UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO FACULDADE DE MEDICINA COORDENAÇÃO DE PROGRAMAS DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE

UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO FACULDADE DE MEDICINA

COORDENAÇÃO DE PROGRAMAS DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE

EXPRESSÃO DA ANEXINA A1 E DA INTERLEUCINA-10 NA PELE DE PACIENTES COM HANSENÍASE

CAROLINE MARQUES CALOI

Cuiabá-MT 2014

Expressão da anexina A1 e da interleucina-10 na pele de pacientes com hanseníase

CAROLINE MARQUES CALOI

Orientador: Prof. Dr. Amílcar Sabino Damazo

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, Faculdade de Medicina, da Universidade Federal de Mato Grosso, campus de Cuiabá como requisito final para obtenção do título de mestre em Ciências da Saúde, área de concentração Farmacologia.

Cuiabá-MT 2014

DEDICATÓRIA

A minha amada e saudosa vó, Luzia Angelina Scremin Caloi, por todo amor e conselhos dados a mim durante a sua significante existência ao meu lado. Por você sempre lutei e continuarei lutando pelos meus sonhos, defendendo sempre o que eu acredito ser certo e justo.

Aos meus pais, Edenilson Jeferson Caloi e Vera Lúcia de Castro Marques Caloi, por me apoiarem em todas minhas escolhas e decisões, pelo esforço em sempre querer me dar o melhor estudo, por ter me dado princípios e valores para que eu pudesse trilhar o meu caminho.

A você, Anna Lígia Oenning Soares, pelo incentivo, apoio e companheirismo em todos os momentos difíceis da minha vida. Certamente sem você tudo ficaria mais difícil.

AGRADECIMENTOS

Ao meu orientador, Amílcar Sabino Damazo, pela orientação e dedicação na concretização desse trabalho, e também pela compreensão e paciência diante aos problemas pessoais ocorridos nesse período.

Aos meus colegas do mestrado e doutorado que de alguma forma contribuíram na elaboração desse trabalho, em especial a minha amiga Lenuce Ribeiro Aziz Ydy, que contribuiu significativamente com o meu crescimento pessoal e profissional quando mais precisei.

A Sílvia Thaís Sá Pimenta, pela dedicação, paciência e carinho que teve com cada paciente e com cada situação complicada que surgiu. Sua participação foi fundamental para que esse trabalho fosse desenvolvido.

A todos profissionais do Hospital Universitário Júlio Mulher, que direta ou indiretamente colaboraram com a coleta biológica e de dados, ao Dr. Cabral que me ensinou muito sobre a clínica e a vida desses pacientes.

A todos os funcionários e técnicos do departamento de Pós-Graduação pela ajuda e contribuição nesse trabalho.

Aos professores da banca pela disponibilidade e contribuição oferecida a esse trabalho.

Ao CNPq pelo apoio financeiro durante meu trajeto no desenvolvimento dessa pesquisa.

PENSAMENTO

“Prefiro uma carreira obscura de trabalho honesto a acumular riqueza fazendo ouro dos sofrimentos inexprimíveis de outros homens.”

RESUMO

A hanseníase é uma doença infecciosa crônica, causada pelo Mycobacterium leprae (M. leprae), parasita intracelular obrigatório que afeta, preferencialmente, macrófagos no tecido conectivo e células de Schwann nos nervos periféricos. O objetivo desse trabalho foi identificar as células mnonucleares presentes na pele de pacientes com hanseníase, com as formas clínicas tuberculóide-tuberculóide (TT), tuberculóide-borderline (TB), borderline-borderline (BB), virchowiano-borderline (BV) e virchowiano-virchowiano (VV); e mensurar a expressão dos mediadores anti-inflamatórios anexina-A1 (ANXA1) e interleucina-10 (IL-10), investigando seu possível papel na patogênese da doença. Após o diagnóstico clínico os pacientes foram submetidos à biópsia da lesão para análise histopatológica. Os cortes histopatológicos foram submetidos à técnica de imunofluorescência para detecção dos mediadores ANXA1 e IL-10. Os resultados demonstraram uma correlação na diferença dos tipos de leucócitos presentes nas diferentes formas clínicas dos pacientes com hanseníase com os níveis dos mediadores ANXA1 e IL-10 produção diferencial de mediadores reguladores do processo infeccioso. Os dados demonstraram que os histiócitos, células T CD4+ e T CD8+ dos pacientes com as formas clínicas BV e VV apresentavam uma expressão aumentada da proteína ANXA1, assim como nos níveis da citocina IL-10. Além disso, pode-se verificar uma correlação positiva na expressão da ANXA1 e nos níveis de IL-10 nos pacientes BB, BV e VV, indicando possivelmente que essa proteína possa contribuir com a regulação da produção dessa citocina durante o processo infeccioso induzido por M. leprae. Em conclusão, a proteína ANXA1 foi caracterizada como um possível regulador do processo infeccioso induzido por M. leprae, indicando que, a presença dessa proteína poderia estar reduzindo o potencial pró-inflamatório nos pacientes BB, BV e VV, levando a disseminação do M. leprae. Do contrário, em pacientes TT e BT, a proteína ANXA1 apresenta-se reduzida, o que poderia contribuir com a ativação dos leucócitos e a eliminação das bactérias.

ABSTRACT

Leprosy is a chronic infectious disease caused by Mycobacterium leprae (M. leprae), a intracellular obligate parasite that affects mainly macrophages and Schwann cells. This study’s goal was to identify monocytic cells present in the skin of leprosy patients with tuberculoid clinical forms (TT), tuberculoid-borderline (TB), tuberculoid-borderline-tuberculoid-borderline (BB), tuberculoid-borderline-lepromatous (BV) and lepromatous (LL); and evaluating the expression of annexin-A1 (ANXA1), and anti-inflammatory mediators interleukin-10 (IL-10), evaluating its potential role in pathogenesis disease. After the clinical diagnosis, the patients underwent biopsy for histopathological analysis. Histopathological cuts were submitted to immunofluorescence staining for detection of mediators ANXA1 and IL-10. The results showed a difference in the of leukocytes’s profile in patients with different clinical forms of leprosy, that is essential to allow the differential production of regulatory mediators of the infectious process. The data showed that the histiocytes, CD4 + and CD8 + T cells of patients with clinical forms BV and VV had a higher expression of ANXA1 protein as well as high levels of IL-10. Furthermore, it can be seen a positive correlation in expression of ANXA1 and IL-10 in BB, BV and VV patients, possibly indicating that this protein may contribute to the regulation of this cytokine production during the infectious process induced by M. leprae. In conclusion, ANXA1 protein was characterized as a possible regulator of the infectious process induced by M. leprae, indicating that the presence of this protein could be reducing the pro-inflammatory potential in BB, BV and VV patients taking the spread of the bacterium M. leprae. Otherwise, patients in TT and BT, ANXA1 protein comes in lower levels, which could contribute to more effective activation of pro-inflammatory action of the immune system, favoring the elimination of bacterias.

