UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE
PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS
APLICADAS À SAÚDE
BETÂNIA CABRAL ACIOLE BOMFIM
AVALIAÇÃO DO PAPEL DO CCR4 NO REPARO ÓSSEO
ALVEOLAR EM CAMUNDONGOS
LAGARTO-SE 2018
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2 0 1 8BETÂNIA CABRAL ACIOLE BOMFIM
AVALIAÇÃO DO PAPEL DO CCR4 NO REPARO
ÓSSEO ALVEOLAR EM CAMUNDONGOS
Dissertação apresentadaao Programa de Pós-Graduação em Ciências Aplicadas à Saúde da Universidade Federal de Sergipe como requisito à obtenção parcial do grau de Mestre em Ciências Aplicadas à Saúde.
Orientador: Prof. Dr. Carlos Eduardo Palanch Repeke
LAGARTO- SE 2018
FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA DO CAMPUS DE LAGARTO UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE
B695a
Bomfim, Betânia Cabral Aciole
Avaliação do papel do CCR4 no reparo ósseo alveolar em camundongos / Betânia Cabral Aciole Bomfim ; orientador Carlos Eduardo Palanch Repeke – Lagarto, 2018.
67 f. : il.
Dissertação ( Mestrado em Ciências Aplicadas à Saúde ) - Universidade Federal de Sergipe, 2018.
1. Osteogênese. 2. Inflamação. 3. Imunologia. 4. CCR4. 5. Alvéolo dental. I. Repeke, Carlos Eduardo Palanch, Orient. lI. Título.
BETÂNIA CABRAL ACIOLE BOMFIM
AVALIAÇÃO DO PAPEL DO CCR4 NO REPARO
ÓSSEO ALVEOLAR EM CAMUNDONGOS
Dissertação apresentadaao Programa de Pós-Graduação em Ciências Aplicadas à Saúde da Universidade Federal de Sergipe como requisito à obtenção parcial do grau de Mestre em Ciências Aplicadas à Saúde.
Aprovado em :_____/_____/_____
1º examinador
2º examinador
3º examinador
PARECER _______________________________________________________________________ _______________________________________________________________________ _______________________________________________________________________ _______________________________________________________________________ _______________________________________________________________________DEDICATÓRIA
Dedico esse trabalho aos meus amados...
Alberto, Tânia, Saulo, Isabella e Paulo Victor
AGRADECIMENTOS
Dois anos se passaram e tantos conhecimentos e descobertas foram adquiridos no mundo da pesquisa! Eu não poderia deixar de agradecer a todos que estiveram comigo nessa jornada, tornando esse sonho possível.
A Deus em primeiro lugar, por estar presente em minha vida, guiando minhas escolhas, protegendo com Seu sagrado manto minha casa e minha família. A Ele, toda honra e toda glória!
Aos meus pais, Alberto e Tânia, por serem meus alicerces e minhas maiores inspirações. Obrigada por sempre me dar apoio, incentivo, amor incondicional. Obrigada por cuidar de meus filhos nos meus momentos de entrega ao estudo. Muito obrigada por, muitas vezes, acreditarem mais em mim do que eu mesma. Amo vocês!
Ao meu esposo Saulo, por compreender minhas ausências e as minhas angústias. Por ser meu parceiro de vida e meu amor. Nossa união, nossos momentos, nossos filhos, não me deixaram desistir quando achei que seria difícil demais concluir isso tudo. Obrigada por me fazer rir, obrigada por me deixar chorar, obrigada por acreditar no meu sonho. Essa conquista é nossa! Te amo!
Aos meus filhos, Isabella e Paulo Victor, por me mostrarem o poder do amor incondicional, por me fazer querer ser melhor a cada dia, é por vocês que luto! Obrigada meus pequenos por sempre suavizarem meus dias mais pesados, por cada abraço, carinho, beijo. Mamãe promete colocar vocês pra dormir, sentar no chão pra brincar, conversar até cansar, cantar, voltar a curtir a infância de vocês... Ao meu orientador, Prof. Dr. Carlos Eduardo Palanch Repeke, por todo ensinamento, confiança, paciência e incentivo constante. Muito obrigada por toda dedicação e disponibilidade na orientação desse estudo.
À professora Drª Edna Aragão Farias Cândido, por toda atenção, carinho, colaboração durante esta fase. Obrigada por abrir as portas do seu laboratório (ITP-UNIT/SE), por ceder seu espaço e seus conhecimentos. Você sempre foi e será minha mãe científica.
Aos docentes e colaboradores do Programa de Pós Graduação em Ciências
Aplicadas à Saúde (PPGCAS), por compartilhar conhecimentos científicos e assim
Aos amigos discentes que conquistei nessa fase, por dividirem comigo o mesmo sonho, em especial Ananda Ribeiro, Giulliani Brasileiro, Heloísa Bernini, Juliana Alcantara e Hugo Carvalho. Obrigada ela amizade, força, momentos de discussão científica e principalmente, pelas boas risadas.
Aos meus coordenadores da Universidade Tiradentes – UNIT, por compreenderem minhas ausências e acreditarem nesse sonho.
À Universidade Federal de Sergipe – UFS, pela oportunidade e por todo suporte necessário para o desenvolvimento deste mestrado.
À equipe de pesquisadores da FOB/USP, pela gentileza e colaboração.
A todo o grupo de pesquisa, em especial Tainah e Bruna, por toda a ajuda durante a realização do projeto. Vocês foram peças fundamentais!
Enfim, a todos que de certa forma contribuíram direta ou indiretamente para a concretização desta pesquisa: MUITO OBRIGADA!
RESUMO
AVALIAÇÃO DO PAPEL DO CCR4 NO REPARO ÓSSEO ALVEOLAR EM CAMUNDONGOS. BETÂNIA CABRAL ACIOLE BOMFIM. LAGARTO/SE. 2018.
Introdução: O processo do reparo ósseo depende de mecanismos que envolvem o sistema ósseo e imunológico. Leucócitos, citocinas e seus receptores, participam facilitando respostas imunoinflamatórias durante o reparo. O receptor CCR4 é importante no recrutamento de linfócitos T durante respostas imunes. A expressão de CCR4 em células T traz interesse em investigar o papel deste receptor na imunidade inata durante o reparo ósseo, já que os linfócitos T ativados podem ser fontes de ativação de RANKL e a partir daí, interferir na osteoclastogênese e,
portanto, no reparo ósseo. Assim, o objetivo desse estudo é avaliar o papel do
CCR4 no processo de reparo ósseo alveolar pós-exodontia do incisivo superior direito de camundongos. Metodologia: Para isso, foram utilizados 40 camundongos divididos em dois grupos WT - (grupo controle) e CCR4KO - (grupo experimental - deficiente para o receptor CCR4) e analisados quanto ao reparo ósseo alveolar nos períodos de 0, 7, 14 e 21 dias pós-exodontia. Amostras foram submetidas ao processamento histológico e analisadas ao microscópio óptico para caracterização histomorfométrica. Resultados: Como resultado geral das análises histológicas, constatamos que a ausência de CCR4 não afetou o resultado final do reparo ósseo alveolar em camundongos CCR4KO, que tiveram uma sequência de eventos inflamatórios e de reparo semelhantes ao do grupo controle. Na análise histomorfométrica, os resultados mostram maior densidade de coágulo no grupo CCR4KO no período de 0 hora (p< 0,05); como também mais células inflamatórias no período de 7 dias comparado ao controle (p< 0,05). Houve no grupo CCR4KO uma menor densidade de vasos nos períodos de 7, 14 e 21 dias, porém com aumento gradativo nos dois grupos (p< 0,05). Quanto a densidade de fibras, a diferença entre os grupos foi estatisticamente significante (p< 0,05) quando observada a redução gradual da densidade no grupo CCR4KO a partir do período de 7 dias, assim como a densidade de fibroblastos que foi menor nos períodos de 7, 14 e 21 no grupo CCR4KO, quando comparado ao grupo controle. Houve também uma diferença significativa na formação óssea, onde o grupo CCR4KO teve densidade de área de tecido ósseo maior nos períodos de 7, 14 e 21 dias quando comparado ao controle (p< 0,05), com atividade de osteoblastos menor aos 7 dias e maior aos 14 e 21 dias e, atividade de osteoclastos maior que o grupo controle nos períodos de 7, 14 e 21 dias. Conclusão: A ausência do receptor CCR4 não foi capaz de interferir na sequência de eventos que acontecem no reparo ósseo alveolar dos camundongos, mas promoveu diferenças em alguns componentes participantes do processo de reparo ósseo alveolar.
