Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro

Infecção por Leishmania em Portugal

Estudo retrospectivo de resultados laboratoriais de cães ao longo de 10 anos (2009-2019)

Dissertação de Mestrado em Biologia Clínica Laboratorial

Candidata: Ana Carolina Pontes de Miranda Maranhão Orientador: Prof. Doutor Luís Cardoso

Co-orientadora: Dra. Paula Brilhante Simões

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Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro

Infecção por Leishmania em Portugal

Estudo retrospectivo de resultados laboratoriais de cães ao longo de 10 anos (2009-2019)

Dissertação de Mestrado em Biologia Clínica Laboratorial

Candidata: Ana Carolina Pontes de Miranda Maranhão Orientador: Prof. Doutor Luís Cardoso

Co-orientadora: Dra. Paula Brilhante Simões

Composição do Júri:

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À toda a comunidade acadêmica da área de medicina veterinária, que esse trabalho seja de grande serventia no diagnóstico de seus pacientes.

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Agradecimentos

Gostaria de agradecer a todos que me auxiliaram na realização desta dissertação de mestrado, cuja contribuição foi essencial, dentro e fora do espaço acadêmico:

À minha Família, que embarcou comigo no avião em 2018 quando eu nem sabia que ao invés de 2 meses estaria vindo de mudança por mais de 2 anos. Obrigada por todo apoio e incentivo desde sempre, e por me mostrarem que o maior investimento que podemos fazer em nossa vida é na educação.

Ao Prof. Luís Cardoso, que muito mais do que orientador foi um foi um grande entusiasta deste trabalho. Admiro demais o seu trabalho e tenho certeza de que o mundo acadêmico não seria o mesmo sem toda a sua contribuição. Obrigada por cada artigo compartilhado e cada correção feita, ao fim deste trabalho tenho certeza de que o professor já é 50% brasileiro!

À minha co-orientadora dra. Paula Brilhante, pela oportunidade incrível de poder fazer parte da sua ―equipa‖ como se eu sempre tivesse estado ali.

Ao querido amigo e colega de profissão Ricardo Lopes, que esteve conosco desde que o tema desta dissertação foi pensado. Devo-te muito mais que uma viagem ao Brasil com caldinho de feijão.

A todos os amigos e colegas do laboratório INNO, por tão bem me acolherem desde 2018, quando eu caí de paraquedas em um estágio que não era o que eu tinha vindo fazer aqui. Guardo com carinho cada ensinamento e cada abraço que pude compartilhar com vocês, para mim vocês são muito mais do que referência em medicina veterinária neste país.

Aos meus amigos do mestrado de Biologia Clínica Laboratorial, por todas as experiências incríveis que vivemos em nosso primeiro ano em Vila Real e por me mostrarem que nós brasileiros ainda temos muito a aprender com os nossos colonizadores.

Aos meus amigos brasileiros de Portugal, que são a verdadeira prova de que podemos sim escolher parte da nossa família. Obrigada por serem um pedacinho de diversas terras do nosso país, e por terem sido um afago na hora que a saudade de casa apertava.

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Aos meus amigos brasileiros que ficaram no Brasil, mas que se fizeram presentes a todo tempo, seja enviando uma mensagem de incentivo ou até fazendo pressão para que eu acabasse logo essa etapa da minha vida para que pudesse voltar para perto deles. Finalmente estou voltando (será?).

E por fim, mas não menos importante, gostaria de agradecer ao meu namorado, Lucas, por todo o incentivo e paciência toda vez que eu digo que ―vou ali fazer um estágio‖. Obrigada por sempre me esperar, você é a minha única certeza.

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Resumo

A leishmaniose canina (LCan) é uma zoonose presente em muitos países. Em Portugal a doença é endêmica e aparece cada vez mais em destaque. Pensando em contribuir para o diagnóstico, foi realizada a análise de 1.307 cães de Portugal Continental com suspeita clínica de LCan. As amostras foram enviadas para o Laboratório INNO nos anos 2009-2019 e a análise estatística foi realizada como forma de tentar traçar um perfil da doença, através de testes de correlação e de comparação de porcentagens e medianas. Os objetivos deste trabalho foram estudar as análises laboratoriais que passaram pelo teste de ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) no laboratório, como forma de mapear a doença e entender como ela se comporta nas diversas regiões de Portugal Continental, traçar o perfil dos animais acometidos e entender fatores predisponentes que podem levar esses animais a serem acometidos, gerando um diagnóstico mais preciso. A mediana das idades dos animais estudados foi de 7 anos, e dos animais acometidos de 5, sendo esta idade aquela com maior porcentagem de animais positivos. Não foi encontrada predisposição ao desenvolvimento de manifestações clínicas em relação ao sexo do animal, apesar de os machos terem sido mais testados que as fêmeas. Regiões como o Centro tiveram um aumento no número de animais acometidos, que acompanha o aumento do número de animais testados, o que pode indicar o surgimento de uma futura zona endêmica dentro do país. Também é de se destacar a região do Alentejo, que mantém altos níveis de porcentagem de animais acometidos (36,1% e 66,2%) ao longo dos anos e pode estar ligada ao fato de apresentar um clima que favorece a atividade dos vetores. De acordo com a literatura pesquisada, a região Norte apresentou destaque no avanço da doença e isso também foi um achado nosso. Parâmetros quantitativos, como a contagem total dos glóbulos brancos (98,3%), linfócitos (79,1%), eosinófilos (78,1%), creatinina (70%), alanina aminotransferase (82%), uréia (73%) e albumina (82%) encontravam-se em sua maioria dentro dos parâmetros fisiológicos para a doença, e o rácio albumina/globulinas (RAlbGlo) estava bem dividido entre dentro (49,1%) e abaixo (48,5%) dos parâmetros fisiológicos. As proteínas totais estavam divididas entre dentro (50,4%) e acima (45,1%) dos padrões fisiológicos, o que pode ter ligação com o aumento de beta e gama globulinas observado, uma vez que estes apresentam correlação estatisticamente significativa (p < 0,05). O hematócrito apresentou correlação estatisticamente significativa com os resultados do teste de ELISA, beta, gama e albumina e consequentemente com o RAlbGlo. Uma parcela de 34,9% dos animais apresentavam trombocitopenia, e 25,3% apresentava anemia, o que corrobora com os achados de outros autores que não relatam anemia como um forte

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indicativo da doença. Em conclusão, é importante que o diagnóstico da LCan seja feito através da junção de um conjunto de fatores, como as manifestações clínicas, um perfil hematológico e bioquímico, proteinograma e a confirmação através de uma análise específica para a detecção do agente, para que sejam excluídos os diversos diagnósticos diferenciais que poderiam influenciar no diagnóstico dessa zoonose.

Palavras-chave: cão, epidemiologia, fatores predisponentes, hematologia, leishmaniose, sorologia.