SUMÁRIO

LISTA DE FIGURAS E TABELAS ... 9

1 - INTRODUÇÃO ...10 1.1HANSENÍASE...10 1.2CLASSIFICAÇÃODAHANSENÍASE ...11 1.3IMUNOLOGIADAHANSENÍASE ...13 1.4ANEXINAA1...14 1.5INTERLEUCINA10 ...17 2 - OBJETIVOS ...19 2.1OBJETIVOGERAL ...19 2.2OBJETIVOSESPECÍFICOS...19 3 - MATERIAIS E MÉTODOS ...20 3.1.PACIENTES...20 3.2.CONSIDERAÇÕES ÉTICAS ...21

3.3.BIÓPSIA PARA EXAME HISTOPATOLÓGICO...21

3.4.QUANTIFICAÇÃO DA EXPRESSÃO DA PROTEÍNA ANXA1 ENDÓGENA, DA CITOCINA IL-10 E IDENTIFICAÇÃO DE MARCADORES CELULARES LINFOCITÁRIOS PELA TÉCNICA DE IMUNOFLUORESCÊNCIA ...22

4 - RESULTADOS ...24

4.1.PACIENTES...24

4.2.ANÁLISE DE IMUNOFLUORESCÊNCIA PARA CITOCINA IL-10 ...27

4.3.ANÁLISE DE IMUNOFLUORESCÊNCIA PARA PROTEÍNA ANXA1 ...29

5 - DISCUSSÃO ...34 6 - CONCLUSÃO ...37 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...38 ANEXO 1 ...42 ANEXO 2 ...43 ANEXO 3 ...44

LISTA DE FIGURAS E TABELAS

Figura 1 Imunologia da Hanseníase 14

Figura 2 Efeito dos glicocorticóides, ANXA1 e seus peptídeos 18 bioativos no tráfegos de leucócitos durante a resposta

inflamatória.

Figura 3 Lesão de pele de pacientes com hanseníase, forma clínica ...27 tuberculóide

Figura 4 Lesão de pele de pacientes com hanseníase, forma clínica 27 borderline tuberculóide

Figura 5 Lesão de pele de pacientes com hanseníase, forma clínica 28 Borderline Borderline

Figura 6 Lesão de pele de pacientes com hanseníase, forma clínica 28 Borderline Virchowiana

Figura 7 Lesão de pele de pacientes com hanseníase, forma clínica ...29 Virchowiana

Figura 8 Análise da expressão da IL-10 no sítio inflamatório de 30 pacientes com hanseníase

Figura 9 Análise de Imunofluorescência para a proteína ANXA1 e 31 IL-10

Figura 10 Análise da expressão da ANXA1 no sítio inflamatório de 32 pacientes com hanseníase

Para célula TCD4+

Figura 12 Análise de Imunofluorescência para a proteína ANXA1 e 33 Para célula TCD4+

Figura 13 Análise da relação da proteína ANXA1 e da citocina IL-10 35 nos linfócitos

Figura 14 Análise da relação da proteína ANXA1 e da citocina IL-10 36 nas células epitelióides e nos histiócitos

Tabela 1 Avaliação das formas clínicas dos pacientes com 26 hanseníase

1 - INTRODUÇÃO

1.1 HANSENÍASE

A hanseníase é uma doença infecciosa crônica, causada pelo Mycobacterium leprae, bactéria em forma de bastonete, descrita por Hansen no século XIX (1). É um parasita intracelular obrigatório que afeta, preferencialmente, macrófagos do tecido conectivo e células de Schwann dos nervos periféricos (2). Sua transmissão, embora não comprovada, se dá provavelmente por via inalatória, embora haja pequena possibilidade de infecção via lesões de pele (3).

O M. leprae tem alta infectividade e baixa patogenicidade, isto é, pode infectar muitos indivíduos, embora somente alguns adoeçam; sendo assim, a doença é determinada pela resposta imune do hospedeiro. Após o diagnóstico da doença, é de fundamental importância classificá-la de maneira correta, a fim de realizar o tratamento adequado (4).

A hanseníase apresenta evolução lenta e insidiosa, com múltiplos desfechos clínicos, dependentes de resposta imune. A forma mais contida é a paucibacilar, ligada a resposta imune Th1, com baciloscopia negativa e lesões de pele e nervos menores, risco de transmissibilidade reduzido e melhor resposta ao tratamento. Porém, pode gerar lesões granulomatosas de nervos periféricos, o que possivelmente geram sequelas variadas em órgãos e membros associados. Já os pacientes com a forma multibacilar apresentam resposta imune pouco eficaz, nódulos eritematosos, lesões bastante infiltradas com bordas mal definidas, e ricas em bacilos. As lesões ocupam largas áreas, sendo simétricas e localizadas na face, dorso e nádegas (1).

11

1.2 CLASSIFICAÇÃO DA HANSENÍASE

Em 1953, o VI Congresso Internacional de Leprologia realizado em Madri, estabeleceu a classificação da hanseníase segundo sua tendência de evoluir a um dos seus pólos, encontrando-se duas formas polares (tuberculóide e virchowiana), e dois grupos (indeterminado e dimorfo) (5). A forma clínica indeterminada (I) pode ser a manifestação inicial da doença onde a resposta do hospedeiro é insuficientemente diferenciada para permitir classificação. Pode evoluir para cura espontânea ou desenvolver aspectos clínicos da doença estabelecida dentro do espectro, dependendo da sua capacidade em montar uma resposta imune efetiva contra o M. leprae (6).

Baseando-se no espectro imunológico dos pacientes, Ridley e Jopling, apresentaram a seguinte classificação: TT (tuberculóide), BT (borderline tuberculóide), BB (borderline borderline), BV (borderline virchowiana) e VV (virchowiana). Cada um desses grupos foi caracterizado por parâmetros clínicos, histopatológicos e imunológicos (7).

No entanto, a Organização Mundial de Saúde (OMS) propôs uma classificação operacional baseada no número de lesões de pele apresentadas pelos pacientes, os quais foram classificados em paucibacilares (PB) se apresentarem de uma a cinco lesões ou em multibacilares (MB) se apresentarem mais de cinco lesões (8).

Quadro 1: Classificação de Madri, Ridley & Jopling e OMS adotadas para a hanseníase. Madri (1953) Indeterminada (I) Tuberculóide (T) Dimorfa (D) Virchowiana (V) Ridley e Jopling (1966) TT BT BB BV VV OMS (1990) Paucibacilares Multibacilares Adaptado da literatura (5,7,8)

Durante o desenvolvimento da doença ou, ainda, o seu tratamento, podem surgir as reações, episódios de resposta inflamatória aguda associados a alterações da resposta imunológica dos pacientes (9).

As reações são classificadas conforme suas características clínicas e imunológicas dadas em tipo 1 ou reação reversa (RR), e tipo 2 ou eritema nodoso hansênico (ENH) (10).

13

1.3 IMUNOLOGIA DA HANSENÍASE

Figura 1: Padrão da resposta imune induzida pelo M leprae durante a hanseníase (Goulart, 1995).

A primeira linha de interação entre o M. leprae e o homem é mediada por receptores do hospedeiro que reconhecem o padrão da micobactéria, denominados “Toll-like” (TLR) e são essenciais para o reconhecimento de patógenos pelos macrófagos e células dendríticas (CDs). Os TLRs mais importantes para o reconhecimento de micobactérias são os TLR2 e o TLR4 (11).

A resposta imune celular/humoral frente à infecção pelo bacilo influencia na evolução da doença e está associado com as características clínicas observadas nos pacientes portadores das formas paucibacilar e multibacilar (12-16). A captação dos bacilos e a produção subsequente de citocinas pelas CDs regulam a inflamação local e induzem a polarização da resposta imune para o padrão de resposta do tipo 1 ou 2 (15). Em pacientes com a forma clínica TT predomina a resposta do tipo 1, onde as CDs produzem citocinas pró-inflamatórias, como a IL-12, que estimulam as células T a desenvolverem uma resposta imune do tipo Th1, produzindo IL-2 e INF-

(15-19). Esses mediadores ativam os macrófagos e favorecem a atividade citotóxica, induzindo a produção de TNF-α (12,18) e a formação dos granulomas (15, 18).