ABSTRACT
ASSESSMENT OF THE ROLE OF CCR4 CELLS IN THE ALVEOLAR BONE REPAIR PROCESS IN MICE. BETÂNIA CABRAL ACIOLE BOMFIM. LAGARTO/SE. 2018.
Introduction: The bone repair process depends on mechanisms which involve both osseous and immune systems. Leukocytes, cytokines and their receptors play a role in yielding immune responses during repair. The CCR4 receptor is important in recruiting T lymphocytes during immune responses. That expression of CCR4 in T cells has aroused our interest in investigating the role of that receptor in innate immunity during bone repair, since T activated lymphocytes could be the source of RANKL activation and thus interfere in osteoclastogenesis, and therefore in bone
repair. Thus, the purpose of this study is to determine the role of CCR4 cells in the
post-extraction alveolar bone repair process of the upper right incisor of mice. Methodology: For that, a total of 40 mice were used, divided into two groups (control group - C57 BI/6 WT) and CCR4KO (experimental group – CCR4 deficient) and had their bone repair processes analyzed during periods of 0 hour, 7, 14 and 21 days post-exodontia. Samples underwent histological processing and were analyzed by means of optical microscopy for histomorphometric characterization. Results: As an overall result of the histological analyses, it has been observed that the absence of CCR4 did not affect the end result of alveolar bone repair among CCR4KO mice, which showed a sequence of inflammatory and repair events similar to that of the control group. As for the histomorphometric analysis, results showed higher blood clot density among the CCR4KO group at 0 hour (p< 0,05); as well as a higher number of inflammatory cells over the 7-day period when compared to the control group (p< 0,05). The CCR4KO presented lower vessel density over the 7, 14 and 21-day periods, however, with a gradual increase among both groups (p< 0,05). As for the fiber density, the gap among the four groups was statistically significant when the focus was on the gradual density decrease in the CCR4KO group from the 7-day period, as well as the fibroblast density was lower in the 7, 14 and 21 days in the CCR4KO group, when compared to the control group. There was also a significant difference in bone formation, with the CCR4KO group showing higher area density of bone tissue over the 7, 14 and 21-day periods when compared to the control group (p< 0,05), with lower osteoblast activity at 7 days and higher at 14 and 21 days, and an osteoclast activity higher than that of the control group at 7, 14 and 21 days. Conclusion: The absence of the CCR4 receptor was not capable of interfering with the sequence of events which take place during alveolar bone repair of mice, but caused differences within some active components of alveolar bone repair process. Descriptors: osteogenesis, inflammation, immunology, CCR4, dental alveolus.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Representação esquemática da sequência de eventos histológicos no processo do reparo ósseo alveolar pós exodontia ...27
Figura 2:Superfamília de Quimiocinas e seus Receptores ...30
Figura 3: Procedimento de exodontia/extração de incisivo superior direito em camundongo. (a). Camundongo da linhagem C57Bl/6-WT; (b). Procedimento de deslocamento da mucosa e luxação; (c). Remoção do dente do alvéolo; (d). Alvéolo pós-exodontia...38
Figura 4: Representação esquemática da análise histomorfométrica. Em (a) retículo de integração (II ZEISS) sobreposto a um corte histológico formando um campo contendo 100 pontos equidistantes (10x10) e sua distribuição regular por 13 campos sobre o corte histológico em (b), totalizando 39 campos nos 3 cortes
histológicos do terço médio do alvéolo
pós-exodontia...42
Figura 5: - Fotomicrografia representativa do Grupo WT e CCR4KO nos tempos de 0,7, 14 e 21 dias. Cortes histológicos foram obtidos provenientes dos alvéolos após exodontia do incisivo superior com a objetiva de 10x e 40x (Coloração em HE.; barra=100 μm)...44
Figura 6: Análise comparativa da densidade de área (%) dos parâmetros coágulo sanguíneo (a) e outras estruturas (b) presentes no alvéolo dental de camundongos do grupo controle (WT) e experimental (CCR4KO) nos períodos de 0h, 7 e 14 dias pós-exodontia...47
inflamatórias (a) e vasos (b) presentes no alvéolo dental de camundongos do grupo controle (WT) e experimental (CCR4KO) nos períodos de 0h, 7 e 14 dias pós-exodontia...47
Figura 8: Análise comparativa da densidade de área (%) dos parâmetros Fibras (a) e Fibroblastos(b) presentes no alvéolo dental de camundongos do grupo controle (WT) e experimental (CCR4KO) nos períodos de 0h, 7 e 14 dias pós-exodontia...48
Figura 9: Análise comparativa da densidade de área (%) dos parâmetros osteoblastos (a) e Osteoclastos (b) presentes no alvéolo dental de camundongos do grupo controle (WT) e experimental (CCR4KO) nos períodos de 0h, 7 e 14 dias pós-exodontia...49
Figura 10: Análise comparativa da densidade de área (%) do parâmetro osso (a) presente no alvéolo dental de camundongos do grupo controle (WT) e experimental (CCR4KO) nos períodos de 0h, 7 e 14 dias pós-exodontia...50
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Relação dos grupos experimentais avaliados de acordo com o número de animais por período e tipo de análise
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
% por cento ºC grau Celsius µm nº micrometro número ALP ATL fosfatase alcalinalinfoma de células T em adultos - adult T-cell lymphoma BMPs
CD CCL CCR
proteínas morfogenéticas ósseas cluster de diferenciação
quimiocina da família cc
receptor de quimiocina da família cc C57BI∕6 (WT) camundongo 57 black∕6
COL – 1 CTL
colágeno do tipo 1
linfomas de célula T cutâneo - cutaneous T-cell lymphomas
CTsK catepsina K Cm CXCL CXCR centímetro quimiocina da família CXC
receptor de quimiocina da família CXC DNA ácido desoxirribonucléico
EDTA ácido etilenodiamino tetraacético et al. colaboradores
FGF fator de crescimento fibroblasto FOB-USP
FMRP
Faculdade de Odontologia de Bauru –USP Faculdade de medicina de Ribeirão Preto HE hematoxilina e eosina h horas IL INF INOS Interleucina Interferon
Enzima que produz óxido nítrico
KO Animal geneticamente modificado (knowckout) LTDA
MDC
sociedade empresarial de responsabilidade limitada quimiocina derivada de macrófagos
mg/Kg MMPs mRNA
miligrama por quilo
metaloproteinases de matriz ácido ribonucleico mensageiro MSCs células tronco mesenquimais NFAT
NFATc1
fator nuclear de ativação de células T fator nuclear de ativação de células Tc1 NK
NKT
células degradadoras naturais (natural killer)
natural killer T
OPG OSTERIX
Osteoprotegerina
Fator de transcrição que se diferencia em osteoblastos Ph
PTH
potencial hidrogeniônico hormônio da paratireóide
RANK receptor de ativação do fator nuclear Κappa
RANKL ligante do receptor de ativação do fator nuclear Kappa RNA RUN x2 TARC Treg TGF-β Th ácido ribonucleico
fator de transcrição ao runt 2
quimiocina regulada por timo e ativação linfócitos T reguladores
fator de crescimento e transformação beta linfócitos T helper - auxiliar
TNF TRAP UFS
Fator de necrose tumoral
Enzima fosfatase ácida resistente ao tártaro Universidade federal de Sergipe
VEGF fator de crescimento do endotélio vascular
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO...18
2 REVISÃO DE LITERATURA ...20
2.1. TECIDO ÓSSEO ...20
2.2. OSTEOIMUNOLOGIA E REPARO ALVEOLAR...24
2.3. QUIMIOCINAS E CCR4...28 3 OBJETIVOS...35 3.1 OBJETIVO GERAL ...35 3.2 OBJETIVO ESPECÍFICO ...35 4 MATERIAIS E MÉTODOS...36 4.1 TIPO DE ESTUDO...36 4.2 ANIMAIS DE EXPERIMENTAÇÃO...36 4.3 PROCEDIMENTOS CIRURGICOS...37 4.4 COLETAS DE AMOSTRAS...38 4.5 PROCEDIMENTOS HISTOTÉCNICOS...39
4.6 ANÁLISES HISTOLÓGICAS DESCRITIVA E HISTOMORFOMÉTRICA...39
4.6.1 Análise histológica descritiva...40
4.6.2 Análise histomorfométrica...40
4.6.2.1 Estereologia...41
4.7 ANÁLISE ESTATÍSTICA...42
5 RESULTADOS...43 5.1 ANÁLISE HISTOLÓGICA DESCRITIVA DO PROCESSO DE REPARO ÓSSEO ALVEOLAR PÓS-EXODONTIA EM CAMUNDONGOS WT/
CONTROLE...43
5.2 ANÁLISE HISTOMORFOMÉTRICA COMPARATIVA DO REPARO ÓSSEO ALVEOLAR PÓS-EXODONTIA EM CAMUNDONGOS CCR4KO x WT...46
6 DISCUSSÃO...51
7 CONCLUSÃO...58
REFERÊNCIAS...59
18
1 INTRODUÇÃO
Em uma lesão com perda de tecido ósseo, como o que ocorre em fraturas ou lesões inflamatórias osteolíticas, espera-se um adequado processo de reparo ósseo e neoformação óssea para que aconteça o reestabelecimento da homeostasia tecidual e recuperação das funções, bem como o estabelecimento de terapias reabilitadoras (PERES; LAMANO, 2011). Uma variedade de respostas imunoinflamatórias tem sido implicada na patogênese de doenças ósseas; e, a participação no processo de reparo ósseo de células como leucócitos, moléculas regulatórias, citocinas e seus receptores, é constantemente avaliada em novas pesquisas, assim como a harmonia dessas células com as células ósseas. Então, compreender a interação entre o sistema ósseo e imunológico é fundamental para buscar modular a atividade das células ósseas em situações de resposta imune e inflamatória (REPEKE, 2013).
