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Trabalho apresentado no 3º Simpósio Internacional sobre Caprinos e Ovinos de Corte - 3º SINCORTE, em João Pessoa, Paraíba, Brasil, Novembro 2007
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Caroata Genética – Eng. São João s/n – Várzea – CEP 50.741-520 – Recife/PE – Brasil e Instituto Caroatá – Caixa Postal 121 – CEP 55.641-970 – Gravatá/PE – Brasil. E-mail: gustavo@caroata.com.br
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Biotécnicas da reprodução assistida em pequenos ruminantes
2Gustavo Ferrer Carneiro
INTRODUÇÃO
c a p r i n o - o v i n o c u l t u r a r e p r e s e n t a u m g r a n d e p o t e n c i a l p a r a
A
desenvolvimento econômico e vem apresentando um ciclo de crescimento mundial. Esse crescimento tem sido intensificado, sobretudo nos países em desenvolvimento, nos últimos anos, que são detentores dos maiores rebanhos (Fonseca, 2006). Para a c e l e r a r o c r e s c i m e n t o d a produtividade, aliada ao melhoramento genético, pode-se vislumbrar a utilização de biotécnicas da reprodução como a sincronização do estro, a inseminação artificial e a transferência de embriões. O uso dessas técnicas permite um avanço considerável no progresso genético reduzindo assim o intervalo de gerações chegando as técnicas mais modernas de produção in vitro a partir de animais pré-púberes ou através da alteração do genoma animal utilizando-se tecnologias de ultima geração tais como a transgenia e clonagem (Baldassare, 2007). Estas técnicas possibilitam ainda uma maximização reprodutiva da fêmea, explorando todo seu potencial b i o l ó g i c o , e x t r a p o l a n d o a s possibilidades naturais, e contribuindo para a disseminação de animais geneticamente superiores (Simplício et al., 2007). Dentro dessa perspectiva, há uma necessidade da aplicação de técnicas de reprodução assistida com o objetivo de aumentar a eficiência reprodutiva e produtiva do rebanho p a r a q u e p o s s a h a v e r u m aproveitamento mais eficiente dos genótipos utilizados.
As técnicas de reprodução assistida como inseminação artificial (IA) e transferência de embriões foram introduzidas na indústria caprina e ovina com os objetivos principais de acelerar o ganho genético de animais superiores e de superar alguns obstáculos de eficiência reprodutiva (Smith, 1986).
A produção in vitro nos pequenos ruminantes tem uma importância fundamental principalmente devido à produção de material para pesquisa básica a um baixo custo. Estes estudos possibilitam a introdução comercial de biotecnologias de ponta como transferência nuclear e produção de transgênicos (Cognié et al., 2003).
O objetivo deste trabalho foi realizar uma revisão das diversas técnicas de reprodução assistida avaliando as perspectivas do uso da biotecnologia e seu impacto na indústria como um todo.
SINCRONIZAÇÃO DO CIO E DA OVULAÇÃO
A sincronização do cio constitui um passo primordial para o êxito de todas as técnicas de reprodução assistida. O m é t o d o m a i s d i f u n d i d o d e sincronização de cio é baseado no uso d e d i s p o s i t i v o s a b a s e d e progestágenos. Estes dispositivos podem ter a forma de esponjas i n t r a v a g i n a i s i m p r e g n a d a s e m p r o g e s t á g e n o s ( A c e t a t o d e Medroxiprogesterona, Acetato de F l u o g e s t e r o n a ) ; d i s p o s i t i v o s intravaginais de liberação controlada – CIDR, impregnados com progesterona; ou implantes subcutâneos de silicone impregnados com o progestágeno Norgestomet (Evans & Maxwell, 1987;
Freitas et al., 1997; Chemineau et al., 1999). Em qualquer um dos casos o protocolo básico consiste na colocação do dispositivo por um período entre 9-11 dias associados a uma aplicação de uma prostaglandina (ou análogo sintético) entre 0 e 48 horas antes da retirada do dispositivo, o que permite assegurar que o animal não apresente um corpo lúteo ativo no momento da retirada do dispositivo. A utilização de protocolos longos, quando dispositivos são deixados por um espaço de 18-21 dias, também é descrito e nesse caso n ã o r e q u e r u t i l i z a ç ã o d e prostaglandina. Tanto para o caso de IA como para sincronização de receptoras de embriões, se administra 250-500 UI de gonadotrofina coriônica eqüina (eCG) próximo ao momento da retirada do dispositivo de sincronização. Nos casos de IA, deve-se sempre tomar cuidado com as dosagens em virtude do efeito superovulatório e nascimento de múltiplas crias que pode acarretar em problemas durante o parto ou dificuldade da mãe em criá-las. A dose deve considerar diversos fatores tais como raça, peso, idade, usos anteriores, visto que se trata de droga de grande p e s o m o l e c u l a r e a l t a r e a ç ã o imunogênica (Roy et al., 1999; Drion et al., 2001).
