ANTIGENIOS DE ASPERGILLUS

ANTIGENIOS DE ASPERGILLUS

Aspergillus antigens

52942

Aspergillus fumigatus antigens

52962

Aspergillus fumigatus positive control serum

61681

Aspergillus positive control sera

61682

SERODIAGNOSTICO DA ASPERGILOSE POR

REACÇÃO DE IMUNOPRECIPITAÇÃO

1- INTERESSE CLINICO

A Bio-Rad produz diferentes antigénios de aspergilo para o serodiagnóstico de aspergiloses por reacção de imunoprecipitação.

O diagnóstico da aspergilose por demonstração de anticorpos específicos no soro de doentes torna-se, muitas vezes, mais fácil de obter do que o diagnóstico por identificação directa dos fungos.

2- PRINCIPIO

Os antigénios Bio-Rad podem ser utilizados em diferentes reacções de imunoprecipitação.

As duas técnicas seguintes são particularmente recomendadas: • IMUNOELECTROFORESE (IEP)

• ELECTROSINERESE (ES)

As técnicas de imunoprecipitação permitem aumentar a precisão de diagnóstico da aspergilose, através da identificação de anticorpos específicos às duas enzimas, quimotripsina e catalase, presentes nos extractos antigénicos. A sua actividade enzimática é revelada em arcos de precipitação.

3- APRESENTAÇÃO

• Aspergillus fumigatus antigens (Antigénios Aspergillus fumigatus), referência

52962

2 frascos de antigénios liofilizados, a reconstituir com 1 ml de água destilada esterilizada (cerca de 10 reacções).

- Aspergillus fumigatus metabolic antigen - Aspergillus fumigatus somatic antigen

• Aspergillus antigens (Antigénios Aspergillus), referência 52942

4 frascos de antigénios liofilizados, a reconstituir com 1 ml de água destilada esterilizada (cerca de 10 reacções).

- Aspergillus flavus metabolic antigen - Aspergillus nidulans metabolic antigen - Aspergillus niger metabolic antigen - Aspergillus terreus metabolic antigen

• Aspergillus fumigatus positive control serum (Soro de controlo positivo

Aspergillus fumigatus), referência 61681

1 frasco de soro de coelho anti- Aspergillus fumigatus liofilizado, a reconstituir com 1 ml de água destilada esterilizada.

• Aspergillus positive control sera (Soros de controlo positivo Aspergillus),

referência 61682

4 frascos de soro de coelho anti- Aspergillus liofilizado, a reconstituir com 1 ml de água destilada esterilizada.

- Aspergillus flavus positive control serum - Aspergillus nidulans positive control serum - Aspergillus niger positive control serum - Aspergillus terreus positive control serum

4- COMPOSIÇÃO

Antigénios (dois tipos):

• Antigénio metabólico, obtido por filtração de culturas, após 10 dias de

incubação a 30°C.

• Antigénio somático ou celular, obtido a partir de culturas de micélios

jovens (3 dias, sem esporos), esmagados e agitados a 30°C.

5- ARMAZENAMENTO

Sob a forma liofilizada, os reagentes guardados à temperatura de +2-8°C, em local seco, mantêm-se estáveis até ao termo do prazo de validade indicado na embalagem do dispositivo.

Após reconstituição, os reagentes podem ser guardados por vários meses a -20°C, em alíquotas divididas. Não congelar/descongelar os reagentes repetidas vezes.

6- AMOSTRAS

1. Os testes devem ser realizados apenas em amostras de soro provenientes de tubos secos.

2. Observar as seguintes recomendações quanto ao manuseamento, processamento e armazenamento das amostras de soro:

- Recolher as amostras de soro de acordo com as precauções habituais. - Deixar que as amostras coagulem completamente, antes de se proceder

à sua centrifugação.

- Manter os tubos sempre bem fechados.

- Após centrifugação, separar o soro e conservá-lo num tubo de armazenamento convenientemente tapado.

