Conceitos e
aplicações para
cromatografi a
Índice
Sobre a empresa . . . 3
Introdução . . . 4
Conceitos básicos . . . 5
Escolha de empacotamentos . . . 7
Adequação entre amostra, fase estacionária e fase móvel. . . 7
Seletividade . . . 8
Capacidade . . . 12
Operação . . . 13
Condicionamento . . . 13
Carregamento de amostra . . . 14
Lavagem . . . 15
Eluição e coleta . . . 16
Estudo de produtos . . . 17
Análise de Omeprazol em soro humano . . . 17
Opções de cartuchos de tipo C18 . . . 18
Extração Líquida em suporte (SLE) . . . 19
Solução de problemas . . . 20
Pré preparo de amostras . . . 20
Eluição durante etapas de carregamento ou lavagem . . . 20
Ausência do sinal do analito de interesse na mistura final . . . 2 1
Notas finais . . . 22
Referências . . . 23
outros. Fundada em 2014 por profissionais com grande experiência na técnica de cromatografia líquida, a Acore tem como foco o fornecimento de colunas de cromatografia capazes de abranger todo o espectro de separações através de quatro representadas: GL Sciences, atendendo necessidades relacionadas a cromatografia líquida, gasosa e em fluidos supercríticos; Shodex, com colunas poliméricas e de especialidades;
Chiral Technologies, com colunas quirais e Advanced Materials Technologies, com colunas de núcleo sólido.
Introdução
O preparo de amostras está presente no cenário da cromatografia desde o seu início. De fato, o primeiro método cromatográfico registrado na história, desenvolvido por Mikhail Tswett, incluía uma etapa de extração de clorofila e outros pigmentos encontrados em folhas antes da sua aplicação em colunas empacotadas com recheios diversos como alumina ou carbonato de cálcio (Ettre, 2003).
Com o subsequente avanço da química analítica em diversas áreas do conhecimento, desde pesquisas em universidades até o controle de qualidade de diversos produtos, muitas técnicas foram desenvolvidas de maneira a solucionar desafios para análises qualitativas e quantitativas.
Dentre as técnicas mais conhecidas de preparo de amostra, pode-se destacar o emprego de cartuchos e placas para o desenvolvimento de extrações em fase sólida ou SPE. O objetivo deste e-book é explorar conceitos básicos e notas de aplicações, de modo a ilustrar as capacidades da técnica em um laboratório moderno.
empacotada ou utilizada como revestimento das paredes de um suporte, (um exemplo pode ser encontrado na figura 1). Usualmente emprega-
Segundo Kirkland (2010), os cartuchos de SPE podem ser empregados para funções como dessalinização de amostras, remoção de interferentes ou analitos agressivos à coluna analítica, concentração de amostras, troca de solventes ou derivatização in situ.
O emprego deste tipo de produto é uma alternativa fácil, segura e eficiente em comparação com técnicas de extração líquido-líquido, onde explora-
características únicas como afinidade com diferentes solventes e solutos, seletividade e resistência tanto química quanto mecânica.
se a diferença de afinidade de um analito com relação à dois solventes imiscíveis. Esta é uma técnica que geralmente consome menos solventes e evita situações problemáticas como dificuldades de recuperação ou formação de emulsões.
Os procedimentos envolvendo este tipo de produto podem ser desenvolvidos tanto por gravidade quanto por métodos como centrifugação, vácuo ou pressão positiva, ilustrados na figura 2.
Figura 1: Modelo básico de um cartucho de SPE.
Conceitos básicos
Para aumento de produtividade, os cartuchos são posicionados em manifolds, suportes com um número fixo de conexões e coletores dedicados.
Esta configuração permite que um grupo de amostras seja trabalhado ao mesmo tempo. Na figura 3 é possível observar com mais detalhes este tipo de configuração. No caso do trabalho em pequenas quantidades de amostra, o emprego de placas de 96 poços pode ser uma ótima alternativa para produtividade.
Figura 2: Representação de sistemas onde a técnica de SPE pode ser empregada.
Figura 3: Manifold para 12 cartuchos.