INSEMINAÇÃO ARTIFICIAL (IA)
O sucesso da IA se deve a sua relativa simplicidade e sua capacidade de aumentar significativamente a produtividade da progênie quando se utilizam reprodutores devidamente selecionados a partir de testes de progênie (Evans & Maxwell, 1987).
A transferência de embriões possibilita a multiplicação de indivíduos geneticamente superiores. Permite também a redução do intervalo entre gerações por possibilitar a colheita de embriões de fêmeas jovens e pré-púberes (Salles et al., 2000). Uma das barreiras para a eficiência do tratamento superovulatório diz respeito à variabilidade individual da doadora e m r e l a ç ã o à e f i c i ê n c i a d a s g o n a d o t r o f i n a s e x ó g e n a s n o recrutamento, crescimento, maturação e ovulação dos folículos (Cognié et al., 2003).
A variabilidade de resposta aos tratamentos hormonais ainda é uma questão a ser analisada. A partir de e s t u d o s c o m u l t r a - s o n o g r a f i a (Gonzáles-Bulnes et al., 2002) e endoscopia (Brebion et al., 1992) observou-se que a variabilidade de resposta está intimamente relacionada com a presença de folículos antrais (2-3 mm) nos ovários e que os resultados negativos no número de embriões transferíveis é diretamente afetado pela presença de grandes folículos (> 6 mm) quando do início do tratamento superovulatório (Cognié et al., 2003). Cognié et al. (2003) destacam o uso de agonistas e antagonistas do hormônio liberador das gonadotrofinas (GnRH) associado ao progestágenos com o objetivo de suprimir a liberação endógenas destas gonadotrofinas. Dessa maneira, esse grupo testou um pré-tratamento de 2 semanas com um agonista (Buserelina, 40 µg/dia, Receptal®) ou 10 dias com um antagonista (Antarelix®, 0.5 mg/dia, Te v e r e l i x ® ) . O s r e s u l t a d o s demonstraram uma diminuição dos folículos maiores, um aumento no número dos folículos menores e um conseqüente aumento na resposta do FSH em até 50% (Brebion et al., 1992; Cognié, 1999).
Um outro problema a ser transposto diz respeito à formação de anticorpos anti-FSH de origem suína após sucessivas administrações destas
TRANSFERÊNCIA DE EMBRIÕES (TE)
gonadotrofinas no protocolo de superovulação com conseqüente diminuição na resposta ovariana. Outro desafio é com relação à variabilidade individual entre as doadoras e a incidência de regressão luteínica precoce principalmente na espécie caprina interferindo negativamente na taxa de recuperação embrionária e na qualidade e viabilidade dos embriões (Simplício & Santos, 2000). Esta regressão precoce dos corpos lúteos pode ser prevenida com a utilização de inibidores da síntese de prostaglandina (Traldi et al., 1995; 1995; Salles et al., 1996). A utilização dessas drogas no dia da ovulação e no dia da recuperação embrionária permite uma redução considerável na regressão prematura de CL (Battye et al., 1988) e um aumento no número de embriões transferíveis por fêmea tratada (Traldi, 1995).
PRODUÇÃO IN VITRO
?A produção in vitro de embriões de pequenos ruminantes tem despertado um grande interesse científico em virtude da disponibilidade de material para pesquisa a um relativo baixo custo além de estas espécies serem um excelente modelo para aplicação da transgênese. Os métodos de produção in vitro de embriões envolvem:
?Maturação de oócitos primários provenientes de folículos antrais. ?Fertilização de oócitos maturos com
espermatozóides capacitados. ?Cultivo de embriões in vitro por até
uma semana atingindo o estágio de b l a s t o c i s t o p a r a p o s t e r i o r transferência para receptoras sincronizadas ou criopreservação para uso posterior.