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Abstract

Canine leishmaniosis (CanL) is a zoonotic disease in many countries. In Portugal, the disease is endemic and has become a spotlight in the past years. Thinking of contributing for an accurate diagnostic, an analysis of 1,307 dogs from mainland Portugal with clinical suspicion of CanL was carried out. The samples had been sent to INNO Laboratory during the years 2009-2019, and statistic analysis was performed as a way to try to profile the disease, through correlation tests and comparison of percentages and medians. The aim of this dissertation was to analyze all of the results that were produced by the lab based on a request of the ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) test, as a way to map the disease and understand some of its patterns in the different regions of mainland Portugal, to profile the positive animals and to understand predisposing factors that can lead animals to be affected, in order to get a more accurate diagnostic. The median age of the animals studied was 7 years old, and that of the affected animals was 5 years old, this age being the one with the highest percentage of positive animals. There was no predisposition to the development of clinical manifestations in relation to the sex of the animal, although males were more frequently tested than females. Regions such as the Centre experienced an increase in the number of animals affected, which accompanies the increase in the number of animals tested and may indicate the emergence of future endemic zone within the country. It is also noteworthy that the Alentejo region, which has had high percentage levels of affected animals (36.1% and 66.2%) over the years, may be linked to the fact that it has a climate that favours activity of the vectors. According to the literature, the North region showed prominence in the advance of the disease and this was also a finding of ours. Quantitative parameters, such as total white blood count (98.3%), lymphocytes (79.1%), eosinophils (78.1%), creatinine (70%), alanine aminotransferase (82%), urea (73%) and albumin (82%) were mostly within the physiological parameters for the disease, and the albumin/globulin ratio (RAlbGlo) was well divided between within (49.1%) and below (48.5%) of physiological ranges. The total proteins were divided between within (50.4%) and above (45.1%) of the physiological patterns, which may be linked to the increase in beta and gama globulins observed, since they present a significant statistical correlation (p < 0,05). The hematocrit showed a statistically significant correlation with the results of the ELISA, beta, gama and albumin parameters and, consequently, with the RAlbGlo. Part of the dogs (34.9%) had thrombocytopenia and 25.3% presented anemia, which corroborates the findings of other authors who have not reported anemia as indicative strong indicator of CanL. In conclusion, it is important that the diagnosis of LCan is made through the combination of a set of factors, such as as clinical manifestations, hematological and

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biochemical profiles, proteinogram and the confirmation of a specific analysis for the detection of the agent, so that other differential diagnoses can be excluded and do not influence the diagnosis of this zoonosis.

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Índice Geral

Agradecimentos ... iv

Resumo ... vi

Abstract ...viii

Índice de Figuras ...xiii

Índice de Tabelas ... xiv

Índice de Gráficos ... xv

Índice de Anexos ... xvi

Lista de Abreviaturas, Acrônimos, Siglas e Símbolos ... xvii

1. INTRODUÇÃO ... 1 1.1. LEISHMANIOSE ... 1 1.2. LEISHMANIOSE ZOONÓTICA ... 2 1.3. A LCan EM PORTUGAL ... 3 1.4. TRANSMISSÃO ... 4 1.5. EPIDEMIOLOGIA ... 5 1.6. SINAIS CLÍNICOS ... 6 1.7. DIAGNÓSTICO ... 7 1.7.1. DIAGNÓSTICO LABORATORIAL ... 9 1.7.1.1. Sorologia ... 9 1.7.1.2. IFI ... 9 1.7.1.3. ELISA ... 10 1.7.1.4. Testes imunocromatográficos ... 10 1.7.1.5. Cultura ... 11 1.7.1.6. Citologia ... 11 1.7.1.7. PCR ... 12 1.7.1.8. Xenodiagnóstico ... 13

xi

1.8. TRATAMENTO ... 14 1.9. PROFILAXIA ... 15 1.10. CONTROLE ... 16 2. OBJETIVOS ... 19 3. MATERIAL E MÉTODOS ... 21

3.1. COLETA E CHEGADA AO LABORATÓRIO ... 21

3.2. AMOSTRA E DADOS ... 22

3.3. PROCESSAMENTO DE ANÁLISES ... 23

3.4. PROCESSAMENTO DOS DADOS ... 24

3.4.1. Variáveis qualitativas ... 25

3.4.1.1. Análise de 21.795 resultados de animais testados para LCan pelo teste sorológico de ELISA entre os anos 2012-2019 ... 25

3.4.1.2. Regiões de proveniência das amostras (n = 1.307) ... 26

3.4.1.3. Sazonalidade ... 27 3.4.1.4. Sexo ... 27 3.4.1.5. Idade ... 27 3.4.2. Variáveis quantitativas ... 28 3.5. ANÁLISE ESTATÍSTICA ... 28 4. RESULTADOS ... 31 4.1. VARIÁVEIS QUALITATIVAS ... 31

4.1.1. Análise de 21.795 resultados de animais testados para LCan pelo teste sorológico de ELISA entre os anos 2012-2019 ... 31

4.1.2. Região de proveniência da amostra ... 36

4.1.3. Sazonalidade ... 37 4.1.4. Sexo ... 42 4.1.5. Idade ... 42 4.2. VARIÁVEIS QUANTITATIVAS ... 48 5. DISCUSSÃO ... 51 5.1. ANÁLISES QUALITATIVAS ... 52

xii

5.1.1. Análise de 21.795 resultados de animais testados para LCan pelo teste

sorológico de ELISA entre os anos 2012-2019 ... 52

5.1.2. Região ... 54 5.1.3. Sazonalidade ... 55 5.1.4. Sexo ... 56 5.1.5. Idade ... 57 5.2. ANÁLISES QUANTITATIVAS ... 58 6. CONCLUSÕES ... 63 7. REFERÊNCIAS ... 65 ANEXOS ... 75

xiii

Índice de Figuras

Figura 1. Ana Carolina Maranhão representando o laboratório INNO no XV Congresso Internacional Veterinário Montenegro em 2019 ...21

Figura 2. Laboratório INNO, Braga, Portugal. ...22

Figura 3. Placa de teste sorológico de ELISA realizado no laboratório INNO. ...24

Figura 4. Pôster ―Leishmaniose canina em Portugal‖ apresentado no XVI Congresso Internacional Veterinário Montenegro. ...25

Figura 5. Mapa de Portugal Continental com a indicação dos locais de proveniência das amostras dos 1.307 animais deste estudo. ...26

Figura 6. Mapas da distribuição porcentual dos animais positivos nas 5 regiões de Portugal Continental nos anos de 2013, 2015 e 2019 (n = 21.795) ...34

Figura 7. Mapas da distribuição porcentual dos animais positivos nas 5 regiões de Portugal Continental nos anos de 2013, 2015 e 2019 (n = 1.307) ...40

xiv

Índice de Tabelas

Tabela 1. Números absolutos de animais estudados (entre parêntesis) e diagnosticados como positivos em Portugal Continental de 2012-2019 (n = 21.795) ...32

Tabela 2. Porcentagem de animais diagnosticados como positivos em Portugal Continental de 2012-2019 (n = 21.795) ...33

Tabela 3. Números absolutos de animais estudados (entre parêntesis) e diagnosticados como positivos em Portugal Continental de 2009-2019 ...36

Tabela 4. Resultados positivos para Leishmania no teste de ELISA de cães das regiões de Portugal Continental. ...38

Tabela 5. Disposição da porcentagem de animais testados como positivos para Leishmania no teste de ELISA e sua evolução anual desde 2013 a 2019. ...39

Tabela 6. Disposição do número absoluto de animais testados no teste de ELISA. ...42

Tabela 7. Análise dos cães negativos e positivos para Leishmania no teste de ELISA entre <1 ano e ≥1 ano de idade. ...42

Tabela 8. Análise dos cães negativos e positivos para Leishmania no teste de ELISA nos 3 Grupos etários trabalhados neste estudo. ...43

Tabela 9. Valores de r na correlação da Spearman. ...46

Tabela 10. Distribuição de casos de acordo com os diferentes parâmetros quantitativos considerados no diagnóstico: valores mínimos e máximos. Valores abaixo, acima e dentro dos parâmetros fisiológicos. ...48

Tabela 11. Distribuição das medianas dos diferentes parâmetros quantitativos considerados no diagnóstico dos animais soropositivos e soronegativos e valores de p. ...49

xv

Índice de Gráficos

Gráfico 1. Representação gráfica da evolução porcentual do número de positivos ao longo de 8 anos (2012-2019) (n = 21.795) ...35

Gráfico 2. Representação gráfica da evolução porcentual do número de positivos ao longo 7 dos anos estudados neste trabalho. ...41

Gráfico 3. Representação do número de animais positivos para Leishmania no teste de ELISA de acordo com o sexo e idade ...44

Gráfico 4. Representação da porcentagem de animais positivos para Leishmania no teste de ELISA de acordo com o sexo e idade (<1 - >14 ) ...45

