A (9% NaCl) MOD 28.8 Aclim. Salina MOD (8% NaCl) R2A 32.B Est. Bonsucesso R2A (9% NaCl) R2A 21.8 Aclim. Salina R2A (8% NaCl)

R2A 33.B Est. Bonsucesso R2A (9% NaCl) R2A 22.8 Aclim. Salina R2A (8% NaCl)

MOD 31.B Est. Bonsucesso MOD (9% NaCl) R2A 23.8 Aclim. Salina R2A (8% NaCl)

R2A 31.A Est. Aguilhada R2A (9% NaCl) R2A 26.8 Aclim. Salina R2A (8% NaCl)

MOD 31.A Est. Aguilhada MOD (9% NaCl) MOD 21.9 Aclim. Salina MOD (9% NaCl) R2A 31.O Est. Oiteirinhos R2A (9% NaCl) MOD 22.9 Aclim. Salina MOD (9% NaCl) R2A 32.O Est. Oiteirinhos R2A (9% NaCl) MOD 23.9 Aclim. Salina MOD (9% NaCl) R2A 33.O Est. Oiteirinhos R2A (9% NaCl) R2A 21.9 Aclim. Salina R2A (9% NaCl)

R2A 34.O Est. Oiteirinhos R2A (9% NaCl) R2A 22.9 Aclim. Salina R2A (9% NaCl)

MOD 31.O Est. Oiteirinhos MOD (9% NaCl) R2A 23.9 Aclim. Salina R2A (9% NaCl)

MOD 32.O Est. Oiteirinhos MOD (9% NaCl) R2A 24.9 Aclim. Salina R2A (9% NaCl)

MOD 33.O Est. Oiteirinhos MOD (9% NaCl) MOD 21.10 Aclim. Salina MOD (10% NaCl) R2A 31.J Est. Jordão R2A (9% NaCl) MOD 22.10 Aclim. Salina MOD (10% NaCl) R2A 32.J Est. Jordão R2A (9% NaCl) MOD 23.10 Aclim. Salina MOD (10% NaCl) R2A 33.J Est. Jordão R2A (9% NaCl) R2A 21.10 Aclim. Salina R2A (10% NaCl)

R2A 34.J Est. Jordão R2A (9% NaCl) R2A 22.10 Aclim. Salina R2A (10% NaCl)

R2A 35.J Est. Jordão R2A (9% NaCl) R2A 23.10 Aclim. Salina R2A (10% NaCl)

MOD 31.J Est. Jordão R2A (9% NaCl) R2A 24.10 Aclim. Salina R2A (10% NaCl)

MOD 32.J Est. Jordão R2A (9% NaCl) MOD 21.11 Aclim. Salina MOD (11% NaCl) MOD 33.J Est. Jordão R2A (9% NaCl) MOD 22.11 Aclim. Salina MOD (11% NaCl) R2A 36.J Est. Jordão R2A (16% NaCl) MOD 23.11 Aclim. Salina MOD (11% NaCl) R2A 37.J Est. Jordão R2A (16% NaCl) R2A 22.11 Aclim. Salina R2A (11% NaCl)

MOD 34.J Est. Jordão R2A (16% NaCl) R2A 23.11 Aclim. Salina R2A (11% NaCl)

R2A 01 Lodo Ativado R2A (4% NaCl) R2A 24.11 Aclim. Salina R2A (11% NaCl)

R2A 02 Lodo Ativado R2A (4% NaCl R2A 25.11 Aclim. Salina R2A (11% NaCl)

R2A 03 Lodo Ativado R2A (4% NaCl) R2A 26.11 Aclim. Salina R2A (11% NaCl)

R2A 04 Lodo Ativado R2A (4% NaCl) MOD 21.12 Aclim. Salina MOD (12% NaCl)

MOD 01 Lodo Ativado MOD (4% NaCl) R2A 22.12 Aclim. Salina R2A (12% NaCl)

MOD 04 Lodo Ativado MOD (4% NaCl) MOD 21.13 Aclim. Salina MOD (13% NaCl) MOD 05 Lodo Ativado MOD (4% NaCl) MOD 22.13 Aclim. Salina MOD (13% NaCl) MOD 07 Lodo Ativado MOD (4% NaCl) MOD 23.13 Aclim. Salina MOD (13% NaCl) MOD 08 Lodo Ativado MOD (4% NaCl) R2A 22.13 Aclim. Salina R2A (13% NaCl)

MOD 11 Lodo Ativado MOD (4% NaCl) MOD 21.14 Aclim. Salina MOD (14% NaCl) MCAT 01 Lodo Ativado MCAT (4% NaCl) MOD 22.14 Aclim. Salina MOD (14% NaCl) MCAT 02 Lodo Ativado MCAT (4% NaCl) R2A 22.14 Aclim. Salina R2A (14% NaCl)

MCAT 03 Lodo Ativado MCAT (4% NaCl) R2A 23.14 Aclim. Salina R2A (14% NaCl)