O tecido ósseo é extremamente dinâmico, e mesmo em homeostase, apresenta alta taxa de renovação. Basicamente é formado por três tipos celulares, os osteoclastos, osteoblastos e osteócitos, que em conjunto são responsáveis pela constante remodelação deste tecido, em ciclos de reabsorção e deposição óssea, um processo chamado de "couple bone formation". A integridade do tecido ósseo depende da manutenção de um delicado equilíbrio entre a reabsorção óssea pelos osteoclastos e a formação óssea pelos osteoblastos (TAKAYANAGI, 2009; ERIKSEN, 2010).
A interação entre os sistemas imunológico e esquelético ocorre pela ação de mediadores produzidos pelas células do sistema imune. Esses mediadores interferem no processo de remodelação óssea: mediadores inflamatórios inibem a atividade dos osteoblastos e potencializam a atividade dos osteoclastos, enquanto mediadores anti-inflamatórios realizam efeito oposto (GARLET et al.,2006a; GARLET et al., 2006b; GARLET et al., 2007).
O conhecimento sobre a conexão do sistema ósseo e o sistema imunológico apresentou avanços com a descoberta do sistema RANK (receptor de ativação do fator nuclear kappa-beta) / RANKL (ligante do receptor de ativação do fator nuclear kappa-beta) / OPG (osteoprotegerina), formado por moléculas compartilhadas por ambos os sistemas, e que resultou no nascimento da terminologia "osteoimunologia"
19
(LORENZO; CHOI, 2005). A ligação de RANKL a RANK, expresso nos precursores
de osteoclastos, é o principal evento estimulatório para sua diferenciação e posterior ativação de osteoclastos. Os efeitos de RANKL são regulados por OPG, que inibe a reabsorção óssea impedindo a interação entre RANKL e RANK. Alterações no balanço da expressão destes fatores osteoclastogênicos estão relacionadas a eventos chaves na patogênese de doenças inflamatórias no tecido ósseo (REPEKE et al., 2010).
De modo geral, os eventos inflamatórios podem contribuir para a produção local e liberação de fatores de crescimento classicamente associados à neoformação
óssea (como BMPs – proteínas morfogenéticas ósseas e TGF-β – fator de
crescimento e transformação beta), bem como a promoção da quimiotaxia de células
associadas ao processo de reparo, como citocinas e seus receptores. E assim,
várias classes de receptores do sistema imune são importantes para o reconhecimento antigênico inicial e para a indução subsequente da resposta pró-inflamatória (VIEIRA et al., 2015).
Sabe-se que o receptor de quimioquina CC4 (CCR4) é o receptor de dois
ligantes de quimiocina CC (CCLs) - CCL17 e CCL22. Assim a ligação entre o
receptor CCR4 com CCL17 e CCL22 demonstra ser capaz de induzir a atração de células T, monócitos e células NK ativadas com IL-2, que possuem papéis fundamentais na resposta imune/inflamatória e no processo de reparação tecidual em geral (YOSHIE; MATSUSHIMA, 2014; SOLARI; PEASE, 2015).
Essa expressão de CCR4 em células T traz um interesse em investigar o papel deste receptor durante o reparo ósseo, já que os linfócitos T ativados podem ser fontes de ativação de RANKL (SUCUR et al., 2017), e, a partir daí, interferir na
osteoclastogênese; ou através das células Treg, influenciar OPG e, portanto, a
formação óssea.
Trabalhos iniciais de VIEIRA, 2013; BIGUETTI, 2014 mostraram, dentre outros achados, um aumento na expressão de CCR4 ao longo do processo do reparo alveolar em camundongos WT (especialmente nos primeiros 7 dias de estudo) , assim como do seu ligante CCL17 no recrutamento de células T, NK e macrófagos, o que torna oportuna a investigação do papel do CCR4 durante o processo de reparo ósseo alveolar pós-exodontia, foco desse trabalho.
20
2 REVISÃO DE LITERATURA
Recentemente, extensas interações recíprocas entre os sistemas imunológico e esquelético foram demonstradas, resultando no estabelecimento de um novo campo de pesquisa interdisciplinar denominado “osteoimunologia”, que é focado no estudo
da relação entre os sistemas imunológico e ósseo. Em particular, a osteoimunologia
tenta esclarecer como o sistema imune impacta na renovação óssea, como ocorre o equilíbrio dinâmico entre esses sistemas nas fases de formação e reabsorção
ósseas, em condições fisiológicas e patológicas. (TAKAYANAGI, 2005; REPEKE,
2013; GINALDI; de MARTINIS, 2016). Sob esse aspecto, diversas frentes de estudos vêm tentando pesquisar o processo de formação e reparo ósseo através da análise da participação de células como leucócitos, moléculas regulatórias, citocinas e seus receptores, assim como a harmonia destas células com as células ósseas (KALYVAS; TARENIDOU, 2008).
Portanto, o grande desafio da osteoimunologia é compreender de que forma ocorrem os mecanismos regulatórios e as vias de sinalização que envolve essa interação entre o sistema ósseo e imunológico, favorecendo um adequado desenvolvimento do processo de reparo e neoformação óssea e com isso o restabelecimento da homeostasia tecidual e recuperação de suas funções. Assim, tenta-se com o entendimento dessa interação, fornecer estrutura para a descoberta
de novos tratamentos para doenças relacionadas a ambos os sistemas (PERES;
LAMANO, 2011; GINALDI; de MARTINIS, 2016).
2.1. TECIDO ÓSSEO
O tecido ósseo é um tecido mineralizado rígido, de origem conjuntiva, que se dispõe formando os ossos, estruturas rígidas e resistentes que formam o esqueleto. O osso tem funções estruturais e mecânicas bem reconhecidas, sendo capaz de
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proteger órgãos vitais, dar apoio às estruturas do corpo, auxiliar a locomoção, alojar a medula óssea e serve como um reservatório de cálcio e fosfato ao organismo. Além disso, proporciona apoio aos músculos esqueléticos, transformando suas contrações em movimentos úteis, constituindo, assim, um sistema de alavancas que amplia as forças geradas na contração muscular. Ao lado do excelente comportamento mecânico, o osso exibe um excelente potencial de reparo e mesmo em homeostase apresenta alta taxa de renovação (TAKAYANAGI, 2009; JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2013).
Uma matriz extracelular abundante e mineralizada garante a atividade multifuncional do tecido ósseo, através de ações coordenadas de células especializadas (osteoblastos, osteoclastos e osteócitos) (SCHROEDER; MOSHEIFF, 2011). A composição dessa matriz se dá por 65% de material inorgânico, 20% de matriz orgânica e 15% de água, e o principal componente da matriz orgânica é o colágeno tipo I (COL-I) (HADJIDAKIS; ANDROULAKIS, 2006; KATCHBURIAN; ARANA, 2012).