- As amostras podem ser armazenadas a +2- 8°C, se o teste for realizado no prazo de 24 horas. Caso não seja possível efectuar o teste nas 24 horas seguintes, ou se as amostras tiverem de ser transportadas, congelar à temperatura de –20°C ou mais baixa.

- De preferência, as amostras deverão ser descongeladas apenas uma vez. As amostras previamente congeladas devem ser cuidadosamente homogeneizadas após a descongelação, antes de se proceder ao teste. 3. Não foram analisadas interferências devidas a elevadas taxas de

albumina ou bilirrubina, lípidos ou hemoglobina. 4. Não aquecer as amostras.

7- MODO DE FUNCIONAMENTO

A)MATERIAIS NECESSARIOS MAS NÃO FORNECIDOS • Barbital sódico • Ácido clorídrico • Água destilada • Barbital • Glicina • Tampão Tris 0,05M pH7 • Agarose • 30% H2O2

• Éster N-acetil-DL naftil fenilalanina • Dimetilformamida

• Azul Diazo B

B) IMUNOELECTROFORESE (foto 1)

A imunoelectroforese (Grabar) pode ser efectuada em lâminas de vidro para observação ao microscópio

• Preparar um gel utilizando agar purificado ou agarose a 1%, misturada com solução tampão barbital de pH 8.2 (adicionando mertiolato 1/10.000).

• Cortar uma tira de gel de 60 mm de comprimento por 2 mm de largura e dois poços de 2 mm de diâmetro, de cada lado da secção, a uma distância de 4 mm (ver diagrama).

• Depositar 20 µl de antigénio não diluído nos dois poços laterais. • Durante 1h30m, aplicar um potencial de 5 volts/centímetro nas

extremidades da lâmina.

• Depositar o soro na tira central e permitir a sua difusão durante 48 horas, em atmosfera húmida, à temperatura ambiente (18-30°C).

• Ao terceiro dia, mergulhar as lâminas, durante 24 horas, numa solução de lavagem.

• Proceder à leitura da lâmina ao 4º dia. Poderá ser necessária uma coloração de Azul Coomassie para ler as linhas especialmente finas.

C) ELECTROSINERESE (fig. 1)

A electrosinerese (Bussard) ou contra-electroforese pode ser efectuada utilizando gel de agarose ou acetato de celulose. Trata-se de uma técnica simples, muito sensível e rápida, que se revela útil para a análise de soros em grande número.

• Utilizando gel de agarose e lâminas de microscópio, é possível cortar poços de acordo com o diagrama: antigénios colocados no lado catódico (-), soros colocados no lado anódico (+). Os poços de 2 mm de diâmetro são separados entre si por 6 mm.

• Encher os poços de antigénio com soluções puras, a uma diluição de 1/2 e 1/4. Os poços de soros devem ser cheios com 20 microlitros.

• Aplicar um potencial de 5 volts/centímetro, durante 1h e 30 minutos. • A reacção é normalmente lida imediatamente após a migração.

• Se for necessária a coloração com Azul Coomassie, esta deverá ser precedida de duas lavagens sucessivas: em soro fisiológico (durante uma noite) e, em seguida, em água destilada (24 horas), seguida de secagem. Recomenda-se a realização simultânea do teste nos controlos positivos, seguindo o mesmo procedimento que o utilizado para os antigénios. D) IDENTIFICAÇÃO DA ACTIVIDADE ENZIMATICA EM CERTOS ARCOS

DE PRECIPITAÇÃO

Os arcos mais frequentemente observados após imunoelectroforese são designados como C e J (ver diagrama) e indicam actividade enzimática (C: quimotripsina e J: catalase). Uma maior evidência da presença destas enzimas é fornecida por reacções específicas (BIGUET et al.) (ver anexo). E) PREPARAÇÃO DOS REAGENTES

1) TAMPÕES - VERONAL pH 8,2

Barbital Sódico 15.85 g

HCl 1N 23 ml

H2O q.s.p. 1000 ml

- BARBITAL- SODIUM BARBITAL TRIS GLYCINE (BBNa TG) pH 8,8

A. Barbital Sódico 65 g Barbital 10,35 g H2O q.s.p 5000 ml B. Glicina 281 g Tris 226 g H2O q.s.p 5000 ml 55

Após mistura em partes iguais das soluções a e b, obtém-se uma solução tampão com um pH de 8.8 e uma osmolaridade de 0.08.