MCAT 06 Lodo Ativado MCAT (4% NaCl) MOD 21.15 Aclim. Salina MOD (15% NaCl) MCAT 07 Lodo Ativado MCAT (4% NaCl) MOD 22.15 Aclim. Salina MOD (15% NaCl) MCAT 08 Lodo Ativado MCAT (4% NaCl) MOD 23.15 Aclim. Salina MOD (15% NaCl)

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MCAT 13 Lodo Ativado MCAT (4% NaCl) MOD 21.16 Aclim. Salina MOD (16% NaCl) MCAT 14 Lodo Ativado MCAT (4% NaCl) MOD 22.16 Aclim. Salina MOD (16% NaCl) SAL 01 Lodo Ativado SAL (9% NaCl) R2A 21.16 Aclim. Salina R2A (16% NaCl)

SAL 02 Lodo Ativado SAL (9% NaCl) R2A 23.16 Aclim. Salina R2A (16% NaCl)

SAL 03 Lodo Ativado SAL (9% NaCl) R2A 26.16 Aclim. Salina R2A (16% NaCl)

MOD 21.7 Aclim. Salina MOD (7% NaCl) R2A 21.17 Aclim. Salina R2A (17% NaCl)

R2A 21.7 Aclim. Salina R2A (7% NaCl) R2A 22.19 Aclim. Salina R2A (19% NaCl)

4.2. Caracterização Taxonômica dos Micro-organismos 4.2.1. Extração de DNA genômico

Após a confirmação da pureza das linhagens, o DNA genômico foi extraído a partir das 141 bactérias isoladas de águas de produção e lodos ativados, segundo o protocolo descrito por Soolinger et al. (1993). O resultado da extração foi visualizado em transiluminador UV,após eletroforese por 30 min a5V/cm em gel de agarose 0,8% corado com 0,02µL/mL SYBR Safe 10.000X in DMSO (Invitrogen). A estimativa de concentração do DNA genômico dos isolados foi realizada através de eletroforese utilizando DNA intacto do fago lambda como padrão de concentração.

4.2.2. Amplificação e Purificação de genes RNAr 16S

O DNA obtido dos isolados foi utilizado em reações de PCR para amplificação do gene RNAr 16S usando-se o par de primers 10f e 1100r (Tabela 4). O programa de amplificação utilizado consistiu de 1 ciclo a 95°C por 2 min; 30 ciclos a 94°C por 1 min, 55°C por 1 min e 72°C por 3 min; e 1 ciclo de extensão final a 72 °C por 3 min. Foram utilizadas alíquotas de 50 ng de DNA. Cada reação continha: tampão de PCR (Invitrogen) 1X, 1,5 mM de MgCl2, 0,2 mM de dNTP Mix (Invitrogen), 0,5 μM de cada primer, 2,0 U de

Taq DNA Polimerase (Invitrogen), e 5,0 μL da amostra de DNA; totalizando um volume final de 25 μL.

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Tabela4. Sequências dos primers utilizados para amplificação dos genes RNAr 16S de bactérias.

Primers Seqüências 5’- 3’ Referências

10f GAG TTT GAT CCT GGC TCA G Lane, 1991

1100r AGG GTT GCG CTC GTT G Lane, 1991

Os resultados da amplificação dos fragmentos do gene RNAr 16S foram confirmados em gel de agarose 1%, corados com 0,02 μL/mL SYBR Safe 10.000X in DMSO (Invitrogen). Os produtos de PCR dos isolados foram purificados utilizando mini-colunas (GFX PCR DNA and gel band purification kit, GE Healthcare), de acordo com as instruções do fabricante.

4.2.3. Sequenciamento dos genes RNAr 16S

O sequenciamento dos fragmentos de DNAr 16S provenientes dos isolados foi realizado em sequenciador automático ABI 3500 XL (Applied BioSystems), utilizando BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit, tampão Save Money (Tris-HCl 0,1M, MgCl2

0,5mM), e 3,2 pmols dos primers10f e 1100r, especificados anteriormente.

4.2.4. Montagem dos contigs e análise filogenética

As sequências parciais do gene RNAr 16S obtidas com cada primer foram montadas em uma sequência consenso única (contig), combinando os diferentes fragmentos obtidos com ajuda do programa phredPhrap (Ewing et al.,1998).

Após a montagem das sequências, estas foram comparadas com as sequências de RNAr 16S de organismos representados nas bases de dados Genbank (http://www.ncbi.nem.nih.gov) e RDP (Ribosomal Database Project, Wisconsin, USA, http://www.http://rdp.cme.msu.edu/), usando as rotinas BLASTn e SequenceMatch, respectivamente. Foram então selecionadas sequências de organismos tipo relacionados ao organismo desconhecido, para realização das análises filogenéticas. As sequências foram alinhadas utilizando o programa CLUSTAL X (Thompson et al., 1997) e analisadas com o software MEGA v. 4 (Tamura et al., 2007). As matrizes de distância evolutiva foram calculadas com o modelo de Kimura 2 p (1980) e a construção da árvore filogenética a

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partir das distâncias evolutivas foi feita pelo método de Neighbor-Joining (Saitou e Nei, 1987), com valores de “bootstrap” calculados a partir de 1000 replicatas, utilizando as rotinas incluídas no software MEGA.

