GENOTIPAGEM DE AMOSTRAS DE Corynebacterium pseudotuberculosis ORIGINADAS DE CASOS DE LINFADENITE CASEOSA NO DISTRITO FEDERAL

(1)

UNIVERSIDADE DE BRASÍLIA

FACULDADE DE AGRONOMIA E MEDICINA VETERINÁRIA

GENOTIPAGEM DE AMOSTRAS DE

Corynebacterium pseudotuberculosis

ORIGINADAS DE CASOS DE LINFADENITE

CASEOSA NO DISTRITO FEDERAL

LORENA FERNANDES ARRUDA

DISSERTAÇÃO DE MESTRADO EM CIÊNCIAS AGRÁRIAS

BRASÍLIA / DF

MAIO / 2006

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UNIVERSIDADE DE BRASÍLIA

FACULDADE DE AGRONOMIA E MEDICINA VETERINÁRIA

GENOTIPAGEM DE AMOSTRAS DE Corynebacterium pseudotuberculosis ORIGINADAS DE CASOS DE LINFADENITE CASEOSA NO DISTRITO

FEDERAL

LORENA FERNANDES ARRUDA

ORIENTADOR: JOSÉ RENATO JUNQUEIRA BORGES

DISSERTAÇÃO DE MESTRADO EM CIÊNCIAS AGRÁRIAS

PUBLICAÇÃO: 224/2006

BRASÍLIA/DF MAIO/2006

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ii UNIVERSIDADE DE BRASÍLIA

FACULDADE DE AGRONOMIA E MEDICINA VETERINÁRIA

GENOTIPAGEM DE AMOSTRAS DE Corynebacterium pseudotuberculosis ORIGINADAS DE CASOS DE LINFADENITE CASEOSA NO DISTRITO

FEDERAL

LORENA FERNANDES ARRUDA

DISSERTAÇÃO DE MESTRADO SUBMETIDA À FACULDADE DE AGRONOMIA E MEDICINA VETERINÁRIA DA UNIVERSIDADE DE BRASÍLIA, COMO PARTE DOS REQUISITOS NECESSÁRIOS À OBTENÇÃO DO GRAU DE MESTRE EM CIÊNCIAS AGRÁRIAS NA ÁREA DE CONCENTRAÇÃO DE DISCIPLINAS DE PRODUÇÃO ANIMAL.

APROVADA POR:

___________________________________________ JOSÉ RENATO JUNQUEIRA BORGES, DOUTOR (UnB) CPF: 400975447 - 87 E-mail: [email protected]

___________________________________________ SIMONE PERECMANIS, DOUTORA (UnB)

CPF: 010126137 - 39 E-mail: [email protected]

___________________________________________ TÂNIA MARIA DE PAULA LYRA, DOUTORA (UNIPLAC)

CPF: 059611221-15 E-mail: [email protected]

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iii FICHA CATALOGRÁFICA

Arruda, Lorena Fernandes

GENOTIPAGEM DE AMOSTRAS DE Corynebacterium

pseudotuberculosis ORIGINADAS DE CASOS DE LINFADENITE

CASEOSA NO DISTRITO FEDERAL / Lorena Fernandes Arruda; orientação de José Renato Junqueira Borges. – Brasília, 2006.

41 p. : il.

Dissertação de Mestrado (M) – Universidade de Brasília/Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, 2006.

1. Corynebacterium pseudotuberculosis. 2. Linfadenite Caseosa. 3. Genotipagem. 4. Ovinos. I. Borges, J.R.J. II. Doutor.

REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA

ARRUDA, L. F. Genotipagem de amostras de Corynebacterium

pseudotuberculosis originadas de casos de Linfadenite Caseosa no

Distrito Federal. Brasília: Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária,

Universidade de Brasília, 2006, 41 p. Dissertação de Mestrado.

CESSÃO DE DIREITOS

NOME DO AUTOR: Lorena Fernandes Arruda

TÍTULO DA DISSERTAÇÃO DE MESTRADO: Genotipagem de amostras de

Corynebacterium pseudotuberculosis originadas de casos de Linfadenite

Caseosa no Distrito Federal. GRAU: Mestre ANO: 2006

É concedida à Universidade de Brasília permissão para reproduzir cópias desta dissertação de mestrado e para emprestar ou vender tais cópias somente para propósitos acadêmicos e científicos. O autor reserva-se a outros direitos de publicação e nenhuma parte desta dissertação de mestrado pode ser reproduzida sem a autorização por escrito do autor.

_______________________________________ Lorena Fernandes Arruda

CPF: 832523631-00

QNB 11 casa 09 – Taguatinga Norte

CEP – 72115-110 - Brasília / DF - Brasília (61) 33515521 / 92759361

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iv

AGRADECIMENTOS

A Deus por ter concedido proteção, sabedoria, misericórdia e perseverança para a realização de mais um objetivo em minha vida, sempre ao meu lado mostrando o caminho correto a seguir.

Aos meus pais, Diva e Francisco, e as minhas irmãs, Andréa e Sandra, pelo apoio, oportunidade de estudo e incentivo.

Ao professor Dr. José Renato Junqueira Borges por ter acreditado em meu trabalho, por ter sido um exemplo profissional e humano e a oportunidade de crescimento científico.

A professora Dra. Simone Perecmanis pelo auxílio durante todo o desenvolvimento dos experimentos, sempre apoiando com os conhecimentos intelectuais, morais e amigos, nunca deixando o cansaço e o desespero atingir o desenrolar da dissertação. Obrigada pelo tempo dedicado e a convivência almejando o fim de mais uma etapa.

Ao professor Dr. Bergmann Moraes Ribeiro por ter concedido o espaço e a tecnologia de seu laboratório para o desenvolvimento dos experimentos moleculares.

Ao Laboratório de Microscopia Eletrônica da Universidade de Brasília pelo espaço cedido para a realização da parte molecular da dissertação.

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Aos técnicos Hudson, Nara e Daniela do Laboratório de Microbiologia Veterinária da Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária da Universidade de Brasília pelo apoio técnico nos ensaios microbiológicos.

Aos colegas de trabalho, Alice, Bruno, Luis Alberto, Luis Finotti e Silvio pelo auxílio a campo.

Aos colegas do Laboratório de Microscopia Eletrônica, Raimundo Wagner, Roberto, Mariana, Greice, Ramon e Suzane, pelo apoio técnico e amizade na parte molecular dos experimentos.