Maturação in vitro
Maturação in vitro (MIV) e fertilização in vitro (FIV) têm sido rotineiramente utilizada na espécie humana e em várias outras espécies domésticas. Apesar da produção in vitro ser documentada em pequenos ruminantes (Chauan et al., 1991; DeSmedt et al., 1992; Hanada,
1985; Keskintepe et al., 1994; Tervit et al., 1972; Younis et al., 1991), os resultados de cultivo in vitro apresentam um avanço limitado e esta técnica ainda não é utilizada como rotina nessa espécie. O sistema de maturação de oócitos mais utilizados nos ruminantes domésticos trata-se de meio de cultivo básico suplementado com FSH, LH, estradiol e 10% de soro fetal bovino. A adição de diferentes suplementos aos meios de cultivo tem sido largamente utilizada. Fluido folicular foi utilizado com relativa eficiência, com exceção de fluido folicular proveniente de folículos atrésicos. Os efeitos moleculares que mediam a influência positiva destes suplementos não estão completamente esclarecidos, mas dados recentes (Carneiro et al., 2003) suportaram o possível envolvimento dos fatores de crescimento influenciando na MIV. Gonadotrofinas são reconhecidamente reguladores da maturação nuclear de oócitos em mamíferos.
O u t r o s f a t o r e s a l é m d a s g o n a d o t r o f i n a s t a m b é m e s t ã o e n v o l v i d o s n o p r o c e s s o d e foliculogênese. Dentre estes, o insulin-l i k e g r o w t h f a c t o r - I ( I G F - I ) demonstrou importante papel na maturação in vivo (Carneiro et al., 2002) e efeito positivo na maturação nuclear e citoplasmática in vitro em diversas espécies (Carneiro et al., 2001). Além disso, é reportado que o IGF-I aumenta os índices de formação de blastocisto obtidos através de FIV em bovinos (Herrler et al., 1992; Lorenzo et al., 1993) e em coelhos (Herrler et al., 1998). Com base nesses estudos desenvolvemos um trabalho para estabelecer um sistema de maturação in vitro testando a influência da adição de IGF-I ao meio de cultivo. C o m o r e s u l t a d o s , o b s e r v a m o s diferença estatisticamente significativa nas taxas de maturação nuclear em concentrações superiores a 100 ng/mL. Os resultados estão resumidos na Tabela 1, os quais demonstram que O IGF-I em concentração superior a 100 ng/mL influencia positivamente a maturação in vitro de oócitos caprinos.
P < 0.05 para sobrescritos de letras diferentes na mesma coluna.
Tabela 1. Efeito de diferentes
concentrações de IGF-1 na maturação nuclear de oócitos caprinos durante 28 horas. 0 50 100 200 400 78 46 110 110 92 32 (41,02%) a 18 (39.13%) a 64 (58,18%) b 74 (67.27%) b 60 (65,21%) b Tratamento (ng/mL) Número de Oócitos Metáfase - II Fertilização in vitro Em 1984, Rao e colabores documentaram os primeiros casos de fertilização in vitro (FIV) em caprinos usando espermatozóide capacitado e fertilizado em oviduto de coelha, e Hanado & Pao, também, em 1984, conseguiram demonstrar fertilização utilizando-se espermatozóide tratado com cálcio ionóforo.