4.2.5. Tipagem por RAPD

A técnica molecular RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) foi utilizada com o intuito de diferenciar geneticamente os isolados pertencentes à mesma espécie. Três dos cinco primers listados a seguir foram utilizados para a tipagem dos isolados bacterianos, em reações independentes: UBC# 2 (5´ - CCT GGG CTT G – 3´), UBC # 4 (5´- CCT GGG CTG G – 3´), UBC# 16 (5´ - GGT GGC GGG A - 3´), UBC # 18 (5´- GGG CCG TTT A– 3´) e UBC# 25 (5´ - ACA GGG CTC A - 3´), da seguinte forma: UBC# 2, UBC # 4 e UBC# 25 para Proteobacteria, e UBC# 4, UBC # 18 e UBC# 25 para Actinobacteria e Flavobacteria. Na reação utilizou-se 1 X do tampão da enzima Taq DNA polimerase (Invitrogen); 0,2 mM de dNTPs, 1 μM do primer, 2 U de Taq DNA polimerase (Invitrogen) e 5 ng de DNA genômico. O programa de amplificação consistiu de 1 ciclo de 2 min a 95 oC, 30 ciclos de 30 seg a 94 oC, 30 s a 36 oC e 1 min a 72 oC e um ciclo final de extensão a 72 oC por 3 min. Os primers utilizados foram selecionados dentre aqueles que geraram maior diversidade de perfis para os isolados, em teste preliminar realizado. Os produtos das reações foram submetidos à eletroforese em gel de agarose a 1,5% corado com 0,02 μL/mL de SYBR Safe 10.000X em DMSO (Invitrogen), 60 V por 120 min. Os perfis de bandas polimórficos foram visualizados em fotodocumentador modelo ImageQuantTM LAS 4000 (GE Healthcare).

4.3. Triagem dos genes catabólicos

A amplificação de genes catabólicos que codificam para monoxigenases e dioxigenases a partir do DNA genômico dos isolados foi realizada utilizando os primers alk (monoxigenase) e α-ARHD (dioxigenase) (Tabela 5).

Nas reações de PCR com os primers alk foram utilizados dois controles positivos: Acinetobacter sp. ADP1 (CBMAI 991) e Rhodococcus erythropolis DSM 43066 (CBMAI 811).A metodologia utilizada foi de acordo com Kuhn (2007), à exceção de que o número

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de ciclos foi aumentado para 35 e a temperatura de anelamento para 51°C. Para os primers ARHD foram utilizados como controles positivos as linhagens Pseudomonas putida 17484 (CBMAI 992) e Pseudomonas putida F1 (CBMAI 994). A metodologia utilizada foi a estabelecida por Bellicanta et al. (2004), aumentando o número de ciclos para 35 e a temperatura de anelamento para 58°C.

Tabela 5. Sequências dos primers utilizados para amplificação de genes catabólicos.

Primers Seqüências 5’- 3’ Referências

α-ARHDf 5’ TTY RYI TGY AII TAY CAY GGI TGG G

Bellicanta & Pellizari, 2009

α-ARHDr 5’ AAI TKY TCI GCI GSI RMY TTC CA

alkF 5’ GCI CAI GAR ITI RKI CAY AA

Bellicanta, 2005

alkR 5’ GCI TGI TGI TCI SWR TGI CGY TG

4.4. Triagem para atividade de degradação de hidrocarbonetos

Antes dos ensaios de biodegradação, os isolados foram inicialmente triados quanto à capacidade de crescer em presença de hidrocarbonetos como única fonte de carbono. Os ensaios foram conduzidos em placas de 96 compartimentos contendo, cada um, 150 μL de meio mineral (5,0 gL-1 NaCl, 1,0 gL-1 K2HPO4, 1,0 gL-1 NaHPO4, 1,0 gL-1 NH3SO4, 0,2 gL-1

MgSO4.7H2O, 3,0 gL-1 K2NO2) (Vasconcellos et al., 2009), acrescido de um dos

hidrocarbonetos a seguir: 1% de Hexadecano (Garcia, 2011), 0.02% de fenol, 0.01% de naftaleno, 0.01% de fenantreno, 0.01% pireno, e 0.005% de benzopireno (Patzelt, 2005), os quais foram diluídos em dimetilformamida (Merck). A concentração utilizada para os hidrocarbonetos foi de acordo às referências bibliográficas.

As culturas foram incubadas a 28°C por 24 h. A detecção dos isolados capazes de crescer em cada um dos diferentes hidrocarbonetos testados como única fonte de carbono foi realizada pelo método colorimétrico do MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-yl)- 2,5-difeniltetrazolium brometo), o qual é baseado na avaliação da respiração bacteriana (Johnsen et al., 2002). O MTTé um corante sintético amarelo que em contato com células vivas é reduzido à formazano, um composto de coloração violeta. Assim, em cada poço da placa foram adicionados 30 μL de MTT 1%, seguido pela incubação das placas de 96 poços