E aos sempre e eternos amigos de qualquer hora e situação, Alice, Ana, André, Caroline, Daniel, Camila, Fabio, Juliana, Leandro, Liandra, Marceli, Marcos, Simone, Teresinha, Wilson, por sempre me apoiarem a dedicação ao trabalho, aceitarem os estresses, as ausências de tempo e as crises!

“Feliz do homem que encontrou a sabedoria, daquele que adquiriu a

inteligência, porque mais vale este lucro que o da prata, e o fruto que se obtém é melhor que o fino ouro”. (PROVERBIOS 3:13-14)

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v ÍNDICE Capítulos/Sub-capítulos Página 1. INTRODUÇÃO GERAL 1 2. OBJETIVOS 2 3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 3

3.1. A Ovinocultura no Mundo e no Brasil 3

3.2. Fatores Sanitários que Interferem com a Criação 4

3.3. Descrição da Doença 5

3.4. Prevalência da Doença e Diagnóstico 6

3.5. Caracterização do Microorganismo 7

3.6. Vias de Entrada e Patogenia 8

3.7. A Utilização de Técnicas Moleculares para o Estudo Genômico de Microorganismos

10

3.7.1. Reação de Polimerização em Cadeia 10

3.7.2. Análise de Polimorfismo do Comprimento de Fragmentos de Restrição (RFLP) na Modalidade de RFLP locus Específico

13

4. MATERIAL E MÉTODOS 16

4.1. Coleta das Amostras 17

4.2. Cultivo e Estocagem 20

4.3. Atividade Bioquímica 20

4.4. Extração do DNA Genômico 21

4.5. Reação de Amplificação e Digestão do DNA 22

5. RESULTADOS 23

5.1. Cultivo e Identificação Bioquímica 23

5.2. Extração Genômica e PCR 26

5.3. Análise de Restrição de Fragmentos de Polimorfismo em locus Específico

29

6. DISCUSSÃO 33

7. CONCLUSÕES 37

(8)

vi

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura Página

Figura 1 Método de extração de ácidos nucléicos. 12

Figura 2 Reação de Polimerização em Cadeia. 15

Figura 3 Aprisco visitado em uma das coletas. 16

Figura 4 Imagem dos Linfonodos caseosos fechados. 17

Figura 5 Etapas do procedimento das coletas. 19

Figura 6 Placa de ágar sangue com crescimento de colônias de

Corynebacterium pseudotuberculosis

23

Figura 7 Lâmina corada pelo método de Gram de células bacterianas em paliçada características de

Corynebacterium pseudotuberculosis ao microscópio

óptico (1000X).

24

Figura 8 Perfil da reação de nitrato – resultado negativo para todas as amostras.

25

Figura 9 Padrão não inoculado das atividades bioquímicas: sacarose, uréia, glicose, gelatina, trealose, arginina, controle da arginina, maltose e lactose respectivamente.

25

Figura 10 Perfil das atividades bioquímicas com os meios inoculados com as amostras de C. pseudotuberculosis. (sacarose, uréia, glicose, gelatina, trealose, arginina, controle da arginina, maltose e lactose respectivamente).

26

Figura 11 Confirmação da extração do DNA genômico 27

Figura 12 Reação de Polimerização em Cadeia (PCR) das amostras testadas.

28

Figura 13 Digestão do gene 16S com a enzima EcoRV. 30

(9)

vii

ÍNDICE DE QUADROS

Quadro Página

Quadro 1 Padrão dos testes de atividades bioquímicas realizadas com as amostras testadas.

24

Quadro 2 Resultados das amostras em todos os procedimentos realizados.

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viii

Lista de Símbolos e Abreviações

ASCOB – Associação de Criadores de Ovinos de Brasília.

C. pseudotuberculosis – Corynebacterium pseudotuberculosis.

DF – Distrito Federal.

DNA – Ácido Desoxirribonucléico. EDTA - Ácido Etilenodiaminotetracético. PCR - Reação de Polimerização em Cadeia

RFLP – Polimorfismos do Comprimento de Fragmentos de Restrição. RNA – Ácido Ribonucléico.

rDNA - Ácido Desoxirribonucléico ribossômico. rRNA – Ácido Ribonucléico ribossômico.

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RESUMO GERAL

GENOTIPAGEM DE AMOSTRAS DE Corynebacterium pseudotuberculosis ORIGINADAS DE CASOS DE LINFADENITE CASEOSA NO DISTRITO FEDERAL

O Corynebacterium pseudotuberculosis é amplamente distribuído entre as populações de ovinos em todo o mundo causando a linfadenite caseosa. Raramente infecta humanos, mesmo que aqueles tenham contato direto com os animais infectados e é responsável por sérias perdas econômicas na produção indústria de ovinos. A alta variabilidade nas características de cultura e bioquímica do Corynebacterium pseudotuberculosis tem sido investigada pela análise por endonucleases de restrição. O objetivo do estudo foi caracterizar os isolados de Corynebacterium pseudotuberculosis no Distrito Federal, com base na sua cultura, características bioquímicas e a genotipagem para estabelecer se há a diversidade genética e através desta traçar uma correlação com a origem dos rebanhos utilizados, para a elaboração de um programa de rastreamento da doença. Através da amplificação do gene 16S por PCR observou-se dois padrões distintos. A partir de 31 amostras analisadas 22 foram amplificadas e submetidas à análise de RFLP obtendo-se dois padrões entre as digestões dos produtos amplificados por EcoRV e de digestão com Hind III. Foram encontrados assim, três diferentes perfis entre as cepas de C.

pseudotuberculosis das amostras analisadas. A autora conclui que através da

biologia molecular é possível evidenciar amostras epidemiologicamente relacionadas, e que deve ser usado para controlar a disseminação do

Corynebacterium pseudotuberculosis e reduzir os prejuízos causados pela

linfadenite caseosa.