O primeiro passo para a escolha de um empacotamento está na determinação do objetivo da operação. Os principais métodos são voltados à concentração ou limpeza de amostras. Este
É possível conceber um cartucho de SPE como uma coluna de cromatografia menor e menos eficiente, cujo objetivo é apenas realizar uma
“separação primária”. Levando em conta este
É importante que tanto os interferentes quanto os analitos de interesse sejam solúveis em uma fase móvel adequada, desta maneira pode-se garantir que o método desenvolvido apresente
critério determinará o mecanismo de interação intermolecular da coluna e o que exatamente deve ser mais retido, como é apresentado na figura 4.
ponto de vista, as mesmas regras aplicadas às colunas de HPLC devem valer nesta situação.
Alguns critérios básicos devem ser considerados:
Figura 4: Exemplos de métodos envolvendo cartuchos de SPE.
boa recuperação. A figura 5 apresenta um guia de sugestão de trabalho relacionando tipos de amostra, analitos de interesse e sugestões de fase estacionária.
Adequação entre amostra, fase estacionária e fase móvel
Escolha de
empacotamentos
De maneira análoga às outras técnicas de cromatografia, a seletividade que um empacotamento pode proporcionar é muito importante para este tipo de preparo de amostras, sendo um critério determinante para a retenção ou não de um conjunto de moléculas.
Segundo o levantamento da equipe de aplicações da Acore Consumíveis, o tipo de empacotamento mais utilizado para preparo de amostras no primeiro semestre de 2020 foi “sílica-C18”, o que nos leva ao primeiro mecanismo de separação a ser destacado neste capítulo, a fase reversa.
A fase reversa é empregada para todo o tipo
Figura 5: Guia de escolha de cartuchos de SPE.
Seletividade
de situação em que se necessita de retenção de compostos apolares ou de polaridade intermediária.
A série de fase reversa geralmente conta com diversos tipos de ligantes em base sílica capazes de desempenhar interações intermoleculares não somente de natureza hidrofóbica como também mecanismos auxiliares como troca iônica ou interações do tipo π- π.
Segundo a teoria apresentada por Moldoveanu e David (2013), a seletividade em análises cromatográficas pode ser modulada pelo pH de uma fase móvel, cujo ambiente colabore com que uma molécula se apresente na forma ionizada
Figura 6: Interação entre a fase estacionária InertSep CH e o fenol.
ou neutra e, consequentemente torná-la mais ou menos susceptível à interação com a fase estacionária trabalhada. Este raciocínio também é expandido para a técnica de SPE, como apresenta a figura 6.
As fases poliméricas são apresentadas como opção para fase reversa. Algumas das características deste tipo de material referem-se à resistência química, atingindo faixas de pH de trabalho de 1 a 14, bem como a seletividade alternativa. A InertSep HLB é desenvolvida com base em uma tecnologia já existente em outros modelos comercialmente
disponíveis à base de copolímeros que trazem um comportamento “balanceado” entre interações tanto hidrofílicas quanto lipofílicas, com alta capacidade de retenção de analitos de interesse, fazendo jus ao acrônimo (do inglês Hydrophilic- Lipophilic Balance).
A segunda seletividade a ser discutida é a fase normal. Os dois materiais que se destacam neste segmento são à base de sílica ou florisil, um material sintético à base de silicato de magnésio.
Trata-se de um método excelente para a retenção de compostos fortemente polares.
Escolha de
empacotamentos
A retenção de um composto pode ser realizada através de interações iônicas. A GL Sciences possui uma vasta quantidade de empacotamentos na linha InertSep capazes de trabalhar exclusivamente através de mecanismos de troca iônica, (representada pela figura 7), ou através do modo misto como é o caso da coluna InertSep MPC, onde tem-se um empacotamento à base de copolímero de estireno e divinilbenzeno funcionalizado com grupos C18 (fase reversa) e grupos sulfônicos (troca catiônica forte).
Figura 7: Representação de mecanismos de atração eletrostática entre um sítio protonado e um grupo de troca catiônica forte (SCX).
De acordo com as literaturas desenvolvidas in-house pela equipe da GL Sciences, é possível prever o tipo de material de empacotamento mais adequado para um cartucho de extração em fase sólida tendo como um dos critérios a natureza do analito a ser retido. A tabela 1 sugere fases estacionárias com base na força e no tipo de espécie iônica a ser retida.
