I AVALIAÇÃO MICROBIOLÓGICA DOS BIOFILMES METANOGÊNICOS DESENVOLVIDOS EM DIFERENTES SUPORTES INERTES NUM MESMO REATOR ANAERÓBIO DE LEITO FIXO

I-039 - AVALIAÇÃO MICROBIOLÓGICA DOS BIOFILMES

METANOGÊNICOS DESENVOLVIDOS EM DIFERENTES SUPORTES

INERTES NUM MESMO REATOR ANAERÓBIO DE LEITO FIXO

Aurélio Pessôa Picanço(1)

Engenheiro Sanitarista formado pela Universidade Federal do Pará (UFPA). Mestre em Hidráulica e Saneamento pela Escola de Engenharia de São Carlos da Universidade de São Paulo (EESC - USP). Doutorando em Hidráulica e Saneamento na EESC - USP.

Eloisa Pozzi Gianotti

Graduada em Ecologia. Curso de Especialização em Biologia Sanitária no CRHEA -EESC – USP. Mestre em Hidráulica e Saneamento pela Escola de Engenharia de São Carlos. Doutora em Ecologia e Recursos Naturais pela Universidade Federal de São Carlos - UFSCar e Pesquisadora do Departamento de Hidráulica e Saneamento da EESC - USP.

Carlos Eduardo Blundi

Químico Licenciado em Bacharel pelo Instituto de Química da UNESP - Araraquara - SP. Engenheiro Civil pela Faculdade de Engenharia Civil de Araraquara - SP. Mestre em Hidráulica e Saneamento pela Escola de Engenharia de São Carlos - Universidade de São Paulo - EESC/USP - São Carlos - SP. Doutor em Hidráulica e Saneamento pela EESC/USP - SP. Prof. Doutor do Departamento de Hidráulica e Saneamento da EESC/USP - São Carlos - SP.

Endereço(1): Universidade de São Paulo - Escola de Engenharia de São Carlos - Departamento de Hidráulica e

Saneamento - Av. dos Trabalhadores São-carlenses, 400 - Centro - CEP: 13566-590 - São Carlos - SP - Brasil - Tel: (16) 273-9560 - e-mail: picanco@sc.usp.br

RESUMO

Nesse trabalho são apresentados os resultados de estudo da caracterização dos biofilmes metanogênicos que desenvolveram-se integralmente e simultaneamente em quatro suportes inertes diferentes, num mesmo reator anaeróbio de leito fixo, sendo eles: cloreto de polivinila (PVC), espuma de poliuretano, tijolo refratário e cerâmica porosa. A porosidade tem papel fundamental na retenção da biomassa, sendo que a espuma de poliuretano seguido da cerâmica porosa apresentaram a maior quantidade de sólidos voláteis imobilizados, confirmando a influência da superfície específica, proporcionada pela porosidade, na imobilização do biofilme. Os exames microbiológicos revelaram uma distinção na colonização dos suportes, ocorrendo predominância de arqueas metanogênicas semelhantes a Methanosaeta no suportes cerâmicos (tijolo refratário e na cerâmica especial porosa), de Methanosarcina no suportes poliméricos (PVC e na espuma de poliuretano).

PALAVRAS-CHAVE: Biofilme, Materiais Suportes, Arqueas Metanogênicas, Methanosaeta sp., Methanosarcina sp.

INTRODUÇÃO

Novas tecnologias buscam soluções eficientes e de custo compatível, para minimizar o grande problema gerado pela lançamento de despejos domésticos e industriais em corpos de água receptores, visto que a legislação torna-se cada vez mais exigente devido à escassez crescente desses recursos e a busca do desenvolvimento sustentado.

Os processos biológicos de tratamento quase sempre são a melhor alternativa. A capacidade de tratamento em sistemas anaeróbios é basicamente determinada pela concentração da população ativa de microrganismos retida no reator. O filtro anaeróbio é um sistema de tratamento desenvolvido para favorecer a imobilização e aderência de biomassa, alcançando bons resultados na remoção de matéria orgânica. Contudo, vários fatores interferem na aderência de biomassa no suporte em reatores de leito fixo, sendo alguns deles: forma, tamanho, porosidade, superfície específica, natureza do sólido suporte e suas cargas eletrostáticas.

Nos diferentes estágios da colonização do biofilme nos suportes é importante a presença e o tamanho médio de seus micro e macros poros, onde a biomassa adere. A presença de poros e reentrâncias na superfície do material suporte, proporcionam um ambiente menos turbulento para os microrganismos, favorecendo assim a formação inicial do biofilme (VERRIER et al., 1988). Segundo INCE (1999), filtros anaeróbios com suportes de alta porosidade e superfície específica, apresentam melhores rendimentos do que os reatores com suporte convencional, tanto na partida quanto no equilíbrio do sistema.