Os osteoblastos são células mononucleadas de origem mesenquimal, que tem como funções: secretar a matriz óssea orgânica, regular sua biomineralização, e o recrutamento, diferenciação e ativação dos osteoclastos. Estes, por sua vez, são células gigantes multinucleadas, de origem hematopoeica, responsáveis pela reabsorção óssea. Ainda, no final da fase de formação óssea, os osteoblastos podem passar a um estado quiescente e permanecer na superfície da matriz como células de revestimento, ou sofrerem apoptose, ou ainda serem incorporados à matriz como osteócitos que são células discoides, achatadas, localizadas em lacunas e responsáveis pela manutenção do osso (DALLAS; BONEWALD, 2010; BIANCO; SACCHETTI; RIMINUCCI, 2011).
Durante o desenvolvimento, a remodelação e a reparação do tecido ósseo, as células tronco mesenquimais (MSCs) se diferenciam em osteoblastos através do controle dos fatores de transcrição RUNX2 (runt-related transcriptionfactor 2) e OSTERIX, e de outros fatores como o TGF-b e BMPs (TAKAYANAGI, 2009; ERIKSEN, 2010). Após serem diferenciados e ativados, os osteoblastos sintetizam a porção orgânica da matriz óssea, regulam a produção da fosfatase alcalina (ALP) o que contribui para a mineralização da matriz, secretam fatores de crescimento com função autócrina e parácrina (BMPs, Fator de crescimento de fibrobasto – FGF, TGF-b, entre outros) e ainda controlam a diferenciação e ativação de osteoclastos
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através da síntese de osteoprotegerina (OPG) e do ligante do receptor de ativação do fator nuclear Kappa-B (RANKL) (RHO; TAKAMI; CHOI, 2009; ERIKSEN, 2010). Posteriormente, os osteoblastos podem seguir dois caminhos: ou entram em estado quiescente e revestem a matriz óssea, ou sofrem morte por apoptose. Os osteoblastos que foram incorporados a matriz durante o processo de deposição, diferenciam-se em osteócitos (DALLAS; BONEWALD, 2010; BONEWALD, 2017). Durante a transição de osteoblastos para osteócitos há uma grande diminuição do volume celular e são formadas projeções dendítricas que se estendem através de um sistema canalicular no interior da matriz, permitindo o acesso dos osteócitos aos vasos sanguíneos e também a comunicação dessas células entre si e com outras células ósseas presentes na superfície (FRANZ-ODENDAAL; HALL; WITTEN, 2006; DALLAS; PRIDEAUX; BONEWALD, 2013). Nesse contexto, os osteócitos são considerados células bastante versáteis que podem regular a mineralização da matriz logo após sua incorporação na mesma, e quando totalmente diferenciados, remodelar a matriz perilacunar, captar estímulos mecanosensoriais e coordenar processos de remodelação óssea por meio de sinais bioquímicos e moleculares transmitidos a osteoblastos e osteoclastos (ERIKSEN, 2010; DALLAS; PRIDEAUX; BONEWALD, 2013).
Os osteoclastos são células gigantes, hematopoéticas, derivadas de progenitores da linhagem de macrófagos e responsáveis pela reabsorção óssea (GARTNER; HIATT, 2007). O desenvolvimento dos osteoclastos depende de uma molécula ativadora chamada RANKL (ligante do receptor de ativação do fator nuclear κappa-B) que quando se liga ao receptor RANK (receptor de ativação do fator nuclear κappa-B), presente na membrana celular tanto de precursores como de osteoclastos já diferenciados, desencadeia uma cascata de sinalização o que ativa diversos fatores de transcrição responsáveis pela diferenciação e ativação dos pré-osteoclastos (JIMI; GHOSH, 2005; TAKAYANAGI, 2009). O principal fator de transcrição desse processo é o NFATc1 (fator nuclear de ativação de células T c1), um membro da família NFAT (fator nuclear de ativação de células T), descoberto no processo de ativação das células T e que parece estar envolvido na função e desenvolvimento de diversas células (KIM et al., 2005; TAKAYANAGI, 2005). Porém, como já relatado anteriormente, osteoblastos também secretam OPG (osteoprotegerina), que atua como um receptor “decoy” para RANKL, impedindo sua
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ligação com RANK e por consequência regulando a reabsorção óssea (TAKAYANAGI, 2009; ERIKSEN, 2010).
Para que os osteoclastos promovam a reabsorção óssea ocorre a seguinte sequência: inicialmente aderem à superfície óssea por meios de zonas de vedação, em seguida formam um microambiente ácido na região vedada e, finalmente, são formadas lacunas de reabsorção, lacunas de Howship. As enzimas produzidas por osteoclastos nessa fase de degradação da matriz, a exemplo de catepsina K (CTSK), metaloprotease da matriz (MMPs) e fosfotase ácida resistente ao tartarato (TRAP), são também importantes componentes que caracterizam a função osteoclástica (KATCHBURIAN; ARANA, 2012; REPEKE, 2012; VIEIRA, 2013).
As interações celulares e moleculares que ocorrem no microambiente do tecido ósseo o tornam extremamente dinâmico, e, com alta taxa de renovação. A remodelação óssea é um processo equilibrado, onde osteoclastos e osteoblastos funcionam sequencialmente, promovendo reabsorção seguida de neoformação óssea nas mesmas proporções (“coupled bone formation”), e permitindo renovação do tecido ósseo sem que haja alteração de sua função (TAKAYANAGI, 2009; ERIKSEN, 2010).
Basicamente, durante a remodelação, acontecem quatro fases: a fase de ativação quando os osteoclastos são recrutados; A fase de reabsorção, quando os osteoclastos reabsorvem o osso; A fase de reversão, onde os osteoclastos sofrem apoptose e osteoblastos são recrutados; e, a fase de formação, onde os osteoblastos estabelecem nova matriz óssea orgânica que subsequentemente mineraliza (LANGDAHL; FERRARI; DEMPSTER, 2016). O desenvolvimento, a homeostasia e a capacidade de reparo do tecido, dependem então do perfeito balanço entre essas etapas, sabendo que as mesmas podem sofrer influência de fatores locais e sistêmicos e também de fatores associados ao sistema imunológico (DIMITRIOU; TSIRIDIS; GIANNOUDIS, 2005; TAKAYANAGI, 2009).
Alterações no balanço da expressão destes fatores osteoclastogênicos (RANKL, RANK e OPG) estão relacionadas a eventos chaves na patogênese de doenças inflamatórias no tecido ósseo. Se por um lado, a presença exacerbada de fatores osteoclastogênicos é a principal causa da reabsorção óssea patológica, a presença destes mesmos fatores na quantidade "ideal" é fundamental no processo de reparo ósseo, mediando à conversão do osso primário em osso secundário (ASAGIRI; TAKAYANAGI, 2007; REPEKE et al., 2010).
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2.2. OSTEOIMUNOLOGIA E REPARO ALVEOLAR
A conexão entre os sistemas imunológico e esquelético ocorre pela ação de mediadores produzidos pelas células do sistema imune. Esses mediadores interferem no processo de remodelação óssea: mediadores inflamatórios inibem a atividade dos osteoblastos e potencializam a atividade dos osteoclastos, enquanto mediadores anti-inflamatórios realizam efeito oposto (GARLET et al.,2006a; GARLET et al., 2006b; GARLET et al., 2007). Um exemplo já caracterizado dessa interação é a produção de RANKL por linfócitos T ativados, que desequilibra o balanço entre RANKL e OPG, normalmente mantido sobre cauteloso controle pelos osteoblastos. Essa interferência dos leucócitos e seus produtos sobre o sistema RANK/RANKL/OPG pode de fato interferir na homeostasia do tecido ósseo. Nesse contexto, o componente RANK/RANKL/OPG é o melhor exemplo de interação entre os sistemas ósseo e imunológico e, seu estudo resultou na vertente da imunologia
denominada osteoimunologia (TAKAYANAGI, 2009; VIEIRA, 2013).