Classificações menos famosas de recheios de cartuchos incluem os chamados “cartuchos multicamadas” e os “cartuchos especiais”.
Cartuchos multicamadas são desenvolvidos para tratamentos de matrizes complexas contendo
substâncias como clorofila e pigmentos bem como ácidos graxos, sendo especialmente utilizados em técnicas de limpeza de matrizes contendo pesticidas residuais. Um exemplo da técnica de
“limpeza multicamadas” é encontrado na figura 8.
Os cartuchos especiais são desenvolvidos para aplicações extremamente específicas. Alguns dos exemplos que podem ser destacados são o cartucho InertSep ME-1 cujo grupo funcional é o ácido iminodiacético, ideal para a captura de cátions metálicos (preferencialmente aqueles que apresentam estado de oxidação maior que “+2”) e a série de cartuchos InertSep VRA especificamente desenvolvidos para a análise de aflatoxinas B1, B2, G1 e G2 em diversos alimentos como arroz, amendoim, cevada, entre outros.
Tabela 1: Recomendação de fases estacionárias para troca iônica com base na força e no tipo de espécie iônica a ser retida.
Figura 8: Aplicação do cartucho InertSep GC/NH2 para a remoção de ácidos graxos e alguns pigmentos
encontrados em alimentos.
Escolha de
empacotamentos
De um ponto de vista termodinâmico, todo material apresenta limites para adsorção de moléculas. Em colunas cromatográficas, este evento é notado quando o perfil cromatográfico de um analito de interesse sofre algum tipo de deformação devido ao aumento de quantidade de amostra injetada.
Um cartucho de SPE não apresenta resultado visual indesejado pelo simples fato de que não é comum que se conecte tal produto à um detector.
No entanto, é possível que a sobrecarga ainda traga consequências severas ao método, como baixa recuperação.
A taxa de recuperação é um parâmetro determinado pela razão entre a determinação
Figura 9: Identificação geral de tamanhos de cartuchos de SPE e quantidades de amostras para se trabalhar
Capacidade
da concentração de analitos de interesse em uma amostra antes e depois de um procedimento de extração. Segundo a lógica do ensaio, a diferença entre estes valores expressa a quantidade de analito que é perdida em uma das etapas do preparo de amostras e deve ser minimizada.
De maneira a evitar este tipo de situação, a GL Sciences tem como principal sugestão o emprego das seguintes referências: uso de amostras cuja massa seja igual a 5% da massa de empacotamento total e um volume de leito de 120 µL/100 mg de material de empacotamento. A figura 9 ilustra os dois parâmetros sugeridos para diferentes tamanhos de cartuchos com base em modelos de sílica funcionalizados com grupos C18.
O condicionamento também identificado como
“ativação” em algumas literaturas, é o ato de permitir o fluxo de um solvente adequado através do empacotamento a ser utilizado. Trata-se de um procedimento extremamente importante, responsável por “molhar” a superfície do empacotamento de modo a garantir eficiência máxima e, consequentemente valores de retenção e recuperação adequados em relação à referência do fabricante.
Tabela 2: sugestão de condicionamento de fases estacionárias
Condicionamento
Alguns cartuchos de natureza polimérica apresentam características diferentes, sem necessidade desta etapa inicial. Consulte a equipe de aplicações da Acore Consumíveis sobre boas práticas com produtos específicos para certificação da melhor maneira de utilizar seus cartuchos de SPE.
Algumas sugestões de condicionamento podem ser encontradas na tabela 2.
Tipo de fase sólida Solvente de condicionamento
Fase reversa (C18, C8, etc.) Sugestão 1 – preencha o volume disponível do cartucho com metanol Sugestão 2 – realize uma lavagem com água empregando o dobro da capacidade do cartucho
Sugestão 3 – realize uma lavagem com uma fase móvel com pH igual ao da amostra
Sugestão 4 – Se necessário, equilibre o cartucho com agentes quelantes ou pareadores iônicos
Fase normal (sílica, florisil, etc.) Preencha o cartucho com hexano ou outro solvente orgânico desta natureza
Troca iônica (SAX, SCX, etc.) Sugestão 1 - preencha o volume disponível do cartucho com metanol Sugestão 2 - preencha o volume disponível do cartucho com água Sugestão 3 - preencha o volume disponível do cartucho com uma solução tampão em pH entre 6 e 7
Operação
A completa retenção de um grupo de analitos de interesse depende de uma série de fatores como a natureza do analito, da amostra e tanto da fase móvel quanto da fase estacionária. Alguns desses
Tabela 3: Sugestão de métodos de introdução de amostras em cartuchos de SPE
Carregamento de amostra
parâmetros já foram discutidos no capítulo 3.2 (Seletividade). Na tabela 3, encontre sugestões de condições empregadas para a introdução de amostras em seu cartucho.