Como protocolo básico utilizado em d i v e r s o s l a b o r a t ó r i o s , a p ó s a maturação, as células do cumulus são r e m o v i d a s e e s p e r m a t o z ó i d e s capacitados são incubados juntamente com os oócitos maturos. O meio de capacitação definido modificado (Younis et al., 1991) tem sido largamente utilizado com resultados s a t i s f a t ó r i o s . N e s t e , o s espermatozóides com motilidade superior a 70% são centrifugado a 200 g, e o pellet é suspenso em meio de capacitação suficiente que atinja uma 6 c o n c e n t r a ç ã o d e 1 6 0 x 1 0 espermatozóide/mL. Um volume semelhante de solução de 100 g/mL de heparina (Sigma, H-3329) diluída em meio de capacitacitação é adicionado a solução contendo espermatozóide, resultando em uma concentração final
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de 80 x 10 sptz/mL e 50 g/mL de heparina. A fertilização é realizada em gotas de 50 L sob óleo mineral preparado com meio TALP-fert (Bavister & Yanagimachi, 1977) modificado (Parrish et al., 1986), suplementado com hypotaurina (1 g/mL, Sigma, H-1384). Oócitos
maturados in vitro por 26 horas são selecionados, lavados com meio de TALP-fert e transferidos para as gotas de FIV. Uma alíquota de 5 L de espermatozóides tratados com heparina é adicionada aos oócitos em cada gota dando uma concentração final de 3,5 a
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4,0 x 10 sptz/mL (Izquierdo et al., 1999). Após inseminação in vitro, oócitos e espermatozóides são encubados a 38,5 C em 5% de Co .2
Cultivo Embrionário
Após 24 horas de inseminação, espermatozóides e células do cumulus são removidos mecanicamente dos oócitos. Supostos zigotos e embriões de 2-células são lavados por quatro vezes em meio de cultivo e colocados em microgotas de 100 L sob óleo mineral, e cultivados a 38,5 C em 5% de CO por 2 sete dias (oito dias pós-inseminação). Apesar de resultados positivos, após a t r a n s f e r ê n c i a p a r a r e c e p t o r a s sincronizadas a taxa de sobrevivência dos embriões produzidos in vitro é e s t a t i s t i c a m e n t e i n f e r i o r a o s produzidos in vivo (47% vs. 71% - Cognié et al., 2003).
Coleta em animais pré-púberes
Ovários obtidos de abatedouros são fonte economicamente viável e abundante de oócitos. Recuperação oocitária in vivo é conseguida através de laparotomia ou através da técnica de laparoscopia guiada por ultra-som LOPU (Tervit, 1996). Recuperação oocitária após LOPU em cabras (Kuhholzer et al., 1997, Baldassarre et al., 2002) tem resultado em bons números de oócitos por doadora (4-6 por sessão).
Progresso considerável tem sido adquirido em produção de embriões de animais jovens (5-9 semanas) após r e c u p e r a ç ã o d e u m n ú m e r o considerável de oócitos e utilizado para MIV (Aguilar et al., 2002, Baldassare et al., 2002). O tratamento de indução utilizado envolve uma aplicação de FSH + eCG 36 horas antes da coleta,
sendo reportado ótimos resultados em caprinos com menos de 3 meses de idade (Baldassare et al., 2002). Apesar dos resultados positivos, há diferenças estatísticas de produção de blastocistos quando comparados com oócitos aspirados de animal adulto (19% vs. 65% - Baldassare et al., 2002) sugerindo que oócitos provenientes de animais pré-púberes não possuem um potencial de desenvolvimento como dos animais adultos havendo ainda altos índices de polispermia como possível conseqüência da dispersão dos grânulos corticais. Maiores estudos são necessários nessa área para propiciar produção de embriões provenientes de animais pré-púberes com um potencial de redução do intervalo de gerações.
Mosaicos ou “Quimeras”
Indivíduos com populações de células geneticamente distintas. As quimeras de caprino/ovino foram inicialmente produzidas a partir de manipulação embrionária. Não foram híbridos e sim uma composição de células derivadas de caprinos e outras derivadas de ovinos. Os primeiros produtos foram realizados pelo laboratório de Fehilly et al. (1984) d e m o n s t r a n d o c a r a c t e r í s t i c a s fenotípicas de ambas espécies. Posteriormente, o laboratório de Gary A n d e r s o n n a U n i v e r s i d a d e d a Califórnia em Davis repetiu o experimento produzindo a quimera a partir de introdução de células embrionárias caprinas em oócitos ovinos transferidos para uma receptora ovina, evitando assim a rejeição desse feto. Quimeras foram produzidas com o objetivo de servir como modelo para pesquisa na área de incompatibilidade materno-fetal e desenvolvimento celular. Mclaren et al.(1993) manipulou 22 embriões com células caprinas e transferiu para 12 receptoras ovinas. Nove ovelhas produziram um total de 13 filhotes (59% de sobrevivência embrionária). Após cariotipagem, 10 foram qualificados como ovinos, um como caprino e 2 como quimeras interespecificas.