Os linfócitos T residentes na medula óssea são as células chave da imunidade que regulam a remodelação óssea e a capacidade de resposta das células ósseas ao hormônio paratireóide (PTH), em condições fisiológicas e patológicas. Durante as doenças inflamatórias ou em condições caracterizadas por inflamação sistêmica de baixo grau, como a menopausa e o envelhecimento, a reabsorção óssea direta por osteoclastos é mediada por citocinas inflamatórias produzidas pelos linfócitos T ativados. No entanto, as células T da medula óssea também promovem a homeostase e a formação óssea, através de interações diretas com as células ósseas (GINALDI; de MARTINIS, 2016).
Basicamente, os linfócitos T subdividem-se em duas populações, classificadas pelos marcadores antigênicos de superfície CD4+ e CD8+, em linfócitos T CD4+ e linfócitos T CD8+. Os linfócitos T CD4+ auxiliares (T helper) são divididos em Th1, Th2 e Th17 a depender do padrão de citocinas que produzem. Já os linfócitos T
CD8+ podem ser citotóxicos ou reguladores (Treg). Linfócitos Th1 regulam a
resposta imunológica contra agentes patogênicos intracelulares através da liberação das citocinas IL-2 e INF-γ (Interferon – γ). Linfócitos Th2 produzem IL-4, IL-5, IL-6 e
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IL-10, favorecendo a defesa contra doenças alérgicas e infecção por helmintos. Linfócitos Th17 são responsáveis por induzir doenças autoimunes com a produção das citocinas IL-22, IL-26 e citocinas da família IL-17. Linfócitos CD8+ citotóxicos reconhecem antígenos intracitoplasmáticos e promove a morte celular programada (apoptose) na célula alvo. Linfócitos reguladores (Treg) produzem citocinas
imunossupressoras, como IL-4, IL-10 e TGF-β, e, suas funções supressivas podem
gerar benefícios no tratamento de doenças autoimunes e na prevenção da rejeição de transplantes (MESQUITA JUNIOR et al., 2010; BERTOLINI, 2015).
As populações de células Th1 e Th2 distinguem-se quanto à produção de citocinas, mas também quanto à expressão de receptores de quimiocinas. A expressão de CXCR3, CCR2 e CCR5 é observada principalmente em células Th1, enquanto CCR3, CCR4 e CCR8 são detectados entre as células T CD4+ linhagem Th2. Células Tregs expressam uma variedade de receptores de quimiocinas que permitem a entrada dessas células em tecidos. Muitas Tregs residentes nos órgãos periféricos expressam os receptores CCR4 e CCR8. Essas células têm o potencial de entrar em sítios inflamatórios na pele e no pulmão (ROCHA 2010).
O efeito final dos linfócitos T no osso depende do seu estado de ativação e do seu fenótipo específico. As células T reguladoras (Treg) inibem a osteoclastogênese e promovem a formação óssea. As células Th17 (T helper) induzem a osteoclastogênese pela secreção de interleucina (IL) -17, RANKL, TNF-α, 1 e IL-6. Além disso, IL-17 estimula a liberação de RANKL e aumenta a expressão de RANK (NAKAMURA et al., 2006).
Em condições homeostáticas de reparo, ocorre instalação de um processo
inflamatório moderado e transitório, que diminui à medida que o processo de reparo progride com a formação de um tecido de granulação, diferenciação de células ósseas e produção de matriz mineralizada, resultando na completa neoformação óssea. (CARDOSO et al., 2010; VIEIRA, 2013; BIGUETTI, 2014). Diante da lesão tecidual, ocorre uma resposta inflamatória e imune com a finalidade de restaurar a homeostase alterada, o que indica um papel fundamental das células e fatores do sistema imunológico no processo de reparo.
De modo geral, os eventos inflamatórios podem contribuir para a produção local/ liberação de fatores de crescimento classicamente associados à neoformação óssea (como BMPs e TGF-β), bem como a promoção da quimiotaxia de células associadas ao processo de reparo, como citocinas e seus receptores. Uma resposta
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imune/inflamatória envolve etapas características, entre as quais podemos destacar
as fases de reconhecimento, efetuação e regulação. E, nesse contexto, várias classes de receptores do sistema imune são importantes para o reconhecimento antigênico inicial e para a indução subsequente da resposta pró-inflamatória (VIEIRA
et al., 2015).
O osso é um dos poucos órgãos que possui alto grau de regeneração ainda na fase adulta, devido a sua capacidade de remodelação. Mesmo na cavidade oral, o tecido ósseo está em constante renovação. No caso de uma extração dentária, o reparo ósseo alveolar envolve processo complexo e sequenciado, que engloba diversas células e tecidos, de forma que a região onde havia o dente fique preenchida com tecido ósseo (TSIRIDIS; UPADHYAY; GIANNOUDIS, 2007; LIN et al., 2011; VIEIRA, 2013; BIGUETTI, 2014). O osso alveolar é uma estrutura de suporte dos dentes que se desenvolve junto com o processo de erupção e que possui as seguintes particularidades: remodelação contínua, respondendo a estímulos fornecidos pelos dentes e forças relacionadas, e o constante desafio microbiano característico do ambiente bucal (FRANCISCONI, 2013; VIEIRA, 2013). O processo de reparo alveolar envolve uma sequência de eventos, sendo seu início marcado por uma inflamação em resposta a uma lesão inicial ao tecido. Primeiro, ocorre formação do coágulo sanguíneo no interior do alvéolo, que ao longo do tempo sofre invasão de células inflamatórias. Aos poucos o coágulo é reabsorvido dando lugar a um tecido conjuntivo de granulação rico em vasos sanguíneos. Sequencialmente, esse tecido é substituído por uma matriz osteóide ativamente formada por osteoblastos. Por fim, a matriz forma as trabéculas ósseas primarias, as quais ainda são remodeladas, dando sequencia a um tecido ósseo maduro e resistente (Figura 1) (VIEIRA, 2013; BIGUETTE, 2014).
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Figura 1 – Representação esquemática da sequência de eventos histológicos no processo de reparo ósseo alveolar após exodontia
Fonte: VIEIRA et al., 2015.
De forma geral, uma resposta inflamatória inicial é necessária para desencadear o processo de reparo, o que influencia as fases seguintes. E, os mediadores da resposta imune inflamatória desempenham papel importante na modulação do reparo ósseo (MILLS; SIMPSON, 2012). Nesse contexto, pesquisas realizadas em camundongos, pós-exodontia de incisivos, surgiram como alternativa para investigar os mecanismos regulatórios do sistema imunológico sobre o tecido ósseo (REPEKE, 2012; FRANCISCONI, 2013; VIEIRA, 2013; BIGUETTI, 2014).
A sequência de eventos histológicos presentes no reparo ósseo alveolar de camundongos é semelhante a dos modelos em humanos. Os camundongos podem ser modificados geneticamente para a ausência da expressão de um determinado alvo; e, a possibilidade de geração de camundongos KO (knockouts, ou geneticamente deficientes) para um determinado fator, torna possível investigar o papel específico de cada componente de um determinado fenótipo ou evento biológico, por meio da comparação dos mesmos eventos ou com o fenótipo observado em camundongos WT (camundongos normais, “tipo selvagem” – Wild-
Type), considerados nesse caso como controle (TOMOMATSU et al., 2009).
Nos estudos com camundongos WT verificou-se que durante o processo de reparo ósseo alveolar ocorre a expressão de diferentes fatores moleculares, tais
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como a enzima iNOS, fatores de crescimento como diferentes BMPs,TGF-b e VEGF (fator de crescimento vascular endotelial), marcadores de osteoblastos, de osteócitos e de osteoclastos, marcadores de matriz como metaloproteases, seus inibidores, diferentes tipos de colágeno, citocinas, além de diferentes receptores de quimiocinas e quimiocinas (REPEKE, 2012; FRANCISCONI, 2013; VIEIRA, 2013; BIGUETTI, 2014). Assim, esses trabalhos iniciais trouxeram um melhor entendimento dos mecanismos regulatórios de sistema imunológico sobre o reparo ósseo; e, uma informação curiosa foi um aumento na expressão de CCR4 ao longo do processo do reparo alveolar em camundongos WT (especialmente nos primeiros 7 dias de estudo) , assim como do seu ligante CCL17 no recrutamento de células T, NK e macrófagos (VIEIRA, 2013; BIGUETTI, 2014).