Palavras Chaves

(12)

ABSTRACT

GENOTYPING of Corynebacterium pseudotuberculosis ISOLATED from CASEOUS LYMPHADENITIS CASES in DISTRITO FEDERAL

Corynebacterium pseudotuberculosis is widely distributed among animal populations, causing caseous lymphadenitis in sheep and goats. Commonly causes suppurative lymphadenitis domestic animals but only rarely infects humans, even those having close contact with infected animals and is responsible for serious economic losses to the sheep industry. Caseous lymphadenitis is prevalent worldwide but incidence is higher in areas where intensive husbandry is practiced. Sheep industries worldwide suffer significant economic loss due to the culling of infected animals, carcass condemnation, and decreased wool production. Extensive variability in the cultural and biochemical characteristics of Corynebacterium pseudotuberculosis has been investigated by restriction endonuclease analysis. The aims of the study were to characterize isolates of Corynebacterium pseudotuberculosis on the basis of their culture, biochemical and genotyping to establish whether there was genetic diversity and through this drawn up a correlation with the origin of the flock to elaborate a program of tracking disease. Through the gene 16S amplification by PCR observed two different patterns. From 31 samples analyzed 22 amplified e were submitted by a RFLP analysis obtain two patterns among the digestion of the amplicons by EcoRV and Hind III digestion. Therefore obtain 3 different profiles among Corynebacterium C.

pseudotuberculosis strains analyzed samples. The author concluded that

through molecular biology its possible evidence samples related epidemiologically and must use to control the dissemination of Corynebacterium

pseudotuberculosis and to reduce losses caused by caseous lymphadenitis.

Key words

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1. INTRODUÇÃO GERAL

A ovinocultura desde que racionalmente explorada e conduzida em sintonia com os aspectos de ambiente, econômico e social, é uma excelente alternativa para os diferentes ecossistemas existentes no Brasil (SIMPLÍCIO, 2001). Esta atividade foi melhor desenvolvida e apresenta maior concentração nas regiões semi-áridas dos Estados Nordestinos.

Nos últimos anos, a criação da espécie vem sendo incrementada em outras regiões do país, como alternativa econômica e nutricional de populações de baixa renda, visando a produção de lã e pele e o consumo de leite e carne, bem como na fabricação de queijos e sucedâneos lácteos para pacientes com intolerância ao leite bovino.

O Centro Oeste, principalmente o Distrito Federal, tornou-se um grande centro produtor de ovinos, e muitos rebanhos em formação são encontrados na região.

Estes rebanhos apresentam em sua composição animais oriundos do nordeste e do sul do Brasil, e trouxeram para a região doenças típicas da ovinocultura dessas regiões como a Linfadenite caseosa dos ovinos.

O estudo e a diferenciação de cepas de Corynebacterium

pseudotuberculosis, microorganismo causador da linfadenite caseosa, pode vir

a auxiliar a criação de um programa local de controle da doença e de rastreamento da mesma em nível nacional, sendo, portanto o tema principal deste trabalho.

(14)

2. OBJETIVO

O objetivo do trabalho foi caracterizar diferentes amostras de

Corynebacterium pseudotuberculosis isoladas de ovinos no Distrito federal

provenientes de diversos Estados a partir da técnica de Análise de Polimorfismos do Comprimento de Fragmentos de Restrição de locus específico com a utilização da PCR do gene 16S ribossomal.

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3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

3.1. A Ovinocultura no Mundo e no Brasil

Os rebanhos mundiais de caprinos e ovinos são de aproximadamente 898.132 mil cabeças. O Brasil detém 22.487 mil cabeças, sendo 37% de caprinos e 63% de ovinos. Em 1970 o rebanho de ovinos era da ordem de 18,3 mil animais, passando para 14,2 mil cabeças em 2001. Em termos de distribuição por região, o rebanho ovino se encontra dividido da seguinte forma: 2,8% encontram-se na Região Norte, 49% no Nordeste, 2,8% no Sudeste, 40% no Sul e 4,9% no Centro-Oeste. A Região Nordeste, detentora do maior rebanho brasileiro de ovinos, abrange uma área total de 166,2 milhões de hectares, dos quais 95,2 milhões (57%) estão inseridos na zona semi-árida. A ovinocultura se apresenta mais importante nas microrregiões do Médio Jaquaribe (CE) e Serrinha (BA). Cerca de 50% do rebanho de caprinos e ovinos do Nordeste estão localizados em propriedades com menos de 30 hectares (VASCONCELOS; VIEIRA, 2004).

A atividade de ovinocultura também oferece perspectivas de negócios aos criadores do Distrito Federal. A atividade conta hoje com um plantel de mais de sete mil cabeças, contando com um mercado seguro para a sua produção. Em 1998, o consumo de carne de carneiro foi de 291,6 toneladas, equivalentes a 25.247 cabeças, representando um consumo per capita anual em torno de 0,150kg. Este mercado se apresenta como um centro consumidor bastante

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atrativo uma vez que grande parte da população se origina do Nordeste, onde o consumo de carnes ovinas e caprinas é uma tradição, alem disso, em Brasília se concentra uma das mais elevadas rendas per capita do Brasil. Esta demanda pode ser ainda substancialmente aumentada: estima-se que pode chegar a 1.020,3 toneladas, ou 88.337 cabeças/ano (Emater, 2004).

3.2. Fatores Sanitários que Interferem com a Criação

Diferentes fatores sanitários são indicados como responsáveis pela redução da produtividade. Parasitoses ou doenças multissistêmicas como a micoplasmose, a listeriose, a artrite e encefalite caprina a vírus e a Linfadenite Caseosa são alguns deles (ROSA, 1996).

Dentre estas doenças pode ser destacada a linfadenite caseosa – também denominada “Mal do Caroço”, em virtude dos prejuízos provocados com a queda na produção de leite e do comprometimento da pele, lã e carcaça, chegando a causar uma redução de 4 a 7% na produção de lã, a qual resulta em uma perda anual de aproximadamente R$ 15 milhões para a indústria de ovinos (PATON et al, 2003).

A presença de abscessos nos linfonodos superficiais acarreta desvalorização da pele para fins industriais. Os abscessos internos podem freqüentemente provocar problemas respiratórios, hepáticos e com menor freqüência, reprodutivo e nervoso. Nestes casos, os animais apresentam-se extremamente caquéticos (ROSA, 1996).

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No Rio Grande do Sul a linfadenite caseosa se apresenta como uma doença subclínica, encontrada freqüentemente em frigoríficos, razão pela qual causa perdas econômicas por condenação total ou parcial de carcaças e pode significar uma limitante para a exportação de carne ovina. Foi observado também que a freqüência da enfermidade aumenta à medida que aumenta a idade dos animais (RIET-CORREA, 2001).