Tipo de fase sólida Solvente de Operação
Fase reversa (C18, C8, etc.) Sugestão 1 – para amostras biológicas como plasma sanguíneo ou soro, recomenda-se uma diluição 1:1 ou 1:2 com água ou tampão Sugestão 2 – evite o uso de altas concentrações de solventes orgânicos. Como regra geral, procure manter abaixo de 10% v/v Sugestão 3 – o uso de uma solução tampão é permitido desde que sua concentração seja menor que 0.1 mol/L
Sugestão 4 – sempre adeque o pH do diluente ao pH que irá propiciar melhor retenção de seu analito. Ex: o fenol apresenta maior retenção quando em pH entre 2 e 3
Fase normal (sílica, florisil, etc.) Utilize um solvente de baixa polaridade como o hexano
Troca iônica (SAX, SCX, etc.) Sugestão 1 – dilua a amostra em água ou tampão e adeque o pH entre 6 e 7
Sugestão 2 –o uso de uma solução tampão é permitido desde que sua concentração seja menor que 0.1 mol/L
Tabela 4: Sugestão de fases móveis de lavagem
Tipo de fase sólida Solvente de Operação
Fase reversa (C18, C8, etc.) Sugestão 1 – lavagem com água
Sugestão 2 – caso seja observado que houve eluição empregando água pura, é importante utilizar um tampão cujo pH seja similar ao da amostra
Sugestão 3 – pequenas quantidades de modificadores orgânicos podem ser bem-vindas. Geralmente emprega-se 5 – 40% de metanol ou 5 – 30% de acetonitrila
Fase normal (sílica, florisil, etc.) Sugestão 1 – lavagem com hexano ou outro solvente de natureza similar
Sugestão 2 – de maneira a aumentar a capacidade de limpeza de matriz, pode-se empregar solventes como isopropanol ou acetona, em devidas proporções
Troca iônica (SAX, SCX, etc.) Sugestão 1 – lavagem com água.
Sugestão 2 – lavagem subsequente com 40 – 100% de metanol móvel fraca o suficiente para não permitir a eluição
dos analitos de interesse e adequada para a retirada de interferentes presentes na amostra que podem levar à consequências indesejadas para a etapa analítica.
importante que, ao menos na etapa de desenvolvimento de métodos o produto da lavagem também seja coletado de modo a garantir que os componentes de interesse não eluam nesta etapa.
O solvente de eluição deve ser cuidadosamente escolhido de acordo com todos os fatores de seletividade e força de solvente já destacados em outros segmentos deste livro. Idealmente, uma mistura de solventes de eluição deve permitir
Tabela 5: Sugestão de composição de solventes de eluição
Eluição e coleta
a coleta de analito no menor volume possível, garantindo sensibilidade, reprodutibilidade e excelente recuperação. A tabela 5 apresenta sugestões de solventes de eluição.
Tipo de fase sólida Solvente de Operação
Fase reversa (C18, C8, etc.) Sugestão 1 – tipicamente emprega-se metanol ou acetonitrila (duas a cinco vezes o volume do empacotamento)
Sugestão 2 – caso o analito de interesse apresente forte retenção mesmo após a condição 1, utilize aditivos capazes de promover dissociação ou ionização (a depender na natureza da molécula) Sugestão 3 – aplique solventes como acetato de etila ou diclorometano (DCM)
Fase normal (sílica, florisil, etc.) Sugestão 1 – empregue solventes polares como metanol ou acetona Sugestão 2 – misturas entre solventes de menor polaridade como hexano ou DCM, e maior polaridade como os apresentados pela sugestão 1 podem ser uma boa opção
Troca iônica (SAX, SCX, etc.) Sugestão 1 – A natureza da retenção está no controle das espécies iônicas presentes no sistema. Uma vez que a fase estacionária ou o analito de interesse se encontram neutralizados, observa-se enfraquecimento de interações intermoleculares levando à eluição do mesmo.