Índice de Anexos

Anexo A. Pôster ―Leishmaniose canina em Portugal: Mapeamento de animais soropositivos por região (2012-2019)‖ do XVI Congresso Internacional Veterinário Montenegro. ...75

Anexo B. Ficha de requisição do INNO ...76

Anexo C. Teste U de Mann-Whitney ...78

Anexo D. Valores de p na correlação da Spearman. ...80

xvii

Lista de Abreviaturas, Acrônimos, Siglas e Símbolos

AIQ - amplitude interquartil

ALAT - alanina aminotransferase

ALB - albumina

AM Lisboa - Área Metropolitana de Lisboa

ANOVA - análise de variância

CAMV - centro de atendimento médico-veterinário

CREA - creatinina

DNA - ácido desoxirribonucleico (do inglês ―deoxyribonucleic acid‖)

EDTA - ácido etilenodiamino tetra-acético (do inglês ―ethylenediamine tetraacetic acid‖)

ELISA - ensaio imunoenzimático (do inglês ―enzyme-linked immunosorbent assay‖)

Ht - hematócrito

ICT - testes imunocromatográficos (do inglês ―immunochromatographic test‖)

IFI - imunofluorescência indireta

IgG - imunoglobulina G

LC - leishmaniose cutânea

LCan - leishmaniose canina

LEISH - Leishmania

LIN - linfócitos

LMC - leishmaniose mucocutânea

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NUTS - Nomenclatura de Unidade Territorial para fins Estatísticos

OIE - Organização Mundial para a Saúde Animal (do inglês ―World Organization for Animal Health‖)

PCR - reação em cadeia da polimerase (do inglês ―Polymerase chain reaction‖)

PLT- plaquetas

PT - proteínas totais

RAlbGlo - rácio albumina/globulinas

Rz - razão

SFM - sistema fagocítico mononuclear

spp. - espécies

UREA – ureia

UTAD - Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro

WBC - glóbulos brancos (do inglês ―white blood cells‖)

% - porcentagem

α- alfa

β - beta

1

1. INTRODUÇÃO

1.1. LEISHMANIOSE

A leishmaniose canina (LCan) é um grande problema de Saúde Pública mundial. A precocidade em seu diagnóstico e o tratamento fazem toda a diferença quando se trata de prevenção e transmissão entre animais e seres humanos[1].

A doença é causada por um protozoário dimórfico que se caracteriza por possuir dois estados morfológicos principais, a forma amastigota, que se encontra presente no sistema fagocítico mononuclear (SFM) do mamífero, e a forma promastigota, que se encontra presente no trato intestinal médio do inseto vetor [2]. Apesar de os cães serem parasitados por pelo menos 12 espécies de Leishmania, o mais importante agente etiológico causador da Lcan é Leishmania infantum (também Leishmania chagasi) [3].

Na Europa, a LCan é conhecida por ser endêmica em muitos países, como a Albânia, Chipre, Croácia, Espanha, França, Grécia, Itália, Malta, Portugal e Turquia [4]. Fora esses, a doença também é endêmica em mais de 70 países [5], incluindo alguns outros da bacia Mediterrânea, América Central e do Sul, África e sul da Ásia [3, 6]. A prevalência da infeção é mais elevada nas zonas intertropicais da América e África e regiões temperadas da América Latina, Europa e Ásia [7].

Artrópodes do gênero Phlebotomus, no Velho Mundo, e do gênero Lutzomyia, no Novo Mundo, são considerados os principais vetores da LCan [8], a distribuição da doença é geralmente associada à presença do vetor de transmissão [4].

A leishmaniose nos seres humanos compreende três formas clínicas principais de doença, a leishmaniose visceral (LV), a leishmaniose mucocutânea (LMC) e a leishmaniose cutânea (LC), sendo que a LV é a forma com sintomatologia mais severa, sendo fatal em caso de não tratamento [9].

Existem evidências de que a leishmaniose se propagou na América do Sul advinda de cães infectados da Europa na época dos descobrimentos Portugueses e Espanhóis [10– 13].

2

1.2. LEISHMANIOSE ZOONÓTICA

A leishmaniose é uma doença zoonótica e seus hospedeiros vertebrados envolvem uma gama de espécies de mamíferos domésticos, peridomésticos e selvagens. A espécie humana é um hospedeiro acidental da leishmaniose zoonótica, porém atua como hospedeiro primário para a leishmaniose antroponótica [14]. O cão é considerado o principal hospedeiro e reservatório de LV humana causada por L. infantum [14].

A transmissão da LV varia de acordo com os hábitos do vetor local. No Novo Mundo ocorre durante todo o ano, sendo encontrados diversos casos de leishmaniose humana em algumas áreas, com os acometidos usualmente pertencentes a grupos de precárias condições socioeconômicas e que provavelmente não têm condições de arcar com o tratamento médico adequado. Em contra partida, no Velho Mundo a transmissão é sazonal e o número de casos de humanos infectados é relativamente baixo, e acessível, uma alta qualidade de testes diagnósticos e tratamentos são providos pelo Estado [5].

Uma pesquisa feita em Teresina, nordeste do Brasil, revelou que um aumento na prevalência de infecção por L. infantum em cães teve como consequência um aumento nos casos da doença em humanos, e que condições socioeconômicas precárias juntamente com um aumento da vegetação, também foram associadas ao aumento da incidência da LV no local [15, 16]. O mesmo foi relatado em outras partes da América do Sul, em que algumas áreas da Venezuela e Brasil a alta prevalência de infecção canina está associada a um alto risco de doença humana [15].

Segundo a OIE (Organização Mundial para a Saúde Animal) [9], em 2010 a leishmaniose humana era endémica em 98 países, com mais de 350 milhões de pessoas em risco e com cerca de 2 milhões de novos casos por ano (1,5 milhões de casos de LC).

A interação e a coordenação de diferentes organizações com perspectivas científicas e profissionais, são essenciais no combate de doenças zoonóticas como a LV. Isso apenas pode ser alcançado através de um diálogo entre as partes interessadas, e a aplicação de dados baseados em evidências. O consenso entre médicos veterinários, oficiais de saúde pública e agências de financiamento, juntamente com a ajuda do público em geral, pode ser a melhor hipótese no longo caminho para remover a ameaça representada pela LV zoonótica [12].

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1.3. A LCan EM PORTUGAL

Estudos de soroprevalência realizados em 2010 demonstraram que em países como Espanha, França, Itália e Portugal existiam, cerca de 2,5 milhões de cães infectados [17]. Por outro lado, estimou-se que eram diagnosticados de 15 a 20 casos de LV em seres humanos em Portugal [14], em quase todo o território continental [17].

Com o aumento dos casos de LCan, a zoonose foi incluída no grupo das infecções de notificação obrigatória desde 2002 nas campanhas de vacinação anti-rábica. Após isso, foi mais fácil de identificar focos da doença, em que se observou estar mais presente nas zonas urbanas do que em áreas rurais. Apesar de a LV humana ser de notificação obrigatória, o mesmo não se aplica para a LC [14].

Mesmo com a notificação obrigatória e o aumento da disseminação de informações acerca da doença, um estudo de Neves et al. [17] constatou, por meio da entrega de questionários (1.477 respondidos), que quase 50% dos tutores de cães que foram até centros de atendimento médico-veterinário (CAMV) em 123 concelhos de Portugal, nunca tinham ouvido falar da LCan.

Em 2003 comprovou-se a responsabilidade de Phlebotomus ariasi e Phlebotomus perniciosus como vetores de L. infantum em Portugal [18]. A atividade desses vetores adultos ocorre geralmente de maio a novembro, porém dependendo das regiões e condições climáticas pode se iniciar mais cedo [19].

Devido ao amplo número de cães infectados subclinicamente e da ausência de manifestações clínicas patognomônicas, o diagnóstico da LCan depende de testes laboratoriais. Todas as técnicas parasitológicas, imunológicas e moleculares disponíveis para o diagnóstico são importantes e precisam ser interpretadas de acordo com suas vantagens e limitações [20].