3.3. Descrição da Doença

A linfadenite caseosa ou mal do caroço é uma doença infecciosa causada por uma bactéria Corynebacterium pseudotuberculosis, manifestando-se por abscedação caseosa dos linfonodos superficiais de caprinos e ovinos. A doença é caracterizada pela formação de lesões necróticas encapsuladas ou caseosas. Comumente são afetados os linfonodos submaxilares, pré-escapulares, pré-femorais, supramamários e poplíteos, embora o agente também esteja associado a casos de mastite, pneumonia crônica, linfadenite mesentérica e pielonefrite, bem como o desenvolvimento de abscessos subcutâneos e / ou em órgãos internos. O período de incubação é cerca de três meses, (RIBEIRO et al, 2001; WALKER et al, 1994; GARCIA et al, 1987). A mobilização das fontes de infecção é como um dos principais fatores que interferem na difusão da doença.

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Desta forma pode-se caracterizar como um importante determinante epidemiológico da ocorrência da Linfadenite Caseosa, o trânsito dos animais infectados.

A infecção do homem com o C. pseudotuberculosis é considerada ocasional, e é caracterizada como zoonose ocupacional de ovinocultores, bem como de profissionais ligados à criação destas espécies. A transmissão do agente para o homem pode ocorrer pelo contato manual com material purulento procedente de abscessos de pele, linfonodos, e ocasionalmente, pela ingestão de leite de animais com mastite (RIBEIRO et al, 2001).

3.4. Prevalência da Doença e Diagnóstico

A prevalência atual da Linfadenite Caseosa em pequenos ruminantes é usualmente subestimada, porque esta não é uma doença de notificação em muitos países e também pelo fato de que os proprietários dos animais não estão conscientes dos impactos econômicos e normalmente não aplicam as orientações veterinárias para o manejo dos abscessos superficiais. Entretanto, há uma taxa de 8 a 90% de casos reportados em alguns países referente ao rebanho total (ÇETINKAYA et al, 2002).

A doença é prevalente em locais como Austrália, Nova Zelândia, Oriente Médio, Ásia, África e partes da América do Norte e da América do Sul. A linfadenite caseosa está sendo relatada mais frequentemente em países britânicos e europeus (QUINN et al, 2005).

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No Brasil os relatos mais comuns são localizados na região Nordeste com uma alta prevalência nos rebanhos de ovinos e caprinos (COSTA, 2002). A prevalência no Rio Grande do Sul, na região de Campanha, em ovinos abatidos em frigoríficos foi de 8,09% em ovelhas e 1,53% em carneiros castrados. No Rio de Janeiro foram estudados 13 rebanhos, 10 dos quais estavam infectados, com uma prevalência média de 12,2% de animais com sinais clínicos e 22,5% de animais infectados(RIET-CORREA, 2001).

O diagnóstico da doença é geralmente clínico, podendo ser também sorológico (DERCKSEN et al, 2000), através de punção aspirativa (RIBEIRO et al, 2001) ou através do cultivo do agente em meios enriquecidos, devendo a coleta ser realizada com a drenagem dos abscessos.

3.5. Caracterização do Microorganismo

O gênero Corynebacterium é constituído por bactérias Gram-positivas, pleomórficas, pequenas, que aparecem em forma cocóide, clavas ou bacilos, imóveis e não esporuladas. As corinebactérias podem se apresentar em esfregaços corados individualmente, em pares ou paliçadas e em grupos angulares semelhantes a letras chinesas. São parasitas obrigatórios das membranas de mucosas ou de pele de mamíferos e ocasionalmente podem ter outra origem. Quanto ao requerimento de oxigênio podem ser aeróbias, microaerófilas e anaeróbias facultativas. Crescem bem na maioria dos meios de cultivo, mas algumas espécies requerem meios de cultura enriquecidos com

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soro ou sangue e podem sobreviver por meses no meio ambiente. A maioria das corinebactérias são catalase – positivas, oxidase – negativa. (QUINN et al, 2005; HIRSH e ZEE, 2003; MADIGAN et al, 1997; COYLE e LIPSKY, 1990) e cresce no período de 48 a 72 horas em meio ágar sangue, formando colônias pequenas (0,5 mm de diâmetro), esbranquiçadas, ressecadas com hemólise nítida (www.nogueirafilho.com.br/corynebacterium.pdf - 24/09/04)

O C. pseudotuberculosis pode ser considerado um parasita intracelular facultativo (www.nogueirafilho.com.br/corynebacterium.pdf - 24/09/04).

Os isolados de C. pseudotuberculosis originados de animais domésticos são fenotipicamente heterogêneos, mas duas biovariedades (biovars) podem ser diferenciadas. A maioria de isolados de eqüinos reduzem nitrato em nitrito (biovar equi) enquanto as amostras de ovinos falham ao reduzir nitrato em nitrito (biovar ovis). A análise por enzimas de restrição do DNA destes grupos identifica diferenças entre isolados de biovares equi e ovis, mas as bases fenotípicas e genotípicas diferenciais para a escolha do hospedeiro de preferência do microorganismo não foram definidas (COSTA et al, 1998; SONGER et al, 1990 e SONGER et al, 1988).

3.6. Vias de Entrada e Patogenia

O patógeno penetra no organismo através de ferimentos, arranhões ou mesmo de pele intacta e alcança a linfa e atinge os linfonodos regionais. A

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partir destes, podem ocorrer infecções sistêmicas. Em menores proporções podem ser observadas as infecções por via respiratória, digestiva, genital e cordão umbilical. O C. pseudotuberculosis produz uma exotoxina, a fosfolipase D, que tem efeito vasogênico e ataca as células endoteliais, causando uma reação necro-hemorrágica e, em conseqüência da lesão vascular há um aumento da permeabilidade do vaso, que predispõe a disseminação da bactéria do local da infecção primária para outros órgãos (ROSA, 1996; PUGH, 2002).

Outra atividade atribuída a fosfolipase D é a capacidade de hidrolisar lisofosfatidilcolina e esfingomielina além de lisar eritrócitos de ovelha em sinergismo com a colesterol oxidase e a fosfolipase C (SONGER et al, 1990). Pesquisas mais recentes apontam como fatores de patogenicidade também, proteínas como a PC 40 (protease corinebacteriana com 40kDa), cuja caracterização preliminar é de serinoprotease, tem sido identificada como uma proteína imunogênica em ovinos infectados e em uma experiência a campo com preparações semipurificadas deste antígeno secretado mostrou que esta é responsável por uma alta proteção relacionada a resposta mediada por células (WILSON et al, 1995).