Porém, em pacientes com a forma clínica VV, as CDs com M. leprae produzem IL-10 e TGF-β, estimulando as células T a produzirem IL-4 e estimularem a proliferação das células T reguladoras (15). As células T também produzem IL-4, IL-5 e IL-6, que estimulam a proliferação de linfócitos B. Também é importante ressaltar que, nesse cenário imunobiológico, a produção de IL-10 modula negativamente a resposta Th1 (19). A forma multibacilar é caracterizada por um granuloma epitelióide e infiltrado celular intenso composto principalmente por histiócitos. Tem-se descrito que a IL-4 diminui a expressão dos TLR2 nos monócitos e que a IL-10 suprime a produção de IL-12 o que está associado com a predominância de linfócitos CD8+ nas lesões desses pacientes (20).

No desenvolvimento da resposta imune logo após a entrada da micobactéria nos macrófagos, o próprio M. leprae induz a produção de TNF-α e TGF-β (Transforming Growth Factor β). De um lado, o TNF-α promove a ativação de macrófagos para a destruição intracelular do agente infeccioso e potencializa o efeito Th1. Por outro lado, o TGF-β inibe a produção de IL-12 de macrófagos e IL-2 de linfócitos. Dependendo da forma clínica da hanseníase, podemos verificar a predominância da resposta Th1 ou Th2 nos pacientes (18,20,21).

Além de Th1 e Th2, um terceiro subconjunto de células efetoras foi identificado e designado como Th17 (19). Possui um papel fundamental em doenças infecciosas como a tuberculose e leishmaniose, e na regulação de doenças autoimunes, pela interleucina 17A e interleucina 17F (21,-23).

Sendo assim, o papel dos mediadores imunológicos é fundamental para a ativação das diferentes formas clínicas da hanseníase (12-23).

1.4 ANEXINA A1

15

do receptor de células T (TCR), tornando-se um alvo molecular importante na diferenciação e proliferação dos linfócitos (24).

A proteína ANXA1 é considerada a principal mediadora da ação anti-inflamatória dos hormônios glicocorticoides (GCs) endógenos e exógenos. ANXA1 foi descrita inicialmente como a proteína responsável pela inibição da atividade da enzima fosfolipase A2 (PLA2), após o tratamento de células com GCs. A inibição da atividade da PLA2 constitui um mecanismo anti-inflamatório importante, pois tem como ação a inibição do ácido araquidônico e, consequentemente, a dos mediadores pró-inflamatórios como prostaglandinas, leucotrienos e fator de agregação plaquetária (25).

Vários estudos em modelos de inflamação aguda, crônica, ou mesmo sistêmicos, demonstraram que a proteína ANXA1 é inibidora do extravasamento de leucócitos para o local da inflamação (26). Estudos evidenciam que o provável mecanismo de ação da ANXA1 na regulação da migração celular está relacionado com inibição da expressão das moléculas de adesão nas interações leucócito-endotélio, principalmente as integrinas e selectinas (27). Esse efeito pode ser obtido a partir da administração do peptídeo sintético derivado da porção N-terminal da ANXA1, Ac2-26 (28).

ANXA1 também está envolvida com a inibição da enzima ciclo-oxigenase-2 (COX-2) e da enzima sintase induzida do óxido nítrico (iNOS), além de estar relacionada com a liberação de IL-10 em fagócitos, com a indução da apoptose de neutrófilos in vitro e a ativação dos macrófagos para a promoção de remoção de corpos apoptóticos (Figura 2) (25,27,29).

Figura 2. Efeito dos glicocorticoides, ANXA1, e seus peptídeos bioativos no tráfego de leucócitos durante a resposta inflamatória. Várias das funções desencadeadas pelos GCs são compartilhadas pela ANXA1, dentre estas a redução da transmigração de neutrófilos e o aumento da fagocitose de células apoptóticas (29).

A ANXA1 atua de modo específico dependendo do tipo celular. Os leucócitos sintetizam quantidades crescentes de ANXA1 em resposta ao processo inflamatório e ao tratamento com GC (29). A ANXA1 foi observada em níveis aumentados tanto no processo inflamatório agudo e crônico, além do processo de resolução da inflamação (27-29).

Entretanto, estudos recentes demonstraram que essa proteína possui uma ação diferenciada nas células linfocíticas. Estudos que descrevem o mecanismo de ação da ANXA1 em linfócitos são ainda muito escassos, mas alguns estudos demonstram que a ANXA1 induz uma ação antiproliferativa nas células T, mas não

17

influencia no processo de transmigração dessas células (24). Além disso, ela também afeta o processo de diferenciação. Isso foi demonstrado em um experimento, onde o tratamento de células Th0 com proteína recombinante humana ANXA1 (rhANXA1) induziu a diferenciação dessas células para a forma Th1, via aumento da sinalização de TCR pela ativação do receptor FPRL-1 (Formyl peptide receptor-like-1) (27,29). Na mesma linha de pensamento, em animais transgênicos deficientes para a proteína ANXA1, sem a estimulação desta proteína, as células T tinham uma maior propensão para diferenciação em Th2 (29). Alguns trabalhos ainda indicam que as células T CD4+ expressam mais ANXA1 do que as células T CD8+ (27,29).

1.5 INTERLEUCINA 10

IL-10 é um importante imunorregulador durante a infecção por vírus, bactérias, protozoários e helmintos, regulando a resposta celular de células T CD8+ e Th1, as quais são responsáveis por grande parte da imunopatologia associada a infecções (30,31).

A produção de IL-10 foi descrita pela primeira vez em células Th2. Nestas células, a IL-10 é expressa com outras citocinas como, IL-4, IL-5, e IL-13, e é regulada por vias de sinalização associadas a Th2 e fatores de transcrição, incluindo, STAT6, e GATA3 (31).

A 10 inibe a produção de citocinas pró-inflamatórias como TNF, 6 e IL-12, como parte de uma resposta homeostática à infecção ou inflamação. Esse mediador é produzido por macrófagos, linfócitos T e B e uma variedade de outros tipos celulares, incluindo mastócitos e queratinócitos. Esta citocina desempenha a função de limitar a duração e intensidade das respostas imunes e inflamatórias (32-34).

IL-10 é expressa por células do sistema imune inato e adaptativo, incluindo as células dendríticas (DC), macrófagos, mastócitos, células NK, eosinófilos, neutrófilos, células T CD4+ e CD8+ (32-34).

A IL-10 em conjunto com outras citocinas da resposta Th1 (tais como IL-12) regulam a resposta Th2 (35), promovendo o controle da proliferação do M leprae (36, 37 e 38).

19

2 - OBJETIVOS

2.1 OBJETIVO GERAL

Identificar as células mononucleares presentes na pele de pacientes com hanseníase e avaliar a expressão dos mediadores anti-inflamatórios anexina-A1 e IL-10, avaliando seu possível papel na patogênese da doença.

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

a) Identificar as células T CD4+ e CD8+ nas diferentes formas clínicas de hanseníase na pele;

b) Identificar as células epitelióides e os histiócitos nas diferentes formas clínicas de hanseníase;

c) Avaliar a expressão dos mediadores anti-inflamatórios IL-10 e ANXA1 nos linfócitos, células epitelióides e histiócitos da pele de pacientes com hanseníase.