A prevenção é a melhor forma de combater a doença, agindo como forma de parar a disseminação da infecção para outros animais e seres humanos [21].

Em 2005 foi criado o Leishvet, uma comissão técnica e científica que tem o intuito de gerar mais pesquisas e chamar atenção para a LCan, como forma de combater a doença e frear o seu avanço através de um bom diagnóstico e tratamento adequado. O grupo conta com médicos veterinários ligados a instituições acadêmicas da Europa, que organizam

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congressos de temas relacionados à doença e geram conteúdo frequente destinados à área acadêmica [5, 24–27]. O Leishvet conta com um representante português.

1.4. TRANSMISSÃO

Originalmente associada a áreas florestais, o ciclo de transmissão da leishmaniose agora está adaptado ao ambiente doméstico graças ao desmatamento de florestas e à urbanização [22]. Alguns cães desenvolvem a doença clínica, enquanto outros permanecem subclinicamente infectados, porém estes podem ser fontes de infecção e quando em contato com o vetor podem transmitir a infecção para outros cães e humanos [23, 24].

A existência de focos zoonóticos ou antroponóticos dependerá substancialmente da presença vetorial capaz de propagar os agentes infeciosos, da sua distribuição, densidade populacional, capacidade de dispersão e do tropismo da espécie para se alimentar de animais ou de seres humanos [25].

Ambos os sexos dos insetos vetores são fitófagos alimentando-se de sucos vegetais, contudo as fêmeas necessitam de uma refeição sanguínea para que ocorra o desenvolvimento gonotrófico [28]. Durante o dia os insetos fêmeas repousam em locais escuros e abrigados, apresentando um comportamento ativo ao crepúsculo e à noite, dependendo da espécie e da altura do ano [28]. Na zona mediterrânea, os insetos encontram-se ativos principalmente nos meses quentes, desde a Primavera até ao Outono [25].

A transmissão de Leishmania spp. não ocorre unicamente através de vetores flebotomíneos. Apesar de esta representar a via de transmissão mais comum, tem-se considerado cada vez mais outros modos de transmissão [6, 8, 26]. A hipótese de haver transmissão por outros artrópodes hematófagos também já foi levantada, e isso favoreceria a co-infecção por outros parasitas [27]

Há ainda a possibilidade de ocorrer uma transmissão doméstica/peridoméstica pelo cão, juntamente com uma transmissão silvática através da raposa vermelha (Vulpes vulpes), que ocorre através de um vetor comum que transmite o parasita[14].

Transfusão sanguínea é outra possível via de transmissão, e por isso doadores caninos que vivem em zonas endêmicas dos países deveriam ser rotineiramente testados para a LCan [28, 29]. A transmissão direta de cão-para-cão também é uma suspeita, especialmente em áreas em que o vetor não está presente [30, 31]. Casos de transmissão

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intrauterina de cadelas infectadas para as suas crias e transmissão venérea de machos infectados para fêmeas já foram igualmente descritos [8].

Contudo, é de salientar que em áreas endêmicas as vias de transmissão do parasita, de real importância epidemiológica, recairão fundamentalmente na dependente do vetor flebotomíneo [28].

1.5. EPIDEMIOLOGIA

A incidência da doença pode ser influenciada diretamente por alterações climáticas atuais, destacando-se o aumento da temperatura e os invernos cada vez menos rigorosos, que favorecem o ciclo de vida do vetor e consequentemente aumentam a transmissão do parasita seja ao homem ou a outros animais [14].

A leishmaniose deve ser levada em consideração mesmo em países não endêmicos, visto que nos últimos anos os relatos de animais positivos nessas áreas tem se tornado cada vez mais comum, gerando um grave problema de saúde pública. Países que estão fora das zonas endêmicas como a América do Norte e a região norte da Europa vêm sendo considerados uma preocupação, pois o número de relatos de animais infectados vem crescendo cada vez mais graças à grande distribuição do vetor e especialmente devido ao aumento do trânsito de animais infectados para regiões não endêmicas, bem como o inverso [6, 35–38].

Um estudo feito nos Países Baixos relatou que provavelmente 58.000 cães eram levados anualmente para o sul da Europa com seus donos, a passeio, e o risco de adquirir leishmaniose era de 0,027%-0,23% [35].

Antigamente, era aplicada a eutanásia de todos os animais advindos de áreas endêmicas da China; também em outros países como o Brasil é comum encontrar a prática da eutanásia de animais infectados, como tentativa de controle da doença nessas regiões [36]. Em contraste com a política de abate, alguns países tratam o problema da leishmaniose de forma diferente. Por exemplo, na Itália, cães errantes que habitam canis públicos são tratados para o combate da doença e a eutanásia desses animais não é permitida [37]. Entretanto, alguns países em que a doença não é endêmica (como a Alemanha e o Reino Unido) não exigem o teste da leishmaniose no momento do embarque, facilitando a entrada e importação de cães infectados pelo parasita [37, 38].

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A LCan é o exemplo clássico de uma doença em que os sinais clínicos e a patologia estão intrinsicamente relacionadas à interação entre o parasita (fator de virulência), o artrópode vetor (picadas infectantes recorrentes) e o hospedeiro (fatores genéticos predisponentes, resposta imune, e doenças coexistentes) [6].

1.6. SINAIS CLÍNICOS

Nem todos os cães infectados vão desenvolver a doença [32, 39]. Nos animais considerados afetados ocorre fundamentalmente uma resposta do tipo humoral com opressão da resposta celular contra o parasita, com o concomitante desenvolvimento de sinais clínicos. Por outro lado, nos animais infectados, mas aparentemente saudáveis (resistentes ao parasita) ocorre sobretudo uma resposta do tipo celular com a inibição de manifestações clínicas aparentes [40].

Os sinais clínicos mais frequentes em cães soropositivos são lesões cutâneas, perda de peso, letargia, mucosas pálidas, alopecia, doença renal, ornicogrifose e linfadenomegalia [5, 27, 30, 48, 49]. Em um estudo feito por Cortes et al. [47] mais da metade dos animais (53,7%) soropositivos não apresentavam sinais clínicos e apenas 25,8% dos animais que apresentavam sinais clínicos compatíveis com a leishmaniose eram positivos para a doença. Isso reforça a necessidade de uma abordagem mais ampla para o diagnóstico com a junção várias técnicas em conjunto.

Apesar das manifestações clássicas, já foi relatado que podem aparecer outros sinais não comuns, porém sugestivos para a doença, como dermatite, alopecia, e também hiperglobulinemia, hipoalbuminemia e leve anemia não regenerativa [45]. O indicado nesse caso seria uma análise mais apurada com testes diagnóstico mais específicos para leishmaniose como o teste de ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay).

Entretanto, a susceptibilidade para desenvolver a doença também é influenciada por fatores não genéticos como o status nutricional, infecções concomitantes e parasitismo, a virulência do parasita e exposição anterior à LCan [32].

Outro fator que pode desencadear a doença em animais aparentemente saudáveis é a administração de fármacos imunossupressores ou uma doença imunossupressiva severa, que pode levar à ativação de uma infecção latente e o desenvolvimento de sinais clínicos [32].

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Estudos populacionais em áreas endêmicas de Leishmania mostraram que uma proporção da população canina desenvolve a doença aparente, outra fração desenvolve uma persistente infecção subclínica, enquanto outra porção é resistente à infecção ou a resolve intermitentemente sem o desenvolvimento de manifestações clínicas. Isso faz com que o diagnóstico da LCan seja um desafio para o médico veterinário, patologista clínico e oficial de saúde pública em países endêmicos, bem como em regiões não endêmicas, onde a importação da infecção é uma preocupação [24].

Anemia foi descrita como estando presente na maioria dos animais afetados, por causa da doença renal crônica ou da diminuição da eritropoiese causada pela doença crônica e pode ser agravada por perda de sangue ou destruição imunomediada de glóbulos vermelhos [33, 42–44].