Após a invasão preliminar do sitio de entrada o C. pseudotuberculosis atinge o sistema linfático e, os linfonodos, que ao serem afetados ficam aumentados e exibem abscessos encapsulados característicos que, ao corte, se parecem com “anéis de cebola”. O período de incubação até o abscesso ser notado em linfonodos superficiais é tipicamente entre dois a seis meses ou

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mais. O abscesso pode romper e drenar espontaneamente, contaminando o meio ambiente (QUINN et al, 2005; SMITH E SHERMAN, 1994).

3.7. A Utilização de Técnicas Moleculares para o Estudo Genômico do Microorganismo

Diferentes técnicas moleculares foram utilizadas para caracterizar genotipicamente o C. pseudotuberculosis como a ribotipagem (SUTHERLAND et al, 1996, COSTA et al, 1998), a eletroforese de campo pulsado (CONNOR et al, 2000), reação de polimerização em cadeia (ÇETINKAYA et al, 2002) e a técnica de análise de Fragmentos de Restrição rDNA específica (VANEECHOUTTE et al, 1995).

3.7.1. Reação de Polimerização em Cadeia

A capacidade de isolar ácidos nucléicos de células em quantidade, pureza e integridade suficiente representam um requerimento essencial de praticamente todas as análises de biologia molecular e manipulações recombinantes do DNA. A reação de polimerização em cadeia (PCR) pode utilizar quantidades diminutas de ácido nucléico impuro e degradado, de tal

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forma que a simples fervura de células pode ser suficiente para liberar DNA em quantidades adequadas. A primeira etapa envolve a ruptura ou lise das células para liberar os componentes citoplasmáticos e/ou nucleares intracelulares. A segunda etapa consiste na desnaturação ou inativação de proteínas, tais como nucleases degradativas (WALKER e RAPLEY, 1999).

Todos os métodos de extração de ácido nucléico (Figura 1) são realizados a baixas temperaturas, o que reduz a atividade da proteína. Uma ampla variedade de compostos químicos que retardam a atividade da DNAse é frequentemente incluída nos tampões de extração do DNA. Assim, os agentes quelantes, citrato e EDTA (acido etilenodiaminotetracético) são comumente usados, pois removem eficazmente cátions divalentes (por exemplo, íons de magnésio), necessários às atividades de nucleases. Soluções de fenol / clorofórmio / álcool isoamílico são usados para desnaturar ainda mais as nucleases e coagular proteínas, durante extrações de DNA (WALKER e RAPLEY, 1999).

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Etapas da Extração de DNA

Lise Celular Detergente / Lisozima

Agente proteinase Proteinase K

Extração com fenol Fenol / Clorofórmio

Precipitação com álcool Etanol 70% / 100%

DNA

Figura 1 - Método de extração de ácidos nucléicos.

Assim que forem desnaturadas ou inativadas, as proteínas podem ser separadas do DNA em lisados. Estas se baseiam em extração por solvente, precipitação e / ou centrifugação. Um método de recuperação de DNA emprega a solubilidade diferencial de proteínas, lipídeos e ácidos nucléicos, no potente solvente orgânico desproteinizante fenol. Após a centrifugação do lisado / mistura com fenol, observam-se três fases: uma fase superior contendo todos os ácidos nucléicos, uma fase inferior contendo componentes hidrofóbicos da célula, por exemplo, fragmentos de membranas e organelas intracelulares e uma camada intermediária, com a proteína frequentemente concentrada na interface superior (WALKER e RAPLEY, 1999).

A maior parte dos ácidos nucléicos pode ser recuperada da fase superior. Estes devem ser removidos cuidadosamente sem alterar a interface, para

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evitar contaminação com proteínas. A solução de DNA recuperada é submetida à precipitação e lavagem com álcool, sendo o DNA ressuspendido em água deionizada estéril. Todos os traços de fenol devem ser eliminados, antes do DNA ser utilizado para analise subseqüente ou manipulação (WALKER e RAPLEY, 1999).

A amplificação cadeias simples de DNA pela PCR, proporciona suficiente DNA para análise e / ou manipulação subseqüente. A PCR replica igualmente o DNA através de ciclos repetidos em três etapas, como mostra a Figura 2, envolvendo o uso de diferentes temperaturas de reação (WALKER e RAPLEY, 1999).

3.7.2. Análise de Polimorfismo do Comprimento de Fragmentos de Restrição (RFLP) na Modalidade de RFLP locus Específico.

A PCR tem permitido um locus genético específico ser amplificado e examinado para indicar diferenças de variação em cepas. O locus específico para ser examinado é amplificado com um primer específico para o gene e submetido à análise por RFLP. Este DNA anteriormente amplificado pode ser isolado e utilizado como molde para análise de Polimorfismo do Comprimento de Fragmentos de Restrição (RFLP) na modalidade de RFLP locus específico (quando geralmente o locus a ser analisado pode ser o gene 16S ribossomal) onde microorganismos pertencentes a uma mesma espécie e subespécie, mas

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com cepas diferentes, podem ser diferenciados através desta técnica de biologia molecular que permite a observação de bandas com diferentes padrões de massa molecular, baseados em pequenas diferenças na seqüência de DNA após a digestão por enzimas de restrição e a separação dos fragmentos desta forma obtidos por eletroforese em gel de agarose com evidenciação das bandas de DNA pela coloração com brometo de etídio. A ribotipagem pode ser aplicada com sucesso para a diferenciação de cepas bacterianas que exibem um alto grau de heterogeneidade (COSTA 2002; OLIVE e BEAN, 1999).

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Figura 2 -Reação de Polimerização em Cadeia. (1) Etapa de desnaturação: As seqüências do gene alvo são tomadas disponíveis para cópia, através de desnaturação por temperatura elevada das fitas do DNA. (2) Etapa de anelamento: As extremidades da seqüência gênica particular a ser copiada são definidas pela hibridização de dois oligonucleotídeos sintéticos curtos, denominados iniciadores da amplificação. Isto possibilita a ligação subseqüente e ativação da DNA polimerase. (3) Etapa de extensão onde as seqüências gênicas específicas são copiadas, normalmente como um DNA em dupla – fita, através da adição de novas bases as extremidades 3’ livres dos iniciadores, por uma DNA polimerase. Isto é usualmente realizado a 70°C, que representa a atividade ótima da DNA polimerase (modificado, WALKER e RAPLEY, 1999).