Clonagem
A clonagem do primeiro mamífero a partir de uma célula somática retirada de um animal adulto representa uma das mais extraordinárias conquistas da pesquisa na área de biologia do desenvolvimento da última década (Wilmut et al., 1997). Esta tecnologia teve uma rápida expansão sendo utilizada em diversos laboratórios para as mais diversas espécies. Apesar disto, a taxa de sucesso é muito baixa, na maioria das vezes não superior a 1% (Solter, 2000). A baixa viabilidade dos embriões clonados é principalmente expressa pela redução na taxa de implantação, pelo aumento na taxa de mortalidade fetal e perinatal, e pelas diversas anomalias observadas nos animais nascidos (Bordignon, 2003). Em contraste com as diversas espécies clonadas, na espécie caprina não foram observados problemas relacionados com placentação, peso ao nascer, distúrbios cárdio-respiratórios, nem de mortalidade perinatal, o que faz dessa espécie um ótimo modelo para a produção de animais transgênicos assim como para tentarmos entender o mecanismo destas síndromes nas demais espécies clonadas (Bordignon, 2003).
Transgenesis
Um animal transgênico é aquele que adquiriu uma nova informação g e n é t i c a c o m o r e s u l t a d o d e manipulação do seu DNA e que o transmita a seus descendentes (Nicolas & Delouis, 1993). Trata-se de uma tecnologia com importantes aplicações como, por exemplo: (i) pesquisas no desenvolvimento de modelos para o estudo dos genes e seus mecanismos de regulação ou para o desenvolvimento de modelos animais para o estudo de enfermidades humanas; (ii) na indústria, através da incorporação de genes que regulem parâmetros produtivos de importância econômica como incorporação de genes resistente à mastite em gado de leite e finalmente (iii) na biotecnologia, para a produção de proteínas recombinantes de interesse farmacológico.
Produção de transgênicos
O método original para produzir animais transgênicos consiste na microinjeção do gene isolado dentro do pró-núcleo de embriões de uma célula. Produção de proteínas de interesse farmacêutico no leite de animais transgênicos tem se tornado uma alternativa atrativa para bioreatores de células animais. O uso dos pequenos ruminantes, particularmente os caprinos de leite, possibilita uma
Tabela 2. Proteínas de uso terapêutico produzido no leite de animais transgênicos.
Proteína Animal Uso
Antitrombina III Fator VIII, Fator IX CFTR Alfa-1-antitripsina Caprino Caprino, Ovino Ovino Ovino Anticoagulante Tratamento da hemofilia Tratamento da fibrose cística
Tratamento da fibrose cística e enfisema excelente alternativa econômica para a produção de animais transgênicos (Freitas, 2003). Vários autores já citaram a produção de caprinos transgênicos (Ebert et al., 1991; Denman et al., 1994; Gootwine et al., 1997) bem como para produção de larga escala para sua aplicação industrial (Ebert et al., 1994 ; Edmunds et al., 1998). A Tabela 2 apresenta as proteínas de uso terapêutico produzidas no leite de pequenos ruminantes com suas respectivas utilidades.
CONCLUSÕES
Muitas biotécnicas da reprodução se encontram completamente dominadas. Destas, a sincronização hormonal do cio e a IA são as mais difundidas e que tem o maior impacto econômico para o produtor. Apesar desses avanços na produção embrionária, as limitações são grandes, principalmente devido ao alto custo de equipamentos utilizados que reflete diretamente no custo benefício destas técnicas e na
aplicabilidade. Quanto à produção de transgênicos e da clonagem apesar de aparecerem como uma perspectiva futura muito atraente no que se refere à produção de proteínas recombinantes de interesse biotecnológico, a baixa eficiência faz deste método um ponto crítico, mesmo a cabra representando um modelo bastante interessante em virtude de sua eficiência como produtora de leite e o baixo custo em relação a vaca.
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Apresentado no 3º Simpósio Internacional sobre Caprinos e Ovinos de Corte, em João Pessoa, Paraíba, Brasil, Novembro 2007