Os parasitas costumam se disseminar para os linfonodos, baço e medula óssea em se tratando de animais susceptíveis à doença. Para animais resistentes, os parasitas se limitam apenas à pele, podendo atingir também os linfonodos locais [43]. Já foi reportado anteriormente que o grau de infectividade da infecção aumenta com a evolução do quadro do animal acometido [44].

Os parasitas fagocitados podem permanecer no tecido subcutâneo, dando origem às formas clínicas de LC, ou invadir as células do sistema mononuclear fagocítico, como o baço, fígado, medula óssea, linfonodos e outros órgãos linfóides, causando a LV [9].

Os níveis de imunoglobulinas específicas para Leishmania detectados em cães afetados são mais altos do que naqueles detectados em cães subclinicamente infectados, e foi detectada uma associação marcada entre esses níveis, o status clínico e a carga parasitária [46].

A utilização de protocolos de tratamento costuma ter sucesso no controle da doença clínica em cães infectados, porém apesar de uma melhora nos sinais, os animais permanecem frequentemente soropositivos e parasitologicamente positivos [24]. Estes animais aparentemente saudáveis (ou subclinicamente infectados) podem ser altamente infecciosos, reforçando o seu papel na disseminação do parasita em áreas endêmicas [52].

1.7. DIAGNÓSTICO

O diagnóstico definitivo da LCan pode revelar-se complexo, uma vez que nem todos os animais infectados pelo parasita desenvolvem manifestações clínicas. Este fato não pode ser negligenciado uma vez que, apesar de aparentemente saudáveis, os cães portadores

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são infeciosos para os vetores [24, 40]. Isso faz com que o diagnóstico da LCan seja um desafio para o médico veterinário, patologista clínico e oficial de saúde pública em países endêmicos bem como em regiões não endêmicas, onde a importação da infecção é uma preocupação [24].

A investigação da doença deve sempre ser baseada em um conjunto de fatores, considerando a história e os achados clínicos do animal juntamente com resultados de exames de sangue, proteinograma, análise de urina e testes diagnósticos mais específicos [6, 21, 33, 48].

Para que se proceda a um diagnóstico correto de leishmaniose é necessário conhecer os testes específicos, tendo em conta as suas limitações e a sua correta interpretação clínica. O diagnóstico da LCan deve basear-se numa abordagem integrada e considerar a história clínica, os dados laboratoriais não-específicos (hemograma, análises bioquímicas séricas/plasmáticas, proteinograma e urinálise), e/ou os métodos laboratoriais específicos como os parasitológicos (com a observação do parasita ou detecção do seu DNA) e/ou sorológicos (que avaliam a resposta imunitária específica do hospedeiro) [1].

Existem dois tipos de testes etiológicos que podem ser utilizados para diagnosticar a leishmaniose: os testes diretos, que confirmam a presença do parasita e os testes indiretos, que avaliam a resposta do hospedeiro ao parasita. Resultados positivos em testes indiretos (por exemplo, sorologia) podem ou não indicar uma infecção naquele momento. Em contra partida, um resultado positivo de teste direto (citologia, histologia, imunohistoquimica, PCR - polymerase chain reaction, cultura e xenodiagnóstico) demonstra que a doença está acontecendo naquele momento e deve estar associado a dados clínicos e testes clinico-patológicos [49]. Assim deve-se sempre recorrer a um conjunto de técnicas complementares de diagnóstico de modo a confirmar a suspeita clínica.

As técnicas mais comuns para detectar anticorpos anti-Leishmania são baseadas na detecção do anticorpo específico contra Leishmania spp., preferencialmente usando técnicas quantitativas sorológicas: IFI (imunofluorescência indireta), ELISA e ICT (immunochromatographic test) [49, 50].

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1.7.1. DIAGNÓSTICO LABORATORIAL

1.7.1.1. Sorologia

Testes sorológicos detectam e quantificam anticorpos presentes no soro ou plasma. Nem todos os cães irão soroconverter após a infecção [51], em conclusão, sorologia quantitativa deveria ser sempre empregada quando, além de forte suspeita clínica de leishmaniose, as lesões que estariam presentes para um teste de aspirado por agulha fina não estão presentes ou quando a análise citológica de lesões, órgãos linfoides e medula óssea falham em revelar o padrão típico associado à leishmaniose, apesar de uma possível positividade no teste de PCR. Neste caso, uma alta titulação do anticorpo é frequentemente consistente com leishmaniose, enquanto quando a titulação do anticorpo é baixa a leishmaniose deve ser considerada apenas quando for descartada a presença de outras doenças potencialmente responsáveis pelas manifestações clínicas apresentadas [48, 49, 52].

A identificação de animais subclinicamente infectados dentro de uma população é sempre um desafio. Enquanto a soropositividade média de animais clinicamente afetados é de 88-100%, em cães sem manifestações clínicas aparentes gira em torno de 30-66% [53]. Alguns cães podem ainda não ter soroconvertido no momento da coleta do sangue, apesar de já estarem infectados [54].

Vários testes sorológicos foram desenvolvidos, sendo as técnicas de IFI, ELISA e os ―kits‖ rápidos imunocromatográficos os mais utilizados para a detecção de anticorpos anti-Leishmania [52]. Tanto a IFI quanto ELISA possuem a vantagem de dar resultados quantitativos refletindo a presença da titulação do anticorpo ou, para ELISA apenas, os valores de densidade ótica convertidos baseados na titulação de referência do anticorpo presente na amostra [49].

1.7.1.2. IFI

A IFI é considerada um método de diagnóstico sorológico de referência em cães [4], pois apresenta alta sensibilidade e especificidade (aproximadamente 100% em ambos os parâmetros) exceto em áreas endêmicas do Novo Mundo que apresentam infecção pelo parasita Trypanosoma cruzi, pois esses podem gerar resultados falso positivos, o que diminui a especificidade [49].

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1.7.1.3. ELISA

Dentre as técnicas sorológicas utilizadas, o método quantitativo ELISA apresenta-se como amplamente utilizado em vários estudos, no relato de Bordeau et al. [62] foi empregado em 72,2% dos casos, no de Montoya et al. [55] ele representou cerca de 61,8% dos casos e no de Oliveira et al. [33] cerca de 11%. Juntamente com a IFI, o teste de ELISA é o teste mais recomendado para o diagnóstico de LCan segundo o grupo LeishVet e a OIE [5].

Apesar de a produção de anticorpos ser baixa nas fases inicial e final da infecção, bem como em casos subclínicos, os cães usualmente tendem a aumentar de forma gradual os títulos de anticorpos [52]. Os testes sorológicos utilizados no diagnóstico da leishmaniose devem ter em conta que a presença de anticorpos específicos não está necessariamente associada à fase ativa da doença e que após o tratamento os títulos de anticorpos podem permanecer elevados [52].

Testes quantitativos são considerados mais sensíveis, justamente por isso são mais recomendados antes da vacinação para garantir que aquele animal está saudável, já que às vezes cães com baixa carga parasitária não se apresentam como positivos em técnicas qualitativas [56] por causa da sua baixa sensibilidade [55].

Altos níveis de anticorpos são usualmente associados à doença clínica ou infecção subclínica persistente em cães infectados. É preciso ficar atento, pois podem ocorrer reações cruzadas com diferentes patógenos em alguns testes sorológicos, principalmente naqueles que abrangem uma maior gama de antígenos de parasitas [24], gerando assim resultados falso positivos.

1.7.1.4. Testes imunocromatográficos

O teste imunocromatográfico é um bom teste quando se trata de resultados rápidos, porém ele apenas dará um resultado qualitativo, com a presença ou ausência do parasita naquele animal [1]. Diversos testes comerciais estão disponíveis, estes são geralmente baseados em múltiplos ou únicos antígenos recombinantes de Leishmania spp. Esses antígenos são encubados com soro, plasma, sangue total ou partes de sangue em papel-filtro [57].