Estudos comparativos da biomassa ativa entre vários materiais utilizados como suportes em reatores anaeróbio de leito fixo têm sido realizados, a maioria deles operando reatores individualizados para cada suporte ou através de ensaios em batelada (FOX et al., 1990; YEE et al., 1992). Contudo, em estudos mais recentes, diferentes suportes estão sendo colonizados por microrganismos simultaneamente no interior de um mesmo reator, sob as mesmas condições operacionais (temperatura, composição de substrato e regime operacional), favorecendo assim a comparação entre os materiais suportes (VALLERO, 1999; ALVES et al., 1999).

Esse estudo foi realizado para verificar a influência dos materiais suportes no crescimento e retenção da biomassa. Utilizando recursos de microscopia óptica, fluorescência e eletrônica de varredura, examinar as principais morfologias celulares integrantes dos biofilmes e as possíveis influências desses materiais suportes na forma de colonização dos microrganismos.

MATERIAIS E MÉTODOS INSTALAÇÃO EXPERIMENTAL

O reator apresentado nesse trabalho foi desenvolvido com base em estudos realizados por KENNEDY & DROSTE(1986), entretanto com mudanças significativas, devido a dificuldade de coletar o biofilme aderido ao material suporte em diferentes alturas, como também os grânulos e flocos em suspensão.

Foi utilizado um reator anaeróbio com volume total de 34,5 L e construído em PVC, com diâmetro de 200 mm e 1,20 m de altura, sendo 28,8 litros o volume útil do reator e 5,7 litros reservados à separação da fase gasosa (16,5% do volume total), operado com um TDH de 24 h (Figura 1) em câmara climatizada. O gás gerado no reator foi encaminhado para um sistema de medição por deslocamento, composto de um frasco tipo Mariotte, um copo tipo “becker” e uma proveta graduada de 1000 ml.

No interior do reator foram fixadas 16 hastes metálicas (aço inoxidável). Em cada haste foram presos 4 suportes distintos (cloreto de polivinila, o PVC, espuma de poliuretano, tijolo refratário e cerâmica porosa), distantes entre si de 3,5 cm. Foram retirados suportes de diferentes alturas das hastes metálicas (ponto 1: 30 cm do fundo do reator; ponto 2: 36,5 cm do fundo do reator), com o objetivo de avaliar-se o efeito dessa diferença de altura na quantificação da biomassa dos suportes.

Este reator foi instalado em uma câmara climatizada a temperatura de 30°C ± 1o

C, no Laboratório de Processos Biológicos do Departamento de Hidráulica e Saneamento da Escola de Engenharia de São Carlos, Universidade de São Paulo.

1 Reator anaeróbio de fluxo ascendente e leito fixo; 2 Bomba dosadora;

3 Válvula de controle de entrada; 4 Descarga de fundo;

5 Zona de lodo suspenso; 6 Suportes inertes; 7 Amostradores laterais; 8 Placas perfuradas;

9 Tubo perfurado para coleta do efluente; 10 Sifão;

11 Mangueira condutora de gás; 12 Frasco tipo “Mariotte”;

13 Proveta Graduada.

Figura 1. Esquema do reator anaeróbio de leito fixo.

MEIOS SUPORTES

Foram selecionados dois diferentes materiais como suportes inertes: material polimérico e material cerâmico, sendo esses materiais de diferentes porosidades. Os suportes foram: PVC (material polimérico de baixa porosidade), espuma de poliuretano (material polimérico de alta porosidade), tijolo cerâmico refratário (material cerâmico de baixa porosidade) e cerâmica porosa.

Os suportes possuíam dimensões semelhantes: forma cilíndrica com altura de 3 cm, diâmetro interno de 0,8 cm e diâmetro externo de 2,1 cm. Foi feita uma distribuição do conjunto haste/suporte de forma eqüitativa no interior do reator, de maneira a obter-se resultados comparativos mais representativos. Com o reator em funcionamento esses módulos, haste/suporte, são fundamentais para a retirada dos biofilmes aderidos aos suportes. As características dos materiais suportes estão descritas na Tabela 1.

Tabela 1. Características dos Materiais Suportes.

MATERIAL

ESPUMA DE

POLIURETANO

PVC

CERÂMICA

POROSA

TIJOLO

REFRATÁRIO

Textura da superfície

poroso

liso

Poroso

liso

Forma

Cilíndrica

Cilíndrica

Cilíndrica

Cilíndrica

Diâmetro Externo

2,1 cm

2,1 cm

2,1 cm

2,1 cm

Diâmetro Interno

0,8 cm

0,8 cm

0,8 cm

0,8 cm

Altura

3,0 cm

3,0 cm

3,0 cm

3,0 cm

Porosidade

92,0 %

1,5%

64,0%

35,0%

Após 149 dias de operação do reator, amostras dos quatro suportes foram retiradas simultaneamente para a caracterização da biomassa aderida através de exames microscópicos, distinguindo-se as principais morfologias celulares presentes nos biofilmes aderidos a tais materiais suportes.