3 - MATERIAIS E MÉTODOS

3.1. Pacientes

Trata-se de estudo transversal, realizado com pacientes que procuraram o Serviço de Referência para Diagnóstico e Tratamento a Hanseníase, localizado no Hospital Universitário Júlio Müller, Cuiabá, MT.

Foram elegíveis pacientes com diagnóstico de qualquer forma clínica da hanseníase (n=70), com baciloscopia realizada em raspado dérmico positivo ou negativo. Os pacientes foram distribuídos clinicamente de acordo com a classificação pela forma clínica, de acordo com critérios estabelecidos por Ridley e Jopling (7). Após, os pacientes foram submetidos à biópsia da lesão, utilizando punch de 4 mm de diâmetro, após anestesia local, para classificação histopatológica, de acordo com critérios estabelecidos por Ridley e Jopling (1966), em: tuberculóide (TT), borderline tuberculóide (TB), borderline borderline (BB), borderline virchowiana (BV) e virchowiana (VV).

Não foram incluídos indivíduos com idade inferior a 18 anos, gestantes ou lactantes, pacientes com alergia às drogas a serem administradas, com soro positividade ao HIV, com insuficiência renal crônica, com diabetes e outras doenças crônicas

Para a coleta dos dados foi utilizado um questionário padrão (ANEXO 1), com informações sobre residência, idade, sexo, procedência, escolaridade, data do início dos sintomas, tratamento específico prévio, história familiar da doença, história patológica pregressa e presença de cicatriz vacinal de BCG. De todos os pacientes foi realizado exame físico geral e dermatoneurológicos. Foram avaliadas as condições gerais de saúde do paciente e as características da lesão (localização, tamanho, limites, bordas, relevo e sensibilidade térmica, tátil e dolorosa) e avaliação de lesão de tronco neural.

21

3.2. Considerações éticas

Todos os participantes foram esclarecidos sobre os objetivos e procedimentos (punção venosa, biópsia, entrevista e revisão de prontuários médicos) do presente estudo e sobre sua total liberdade para participar ou não. Os participantes que concordaram em fazer parte do estudo assinaram inicialmente o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (ANEXO 2) aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa HUJM, protocolo nº 733/CEP-HUJM/09 (ANEXO 3). A pesquisa não conferiu riscos, pois o material que foi coletado (biópsia e sangue) foi o mesmo utilizado para fazer os exames laboratoriais de rotina.

3.3. Biópsia para exame histopatológico

Após realização de assepsia e anestesia local com lidocaína a 2%, sem vasoconstrictor, foi realizada biópsia utilizando um “punch” de 4 mm na borda da lesão que apresentava maior sinal de atividade clínica, obtendo-se um fragmento que foi imerso em formol tamponado a 10% e transportada para o Laboratório de histopatologia da HUJM/UFMT, para realização do diagnóstico da lesão. As amostras foram lavadas no mesmo tampão, desidratadas em soluções com concentração crescente de etanol, clarificadas em xilol e incluídos em parafina.

Em seguida, as amostras foram levadas para o laboratório de Histologia da Faculdade de Medicina da UFMT para realização dos cortes histológicos (3 m), utilizando o micrótomo HIRAX M60 (Carl Zeiss; Alemanha). Posteriormente, as secções foram colocadas em lâminas histológicas e, após processo de desparafinização e reidratação, coradas com hematoxilina-eosina para análise histopatológica, possibilitando a identificação de histiócitos epitelióides e vacuolizados, célula gigante multinucleada, linfócitos e plasmócitos, além de regiões de lesão epitelial. A coloração Fite-Faraco também foi utilizada para análise de BAAR (bacilo álcool ácido resistente).

3.4. Quantificação da expressão da proteína ANXA1 endógena, da citocina IL-10 e identificação de marcadores celulares linfocitários pela técnica de

imunofluorescência

A detecção da ANXA1 endógena e da IL-10 intracelular foi realizada na biópsia de pele dos pacientes pela técnica de imunofluorescência. Da mesma forma, foi realizada a detecção dos marcadores celulares de linfócitos: CD4 e CD8. Foram realizados cortes seriados (3 m cada) para que a mesma região pudesse ser avaliada pelas colorações HE e Fite-Faraco e na imunoistoquímica.

Os cortes pra a imunoistoquímica foram preparados em lâminas com adesivo biológico (BIOBOND) (British Biocell International, Cardiff, UK) e, posteriormente, incubadas com os seguintes reagentes à temperatura ambiente (28): (a) incubadas em banho-maria a 100°C em solução de citrato de sódio 0,21% por 30 min; (b) bloqueadas com peróxido de hidrogênio a 3% em metanol a 70% por 1 h; (c) permeabilizadas pela incubação com Tween 20 a 0,4% em PBS por 15 min; (d) bloqueadas com albumina sérica bovina (BSA) a 5%, diluída em PBS por 1 h; (e) incubadas com os anticorpos primários para detecção de ANXA1 e IL-10: coelho anti-ANXA1 (1:200 em BSA a 1%), camundongo anti-IL-10 (1:200 em BSA a 1%); para detectar os marcadores de membrana dos linfócitos CD4 e CD8, foram utilizados os anticorpos primários: camundongo anti-CD4 (1:100 em BSA a 1%) e camundongo anti-CD8 (1:100 em BSA a 1%), por 18 h, a 4°C, em câmara úmida; (f) para identificação dos anticorpos, foram utilizados os seguintes anticorpos secundários: cabra anti-coelho IgG conjugado com fluorocromo ALEXAFLUOR 488 (Invitrogen, USA, 1:50 em BSA a 1%) e cabra anti-camundongo IgG conjugado com fluorocromo ALEXAFLUOR 546 (Invitrogen, USA, 1:50 em BSA a 1%) durante 1 h à temperatura ambiente e em câmara escura; (g) lavadas com PBS e montadas em citiflour (DAKO, USA).

As células imunomarcadas foram identificadas no microscópio AxioScope A1 (Carl Zeiss, GR). As moléculas e mediadores anti-inflamatórios foram identificadas através do Software Axiovision (Carl Zeiss, GR) e quantificadas por densidade óptica média (MOD) com o auxílio deste mesmo Software.

Desta forma, foi avaliado a imunomarcação de vários pontos do citoplasma celular de células T CD4+, T CD8+, histiócitos epitelióide e histiócitos vacuolizado. A marcação foi quantificada de acordo com o espectro de luz, variando arbitrariamente

23

de 0 a 255 (unidades arbitrárias – a.u.). Os valores de ANXA1 e IL-10 para cada célula foram expressos como média ± SEM em cada paciente. Desta forma, foi possível avaliar a média da marcação em células T CD4+, T CD8+, histiócitos epitelióides e histiócitos vacuolizados em cada tipo clínico de hanseníase.

As médias entre os diferentes pacientes foram comparadas pelo One Way ANOVA, com pós-teste Bonferroni. As associações entre dados não paramétricos foram analisadas por regressão linear e pelo coeficiente de correlação do teste de Spearman. Valores de P menores que 0,05 serão considerados estatisticamente significativos.

4 - RESULTADOS

4.1. Dados clínicos e histopatológicos

Após análise clínica e histopatológica, 70 pacientes foram diagnosticados com hanseníase, sendo classificados com as formas clínicas de acordo com a tabela 01.

TABELA 01. Avaliação das formas clínicas dos pacientes com hanseníase.

Forma clínica N % Relação fem/masc Cicatriz vacinal da

BCG TT 12 17,1 3/9 1 BT 18 25,7 8/10 2 BB 6 8,6 2/4 0 BV 20 28,6 8/12 0 VV 14 20,0 2/12 1

Os dados foram expressos em número total, porcentagem, relação feminino/masculino e presença da marca da vacina BCG.