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A especificidade desse teste é alta, porém a sensibilidade é mais baixa (em média 30-70%) e altamente dependente do estágio clínico da doença [4]. É uma recomendação do LeishVet que um resultado de teste imunocromatográfico venha seguido de um teste sorológico mais sensível para a doença [5, 25].

Em suma, testes imunocromatográficos podem ser usados como um primeiro teste de triagem em clínicas para avaliar cães clinicamente suspeitos. Em caso de um resultado positivo, um teste quantitativo (ELISA ou IFI) deve ser realizado para se obter um resultado numérico. Mais do que isso, devido à sua baixa sensitividade, um resultado negativo em um teste imunocromatográfico em um animal apresentando forte suspeita de leishmaniose devido às manifestações clínicas deve ser questionado, seguido de testes como IFI e ELISA [49, 58].

1.7.1.5. Cultura

Apesar de apresentar 100% de especificidade, a obtenção do resultado da cultura é demorada e condicionada à ausência de contaminação bacteriana ou fúngica. É também necessário ter em conta que nem todos os isolados crescem em meio de cultura e que um resultado negativo com suspeita clínica não significa que o animal não se encontre infectado, pois a distribuição dos parasitas nos tecidos e nos diferentes órgãos não é homogênea [1]. O isolamento do parasita em meio de cultura a partir de tecidos infectados não é, portanto, o mais adequado para a realização de um diagnóstico rápido, possuindo uma sensibilidade mais baixa que a obtida por metodologias sorológicas ou moleculares [52].

1.7.1.6. Citologia

A aspiração por agulha fina deve ser realizada em todos os casos de lesões cutâneas papulares ou nodulares e/ou aumento de linfonodo [48]. A detecção de amastigotas pode ser difícil em lesões cutâneas ulcerativas, onde necrose e detritos celulares ou contaminação por bactérias podem mascarar a presença das formas amastigotas [49].

Para se obter um resultado positivo para a infecção por Leishmania é necessária a visualização de apenas uma célula parasitada. As formas mais comuns de diagnóstico são através de biópsias de medula óssea, de pele, de punção dos linfonodos ou raspados de lesões cutâneas [52]. Essas técnicas se apresentam como boa opção por serem rápidas e

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econômicas, bem como por possuírem uma alta especificidade, porém uma vez se tratando de cães subclinicamente infetados e com uma baixa carga parasitária, a sensibilidade destes testes pode ser muito baixa [52].

O diagnóstico da leishmaniose é fácil quando amastigotas são detectadas em amostras que mostram padrões citológicos descritos. Entretanto, quando os padrões citológicos são característicos da doença, mas se nenhuma amastigota é encontrada, a leishmaniose não deve ser descartada, uma vez que a sensibilidade do diagnóstico etiológico através da citologia é baixa [4]. Nesses casos, testes com uma maior sensibilidade de diagnóstico, como a PCR, devem ser empregados. Junto a isso, quando amastigotas são encontradas na ausência de anormalidades citológicas, ou a citologia for feita em amostras de medula óssea, linfonodo ou baço, os resultados positivos devem ser interpretados cuidadosamente, já que sinais sistêmicos podem ser de outras doenças além da leishmaniose [48, 49].

De acordo com Alvar et al. [54], o exame direto de esfregaços de medula óssea e de linfonodos de cães infetados apresenta uma sensibilidade de 60-75% e 30-35%, respectivamente. O exame de cultura é mais sensível que o exame direto, aumentando assim a probabilidade de sucesso do diagnóstico.

Uma boa forma de diagnosticar a leishmaniose visceral é através da identificação dos parasitas em lâminas de tecidos (baço, medula óssea e linfonodos), visto que é muito específica. Esfregaços do baço apresentam uma sensibilidade de >90%, porém o procedimento apresenta um risco de hemorragia intra-abdominal [59]. Aspirado de medula óssea é comumente feito, porém apresenta uma sensibilidade mais baixa [60].

1.7.1.7. PCR

De um modo geral, a PCR convencional, ―nested‖ PCR e PCR quantitativa (em tempo real) são amplamente utilizados na rotina prática [4, 48, 52]. A sensibilidade e especificidade variam de acordo com o método e a sequência alvo de DNA [61].

Técnicas de PCR quantitativas são mais sensíveis que o PCR convencional ou ―nested‖ para diagnosticar a LCan [62]. Uma limitação adicional da PCR quantitativa é que métodos padronizados para quantificar com precisão cópias de DNA podem não ser realizadas por alguns laboratórios [49]. A PCR em tempo real é uma ferramenta de

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diagnóstico sensível, com a qual é possível quantificar o número de parasitas em uma amostra e detectar o momento das moléculas de DNA do parasita no tecido [24, 63].

Quando não existem lesões típicas para a realização de biópsia ou aspiração por agulha fina (quando só existem sinais clínicos incluindo anemia ou nefropatia preteinúrica), os tecidos de preferência para a realização de PCR que apresentariam potencial prevalência para uma detecção do agente seria a medula óssea e/ou amostras de linfonodos ou baço [52].

Ao interpretar resultados de PCR, a diferença entre um cão infectado ou doente deve ser considerada. Em última análise, a detecção de DNA do parasita indica que o cão está infectado. A correlação entre a infecção e a doença deve ser baseada na presença de alterações clínicas ou laboratoriais. Dessa perspectiva, a detecção de DNA de Leishmania em lesões com padrões citológicos ou histológicos é altamente consistente para leishmaniose. Em sangue ou medula óssea de um cão que já apresenta forte suspeita clínica para leishmaniose suporta o diagnóstico da doença. Contrariamente, resultados positivos de PCR em cães sem suspeita clínica de referência para leishmaniose não suportam a hipótese de que um cão infectado está doente, apesar de outra doença possível ser excluída [49].

Um único resultado negativo de PCR em um cão suspeito que é compatível com a suspeita clínica não é suficiente para excluir a possibilidade de infecção. Quando a suspeita é alta, a avaliação de tecidos adicionais por PCR é recomendada [24].

1.7.1.8. Xenodiagnóstico

O xenodiagnóstico é um teste de alta sensibilidade e especificidade. O teste é realizado através da junção dos vetores não parasitados com o agente etiológico e cães potencialmente infectados. Estes irão se alimentar do sangue do cão e posteriormente serão analisados microscopicamente para a presença de formas promastigotas em seu abdômen [64].

Entretanto, o teste é muito pouco prático e restrito a centros de referência específicos. Mais do que isso, esse teste tem mais caráter de pesquisa e não está recomendado na prática de rotina [49].

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1.8. TRATAMENTO

Quando falamos em tratamento, na maioria dos casos, o cão consegue apresentar uma diminuição da gravidade clínica, porém sem eliminação total dos parasitas, o que faz com que ele tenha uma capacidade menor de infectar outros vetores apesar de ainda ser um portador de Leishmania [40]. O mesmo pode acontecer com seres humanos, onde em casos de imunossupressão a doença pode ter uma recorrência ou recidiva [9].

Porém é importante ter cuidado, pois cães tratados vivendo em áreas endêmicas estão constantemente expostos ao parasita e podem ser reinfectados. Estudos avaliando a infecciosidade de flebótomos indicaram que cães após o tratamento podem ser fontes de infeção para flebótomos e consequentemente para outros cães e seres humanos [23 ,24].

O estudo de Oliveira et al. [33] em Portugal mostrou que para o tratamento da LCan, 84% dos clínicos usavam allopurinol e uma frequente associação deste com antimoniato de meglumina em 68% dos casos, sendo este muito bom para reduzir relapsos da doença. A utilização e associação destes dois fármacos no tratamento da doença foi relatada por outros autores [33, 55, 65], é apontado como sendo o tratamento mais utilizado (84% dos casos) em Portugal no estudo de Bordeau et al. [62], enquanto 68% dos clínicos utilizam a associação do allopurinol com o antimoniatos.