1-Use metanol acidificado, por volta de 1 mM (ácido clorídrico, fórmico, acético ou outros ácidos que podem ser avaliados) OU
2-Metanol com 2 – 4% NH3 em água OU
3-Acetonitrila:trietilamina:água (80:0,1:20)
Sugestão 2 – aumento de concentração de sal para eluição do analito de interesse com sais que não interfiram nos ensaios
1-0,2 M ou maior de soluções de cloreto de sódio ou de potássio 2-0,2 M ou maior de soluções de fosfato de potássio monobásico
Figura 10: Procedimento de operação padrão para análise de omeprazol em soro humano.
encontrar a nota técnica de referência “ST021”. Trata- se da análise de omeprazol em soro humano através da InertSep Pharma, um empacotamento à base de um copolímero incluindo monômeros de metacrilato
A etapa de condicionamento é realizada com 1 mL de metanol e 1 mL de água como é sugerido pela tabela 2. A etapa de introdução de amostra conta com uma mistura de soro e tampão, (uma recomendação que pode ser encontrada como sugestão 1 da tabela 3). A lavagem é desenvolvida através do emprego de fases
divinilbenzeno, desenvolvido para atender requisições similares aos empacotamentos de tipo HLB.
O método completo pode ser avaliado na figura 10:
móveis “fracas”, sendo 1 mL de água pura e um 1 mL de uma solução água: metanol (90:10) encontrados nas sugestões 1 e 3 da tabela 4. A principal sugestão de solvente de eluição (sugestão 1 na tabela 5) já é o suficiente para fazer com que o analito de interesse seja devidamente coletado e analisado.
A GL Sciences apresenta quatro tipos principais de empacotamentos à base de sílica funcionalizada com grupos C18. Com diferentes características, este grupo de produtos pode recobrir todo o espectro de aplicações que é atendido por diferentes tipos de materiais de mesma química comercialmente disponíveis.
A denominação de cartuchos InertSep do tipo
“C18” é acompanhada por letras que classificam
O material InertSep C18-B apresenta um material cujo endcapping é “intermediário”, fortemente indicado para inícios de desenvolvimentos. Por fim, o cartucho InertSep C18 ENVI é um produto
Figura 11: Representação de uma estrutura de sílica funcionalizada com grupos C18. O círculo tracejado em vermelho indica o grupo denominado como “silanol residual”.
Opções de cartuchos de tipo C18
a qualidade de endcapping do empacotamento, ou seja, a qualidade de recobrimento de grupos silanóis residuais apresentados na figura 11. A indicação “C18” (sem letras) indica um recobrimento excelente de uma interação majoritariamente hidrofóbica. Já a indicação
“C18-C” faz referência à um alto teor de silanóis residuais, indicando a possibilidade de retenção através de mecanismos de interação secundários, como troca iônica.
que faz parte da linha “especial”, especificamente recomendado para análises ambientais como de efluentes ou amostras contendo surfactantes.
Figura 12: Procedimento para SLE cartuchos originalmente desenvolvidos para SPE.
Neste caso, um empacotamento à base de terra diatomácea é empregado como suporte. Uma amostra diluída em água é adicionada a este empacotamento e deixada em espera por um
O procedimento de SLE é muito similar ao procedimento de extração líquido-líquido, no entanto apresenta benefícios como menor consumo de solventes, fácil automação, redução de trabalho e alta eficiência (Majors, 2012).
A técnica de SLE também se destaca devido à ausência de um passo de “agitação”, o que evita a formação de emulsões. Sendo assim, pode-se ganhar em produtividade devido à eliminação de etapas como a centrifugação, bem como em qualidade aumentando a recuperação de produto.
dispersão no material poroso. Um solvente orgânico é aplicado em seguida de modo a extrair analitos localizados na camada aquosa recém-formada. A figura 12 exemplifica o procedimento de maneira mais detalhada.