2) 1% AGAROSE (PESO/VOLUME)

Agarose 10 g

H2O 500 ml

Levar a ebulição e, depois de deixar arrefecer (a cerca de 60°C), Adicionar :

Tampão Barbital pH 8.2 500 ml

Ou

Tampão BBNa TG pH 8,8 500 ml

(diluído a 50% com água destilada). 3) CATALASE

30%H2O2, diluído em tampão TRIS 0,05M pH7 (0,3 ml H2O2 + 50 ml de

tampão) em agarose de imunoelectroforese.

Reacção positiva: bolhas em volta do arco específico.

4) QUIMOTRIPSINA - SOLUÇÃO A

Éster N-acetil-DL naftil fenilalanina 5 mg

Dimetilformamida 2 ml

- SOLUÇÃO B

Azul Diazo B 10 mg

Tampão Tris 0,05 M pH 7,4 18 ml

Antes de usar a solução de mistura A* & B* incubar a membrana de electrosinerese durante 30 minutos a 37°C nesta mistura.

Eliminar a mistura, incubar durante uma noite a 37°C em 18 ml de reagente B. Lavar as membranas com água.

Reacção positiva: a presença de arcos corados de roxo corresponde a

actividade quimotrípsica.

F) QUADRO RESUMIDO

Análise P.J. SVENDSEN MANUEL OF QUANTITATIVE IMMUNOELECTROPHORESIS, FURLAGET UNIVERSITY, OSLO. EDITORS: EXELSEN KROLL-WEEXE. ASPERGILLUS ANTIGENS (Quadro).

* Ver 6 – Modo de Funcionamento (E – Preparação dos reagentes)

8- INTERPRETAÇÃO

A presença de arcos de precipitação utilizando técnicas de imunoprecipitação contra o antigénio aspergilo indica aspergilose infecciosa.

Visto ser mais rápida, a electrosinerese é preferível à imunoelectroforese, para fins de teste. No entanto, os soros comprovados como positivos utilizando esta técnica devem ser confirmados utilizando imunoelectroforese. A actividade enzimática de quimotripsina e catalase, em certos arcos de precipitação, fornece maior evidência da sua especificidade.

No caso de aspergilose broncopulmonar ou difusa, os testes são positivos em 80 – 90% dos casos e, geralmente, observam-se arcos específicos.

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Tampões Tensão Duração Colorações

Imunoelectroforese Agarose 1%/ 5 V / cm 90 mn

Tampão Veronal pH 8.2 Azul

Agarose 1%/ 25 V / cm 60 mn Coomassie Tampão BBNa-TG pH 8.8

Electrosinerese Agarose 1%/ 5 V / cm 90 mn

Tampão Veronal pH 8.2 Azul

Agarose 1%/ 10 V / cm 60 mn Coomassie Tampão BBNa-TG pH 8,8

Catalase Agarose 1%/ 5 V / cm 90 mn H2O2diluída*

Tampão Veronal pH 8.2 _{Reacção positiva:} Agarose 1%/ 25 V / cm 60 mnbolhas em volta do

Tampão BBNa-TG pH 8.8 arco J específico

Quimotripsina Agarose 1%/ 5 V / cm 90 mn Reagentes A* e B*

Tampão Veronal 8,2 _{Reacção positiva:}

Agarose 1%/ 25 V / cm 60 mn cor roxa do arco

Tampão BBNa-TG pH 8,8 C específico

Pur O O O O O O 1/2 O O O O O O 1/4 O O O O O O 1 S 2 S 1 ou 2 Sr Foto 1 antigénios S: soro

Sr : soro de controlo Fig. 1

Foto 2

No aspergiloma, as reacções são altamente positivas: podem observar-se normalmente 5 a 10 arcos e arco C.