Um microscópico para exames biológicos (Olympus BHT 2) equipado com contraste de fase e fluorescência foi utilizado para a observação dos biofilmes. A técnica de fluorescência utilizada para identificação das células metanogênicas, uma vez que as arqueas metanogênicas são facilmente identificadas pela autofluorescência a 420 ηm (ROBINSON et al. 1984; GROTENHUIUS et al. 1991; ZELLNER et al. 1991). As células foram raspadas dos suportes e enxaguadas com água destilada, gotas do líquido resultante foram fixadas em gel ágar (2%).

A microscopia eletrônica de varredura (MEV) foi realizada em microscópico Zeiss DSM-960. As amostras foram fixadas com glutaraldeido a 2,5% por 12 horas. Após esse período as células foram lavadas com solução tampão e posterior desidratação com soluções de etanol em concentrações crescentes (50%, 70%, 80%, 90%, 95% e 100%) e finalmente fixadas em hexametildisilazano por 30 segundos. A preparação das amostras para MEV está descrita em NATION (1983) adaptado por ARAÚJO (1995).

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Os suportes retirados para o exame microscópico óptico foram removidos da parte inferior do reator, ponto 1 e para a microscopia eletrônica de varredura, do ponto 2. Contudo, acreditou-se que essa variação de altura não influenciou a caracterização das morfologias celulares no interior do reator. Os suportes encontravam-se sob as mesmas condições operacionais.

Com relação ao exame do biofilme em microscópico óptico de contraste de fase dos quatro materiais suportes, não foi constatada diferença entre as principais morfologias celulares. Verificou-se a ocorrência de bacilos, cocos, diplococos não fluorescentes e células metanogênicas semelhantes a Methanosaeta e Methanosarcina (Figura 2).

(a) (c)

(b) _(d)

Figura 2. Fotomicrografia dos biofilmes dos suportes: a) bacilos, cocos e células semelhantes a Methanosarcina na espuma de poliuretano (1000x); b) Células semelhantes a

Methanosaeta e Methanosarcina no PVC (1000x); c) Bacilos, diplococos, Methanosaeta e Methanosarcina na cerâmica especial porosa (1000x); d) Methanosaeta e Methanosarcina

no tijolo refratário (1000x).

Através da microscopia de varredura, com a observação do biofilme íntegro aderido aos materiais suportes, foi verificada a ocorrência e predominância de algumas morfologias. Considerando as arqueas metanogênicas, nos materiais poliméricos (espuma de poliuretano e o PVC), predominaram as estruturas celulares semelhantes a Methanosarcina (Figura 3: a e b), fixadas na parede do suporte em agrupamentos não uniformemente distribuídos. Nos materiais cerâmicos (cerâmica porosa e o tijolo refratário), houve predominância de células semelhantes a Methanosaeta (Figura 4: c e d). A cerâmica porosa apresentou colonização mais uniforme dos microrganismos, praticamente unindo seus poros (Figura 4 c), quando comparada com os demais suportes. O suporte tijolo refratário, também apresentou essa distribuição, porém com menor evidência.

Ince et al. (1999) desenvolveram trabalho sobre resistência, influência da porosidade média e aderência da biomassa nos suportes de um filtro anaeróbio tratando esgoto sanitário. A investigação microscópica mostrou que o número de microrganismos metanogênicos autofluorescentes variou entre 15-28% do número total de bactérias ao longo do filtro anaeróbio. Predominaram as arqueas metanogênicas semelhantes a

Methanococcus, seguida de bacilos curtos, bacilos longos, filamentosas e Methanosarcina. MURRAY &

VAN DEN BERG (1981); PÉREZ et al.(1992); URRUTIA et al. (1998) citam a alta capacidade da argila em aderir microrganismos anaeróbios, particularmente a morfologia filamentosa, possivelmente devido às características do material. A sua superfície áspera, com grande quantidade de rachaduras e fendas, favoreceu a aderência e acumulo de Methanosaeta.

(a) (c)

(b) (d)

Figura 3 – . Fotomicrografia eletrônica de varredura dos suportes poliméricos e cerâmicos: a) Tipo de imobilização da biomassa na espuma de poliuretano com ampliação para melhor visualização das células semelhantes a Methanosarcina (50x/3000x); b) Imobilização da biomassa no PVC e ampliação das células semelhantes a Methanosarcina (200x/3000x); c) ) Tipo de imobilização da biomassa nos suportes com predominância de células semelhantes a

Methanosaeta (200x) na cerâmica especial porosa; d) Tipo de imobilização da biomassa nos

suportes com ampliação para visualização dos diplococos e Methanosarcina (200x/3000x) no tijolo refratário.

CONCLUSÕES

Através do exame microscópico da biomassa aderida nos suportes estudados, foi verificada diferença entre as arqueas metanogênicas colonizadoras. Nos suportes poliméricos predominaram as células semelhantes a

Methanosarcina, aderidas de forma isolada e pontual, junto à parede do suporte. Nos cerâmicos,

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