(28)

4. MATERIAIS E MÉTODOS

Foram visitadas 11 propriedades de criação de ovinos, a maioria da raça Santa Inês, no Distrito Federal e entorno para a identificação de animais acometidos pela Linfadenite Caseosa e subseqüente coleta do conteúdo dos abscessos.

As propriedades visitadas foram escolhidas a partir de uma relação de criadores de ovinos cadastrados na ASCOB (Associação dos Criadores de Ovinos de Brasília). Nove propriedades apresentavam apriscos ao nível do solo e duas apriscos suspensos.

(29)

4.1. Coleta das Amostras

O material destinado ao isolamento foi coletado de abscessos localizados em linfonodos (Figura 4) de ovinos positivos para Linfadenite Caseosa. Foram coletadas inicialmente 34 amostras de conteúdo purulento caseoso dos abscessos.

Figura 4 - Imagem dos Linfonodos caseosos fechados.

Após a localização do animal infectado, foi realizada uma higienização da área do abscesso com água e sabão e desinfecção do local com álcool iodado para o procedimento de coleta. Os abscessos foram seccionados no sentido vertical (de cima para baixo). Para a coleta do pus (Figura 5), um swab foi introduzido no abscesso e o material coletado foi transferido para um tubo com

(30)

meio de transporte STUART® (OXOID®), produzido segundo as normas do fabricante. Após a coleta retirava-se todo o material purulento e realizava-se a limpeza interna do abscesso com pinça e gaze, retirando todo o pus restante. Como antisséptico para o interior esvaziado do abcesso foi utilizada uma solução de iodo a 10%. Recomendou-se em todas as propriedades visitadas o isolamento do animal até a completa cicatrização do processo. As amostras colhidas eram encaminhadas para o Laboratório de Microbiologia Médico Veterinária da Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária da Universidade de Brasília para a caracterização microbiológica.

(31)

A

B

D

C

Figura 5 - Etapas do procedimento das coletas. (A) localização do Abscesso. (B) Secção do Abscesso. (C) Introdução do swab para coleta do pus. (D) Eliminação do restante do material caseoso.

(32)

4.2. Cultivo e Estocagem

As amostras dos abscessos dos linfonodos foram inoculadas em meio ágar sangue (BIOBRÁS®), preparado segundo as normas do fabricante, e suplementado com 5% de sangue de ovelha desfibrinado, usando a técnica de esgotamento por estrias que facilita o crescimento de colônias isoladas e incubadas em estufa a 37ºC por 48 horas e armazenadas em meio SKIM MILK® (DIFCO®), produzido segundo as normas do fabricante.

4.3. Atividade Bioquímica

Após o crescimento bacteriano positivo, as amostras eram testadas bioquimicamente para confirmar se eram Corynebacterium pseudotuberculosis. Foram realizados testes de: catalase, oxidase, uréia, maltose, lactose, trealose, arginina, controle, gelatina, glicose, sacarose e reação de redução de nitrato.

(33)

4.4. Extração do DNA Genômico

As amostras positivas no teste bioquímico para C. pseudotuberculosis prosseguiam para o procedimento da extração de DNA. Foi utilizada para a extração do DNA genômico o protocolo de Çetinkaya et al, 2002.

As colônias selecionadas e isoladas da cultura em ágar sangue foram transferidas para um tubo de Eppendorf contendo 200 μl de água destilada. Esta suspensão foi incubada a 56°C por 30 minutos. As amostras foram tratadas depois com 200 μl de tampão TNES (20 mM Tris pH 8.0, 150 mM NaCl, 10 mM EDTA, 0.2% SDS) e proteinase K® (200 μl/ml). E em seguida foram colocadas por 30 minutos em boiling, e após foram adicionadas a mesma quantidade de fenol (saturado com Tris – HCl) à suspensão. A mistura foi agitada vigorosamente por cinco minutos na mão e depois centrifugada a 11600 g por 10 minutos. A fase sobrenadante foi transferida para outro tubo de Eppendorf e teve adicionado ácido acético (0.1 volume) e etanol (2.5 volumes) sendo então submetida a -20°C overnight para precipitar o DNA. O pellet, obtido a partir da centrifugação em alta velocidade por 10 minutos, foi lavado duas vezes com etanol 70%, cada passo intercalado com 5 minutos de centrifugação. Finalmente o pellet foi seco e ressuspendido em 30 μl de água destilada.

(34)

4.5. Reação de Amplificação e Digestão do DNA

A reação foi realizada em um termociclador com um volume de reação final de 50 μl contendo 5 μl de tampão para PCR 10X (10 mM Tris – HCl, pH 9.0, 50 mM KCl, 0.1% Triton X –100), 5 μl 25 mM MgCl2, 250 μM de cada deoxinucleotídeo trifosfato, 2 U de Taq DNA polimerase, 1 μM de cada primer e 5 μl do DNA a ser analisado. A amplificação foi obtida com 30 ciclos contendo um passo de desnaturação inicial a 94°C por 5 minutos. E cada ciclo envolve uma desnaturação a 94°C por 1 minuto, um anelamento a 56°C por 1 minuto e a síntese a 72°C por 2 minutos (ÇETINKAYA et al, 2002).

Os primers de oligonucleotídeos foram derivados de regiões conservadas presentes em cortes do 16S rDNA. A seqüência dos primers foram 5’ – ACCGCACTTTAGTGTGTGTG (forward) e 5’ – TCTCTACGCCGATCTTGTAT (reverse) (ÇETINKAYA et al, 2002).

Os produtos amplificados foram detectados pelo brometo de etídio (0.5 μg / ml) corando depois da eletroforese a 80 V por 1 hora e 30 minutos em gel de agarose 1%.

O DNA ribossomal foi digerido com endonucleases de restrição EcoRV e Hind III a 37°C por três horas e duas horas respectivamente. Os fragmentos da restrição do DNA foram separados por eletroforese em gel de agarose 1% contendo brometo de etídio (0.5 μg / ml).

(35)

5. RESULTADOS

5.1. Cultivo e Identificação Bioquímica

Após a estriagem do pus dos abscessos coletados, as placas foram incubadas a 37ºC por 48 horas em meio ágar sangue e observou-se que das 34 amostras apenas três não possuíam colônias características de

Corynebacterium pseudotuberculosis. As demais 31 amostras apresentaram

colônias pequenas, esbranquiçadas, ressecadas com hemólise nítida, como mostra a Figura 6, o que caracterizam as amostras esperadas de C.

pseudotuberculosis. Após o crescimento foi realizado um esfregaço das

colônias para a evidenciação de células Gram positivas pleomórficas, pequenas, em forma cocóide, clavas ou bacilos, imóveis e não esporuladas em esfregaços corados individualmente, em pares ou paliçadas típicas do microorganismo (Figura 7).