Na bronquite alérgica a aspergilo a reacção é positiva em 50% dos casos. A precipitação de anticorpos verifica-se numa fase posterior da infecção: em certos casos, os anticorpos precipitantes observam-se numa segunda análise, realizada um mês após o primeiro exame.

9- DESEMPENHOS / CONTROLO DE QUALIDADE DO TESTE

Os desempenhos dos antigénios Aspergillus são controlados utilizando soros de controlo positivos a aspergilose (soro de coelho anti-Aspergillus, obtido por imunização do animal com antigénios mistos estandardizados

A. fumigatus e com antigénios metabólicos estandardizados A. flavus, A. niger, A. nidulans e A. terreus).

Demonstração dos arcos de precipitação por imunoelectroforese (pH = 8.2)

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Soro de controlo positivo

Anti- A. fumigatus Anti- A. flavus Anti- A. nidulans Anti- A. niger Anti- A. terreus

Ag somáticos + A. fumigatus 4 a 8 arcos - - - -Ag metabólicos + A. fumigatus 3 a 5 arcos - - - -Ag metabólicos - + A. flavus 3 a 5 arcos - - -Ag metabólicos - - + A. nidulans 3 a 5 arcos - -Ag metabólicos - - - + -A. niger 3 a 5 arcos Ag metabólicos - - - - + A. terreus 3 a 5 arcos

B) DEMONSTRAÇÃO DE ACTIVIDADE ENZIMATICA DOS ARCOS DE PRECIPITAÇÃO

10- CONTROLO DA QUALIDADE DE FABRICO

Todos os reagentes são fabricados e preparados de acordo com o nosso Sistema de Qualidade, desde a recepção das matérias primas até à comercialização do produto final. Cada lote é submetido a um controlo de qualidade, sendo comercializado apenas quando em total conformidade com os critérios de aceitação predefinidos. Os registos relacionados com a produção e controlo de cada lote são arquivados pela Bio-Rad.

11- LIMITES DE UTILIZAÇÃO

O diagnóstico da aspergilose só pode ser estabelecido após observação dos aspectos clínicos, radiológicos e biológicos (microbiológicos, histológicos, serológicos), devendo cada um destes dados em separado ser interpretado com precaução.

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Imunoelectroforese (pH = 8.2) Electrosinerese (pH 8.2)

Demonstração de actividade +

enzimática catalásica após adição de H2O2, bolhas em volta do arco J

sustentam a actividade catalásica

Demonstração de actividade +

enzimática quimotrípsica após incubação com os

reagentes A e B, a coloração roxa do arco C sustenta a

12- REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

1. BIGUET J.; TRAN VANKY P.; FRUIT J. ; ANDRIEU S. : Identification d’une activité chymotrypsique au niveau de fractions remarquables de l’extrait antigénique d’Aspergillus fumigatus. Répercussion sur le diagnostic immunologique de l’Aspergillose. REV. IMMUNOL. (1967)

31, pp. 317-328.

2. DROUHET E.; CAMEY L. ; SEGRETAIN G. : Valeur de l’immunoprécipitation et de l’immunofluorescence indirecte dans les Aspergilloses broncho-pulmonaires. ANN. INST. PASTEUR (1972) 123, pp. 379-395.

3. DROUHET E. ; DUPONT B. : Infections mycosiques et parasitaires au cours des traitements immunosuppresseurs. PATHOL. BIOL. (1976) 24, pp. 99-116.

4. LONGBOTTOM J.L. : Immunological aspects of infection and allergy due to Aspergillus Species. MUKOSEN (1978), supp. 1 pp. 207-217. 5. SEGRETAIN G.; DROUHET ; MARIAT F.; Diagnostic de laboratoire en

mycologie médicale (1979, 4e édition), MALOINE Edt. PARIS 150 pages.