Os pacientes foram categorizados clinicamente como TT por apresentar lesões eritemato-hipocrômicas, eritematosas, com bordas discretamente elevadas ou com microtubérculos e limites precisos. Os nervos periféricos, sobretudo os ulnares encontravam-se espessados e facilmente palpáveis. Histopatologicamente havia a presença de granulomas, sobretudo em torno das glândulas sudoríparas e dos vasos. Nos granulomas, foram identificadas células histiócitos epitelióides, células gigantes, erosão epidérmica e pequeno número de linfócitos na periferia. A baciloscopia da lesão foi negativa.

25

Figura 3. Lesão de pele de paciente com hanseníase, forma clínica TT. (A) Identificação do granuloma (seta). (B) Ausência de bacilo. Coloração: (A) HE; (B) Fite-Faraco. Barra = (A) 100 µm e (B) 50 µm.

Diferenciando-se dos TT os pacientes BT, na análise histopatológica indicou a presença de granuloma frouxo com plasmócitos e zona clara subepidérmica.

Figura 4. Lesão de pele de paciente com hanseníase, forma clínica BT. (A) Identificação do granuloma (seta). (B) Ausência de bacilo. Coloração: (A) HE; (B) Fite - Faraco. Barra = (A) 100 µm e (B) 100 µm.

Os pacientes BB apresentaram lesões eritematosas, infiltradas, edematosas e brilhantes, com contornos internos bem definidos e externos mal definidos. Por sua forma instável, podem apresentar lesões que se assemelham a forma tuberculóide e/ou às lesões disseminadas da forma virchowiana. O comprometimento neurológico periférico era frequente, bem como os episódios reacionais. Os granulomas não

A B

tinham estrutura capsular, e apresentavam plasmócitos e zona clara subepidérmica. Os linfócitos eram escassos e havia grande número de bacilos.

Figura 5. Lesão de pele de paciente com hanseníase, forma clínica BB. (A) Identificação de alguns infiltrados celulares (seta). (B) Presença de alguns bacilos (seta).. Coloração: (A) HE; (B) Fite - Faraco. Barra = (A) 50 µm e (B) 100 µm.

Clinicamente a forma BV era basicamente semelhante à forma VV. Histopatologicamente, na forma BV, a presença de histiócitos vacuolizados era predominante, não havendo presença de célula gigante e os bacilos apareciam em menor número quando comparados a VV.

Figura 6. Lesão de pele de paciente com hanseníase, forma clínica BV. (A) Identificação do infiltrado celular (seta). (B) Presença de bacilos. Coloração: (A) HE; (B) Fite - Faraco. Barra = (A) 50 µm e (B) 100 µm.

A B

27

Os pacientes VV apresentavam infiltração difusa com numerosas lesões eritematosas, brilhantes, mal definidas e de distribuição simétrica. Na face, foram identificados pontos de infiltração que davam um aspecto peculiar, chamado “fácies leonina”. Alguns pacientes também apresentavam nódulos. Múltiplos troncos nervosos estavam comprometidos simetricamente, tornando-se espessados e fibrosos, podendo gerar perda sensitiva e motora. Também podemos identificar plasmócitos no infiltrado celular, a faixa de ulna (região da derme papilar, imediatamente abaixo da epiderme, com ausência de infiltrado celular) e a zona clara subepidérmica.

Figura 7. Lesão de pele de paciente com hanseníase, forma clínica VV. (A) Identificação do infiltrado celular por todo corte. (B) Presença de numerosos bacilos. Coloração: (A) HE; (B) Fite - Faraco. Barra = (A) 50 µm e (B) 100 µm.

4.2. Análise de imunofluorescência para citocina IL-10

Na imunofluorescência para a IL-10, evidenciamos uma marcação positiva dessa citocina em células epitelióides nos pacientes da forma TT, BT e BB, e em histiócitos nos pacientes da forma BV e VV, sendo que a marcação não apresentava diferenças estatísticas entre essas formas clínicas (FIG. 8 e 9).

Da mesma forma, a IL-10 também estava expressa em linfócitos nos pacientes TT, BT, BB, BV e VV. Nesse caso os níveis de IL-10 estavam

TT BT BB BV VV 0 20 40 60 80 100 ** *** *** Linfócito IL -1 0 ( u .a .)

significativamente aumentados em pacientes com a forma clinica BV e VV, em relação aos pacientes TT e BT (FIG. 8 e 9).

Figura 08. Análise dos níveis intracelulares da IL-10 em células presentes no sítio inflamatório de pacientes com hanseníase. Os dados foram avaliados pela análise de variância One way ANOVA e pós-teste de Bonferroni. (A) Histiócito. (B) Linfócito. *, P<0,05; **, P<0,01; ***, P<0,001 versus paciente TT e BT;

Figura 09. Análise de Imunofluorescência para a proteína ANXA1 e para IL-10. (A, B e C) Biopsias de pacientes com a forma clínica TT apresentando baixa imunomarcação para a proteína ANXA1. (D, E e F) Biopsias de pacientes com a forma clínica BB e (G, H e I) com a forma clínica VV, apresentam aumento na expressão da ANXA1. Coloração DAPI (A, D e G); Imunomarcação para a ANXA1 (B, E e H); Imunomarcação para IL-10 (C, F e I). Barra = 50 µm.

TT BT BB BV VV 0 20 40 60 80 100 Histiócito IL -1 0 ( u .a .)

**

*

29 TT BT BB BV VV 0 20 40 60 80 *** ### *** ### *** ### + E x p re s s ã o d e A NX A 1 ( u .a .) Célula T CD4+ TT BT BB BV VV 0 20 40 60 80 * *** ### ### +++ +++ E x p re s s ã o d e A NX A 1 ( u .a .) Célula T CD8+ 4.3. Análise de imunofluorescência para proteína ANXA1

Para a imunofluorescência para a ANXA1 foi evidenciada uma marcação positiva dessa proteína em células epitelióides nos pacientes da forma TT, BT e BB, sendo que em pacientes BB, a imunomarcação estava significativamente aumentada, em relação ao TT e BT (FIG. 8). Da mesma forma, a ANXA1 também estava expressa em histiócitos nos pacientes BV e VV sendo que a marcação não apresentava diferenças estatísticas entre essas formas clínicas (FIG.10 e 11). Nas células T CD4+, a ANXA1 estava com uma expressão menor nos pacientes TT e BT quando comparados aos pacientes BB, BV e VV (FIG.10 e 11). De modo semelhante, nas células TCD8+, a imunomarcação de ANXA1 estava estatisticamente aumentada nos pacientes BV e VV, quando comparado aos grupos TT, BT e BB (FIG. 10 e 12).