Figura 6 - Placa de ágar sangue com crescimento de colônias de

(36)

Figura 7 - Lâmina corada pelo método de Gram de células bacterianas em paliçada características de Corynebacterium pseudotuberculosis ao microscópio óptico (1000X).

Os testes de atividade bioquímica revelaram que todas as cepas isoladas eram catalase – positivas, oxidase – negativa e falhavam na redução de nitrato, características do Corynebacterium pseudotuberculosis. Os resultados dos demais testes realizados para confirmação bioquímica estão relacionados na quadro 1,assim como nas Figuras 8, 9 e 10.

Quadro 1 - Padrão dos testes de atividades bioquímicas realizadas com as amostras testadas. (V: crescimento variável, + : crescimento positivo e

-

: crescimento negativo).

Uréia Gelatina Maltose Lactose Glicose Sacarose Trealose Arginina Controle Nitrato

Amostras Testadas

(37)

Figura 8 - Perfil da reação de nitrato – resultado negativo para todas as amostras.

Figura 9 - Padrão não inoculado das Atividades bioquímicas: sacarose, uréia, glicose, gelatina, trealose, arginina, controle da arginina, maltose e lactose respectivamente.

(38)

Figura 10 - Perfil das atividades bioquímicas com os meios inoculados com as amostras de C. pseudotuberculosis. (sacarose, uréia, glicose, gelatina, trealose, arginina, controle da arginina, maltose e lactose respectivamente).

5.2. Extração Genômica e PCR

Com as 31 amostras já caracterizadas como Corynebacterium

pseudotuberculosis foi realizado o processo de extração de DNA para a

obtenção do DNA genômico bacteriano utilizado para posterior Reação de Polimerização em Cadeia (Figura 11). Seguindo o protocolo, já descrito, foi obtida a amplificação de 22 amplicons (equivalentes ao gene 16S ribossomal DNA) dentro do total das 31 amostras utilizadas (Figura 12). Estes amplicons receberam o número correspondente a amostra da qual se originaram para facilitar a identificação.

(39)

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 Bandas da extração de DNA genômico A 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 26 M Bandas da extração de DNA genômico B

Figura 11 (A e B) - Confirmação da extração do DNA genômico. Gel de Agarose 1 % contendo bandas de DNA genômico extraídas das 31 amostras numeradas respectivamente pelas linhas correspondentes. M – marcador 1kb DNA ladder (Promega®).

(40)

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 818 pb A 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 M 818 pb B

Figura 12 (A e B) - Reação de Polimerização em Cadeia (PCR) das amostras testadas. Gel de agarose a 1% contendo amplicons de uma reação de PCR com primers específicos para o gene 16S. M – marcador 1kb DNA ladder (Promega®) e linhas 1 a 31 representam amostras de mesmo número. Observa-se que as amostras contidas nas linhas 1, 5, 6 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 18, 19, 20, 21, 24, 28, 29, 30, 31 foram amplificados, ao contrário das amostras 2, 3,4,17, 22, 23, 25, 26 e 27 .

(41)

5.3. Análise de Restrição de Fragmentos de Polimorfismo em locus Específico

O gene 16S ribossomal do DNA das 22 amostras amplificadas foi digerido com endonucleases de restrição Eco RV e Hind III a 37°C por três horas e duas horas respectivamente. Foi possível observar diferentes perfis de restrição obtidos na digestão (Figuras 13 e 14).

Os vinte e dois amplicons obtidos com a utilização dos primers específicos, foram submetidos à digestão pelas enzimas EcoRV e Hind III. A partir da análise dos fragmentos obtidos nesta digestão com EcoRV e Hind III observou-se a presença de dois padrões entre as amplificações; um deles onde o fragmento amplificado não foi digerido (1, 9, 10, 11, 12, 18, 21, 24) pela enzima EcoRV (Figura 13) e outro padrão, cuja digestão mesmo parcial originou dois fragmentos de 506 pb e 312 pb (6, 7, 8, 13, 14, 18, 19, 28, 29, 30, 31). A digestão com Hind III não apresentou perfis de digestão diferentes entre os amplicons (Figura 14).

(42)

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 818 pb 506 pb 312 pb 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 M A 818 pb 506 pb 312 pb B

Figura 13 (A e B) – Digestão do gene 16S com a enzima EcoRV. Gel de agarose 1% apresentando a digestão das amostras amplificadas anteriormente com a enzima EcoRV. M – marcador 1kb DNA ladder (Promega®). Observa-se que os amplicons 6, 7, 8, 13, 14, 18, 19, 28, 29, 30, 31 foram digeridas liberando três fragmentos correspondendo a 818 pb, 506 pb, 312 pb. A amostra 1 não foi digerida pela enzima assim como 9, 10, 11, 12, 18, 21, 24.

(43)

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 A 818 pb 546 pb 272 pb 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 M 818 pb 546 pb 272 pb B

Figura 14 (A e B) - Digestão do gene 16S com a enzima Hind III. Gel de agarose 1% apresentando a digestão das amostras amplificadas anteriormente com a enzima Hind IIII. M – marcador 1kb DNA ladder (Promega®). Observa-se que as amostras 1, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 17, 18, 19, 28, 29, 30, 31 foram digeridas liberando três fragmentos correspondendo a 818pb, 546 pb, 272 pb.

O quadro 2 resume os resultados nos procedimentos realizados com todas as amostras testadas.

(44)

Quadro 2 – Resultados das amostras em todos os procedimentos realizados. Amostras Cultivo Extração

de DNA

PCR Digestão EcoRV

Digestão Hind III

01 Positivo Positivo Positivo Negativo Positivo

02 Positivo Positivo Negativo --- --- 03 Positivo Positivo Negativo --- --- 04 Positivo Positivo Negativo --- --- 05 Negativo --- --- --- ---

06 Positivo Positivo Positivo Negativo Negativo

07 Positivo Positivo Positivo Positivo Positivo

18 Positivo Positivo Negativo --- ---

23 Positivo Positivo Negativo --- --- 24 Positivo Positivo Negativo --- ---

26 Positivo Positivo Negativo --- --- 27 Positivo Positivo Negativo --- --- 28 Positivo Positivo Negativo --- ---

33 Negativo --- --- --- --- 34 Negativo --- --- --- ---

(45)

6. DISCUSSÃO

Embora Pimentel (2004), em informação pessoal, cite que a origem da maior parte dos rebanhos do Distrito Federal serem dos estados da Bahia e Sergipe, a criação de ovinos no Distrito Federal não está devidamente organizada quanto ao controle da origem dos animais que estão formando o plantel do DF, ou seja, os registros de compra dos animais não existiam em nenhuma das propriedades visitadas. Isto impossibilitou a construção de um mapa epidemiológico comparativo com a relação da incidência da doença com a origem do animal, buscando assim a origem de um foco disseminador, onde poderíamos instalar uma provável barreira sanitária contra a infecção de um estado com poder de disseminação maior. Não foi possível uma comparação entre a incidência da patologia e a origem dos animais entre estados diferentes.