Esta é uma sugestão particularmente verdadeira para amostras biológicas como plasma ou soro do sangue. Trata-se de uma amostra extremamente complexa, ativa e sensível. O primeiro exemplo a ser abordado envolve o fosfato de piridoxal (PLP), um metabólito da vitamina B6 (usualmente conhecido como piridoxina nos suplementos).
Segundo a base de dados Drugbank, o PLP é um cofator que se encontra ligado através de ligações covalentes em proteínas (configurando uma base de Schiff). Sendo assim, um tratamento de amostras é necessário para que haja a “liberação”
É muito comum que durante o desenvolvimento de métodos encontre-se dificuldades relacionadas à retenção de analitos de interesse. Alguns dos motivos mais listados bem como soluções para estas situações são encontrados abaixo:
• Baixa capacidade de empacotamento; trata-se de um caso clássico de sobrecarga de material. A opção mais lógica é considerar a redução de amostra ou emprego de um cartucho maior (Capacidade, página 12);
• pH inadequado; um pH inadequado pode ser extremamente prejudicial à um analito que pode se encontrar dissociado (ou ionizado, dependendo da natureza da molécula) e apresentar interação mais fraca com a fase estacionária (Seletividade, página 8);
• Tempo de eluição demasiadamente curto; assim como em colunas analíticas, fluxos elevados muitas vezes não permitem boa retenção de um analito e levam à resultados inapropriados;
• Incompatibilidade entre cartucho e solventes; a escolha de técnicas e solventes de trabalhos devem ser realizadas com cuidado de maneira a evitar o emprego de solventes muito fortes em cartuchos inadequados. Por exemplo, não é recomendado diluir uma amostra em isopropanol para carregamento em um cartucho de química C8 equilibrado em metanol dadas as forças dos solventes de trabalho. O mesmo raciocínio pode ser aplicado à fases móveis de lavagem que apresentem interação intermolecular muito forte com o analito.
Pré preparo de amostras
Eluição durante etapas de carregamento ou lavagem
do analito e subsequentemente retenção em cartucho.
Outro exemplo que pode ser abordado com o mesmo analito é o consumo através de reações enzimáticas. Segundo a base de dados BRENDA, a fosfatase de código EC 3.1.3.74 é capaz de consumir o analito que deve ser quantificado. Através de uma coleta adequada trabalha-se com o plasma com um aditivo quelante, responsável por sequestrar cofatores como o magnésio, inibindo o catalisador enzimático e garantindo análises mais precisas.
Figura 13: Comparativo de polaridades e aplicações em diferentes mecanismos.
nota: as setas apontam o solvente “mais fraco” para cada tipo de técnica
Ausência do sinal do analito de interesse na mistura final
• Eluição precoce: avalie se não houve eluição do analito nas fases anteriores (Eluição durante etapas de carregamento ou lavagem, página 20);
• Interação intermolecular intensa: avalie se o seu analito realmente deveria ser trabalhado com a condição prevista. Se houver uma afinidade muito alta entre analito e fase estacionária pode ser que não haja eluição (Seletividade, página 8);
• Volume de eluição insuficiente: pode ser que seja necessária uma quantidade maior de solvente de eluição como define a sugestão 1 da tabela 5 (Eluição e coleta, página 16).
Os cartuchos de extração em fase sólida são uma ferramenta importante em um laboratório de química analítica moderno e traz grandes diferenças com relação a sensibilidade de uma análise ou produtividade.
DRUGBANK. Pyridoxal Phosphate. Criada em Jun 2005, atualizada em jun 2020. Disponível em: https://
www.drugbank.ca/drugs/DB00114;
ETTRE, L. M.S. Tswett and the Invention of Chromatography. LCGC NORTH AMERICA. n. 5, v. 21, mai 2003.
KIRKLAND, J. et al. Introduction to Modern Liquid Chromatography. 3 ed. Nova Jersey: John Wiley &
Sons, Inc. 2010;
Material de consulta interno da GL Sciences;
MAJORS, R. Supported Liquid Extraction (SLE): The Best Kept Secret in Sample Preparation. LCGC North America. n. 8, v. 30, p. 626–633, ago 2012;
MOLDOVEANU, S; DAVID, V. Essentials in Modern HPLC Separations. 1 ed. Elsevier. 2013.