Outros fármacos (41% dos casos estudados) são comumente associados ao tratamento da LCan, como vitaminas, ácidos graxos essenciais, glicocorticóides e antibióticos [33]. Um sucesso no tratamento é normalmente observado em cães com ausência de manifestações clínicas, ou apenas sinais sutis [23]. O estudo de Oliveira et al. [33] demonstrou que cerca de 58% dos casos estudados conseguiram sobreviver de 2 a 5 anos após o tratamento.

É importante salientar que um diagnóstico precoce, juntamente com o tratamento adequado e medidas profiláticas contra o vetor e outros cães potencialmente infectados, são as melhores formas de controlar a infecção [41].

Em muitos pacientes a doença vem associada a uma causa subjacente, que provavelmente deprimiu a resposta do sistema imunitário (tratamentos com fármacos imunossupressores, parasitismo, outras infecções, doenças crônicas, etc.). De fato, a literatura científica é repleta de estudos de LCan associada a outras doenças (hemangiossarcoma, linfoma, erliquiose, etc.). Uma explicação plausível seria a de que esses cães estavam cronicamente infectados e desenvolveram a LCan quando um evento

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ligado a essas novas doenças (tratamento, infecção, neoplasia, etc.) mudou a sua resposta do sistema imunitário. Para cães de idade média a avançada afetados pela leishmaniose a presença de causas ocultas deve ser investigada [67].

1.9. PROFILAXIA

A LV apresenta-se como uma ameaça por ser uma zoonose. Uma abordagem eficaz e com melhor custo-benefício para o controle da doença seria através da colaboração de múltiplos campos de especialistas (oficiais de saúde pública, médicos veterinários e físicos), pesquisadores e laboratórios de diagnóstico (microbiologistas, parasitologistas, imunologistas) e abordagens de nível político (políticos, funcionários públicos, e economistas da saúde) [12, 16, 68].

Além dos animais com manifestações clínicas, os animais que não têm suspeita clínica aparente também podem ser uma potencial fonte de infecção para os vetores [43, 69], portanto estes também deveriam ser incluídos em programas de controle da doença [70].

A aplicação de inseticidas tópicos via coleiras contendo deltametrina e formulações ―spot-on‖ (soluções para unção puntiforme) com permetrina, juntamente à vacinação, se mostram as medidas mais eficazes e que são mais amplamente aceitas e empregadas pelo público geral [12, 20, 33, 53, 66]. Estes podem reduzir o risco de infecção por L. infantum em cães, representando uma ferramenta eficaz que pode ser integrada em programas de controle da LCan [71].

Outra medida preventiva recomendada inclui evitar andar com o cão após anoitecer ou próximo a regiões úmidas, e também manter o animal dentro de casa durante a noite [39, 62, 63].

Um modelo matemático usado para comparar a eficácia de medidas de controle da LV (vacinas, eutanásia de cães soropositivos e o uso de colares com inseticidas) mostrou que as três medidas, em diferentes coberturas, foram associadas a uma diminuição na prevalência da infecção em cães e humanos. Entretanto, dentre estes, o uso de colares com inseticidas teve o maior nível de eficácia [16, 72].

É importante investigar possíveis infecções subclínicas em animais clinicamente saudáveis que vivem em regiões endêmicas, incluindo doadores de sangue, cães de raça e animais que serão sujeitos a vacinação, animais que estão em fase de regressão da doença

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e em cães clinicamente saudáveis de áreas não endêmicas (cães em viagem), para evitar a importação de cães infectados para regiões não endêmicas e para monitorar a sua resposta ao tratamento [5, 52].

Em um cenário ideal, o controle do vetor juntamente com a proteção do hospedeiro seria a melhor forma de prevenir o contato do flebótomo com o animal, visto que nenhuma medida preventiva garante 100% de eficácia na proteção para a doença. Aplicando essa situação em larga escala, poderíamos não só enxergar uma diminuição da incidência da LCan como também baixar a densidade populacional do vetor, reduzindo as hipóteses de contato do homem com o parasita[25].

1.10. CONTROLE

O controle da leishmaniose difere dependendo do país em questão. O contraste das politicas de controle da LCan desde o tratamento médico ao financiamento de países, como a Itália, para a proibição do tratamento e a eliminação obrigatória, como Brasil, baseiam-se nas diferentes condições epidemiológicas, demográficas, econômicas e sociais pertencentes a cada país [5].

A interação e coordenação de diferentes organizações com perspectivas científicas e profissionais são essenciais no combate de doenças zoonóticas como a LV. Isso apenas pode ser alcançado através de um diálogo entre as partes interessadas, e a aplicação de dados baseados em evidências [12].

Cães infectados costumam ter sucesso no controle da doença clínica com a utilização de protocolos de tratamento, porém apesar de uma melhoria nos sinais, estes provavelmente permanecerão soropositivos e parasitologicamente positivos [24].

Enquanto decisões relativas ao controle e manutenção de cães infectados são feitos por médicos veterinários locais e autoridades de saúde pública, essas são tipicamente baseadas em regulamentações concebidas por agentes de saúde a um nível governamental, que podem atuar sob influência não política, enquanto pode ter influência oficial dos ministros, grupos apoiadores de direito e bem-estar dos animais e prefeitos das cidades onde a doença é um problema [12].

A medida controversa da implantação da eutanásia mostrou que o abate generalizado (lê-se a eliminação de 17.600 cães soropositivos de 1990 a 1997) não estava associada a uma redução do número de cães e humanos infectados no Brasil [73]. Em

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contraste, o número total de casos em humanos vem aumentando no país e a doença se tornou um grave problema de saúde pública em diversos estados [16].

Segundo a Organização Mundial de Saúde [9] as estratégias de controle devem incidir sobre: os vetores, nomeadamente nas vertentes biológicas, ecológicas e químicas; o parasita, erradicando-o nos hospedeiros através do tratamento dos doentes e dos reservatórios sempre que possível; proteção da população humana e canina. Adicionalmente, o desenvolvimento de vacinas deve ser encorajado uma vez que a vacinação é uma das medidas de controle mais promissoras.

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2. OBJETIVOS

A LCan é uma doença endêmica em muitos países, mas nem todos eles possuem boas campanhas de prevenção e controle, sem falar que alguns ainda não atentaram para a gravidade da doença, e por isso deixam de investir em métodos de diagnóstico mais acessíveis.

Através deste trabalho pretende-se entregar à comunidade acadêmica e aos clínicos veterinários uma solução complementar que poderia fazer com que todos os envolvidos chegassem a um diagnóstico mais rápido da doença, através de características epidemiológicas juntamente ao hemograma e testes bioquímicos, ferramenta básica e imprescindível no dia-a-dia veterinário e de melhor acesso econômico.

A comunidade acadêmica possui um grande número de artigos referentes a métodos de epidemiologia, diagnóstico e tratamento da LCan, porém aqui gostaríamos de tentar a observar sob uma ótica laboratorial, como forma de traçar o perfil da doença em Portugal e fazer a diferença na implantação de um bom controle da mesma para o animal e por consequência proteger as pessoas e outros animais que vivem no mesmo ambiente e redondezas.

Portanto, o objetivo deste estudo foi descrever a população de 1.307 cães naturalmente infectados por L. infantum e diagnosticados com LCan no teste de ELISA, determinar possíveis associações e correlações entre as diferentes variáveis correlacionadas com a doença e mapear os animais soropositivos pelo país de modo a entender a sua distribuição em Portugal Continental, bem como chegar a um diagnóstico mais rápido e preciso da doença.

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3. MATERIAL E MÉTODOS

3.1. COLETA E CHEGADA AO LABORATÓRIO

Todos os dados dispostos neste trabalho foram cedidos pelo Laboratório INNO, com sede em Braga, Portugal, que é um laboratório de diagnóstico veterinário. O INNO atua desde 2007 no mercado veterinário Português e Europeu com um sistema de recolhas próprio por meio de estafetas e também serviço de entregas contratado (por meio de transportadoras). Portanto, além da ficha de requisição que vem junto com a amostra a ser trabalhada, os médicos veterinários do laboratório não têm qualquer contato com os animais estudados neste trabalho.