Em um estudo da análise cinética do processo de cicatrização óssea, ficou demonstrado que o CCR4 atingiu o pico no período de tempo 7dias (menos significativo que os receptores CCR2 e CCR5), seguido por uma diminuição gradual nos níveis de mRNA. Os receptores de quimiocina CCR2 e CCR5 foram regulados positivamente nos períodos de tempo 7 e 14 dias e apresentaram uma diminuição subsequente nos seus níveis de mRNA. Os níveis de CCL17 apresentaram uma regulação precoce no período de tempo de 7dias, seguido por um aumento adicional nos seus níveis de mRNA, atingindo o pico no período de 14 dias e
subsequentemente foi diminuindo. (VIEIRA et al.,2015). Esses dados trazem uma
visão da estruturação dos receptores de quimiocinas e de outras células do sistema imune no processo de cicatrização óssea e tornam oportuna a investigação do papel do CCR4 no reparo ósseo alveolar pós-exodontia, foco deste trabalho.
2.3. QUIMIOCINAS E CCR4
As quimiocinas compreendem uma superfamília de citocinas quimiotáticas, que induzem, de um modo geral, o recrutamento de diferentes populações de leucócitos, promovendo a ativação de integrinas envolvidas na adesão de leucócitos a células endoteliais e gerando gradientes quimiotáticos aos tecidos (ABBAS; LICHTMAN;
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PILLAI, 2011). Algumas quimiocinas são consideradas pró-inflamatórias e podem ser induzidas durante a resposta imune no sítio de infecção, enquanto outras são consideradas homeostáticas e estão envolvidas no controle da migração celular durante o desenvolvimento ou a manutenção dos tecidos (PALOMINO; MARTI, 2015; VELA et al., 2015). As quimiocinas estão envolvidas também em funções biológicas como angiogênese, hematopoiese, desenvolvimento embriológico, desenvolvimento de linfócitos T e B, maturação de células dendríticas, inflamação e infecção, crescimento tumoral e metástase (GUERREIRO; COSTA; PEREIRA, 2011).
Existem quatro subfamílias de quimiocinas, classificadas com base na posição dois primeiros resíduos de cisteína da extremidade N-terminal: CC, CXC, C
e CX3C (Figura 2). Em contraste com outras citocinas, as quimiocinas medeiam e
sinalizam atividades através de um grupo de sete receptores acoplados à proteína G
transmembranar. (IMAI et al., 1998; ISHIDA; UEDA, 2006; YOSHIE; MATSUSHIMA,
2014). Sabe-se ainda que a seletividade das quimiocinas a seus receptores é um fator importante para a determinação da especificidade da migração celular (ROSSI; ZLOTNIK, 2008).
A maior subfamília consiste nas quimiocinas CC, que geralmente induzem a migração de monócitos, linfócitos T e, em alguns casos, eosinófilos, basófilos ou mastócitos. As quimiocinas CC são detentoras de um papel importante nos processos de inflamação crônica e alérgica, além de atuarem como mediadoras da proliferação de células hematopoiéticas e estarem envolvidas na transmigração de células tumorais (GUERREIRO; COSTA; PEREIRA, 2011).
O movimento de leucócitos depende de um gradiente de atração, um processo conhecido como quimiotaxia, onde a quimiocina é detectada pelos receptores de quimiocina de superfície celular. A ligação da quimiocina à face extracelular do receptor ativa múltiplas vias de sinalização intracelular. Entretanto, quimiocinas e receptores de quimiocinas possuem relações altamente promíscuas: uma única quimiocina pode se ligar a vários receptores de quimiocina, enquanto um único receptor de quimiocina pode interagir com múltiplos ligantes (Figura 2) (YOSHIE; MATSUSHIMA, 2014).
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Figura 2 – Superfamília de Quimiocinas e seus Receptores
Fonte: YOSHIE; MATSUSHIMA, 2014.
Dentre os receptores de quimioquinas, o CCR4 é um receptor muito interessante. Ele é um receptor de alta afinidade para dois ligantes de quimiocina
CC (CCLs) - CCL17 (TARC – quimiocina regulada por timo e ativação) e CCL22
(MDC – quimiocina derivada de macrófagos). Ambos CCL22 e CCL17 são
expressos no timo e regulam o movimento intratímico de CCR4, CD4 +, CD8 + durante o processo de formação e diferenciação de linfócitos T, e também recrutam
essas células para os sítios inflamatórios (PEASE; HORUK, 2014; BERTOLINI,
2015).
Característica importante dos ligantes CCL17 e CCL22 é que eles foram mapeados no cromossoma 16 e não 17, como ocorrem com outras quimiocinas, com
37% de aminoácidos idênticos; e, mostram igualmente níveis elevados em timo e
expressão muito baixa em outros tecidos, derivam de macrófagos e células dendríticas maduras e induzem a agregação plaquetária. CCL17 possui alta afinidade ao CCR4, estimulando quimiotaxia e influxo de cálcio. CCL22 é
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quimioatrativo para monócitos e células NK ativadas com IL-2; e, demonstra afinidade a CCR4 com expressão ainda maior que CCL17. Esses ligantes de
quimiocina, portanto, auxiliam o recrutamento, ativação e desenvolvimento de
células T que expressam CCR4 (IMAI et al.,1998; ABI-YOUNES; SI-TAHAR; LUSTER, 2001; YOSHIE; MATSUSHIMA, 2014; SOLARI; PEASE, 2015).
O CCR4 é conhecido por sua expressão em células T, e possui papel chave na migração celular, na interação célula-célula, bem como na regulação de várias respostas imunes. Inicialmente, CCR4 foi relatado como marcador de células Th2, sendo, posteriormente, descrito em plaquetas, células NK, NKT, macrófagos, basófilos, eosinófilos e células dendríticas (COELHO, 2009; BERTOLINI, 2015). Além das células Th2, a expressão de CCR4 também está associada com
recrutamento de células Treg. Muitas Tregs de sangue periférico expressam os
receptores CCR4 e CCR8. Células dendríticas maduras parecem atrair preferencialmente as células Treg por meio da produção de CCL17 e CCL22. Esses resultados sugerem que CCR4 pode guiar células Treg para os órgãos linfoides secundários e tecidos inflamados para atenuar ativação de células T, desempenhando um papel importante na manutenção do equilíbrio imunológico (IELLEM et al, 2001; ISHIDA; UEDA, 2006).
Assim, o CCR4 atrai muita atenção pela sua possível aplicação clínica em
doenças envolvendo estes subconjuntos de células T. O aumento da expressão do
CCR4 e de seus ligantes está associado a diversas patologias como fibrose pulmonar, inflamação hepática, asma, renite alérgica, dermatites atópicas, desenvolvimento de granulomas e diabetes. Todas essas doenças apresentam infiltração de células T expressando o CCR4 (YOSHI; MATSUSHIMA, 2014; SOLARI; PEASE, 2015). Além disso, mostrou-se que o bloqueio das quimiocinas CCL17 e CCL22 por anticorpos específicos resulta na prevenção da hiper-reatividade das vias aéreas e atenuação da eosinofilia, sendo hoje em dia o CCL17 considerado biomarcador disponível para monitorar atividade da doença durante a terapia da dermatite atópica, por exemplo (BERTOLINI, 2015).
No pulmão, o recrutamento de células Tregs está associado à expressão de CCR4. Ou seja, a ausência de CCR4 prejudica gravemente o acúmulo de células
Tregs nas vias respiratórias e pulmão, resultando em doenças inflamatórias graves
(YOSHI; MATSUSHIMA, 2014; BERTOLINI, 2015). Animais deficientes para o CCR4 apresentam uma resposta antifúngica caracterizada pelo aumento da função
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neutrofílica e aumento do recrutamento de macrófagos no espaço broncoalveolar. Estes dados demonstram que o CCR4 possui um papel regulatório no recrutamento e/ou ativação das células inflamatórias. Além disso, a expressão de CCL17 e CCL22 é fortemente regulada neste órgão durante a inflamação pulmonar (SCHUH et al., 2002).
A expressão de CCR4 em células Treg também está associada com a progressão de tumor em diferentes tipos de câncer como melanoma e carcinoma de pulmão, proporcionando perspectivas para terapias alternativas utilizando pequenas moléculas antagonistas de CCR4 (ISHIDA; UEDA, 2006). Um estudo recente mostrou que o CCR4 é um condutor determinante nas metástases cerebrais de melanoma, sendo que seus ligantes CCL17 e CCL22 foram bastante expressados nos estágios iniciais das metástases de cérebro e, o bloqueio de CCR4 com uma pequena molécula de antagonista de CCR4 in vivo, reduziu a tumorigenicidade e a formação de micrometástases de células de melanoma (KLEIN et al., 2017).