82

- CE marking (European directive 98/79/CE on in vitro diagnostic medical devices)

- Marquage CE (Directive européenne 98/79/CE relative aux dispositifs médicaux de diagnostic in vitro)

- Marcado CE (Directiva europea 98/79/CE sobre productos sanitarios para diagnóstico in vitro) - EG Markierung (Europäische Richtlinie 98/79/EG über In-vitro-Diagnostika)

- Marchiatura CE (Direttiva europea 98/79/CE relativa ai dispositivi medico-diagnostici in vitro) - Marcação CE (Directiva europeia 98/79/CE relativa aos dispositivos médicos de diagnóstico

in vitro)

- CE-märkning (Europa direktiv 98/79/EG om medicintekniska produkter lör in vitro-diagnostik) - CE-mærkningen (Europa direktiv 98/79/EF om medicinsk udstyr til in vitro-diagnostik)

- For in vitro diagnostic use - Catalogue number

- Pour diagnostic in vitro - Référence catalogue

- Para diagnóstico in vitro - Número de catálogo

- In vitro-Diagnostikum - Bestellnummer

- Per uso diagnostico in vitro - Numero di catalogo - Para uso em diagnóstico in vitro - Número de catálogo

- In vitro diagnostik - Katalognummer

- In vitro diagnose - Katalognummer

- Manufacturer - Authorised Representative

- Fabricant - Représentant agréé

- Fabricante - Representante autorizado

- Hersteller - Bevollmächtigter

- Produttore - Distributore autorizzato

- Fabricante - Representante Autorizado

- Tillverkad av - Auktoriserad representant

- Fremstillet af - Autoriseret repræsentant

- Batch code - Expiry date YYYY/MM/DD

- Code du lot - Date de peremption AAAA/MM/JJ

- Código de lote - Estable hasta AAAA/MM/DD

- Chargen-Bezeichnung - Verwendbar bis JJJJ/MM/TT

- Codice del lotto - Da utilizzare prima del AAAA/MM/GG

- Código do lote - Data de expiração AAAA/MM/DD

- Batch nr. - Utgångsdatum År/Månad/Dag

- Batchkoden - Anvendes før ÅÅÅÅ/MM/DD

- Storage temperature limitation - Consult Instruction for use - Limites de températures de stockage - Consulter le mode d'emploi

- Temperatura limite - Consulte la instrucción para el uso

- Lagerungstemperatur - Siehe Gebrauchsanweisung

- Limiti di temperatura di conservazione - Consultare le istruzioni per uso - Limites de temperatura de armazenamento - Consulte o folheto informativo - Temperaturbegränsning - Se instruktionsanvisning vid användning

- Temperaturbegrænsning - Se instruktion før brug

LOT

IVD

EC REP

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The other languages which are required in conformity to the European Directive can be obtained from your local Bio-Rad agent.

Les autres langues requises par la Directive Européenne sont disponibles auprès de votre représentant Bio-Rad local.

Los otros idiomas que se requiren para la conformidad de la Directiva Europea puede ser obtenida en su oficina local Bio-Rad.

Die anderen Sprachen, die in Übereinstimmung mit der europäischen IVD Direktive benötigt werden, erhalten Sie über Ihre lokale Bio-Rad Niederlassung.

Le altre lingue che sono richieste in conformità con le Direttive Europee possono essere ottenute dal locale agente Bio-Rad.

As restantes línguas, obrigatórias em conformidade com a Directiva Europeia, podem ser obtidas através da subsidiária Bio-Rad mais próxima de si.

Övriga språk som krävs i enlighet med EG-direktivet kan erhållas från din lokala Bio-Rad-representant.

De øvrige sprog som kræves i henhold til EU direktiv kan fås ved henvendelse til den lokale Bio-Rad leverandør.

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