Figura 1. Ana Carolina Maranhão representando o laboratório INNO no XV Congresso Internacional Veterinário Montenegro em 2019, o mesmo congresso em que no ano de 2020 foi apresentada uma das análises discutidas nesta dissertação.

As amostras são condicionadas em uma bolsa térmica, seguindo as orientações de preservação durante o transporte. Ao chegar ao INNO as técnicas dão a entrada do material confirmando se todos os dados encontram-se presentes na ficha de requisição (Anexo B), atribuindo um número de identificação do animal e etiquetando todas as amostras correspondentes a ele em seguida.

O material também passa por uma inspeção, em que se observa se encontra-se em condições adequadas (hemolisado, lipêmico, na correta proporção da quantidade de anticoagulante para o volume de amostra, data de coleta e qualquer outra alteração que

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possa prejudicar o resultado final dos exames) e se a amostra é adequada para a análise pretendida (tubo com EDTA para hemograma, tubo seco para a separação do soro para a realização dos exames bioquímicos e o teste de ELISA). Depois disso o material segue para a sala de processamento para que análise tenha início imediato.

Figura 2. Laboratório INNO, Braga, Portugal.

O material de processamento foi sangue total (para o hemograma) e soro (análises bioquímicas e de sorologia). Todo o material foi originário de 195 clínicas e hospitais de todas as cinco regiões de Portugal Continental (Figura 5; ver também 3.4.1).

3.2. AMOSTRA E DADOS

Inicialmente, os animais testados apresentavam manifestações clínicas compatíveis com LCan ou, ao menos, viviam em uma área endêmica para a doença, dividiam o espaço com outro animal potencialmente suspeito ou havia retornado de uma viagem para uma região endêmica. Neste trabalho não serão explorados os sinais físicos dos animais envolvidos.

O ―Perfil Leishmania‖ disponibilizado pelo INNO é realizado mediante solicitação do médico veterinário clínico. Neste perfil existem as seguintes análises: hemograma (RBCs - análise dos eritrócitos, WBC - análise dos glóbulos brancos, PLT - análise das plaquetas),

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creatinina (CREA), ureia (UREA), alanina aminotransferase (ALAT), proteinograma e o teste sorológico de ELISA para a pesquisa quantitativa de anticorpos anti-Leishmania.

Após a realização dos exames os dados ficam armazenados no programa Clindata, pelo qual foi possível retirar os dados dos 1.307 animais que se encaixavam neste perfil ao longo de 11 anos (2009-2019) para a construção deste estudo retrospectivo.

Um estudo adicional foi realizado com base em dados do mesmo programa. Para ele foram utilizados 21.795 resultados (apenas positivos e negativos; excluindo-se duvidosos) do teste sorológico de ELISA nos anos 2012-2019, a idade e os locais/regiões de proveniência das amostras, como forma de entender a distribuição da doença por Portugal Continental. Os resultados foram tabulados em planilha do Excel (3.4.1.1).

3.3. PROCESSAMENTO DE ANÁLISES

O hemograma (Ht, WBC, PLT) foi realizado por um equipamento especializado em contagem de células Sysmex 2000XT-iV e conferido visualmente por microscopia ótica sempre que necessário. Para o hematócrito (Ht) eram admitidos os valores da mesma máquina e se necessário eram conferidos sob o método de micro-hematócrito com a ajuda de uma centrífuga. A análise bioquímica (UREA, CREA, ALAT) foi realizada em uma BS380. O proteinograma foi definido por eletroforese capilar.

A detecção de anticorpos para Leishmania foi feita através do teste sorológico ELISA Leiscan® (Laboratorios Hipra, S.A.), que apresenta sensibilidade e especificidade reais (comprovado por testes e estudos) de 95.3% e 99.8%, respectivamente (Figura 3).

A metodologia ELISA é creditada e recomendada pela OIE como uma das metodologias de referência para confirmação diagnóstica e monitorização da infecção e da doença [1]. Os intervalos dispostos na Tabela 4 foram mantidos desta forma (ao invés de serem classificados apenas como positivos, por exemplo) para uma posterior análise de correlação dos resultados para Leismania com os de outros parâmetros, para analisar se a razão (Rz) do teste de ELISA tinha alguma associação com algum destes. Os intervalos adotados para a classificação dos animais foram os adotados pelo teste: negativo (Rz=<0,9), positivo baixo (1,1<Rz=<1,5), positivo (1,5<Rz=<3), positivo alto a muito alto (Rz>3).

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Figura 3. Placa de teste sorológico de ELISA realizado no laboratório INNO.

3.4. PROCESSAMENTO DOS DADOS

Por ter um alto número de dados em análise é necessária a utilização de estatística descritiva e analítica, principal aliada no tratamento dos dados propostos. Para tal serão utilizados programas estatísticos, incluindo IBM® SPSS® Statistics versão 26.0.

Os parâmetros disponíveis para a análise foram: sexo, idade, sazonalidade (evolução da doença ao longo dos anos), hemograma, leucograma, dados bioquímicos (creatinina, ureia, alanina aminotransferase, proteínas totais), proteinograma (albumina, alfa 1 (α1) e 2 (α2), beta 1 (β1) e 2 (β2) e gama (γ)), rácio albumina/globulina e resultados do teste de ELISA quantitativo (Leiscan®) com classificação de acordo com a absorvância do teste (positivo, positivo baixo, positivo alto, positivo muito alto, negativo e inconclusivo).

Para o delineamento do trabalho os animais foram classificados de acordo com características qualitativas e quantitativas.

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3.4.1. Variáveis qualitativas

3.4.1.1. Análise de 21.795 resultados de animais testados para LCan pelo teste sorológico de ELISA entre os anos 2012-2019

Este tópico aborda a análise de 21.795 amostras sorológicas, submetidas a análise nos Laboratórios INNO, no período compreendido entre janeiro de 2012 e novembro de 2019. Foram testados através do método ELISA Leiscan®, animais entre os 6 meses e 20 anos de idade, sendo a média total de idades de 5,3 anos. Para interpretação estatística, os dados foram agrupados de acordo com as regiões NUTS (Nomenclatura de Unidade Territorial para fins Estatísticos) de Portugal Continental: Norte (n = 6.307), Centro (n = 8.076), Área Metropolitana de Lisboa (n = 3.972), Alentejo (n = 2.350) e Algarve (n = 1.090).

Para esta análise foram consideradas apenas as variáveis ―Região de proveniência da amostra‖, ano de coleta (para ―sazonalidade‖) e a ―idade‖ dos animais. Os resultados apresentam uma amostra aleatória e representativa do país, uma vez que as amostras vieram de todas as regiões em quantidade considerável (Tabela 1).

Esta análise foi apresentada como pôster (Anexo A) no XVI Congresso Internacional Veterinário Montenegro em fevereiro de 2020, e tem como referência Maranhão et al. [82] (Figura 4).

Figura 4. Pôster ―Leishmaniose canina em Portugal‖ apresentado no XVI Congresso Internacional Veterinário Montenegro.

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3.4.1.2. Regiões de proveniência das amostras (n = 1.307)

Para uma análise mais refinada, as análises foram divididas por distritos e em seguida de forma correspondente a cada uma das regiões NUTS de Portugal Continental: Norte (n = 362), Centro (n = 517), Área Metropolitana de Lisboa (n = 163), Alentejo (n = 181) e Algarve (n = 84) (Figura 5).

Figura 5. Mapa de Portugal Continental com a indicação dos locais de proveniência das amostras dos 1.307 animais deste estudo.

Apenas a partir de 2013 o número de amostras pôde ser considerado como mais representativo por apresentar dados de todas as regiões em questão, como pode ser observado na Tabela 3. Portanto, a análise só foi diferenciada por região ao longo dos 7 anos disponíveis (2013-2019). Para mapear os animais positivos no país serão excluídos os