Figura 10. Análise da expressão intracelular da ANXA1 endógena em células presentes no sítio inflamatório de pacientes com hanseníase. (A) Histiócito. (B) Célula T CD4+. (C) Célula T CD8+. Os dados foram avaliados pela análise de variância One way ANOVA e pós-teste de Bonferroni. *, P<0,05; **, P<0,01; ***, P<0,001 versus paciente TT; ##, P<0,01; ###, P<0,001 versus paciente BT; +, P<0,05; +++, P<0,001 versus paciente BB. TT BT BB BV VV 0 20 40 60 80 ** ### Histiócito ** ### * ## E x p re s s ã o d e A NX A 1 ( u .a .) A B _C

Figura 11. Análise de imunofluorescência para a proteína ANXA1 e para célula T CD4+. (A, B e C) Biópsia da pele de pacientes com a forma clínica TT apresentando baixa imunomarcação para a proteína ANXA1. (D, E e F) Biópsia da pele de pacientes com a forma clínica BB e (G, H e I) com a forma clínica VV, apresentam aumento na expressão da ANXA1. Coloração DAPI (A, D e G); Imunomarcação para a ANXA1 (B, E e H); Imunomarcação para os linfócitos CD4+ (C, F e I). Barra = 50 µm. A B C D E F G H I A B C D E F G H I

31

Figura 12. Análise de imunofluorescência para a proteína ANXA1 e para célula T CD8+. (A, B e C) Biópsia da pele de pacientes com a forma clínica TT apresentando baixa imunomarcação para a proteína ANXA1. (D, E e F) Biópsia da pele de pacientes com a forma clínica BB e (G, H e I) com a forma clínica VV, apresentam aumento na expressão da ANXA1. Coloração DAPI (A, D e G); Imunomarcação para a ANXA1 (B, E e H); Imunomarcação para os linfócitos CD8+ (C, F e I). Barra = 50 µm.

4.4. Análise da relação da proteína ANXA1 e da citocina IL-10

A análise da correlação desses marcadores moleculares anti-inflamatórios demonstrou que em linfócitos, existe uma correlação positiva e significativa da expressão da ANXA1 e dos níveis de IL-10 nos pacientes BB, BV e VV. Já nos pacientes TT e BT, essa correlação não estava presente (FIG. 13).

Já na célula epitelióide, essa correlação estava presente apenas nos pacientes TT e BB. Finalmente, em relação ao histiócito, essa correlação estava presente tanto nos pacientes BV quanto nos pacientes VV (FIG. 14).

0 20 40 60 0 50 100 150 200 Tuberculóide r2 _{= 0.22} P < 0.08 IL-10 (u.a) A NX A 1 ( u .a .) 0 50 100 150 0 50 100 150 200

Borderline-Tuberculóide

r

_{= 0.01}

P < 0.91

Figura 13. Análise da relação da proteína endógena ANXA1 e da citocina IL-10 presentes no citoplasma dos linfócitos de pacientes com hanseníase. (A) Pacientes com a forma clínica TT; (B) Pacientes com a forma clínica BT; (C) Pacientes com a forma clínica BB; (D) Pacientes com a forma clínica BV; (E) Pacientes com a forma clínica VV. As associações entre dados não paramétricos foram analisadas por regressão linear e pelo coeficiente de correlação do teste de Spearman.

A

D

E C

33 0 20 40 60 80 0 50 100 150 200 Tuberculóide r2 _{= 0.35} P < 0.0196 IL-10 (u.a) A N X A 1 ( u .a )

Figura 14. Análise da relação da proteína endógena ANXA1 e da citocina IL-10 presentes no citoplasma das células epitelióides e nos histiócitos de pacientes com hanseníase. Células epitelióides de pacientes com as formas clínicas (A) TT e (B) BT; Histiócitos de pacientes com as formas clínicas (C) BB, (D) BV e (E) VV. As associações entre dados não paramétricos foram analisadas por regressão linear e pelo coeficiente de correlação do teste de Spearman.

0 50 100 150 0 50 100 150 200 Borderline-Tuberculóide r2 _{= 0.36} P < 0.035 IL-10 (u.a) A NX A 1 ( u .a ) 0 20 40 60 80 0 50 100 150 200 Borderline-Borderline r2 _{= 0.82} P < 0.0031 IL-10 (u.a) A NX A 1 ( u .a ) 0 50 100 150 0 50 100 150 200 Borderline-Virchowiana r2 _{= 0.86} P < 0.0004 IL-10 (u.a) A NX A 1 ( u .a ) 0 50 100 150 0 50 100 150 200 Virchowiana r2 _{= 0.89} P < 0.0011 IL-10 (u.a) A NX A 1 ( u .a ) A B C D E

5 - DISCUSSÃO

A hanseníase é uma doença complexa, causada pelo M. leprae que possui alta infectividade e baixa patogenicidade (1,2). O nível de patogenicidade da hanseníase pode ser influenciado por diversos fatores, dos quais destacamos o sistema imunológico (6-16). Várias células são ativadas e consequentemente, vários mediadores imunológicos são produzidos para promover o controle e regulação desse processo inflamatório. Para a melhor compreensão da resposta imunológica da hanseníase, as análises histopatológicas e imunoistoquímicas permitem um estudo detalhado dos tipos celulares presentes e dos mediadores produzidos nos sítios inflamatórios.

Os dados obtidos nesse trabalho são semelhantes aos presentes na literatura, onde ocorre um predomínio de células epitelióides e linfócitos T, em pacientes TT e BT, formando o granuloma e controlando a quantidade de bacilos. Já em pacientes BV e VV, os bacilos estão disseminados no sitio inflamatório (12-16). A sinalização via TNF-α é importante à atividade fagocítica dos histiócitos e formação do granuloma, estando positivamente regulada após a infecção por M. leprae, fato que poderia colaborar para a permanência do patógeno nas lesões de pacientes virchowianos (20-22).

Para compreender melhor a regulação do sistema imune durante a hanseníase, avaliamos a citocina anti-inflamatória IL-10. Essa interleucina, também chamada de fator inibidor da síntese de citocinas, foi descrita inicialmente como o fator produzido por células Th2 capaz de suprimir a produção de citocinas pró-inflamatórias das células Th1 (31,33-35). Várias outras células produzem IL-10, tais como: linfócitos B, mastócitos, queratinócitos, eosinófilos, células dendríticas, monócitos e macrófagos, sendo esses dois últimos as principais fontes fisiológicas de IL-10 (33,35). Os dados apresentados nesse trabalho indicaram que níveis aumentados de IL-10 podem ser detectados nos linfócitos de pacientes BV e VV em relação ao TT e BT. Avaliando os valores de IL-10 encontrados em histiócitos, verifica-se que, em pacientes BB, BV e VV, ocorre um aumento do nível dessa citocina intracitoplasmática do que nos histiócitos de pacientes TT e BT. Na literatura, autores descrevem que, na hanseníase, a IL-10 é expressa em altos

35

níveis nas lesões do tipo VV, quando comparados às lesões TT, levando a inibição da resposta Th1 (33).

Para melhor entender o mecanismo de regulação do processo infeccioso na hanseníase, avaliamos a expressão da ANXA1 no sítio inflamatório. Os dados obtidos nesse trabalho mostraram que a imunomarcação para ANXA1 estava aumentada em pacientes BB, BV e VV em relação aos dos pacientes TT e BT, sendo que essa diferença pode ser observada nos histiócitos e nas células T CD4+ e CD8+. Como descrito na literatura, níveis aumentados de ANXA1 podem ser detectados em locais com intensa atividade infamatória, sendo que os leucócitos são as principais fontes de produção desse mediador (27). É importante ressaltar que esse é o primeiro trabalho que demonstra a expressão da ANXA1 no sítio inflamatório de pacientes com hanseníase. Apenas um outro trabalho havia relatado a presença de ANXA1 na membrana dos vacúolos fagocíticos de macrófagos infectados com o M leprae (36). Além disso, a expressão aumentada de ANXA1 em histiócitos pode ser explicada pela importância dessa proteína para a captura e endocitose de partículas/parasitas e clerance de corpos apoptóticos (29). Outros trabalhos demonstraram que a ausência da proteína ANXA1 em animais transgênicos reduz a capacidade fagocítica dos macrófagos (28,37), indicando a participação dessa proteína na resposta do organismo frente à infecção pelo M. leprae. Alguns estudos indicam uma ligação entre a expressão de ANXA1 e a proliferação de linfócitos sendo caracterizada como uma proteína antiproliferativa (24). Nossos estudos demonstraram que a expressão da ANXA1 nas células T CD4+ e CD8+ de pacientes com hanseníase estavam aumentados em pacientes BV e VV, e reduzida em pacientes TT e BT. Esses dados podem indicar uma ação diferencial na proliferação de linfócitos nos diferentes subtipos de manifestação clínica da hanseníase, podendo influenciar na resposta efetiva de controle do parasita.