Pacientes com carcinomas ovariano apresentam redução na resposta antitumoral, mediada por células Treg CCR4+, recrutadas para o tumor como resultado da produção de CCL17 e CCL22. Além disso, já está bem estabelecida a associação negativa de CCR4 em neoplasmas como linfoma/leucemia de células T em adultos (ATL - adult T-cell leukemia/lymphoma) e linfomas de célula T cutâneo (CTL - cutaneous T-cell lymphomas), devido a migração de células Treg para o local favorecendo o crescimento tumoral (ISHIDA; UEDA, 2006; ).
Na clínica tem sido testado o uso de um anticorpo monoclonal contra CCR4, o KW0761 ou Mogamulizumab. Entretanto, seu uso causa duplo efeito, enquanto aumenta a atividade antitumoral, ele pode também aumentar o risco de efeitos adversos imunomediados, como o desenvolvimento de Síndrome de Steven Johnson, onde as lesões cutâneas graves foram associadas a ausência de células Treg CCR4+ (ISHIDA; UEDA, 2006; YOSHI; MATSUSHIMA, 2014).
O papel do CCR4 no reparo ósseo ainda vem sendo pouco estudado. Sabe-se que respostas imune/inflamatórias exacerbadas mostram-se associadas basicamente à reabsorção óssea, uma resposta imune/inflamatória inibida com anti-inflamatórios (mesmos os mais específicos como os não-esteroidais), influenciam de forma negativa os processos de reparo ósseo e osseointegração (JACOBSSON et al., 1994; KALYVAS; TARENIDOU, 2008).
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Nesse contexto, a expressão de CCR4 em células Treg durante um processo inflamatório, pode desempenhar um papel na regulação da capacidade dos osteoblastos ativarem RANKL e secretar OPG, influenciando assim a extensão e grau de osteoclastogênese, ou seja, pode regular o balanço de RANKL / OPG inibindo a formação dos osteoclastos e favorecendo a formação óssea. Por outro lado, a expressão de CCR4 em células T, particularmente as células Th2 e Th17, pode ser fontes de ativação de RANKL induzindo a ativação de osteoclastos e, portanto, a reabsorção óssea (LEI et al., 2015; GINALDI; de MARTINIS, 2016).
Ainda sobre células treg e CCR4, em um modelo de osteólise inflamatória desencadeada por infecção com Aggregatibacter actinomycetemcomitans, animais CCR4KO apresentaram discreta redução da migração de células Th2, com redução mais acentuada da migração de células Treg. E, a transferência adotiva de células
Treg CCR4+ para esses animais reverteu a gravidade da doença
(BERTOLINI,2015).
Outra linha de interferência do CCR4 no reparo ósseo seria a regulação de seus ligantes CCL17 e CCL22. Um estudo de metástase óssea de câncer de pulmão demonstrou que a diferenciação seletiva dos osteoclastos, pela estimulação de RANKL com células T da medula óssea, aumenta a produção da quimiocina CCL22. Assim, é provável que os osteoclastos, que também representam uma linhagem celular intimamente relacionada com células dendríticas maduras, produzam CCL22. Isso sugere que o CCL22 tem um papel potencial na metástase óssea de células cancerosas que expressam CCR4, e, portanto na osteoclastogênese (NAKAMURA et al., 2006).
Em um estudo com implantes ortopédicos avaliou-se a interferência dos íons de titânio na expressão de citocinas e na osteoclastogênese. E, ficou demonstrado que precursores de osteoclastos mononucleares aumentaram a expressão de CCR4 quando tratados com concentração de titânio similar àquela medida in vivo; que houve expressão aumentada dos ligantes CCL17 e CCL22 por osteoclastos desafiados por titânio, o que sugere fortemente o papel fundamental destas quimiocinas no recrutamento de progenitores de osteoclastos que expressam CCR4 podendo, sinergicamente, estimular a diferenciação e ativação de osteoclastos (CADOSH et al.,2009). Ainda nesse contexto, um estudo com pacientes portadores de artrite reumatoide e psoríase mostrou que a população de células progenitoras de osteoclastos foi moderadamente aumentada na artrite reumatoide, que a
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subpopulação de RANK foi expandida em ambos pacientes, que pacientes com artrite possuem osteoclastos com maior expressão de CCR1,CCR2, CCR3 CCR4 e, além disso, houve uma tendência a expressão diminuída do CCR4 com o tratamento com anti-TNF(SUCUR et al.,2017); o que mais uma vez corrobora para a suposição que este receptor tenha um importante papel osteoclastogênico, na reabsorção óssea, e, entender sua atividade no processo de reparo ósseo se torna de grande importância.
Em estudo de VIEIRA, 2013 e BIGUETTE, 2014, uma informação que trouxe curiosidade foi um aumento na expressão de CCR4 ao longo do processo do reparo alveolar em camundongos WT (especialmente nos primeiros 7 dias de estudo) , assim como do seu ligante CCL17 no recrutamento de células T, NK e macrófagos (VIEIRA, 2013; BIGUETTI, 2014), o que torna oportuna a investigação do papel das células CCR4 durante o processo de reparo ósseo alveolar pós-exodontia, foco desse trabalho.
Diante do exposto, a investigação do papel das células CCR4 é fundamental para o entendimento dos mecanismos que ocorrem no processo inflamatório e o conhecimento do funcionamento do reparo ósseo alveolar, fornecendo fundamentos para melhor entendimento dos mecanismos celulares e moleculares que ocorrem no sistema osteoimune em situações homeostáticas de reparo ósseo.
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3 OBJETIVOS
3.1. OBJETIVO GERAL
- Investigar o papel do CCR4 no processo de reparo ósseo alveolar em camundongos.
2.2. OBJETIVO ESPECÍFICO
- Caracterizar o papel do CCR4 na resposta imune/inflamatória em camundongos.
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4 MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 TIPO DE ESTUDO
Trata-se de um estudo experimental, observacional e analítico, de coorte longitudinal, em camundongos que expressavam o receptor CCR4 ou Knockout para o mesmo.
4.2 ANIMAIS DE EXPERIMENTAÇÃO
Para o presente estudo, foram utilizados ao todo 40 camundongos machos (para evitar influência das variações hormonais sobre o processo de reparo alveolar), com idade aproximada de 8 semanas, sendo 20 animais da linhagem tipo selvagem C57Bl/6 WT (wildtype) e 20 animais geneticamente deficientes (knockout,
KO) para o receptor CCR4; formando portanto dois grupos: WT e CCR4KO. Os
camundongos WT- tipo selvagem- foram cedidos pelo biotério da Faculdade de Odontologia de Bauru (FOB/USP) e knockouts para CCR4 foram fornecidos pelo Centro de Criação de Animais Especiais da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo (FMRP/USP) e posteriormente mantidos no biotério da FOB/USP em microisoladores específicos. Os animais foram mantidos em condições controladas de temperatura (22 ± 2º C), ciclo de luz de 12 horas claro/escuro, e, alimentados com ração sólida (Ração Ativada Produtor - Anderson & Clayton S.A.) - com exceção das primeiras 24 horas pós-cirurgia em que essa alimentação foi triturada, e água ad libitum,.
Os 20 animais de cada linhagem, compondo um grupo WT e um grupo CCR4KO, foram submetidos à exodontia do incisivo superior direito e eutanasiados aos finais dos períodos experimentais pré-estabelecidos de 0 hora, 7, 14 e 21 dias. Para cada período, foram utilizados 5 animais de cada grupo para obtenção de
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análises histológicas e histomorfométricas, conforme disposto na Tabela 1. O número de animais de cada grupo experimental, os tempos de análises e as atividades propostas, foram determinados de acordo com estudos prévios utilizando esse modelo de reparo (FRANCISCONI, 2013; VIEIRA, 2013; BIGUETTI, 2014; VIEIRA et al., 2015). O presente trabalho foi realizado com a aprovação da Comissão de Ética em Pesquisa Animal da Faculdade de Odontologia de Bauru - Universidade de São Paulo (FOB/USP) (CEEPA – Proc. Nº 07/2014) - (Anexo 1).