Também não foi possível estabelecer uma correlação entre diferentes tipos de apriscos e a disseminação da doença, ou seja, algumas propriedades possuíam aprisco suspenso enquanto em outras, o rebanho era criado em piquetes abertos ou em apriscos ao nível do solo. A maior parte das propriedades tinham em comum uma produção coletiva de animais, ou seja, no mesmo ambiente os ovinos tinham contato com aves, bovinos, canídeos e outras espécies. E sem controle das enfermidades nas propriedades.

Pôde ser constatado que o manejo diferenciado entre as propriedades analisadas não reduz a incidência do desenvolvimento da doença no plantel.

(46)

Este variava desde um aprisco arejado com tamanho suficiente para a demanda por cabeça e higienização adequada até propriedades sem estrutura de aprisco, apenas com um cercado, apertado para a demanda de animais e sem higienização necessária. Não havia o cuidado de isolar os animais infectados e os curados dos demais. Desta forma variando do mais sofisticado ao de pior estrutura observou-se uma casuística presente em todas as propriedades visitadas constatando um descaso sobre o controle da infecção. Das trinta e quatro amostras coletadas, três não obtiveram crescimento, e trinta e uma amostras foram classificadas como colônias de Corynebacterium

pseudotuberculosis, com células bacterianas com morfologia característica em esfregaços corados pela coloração de Gram. Os testes bioquímicos caracterizando todas as amostras como Corynebacterium pseudotuberculosis biovariedade ovis foram realizados e para assegurar a ausência de amostras de Corynebacterium pseudotuberculosis biovariedade equi, entre as cepas testadas foi incluído o teste de redução de nitrato (cujo resultado é negativo para o Corynebacterium pseudotuberculosis biovariedade ovis) (SUTHERLAND et al, 1996).

A utilização de PCR e a utilização concomitante da técnica de análise de polimorfismos do Comprimento de Fragmentos de Restrição de locus específico vêm sendo usadas não só para caracterizar a espécie, mas também para permitir a diferenciação entre cepas, sendo por isso escolhida para este trabalho.

Das 31 amostras analisadas, apenas 22 (70%) foram amplificadas, obtendo-se um resultado diferente de ÇETINKAYA et al (2002), que utilizando

(47)

os mesmos primers, conseguiram a amplificação de um amplicon de 818 pb de todas as amostras testadas. O C. pseudotuberculosis biovariedade equi não foi amplificado no trabalho de ÇETINKAYA et al (2002).

Nestas 22 amostras amplificadas encontrou-se tipos de diferentes perfis de restrição pelas enzimas Eco RV e Hind III onde amostras não digeridas por EcoRV são visíveis na figura 13 e podem caracterizar prováveis mutações pontuais no gene 16S rDNA.

Os primeiros estudos de caracterização genética do Corynebacterium

pseudotuberculosis foram realizados por Songer et al (1988) com a utilização

de análise de restrição por endonucleases no genoma total do microorganismo. Neste estudo foi encontrada a principal diferença entre os diversos isolados de

Corynebacterium pseudotuberculosis o qual consiste em duas biovariedades

da espécie (equi e ovis), não obtendo dentro da biovariedade ovis nenhuma diferença visível, divergindo desta forma dos resultados encontrados neste experimento onde se obteve três diferentes perfis de cepas para as amostras de C. pseudotuberculosis biovariedade ovis, dois pela digestão com EcoRV e um com Hind III.

Vaneechoutte et al (1995) também em análises de restrição de rDNA amplificado do gene 16S rDNA pertencente a diferentes espécies de corinebactérias, encontraram apenas diferenças visíveis entre os dois biovares

equi e ovis.

Literák et al (1999) encontraram nos seus estudos de ribotipagem de 10 isolados de Corynebacterium pseudotuberculosis uma homogeneidade nas amostras, onde não houve diferenciação dos padrões genotípicos.

(48)

Embora com técnicas diferentes (foi utilizada a eletroforese de campo pulsado), Connor et al (2000) foram os únicos a observar diferenças, definindo seis “pulsotipos” do microorganismo e atribuindo esta diferenciação a possíveis mutações pontuais ou por inserção ou deleção de nucleotídeos como foi atribuído aos resultados encontrados neste trabalho pela identificação de diferentes perfis de restrição caracterizando prováveis mutações pontuais no gene 16S rDNA do C. pseudotuberculosis biovariedade ovis.

(49)

7. CONCLUSÃO

A identificação de Corynebacterium pseudotuberculosis é passível de ser obtida através das suas características morfológicas e de crescimento em determinados meios de cultura (pelo seu padrão de crescimento) auxiliados por provas bioquímicas. No caso de diferenciação entre cepas ou de evidenciar cepas epidemiologicamente relacionadas, se fazem necessários métodos de biologia molecular. Em especial neste experimento foi possível a identificação e caracterização de três diferentes perfis de cepas, dentre microorganismos classificados como Corynebacterium pseudotuberculosis biovariedade ovis, nos quais a genotipagem se torna essencialmente útil quando se pretende eleger uma cepa vacinal ou ainda quando se pretende controlar a disseminação de um determinado foco da doença em uma região, já que as vacinas comerciais não têm conseguido atingir a imunidade específica.

A conscientização deste problema de sanidade animal é fundamental para que sejam tomadas medidas adequadas visando diminuir os prejuízos por ela causados, considerando o impacto econômico desta doença é necessário ter precauções, tal como o desenvolvimento de programas efetivos de vacinação e estratégias alternativas de controle. A tentativa deve ser realizada para se obter suporte aos fazendeiros e cooperação em diminuir a disseminação.

(50)

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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