Para melhor compreender o papel da ANXA1 na hanseníase foi realizada uma análise de correlação linear com a citocina IL-10. A literatura descreve que um mecanismo importante da ANXA1 é a regulação da produção da citocina IL-10 em processos inflamatórios agudos (27). Esse trabalho e outros (38) ainda relatam que a ANXA1 ativa a cascata de sinalização via quinase (ERK), levando ao aumento da

produção dessa citocina. Outros estudos conduzidos por Damazo e colaboradores demonstraram que, em macrófagos estimulados com LPS, a ANXA1 estimulou a liberação de IL-10, sendo esse estímulo dose e tempo dependente (26). Os dados apresentados nesse trabalho demonstram que existe uma correlação entre os níveis intracelulares da proteína endógena ANXA1 e da IL-10 no sitio inflamatório das lesões cutâneas dos pacientes BB, BV e VV, onde o processo inflamatório está mais ativo. Esses dados, associados com a literatura podem indicar a participação da ANXA1 na indução da produção de IL-10 nessas células. Desta forma, podemos sugerir que a ANXA1 é um importante mediador na manutenção do M. leprae em indivíduos com formas clínicas BB, BV e VV.

37

6 - CONCLUSÃO

Observou-se que a diferença de células imunes entre os subtipos de pacientes com hanseníase é fundamental para permitir a produção diferencial de mediadores reguladores do processo infeccioso;

Confirmou-se a contribuição dos histiócitos vacuolizados e células T CD4+ e T CD8+ como importantes fontes de IL-10 nos pacientes BV e VV.

Caracterizou-se a proteína ANXA1 como um regulador do processo infeccioso induzido por M leprae, indicando que, a presença dessa proteína poderia estar reduzindo o potencial pró-inflamatório nos pacientes BB, BV e VV, levando a disseminação da bactéria M leprae. Do contrário, em pacientes TT e BT, onde o sistema imunológico é mais eficaz na eliminação das bactérias, a proteína ANXA1 apresenta uma baixa expressão.

Avaliou-se a expressão da ANXA1 e os níveis de IL-10, indicando uma correlação positiva dessas moléculas durante o processo infeccioso induzido por M leprae nos pacientes BB, BV e VV.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1. Mendonça VA, Costa RD, Brito-Melo GE, Antunes CM, Teixeira AL. Imunologia da hanseníase. An Bras Dermatol. 2008;83(4):343-50.

2. Rambukkana A, Zanazzi G, Tapinos N, Salzer JL. Contact-dependent demyelination by Micobacterium leprae in the absence of immune cells. Science. 2002 May 3; 296(5569):927-31.

3. Walker SL, Lockwood DNJ. The clinical and immunological features of leprosy. Br. Med. Bull. 2006; 77-78: 103-121.

4. Parkash O. Classification of leprosy into multibacillary and paucibacillary groups: an analysis. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 2009 Jan; 55(1): 1-5.

5. 7º Congresso Internacional de Leprologia, Madri, 1953. Memória. Madri: Association Internacional de La Lepra, 1953.

6. Pfaltzgraff RE, Bryceson A. Clinical Leprosy. In: Hastings RC (ed) Leprosy, 1st edition, Churchill Livingstone Inc, New York, p.134-176, 1985.

7. Ridley DS, Jopling W.H. Classification of leprosy according to immunity: a five-group system. Int J LeprOtherMycobactDis. 1966; 34:255–73.

8. World Health Organization (WHO). Guide to eliminate leprosy as a public health problem. Geneva: World Health Organization; 1995.

9. Sarno EN, Sampaio EP. The role of inflammatory cytokines in the tissue injury of leprosy. Int. J. Lepr. Other Mycobact. Dis. 1996 Dez;64(4 Suppl):S69-73.

10. Naafs B, Kolk AH, Chin A Lien RA, Faber WR, Van Dijk G, Kuijper S, et al. Anti- Mycobacterium leprae monoclonal antibodies cross-react with human skin: an

39

alternative explanation for the immune responses in leprosy. J. Invest. Dermatol. 1990 Maio;94(5):685-688.

11. Lyon S; Grossi MAF. Hanseníase. Rio de Janeiro: MedBook, 2013.

12. Vanderborght, P.R. Estudo da associação entre polimorfismo de base única (SNPs) na região promotora do gene de TNF-α e a hanseníase [tese]. Rio de Janeiro: Instituto Oswaldo Cruz, 2001.

13. Mills, K. H. Mcguirk, P. Antigen-specific regulatory T cells-their induction and role in infection. Seminars in Immunology 2004; 16:107-17.

14. Modlin RI, Brenner MB, Krangel MS, Duby AD, Bloom LR. T-cell receptors of human suppressor cells. Nature 329:541-545, 1987.

15. Goulart IMB, Penna GO, Cunha G. Imunopatologia da hanseníase: a complexidade da resposta imune do hospedeiro ao Mycobacterium leprae. Rev Soc Bras Med Trop. 2002;35:365-75.

16. Moraes MO, Cardoso CC, Vanderborght PR, Pacheco AG. Genetics of host response in leprosy. Lepr Rev. 2006;77:189-202.

17. Yamamura M, Wang XH, Ohmen JD, Uyemura K, Rea TH, Bloom BR, et al. Cytokine patterns of immunological mediated tissue damage. J Immunol. 1992;149: 1470–75.

18. Spellberg B, Edwards JE Jr. Type 1/Type 2 immunity in infectious diseases. Clin Infect Dis. 2001;32:76-102.

19. Mehra V, Modlin RL. T-lymphocytes in leprosy lesions. Curr Top Microbiol Immunol. 1990;155:97-109.

21. HAGGE, D. A. et al. Lymphotoxin-alpha and TNF have essential but independent roles in the evolution of the granulomatous response in experimental leprosy. Am. J. Pathol., New York, v. 174, n. 4, p. 1379-1389, 2009.

22. Goulart IMB, Penna GO, Cunha G. Immunopathology of leprosy: the complexity of the mechanisms of host immune response to Mycobacterium leprae. Rev. Soc. Bras. Med. Trop. 2002 Ago;35(4):365-375.

23. Dockrell HM, Brahmbhatt S, Robertson BD, Britton S, Fruth U, Gebre N, Hunegnaw M, Hussain R, Manadhar R, Murrillo L, Pessolani MC, Roche P, Salgado JL, Sampaio E, Shahid F, Thole JE, Young DB. Diagnostic assays for leprosy based on T-cell epitopes. Lepr Rev 71 Suppl:S55-8, 2000.

24. Kamal AM, Flower RJ, Perretti M: An overview of the effects of annexin1 on cells involved in the inflammatory process. Mem Inst Oswaldo Cruz 2005, 100:39-47.