Tabela 1. Relação dos grupos experimentais avaliados de acordo com o número de animais por período e tipo
de análise realizada.
Grupos Períodos Histologia/
Histomorfometria Total 0d 5 5 WT 7d 5 5 14d 5 5 21d 5 5 CCR4KO 0d 5 5 7d 5 5 14d 5 5 21d 5 5 Total 40 40 4.3 PROCEDIMENTOS CIRÚRGICOS
Para a exodontia do incisivo superior direito, os animais foram submetidos à anestesia geral via intramuscular, através de uma combinação do sedativo cloridrato de quetamina injetável (15 mg/kg-Dopalen® , Agribrans do Brasil LTDA) e do relaxante muscular cloridrato de xilazina injetável (10 mg/kg-Anasedan®, Agribrands do Brasil LTDA). Com o animal anestesiado, foi realizada a antissepsia da área cirúrgica com iodo tópico (Dermoidine® - Gessy Lever Industrial LTDA), o incisivo superior direito de cada animal foi extraído por meio de uma adaptação da técnica de exodontia em ratos utilizada por outros pesquisadores (OKAMOTO; DE RUSSO,
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1973). Para esse procedimento instrumentos foram adaptados: a extremidade curva de uma sonda exploradora nº5 devidamente afiada para desinserção dos tecidos moles e luxação do dente, e, uma pinça previamente desgastada para a apreensão e extração propriamente dita do dente (Figura 3) (FRANCISCONI, 2013; VIEIRA, 2013). Devido ao tamanho reduzido da área cirurgica , foi utilizado um microscópio estereoscópico (DF Vasconcelos), nos aumentos de 16x e 25x.
Figura 3 – Procedimento de exodontia/extração de incisivo superior direito em camundongo. (a).
Camundongo da linhagem C57Bl/6-WT; (b). Procedimento de deslocamento da mucosa e luxação; (c). Remoção do dente do alvéolo; (d). Alvéolo pós-exodontia.
Fonte: VIEIRA, 2013; BIGUETTI, 2014.
4.4 COLETAS DE AMOSTRAS
Ao final de cada período experimental (0 hora, 7, 14 e 21 dias pós-exodontia), os animais foram eutanasiados por meio de injeção de dose excessiva de anestésico via intramuscular. Posteriormente, as amostras constituídas pelas maxilas contendo os alvéolos foram coletadas com o emprego de uma lâmina n°20 acoplada ao cabo de bisturi (VIEIRA, 2013; BIGUETTI, 2014).
As amostras destinadas à análises microscópicas foram fixadas em solução de formol tamponado a 10% (pH 7,2), armazenadas em temperatura ambiente e posteriormente lavadas em água corrente (“over-night”). Antes de serem desmineralizadas e processadas para as análises microscópicas, essas peças foram temporariamente acondicionadas em fixador alcoólico (etanol hidratado 70%). O acondicionamento em etanol 70% foi um cuidado adicional, cujo objetivo era manter a fixação previamente obtida com o formol, mas evitar a superfixação do tecido por
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este primeiro reagente, o que poderia desnaturar os antígenos necessários para uma futura e possível marcação de imuno-histoquímica.
4.5 PROCEDIMENTOS HISTOTÉCNICOS
Após a fixação em formol por 24 horas e acondicionamento em fixador alcóolico, as amostras foram lavadas e desmineralizadas em solução de EDTA pH 7,2 (solução contendo 4,13% de Titriplex III Merck® e 0,44% de hidróxido de sódio) à temperatura de 2 a 8ºC, por um período aproximado de quarenta dias, respeitando as trocas semanais da solução desmineralizadora e monitoramento por meio da análise radiográfica.
Posteriormente, as amostras foram lavadas em água corrente, imersas em água destilada por 24 horas visando à total remoção de EDTA, e em seguida submetidas à técnica de rotina para inclusão em parafina Histosec® (parafina + resina). Para inclusão, foi feita a desidratação das amostras em 3 banhos de soluções de etanol 100% (dois banhos por 4 horas, seguido de um banho de 12 horas). Em seguida as amostras desidratadas passaram por 3 banhos de 1 hora em soluções de xilol, e por fim foram incluídas em parafina para confecção dos blocos. Os blocos de parafina foram submetidos a cortes histológicos semi-seriados no sentido transversal (perpendicular ao longo eixo do alvéolo dental), utilizando-se um micrótomo Leica Jung RM 2045. Foram obtidos cortes de 4µm de espessura para coloração com Hematoxilina e Eosina (HE), com intervalos de 500µm, abrangendo os terços coronal, médio e apical do alvéolo (VIEIRA et al., 2015). Todo o processo histológico foi realizado no laboratório de Histologia da Faculdade de Odontologia de Bauru da Universidade de São Paulo (FOB/USP).
4.6 ANÁLISES HISTOLÓGICAS DESCRITIVA E HISTOMORFOMÉTRICA
Para as análises histológicas descritiva (qualitativa) e histomorfométrica (quantitativa), foram obtidas 6 lâminas de cada animal, com 8 cortes semi-seriados em cada lâmina, os quais foram corados em Hematoxilina e Eosina (HE) para serem observados e analisados em microscópio óptico.
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4.6.1 Análise histológica descritiva
A análise histológica descritiva foi realizada com emprego de um microscópio óptico binocular (OLYMPUS, modelo CH-2), do laboratório de histologia da UFS e do Hospital Universitário-UFS, sendo considerado o terço médio do alvéolo dental dos diferentes períodos experimentais (0 hora, 7, 14 e 21 dias) para ambos os grupos (WT e CCR4KO). Optou-se por uma descrição histológica qualitativa mais abrangente da evolução do processo de reparo alveolar em objetivas menores (4x e 10x), e uma análise descritiva mais detalhada em objetiva de aumento de 40x, acompanhando os eventos de reparação óssea conforme os seguintes eventos:
Presença e reabsorção gradativa do coágulo sanguíneo;
Presença de infiltrado inflamatório;
Formação de tecido de granulação e sua transição para tecido conjuntivo, e deste para tecido ósseo neoformado;
Processo de remodelação das trabéculas ósseas neoformadas (evidenciado pela presença de osteoclastos);
Trabéculas ósseas já remodeladas, evidenciadas por linhas de reversão;
Maturação do tecido ósseo neoformado, sugerida pela presença de tecido medular.
4.6.2 Análise histomorfométrica
A análise histomorfométrica foi realizada por meio da avaliação da densidade de área das estruturas constituintes do tecido alveolar durante o reparo, sendo considerados os seguintes parâmetros histológicos:
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coágulo sanguíneo;
infiltrado inflamatório (consideradas células inflamatórias polimorfonucleares e mononucleares distinguíveis em HE);
vasos sanguíneos;
fibras colágenas (consideradas fibras colágenas todas as fibras presentes no alvéolo devido ao seu predomínio em relação aos outros tipos de fibra);
fibroblastos;
matriz óssea;
osteoblastos;
osteoclastos;
outras estruturas (espaço preenchido por líquido intersticial, medula óssea ou estruturas dentárias).
4.6.2.1 Estereologia
A densidade de área foi obtida por meio de contagem de pontos coincidentes sobre os critérios histológicos supracitados, com o emprego de uma lente ocular de compensação ZEISS kpl 8x (Carl-Zeiss Micro Imaging Inc.), contendo uma grade ou retículo de integração II ZEISS e uma objetiva de imersão com o aumento de 100x, em microscópio óptico binocular (JENAMED 2 (Carl-Zeiss).
O retículo de integração utilizado constitui uma grade composta por um quadrado que limita a área a ser estudada, e que contém um conjunto de 10 linhas paralelas sucessivas, divididas igualmente por 10 pontos, formando um sistema de 100 pontos (Figura 4a). Assim, a sobreposição do retículo sobre o campo histológico permite a contagem de estruturas que forem coincidentes com os pontos do retículo, sendo considerados ao todo 13 campos microscópicos distintos, dispostos regular e sistematicamente sobre um único corte histológico. Para cada animal, foram considerados pelo menos 3 cortes histológicos abrangendo o terço médio do alvéolo, sendo portanto contados ao todo 39 campos, conforme demonstrado na Figura 4b. Os campos foram escolhidos com intervalos regulares em cada corte, de maneira a se obter uma amostra representativa de toda área do corte (WEIBEL, 1969).