25. Perretti M, Flower RJ: Annexin 1 and the biology of the neutrophil. J Leukoc Biol 2004, 76: 25-29.

26. Damazo AS, Yona S, D'Acquisto F, Flower RJ, Oliani SM, Perretti M. Critical protective role for annexin 1 gene expression in the endotoxemic murine microcirculation. Am J Pathol. 2005 Jun;166(6):1607-17.

27. Parente L, Solito E: Annexin 1: more than an anti-phospholipase protein. Inflamm res 2004, 53:125-132.

28. Damazo AS, Yona S, Flower RJ, Perretti M, Oliani SM. Spatial and temporal profiles for anti-inflammatory gene expression in leukocytes during a resolving model of peritonitis. J Immunol. 2006 Apr 1;176(7):4410-8.

29. Perretti M, D'Acquisto F. Annexin A1 and glucocorticoids as effectors of the resolution of inflammation. Nat Rev Immunol 9:62-70, 2009.

41

30. Moore KW, Vieira P, Fiorentino DF, Trounstine ML, Khan TA, Mosmann TR. 1990. Homology of cytokine synthesis inhibitory factor (IL-10) to the Epstein-Barrvirus gene BCRFI. Science 248:1230–34.

31. O’Shea JJ, Murray PJ. Cytokine signaling modules in inflammatory responses. Immunity. 2008 abr;28(4):477-487.

32. Martinez FO, Sica A, Mantovani A, Locati M. Macrophage activation and polarization. Front. Biosci. 2008;13:453-461.

33. O’Garra A, Vieira P. 2007. T(H)1 cells control themselves by producing interleukin-10. Nat. Rev. Immunol.7:425–28.

34. Schandene, L., C. Alonso-Vega, F. Willems, C. Gerard, A. Delvaux, T. Velu, R. Devos, M. de Boer, Goldman M. B7/CD28-dependent IL-5 production by human resting T cells isinhibited by IL-10. J. Immunol. 152: 4368–4374, 1994.

35. Sieling PA, Abrams JS, Yamamura M, Salgame P, Bloom BR, Rea TH, et al. Immunosuppressive roles for IL-10 and IL-4 in human infection. In vitro modulation of T cell responses in leprosy. J. Immunol. 1993 Jun 15;150(12):5501- 5510.

36. Frehel, C., de Chastellier, C., Lang, T. and Rastogi, N. Evidence for inhibition of fusion of lysosomal and prelysosomal compartments with phagosomes in macrophages infected with pathogenic Mycobacterium avium. Infect. Immunol.52, 252-262, 2006.

37. Scannell M, et al. Annexin-1 and Peptide Derivatives Are Released by Apoptotic Cells and Stimulate Phagocytosis of Apoptotic Neutrophils by Macrophages. The Journal of Immunology, 178: 4595–4605, 2007.

38. Solito E, de Coupade C, Parente L, Flower RJ, Russo-Marie F. IL-6 stimulates annexin 1 expression and translocation and suggests a new biological role as class II acute phase protein. Cytokine, 10(7):514-21, 1998.

ANEXO 1

QUESTIONARIO HANSENÍASE HUJM Número de cadastro no projeto:

Número de prontuário (HUJM ou outro):

Nome: Idade: Sexo:

Gestante? Cor:

Endereço para contato: Município, CEP:

Fone: Celular: Telefone de contatos:

E-mail: Ocupação:

Escolaridade: Hábitos e outras informações:

fuma?: ( ) sim ( ) não ha quanto tempo? nº de cigarros/dia: já fumou?: ( ) sim ( ) não por quanto tempo:

há quanto tempo parou de fumar?:

convive com pessoas que fumam?: ( ) sim ( ) não

é etilista?: ( ) sim ( ) não há quanto tempo?: quanto bebe por dia?: faz uso de medicamentos: ( ) sim ( ) não quais?:

faz ou já fez uso de drogas ilícitas: ( ) sim ( ) não por quanto tempo?

teve alguma virose recentemente?: ( ) sim ( ) não há quanto tempo foi curado?: você foi submetido a alguma radiografia recentemente?: ( ) sim ( ) não

há quanto tempo atrás?

tem ou teve algum tipo de câncer? se sim, qual? fez tratamento?qual?

Forma clínica: ( ) indeterminada ( ) tuberculóide ( ) dimorfa-tuberculóide ( ) dimorfa ( ) dimorfa-virchowiana ( )virchowiana ( ) neural ( ) não-classificada Classificação operacional: ( )paucibacilar ( ) multibacilar

Número de lesões: lesão (s) ( ) + 10 lesões

Tipo da lesão: ( ) Mancha ( ) Placa ( ) Infiltrado ( ) Nódulo Borda: ( ) Bem definida ( ) Mal definida ( ) Misto

Cor: ( )Hipocrômica ( ) Eritematosa ( )Hipercrômica Limite: ( ) Regular ( ) Irregular

Sensibilidade térmica e dolorosa: ( ) ausente ( )diminuída ( )normal ( ) duvidosa Localização lesão/lesões:

a)Rosto/cabeça e)Costas i)Braços b)Pescoço f)Glúteo j)Antebraços c)Peito g) Coxas l)Pés

d)Abdômen h) Pernas

Nº de nervos afetados: quais

Presença de cicatriz de vacina BCG:sim( ) Não( ) Coleta de biópsia de lesão de pele: sim ( ) não( ) Área de coleta:_____________________

Avaliação do grau de incapacidade: ( ) 0 ( ) I ( ) II ( ) não-avaliado Modo de detecção: ( ) encaminhamento ( ) demanda espontânea

( ) exame de contatos ( ) busca ativa Baciloscpia: ( ) positiva ( ) negativa Histopatologia:______________________ ___________________________________ Classificação final Ridley Jopling

(clínica+histopatologia+baciloscopia): TT ( ),BT( ),BB( ),BL( ),LL( ). Data de início de tratamento:

Esquema inicial: ( ) PQT/PB 6 doses ( ) PQT/MB/12 doses ( ) alternativo

Mitsuda: ( ) positivo ( ) negativo ( ) não realizado ESTÁ EM REAÇÃO?

43

ANEXO 2

1 Termo De Consentimento Livre e Esclarecido

(Conselho Nacional de Saúde, Resolução 196/96).

Você está sendo convidado a participar como voluntário do Projeto de Pesquisa “Avaliação de marcadores moleculares relacionados ao diagnóstico, susceptibilidade e imunidade em indivíduos clinicamente acometidos por hanseníase e seus contatos” sob responsabilidade do Pesquisador Prof Dr Francisco José Dutra Souto e o Prof Dr Cor Jesus Fernandes Fontes. Este estudo é importante porque seus resultados fornecerão informações para o entendimento do processo de hanseníase e poderão auxiliar, futuramente, no desenvolvimento de novas metodologias de diagnóstico desta doença.

Após os procedimentos clínicos necessários para o diagnóstico da sua doença, utilizaremos um pedacinho da pele e um pouco do seu sangue coletado para realização do nosso trabalho, onde separaremos as células de defesa (glóbulos brancos ou leucócitos). Desta forma, não haverá riscos adicionais a sua saúde. Você poderá entrar em contato com o pesquisador responsável em qualquer época, pessoalmente ou pelo telefone da Instituição, para esclarecimento de qualquer dúvida. Você está livre para, a qualquer momento, recusar ou deixar de participar da pesquisa. Essa pesquisa não vai gerar nenhum ganho financeiro ou melhorar a sua saúde. O material retirado para pesquisa será guardado e poderá ser utilizado em pesquisas futuras se você der o seu consentimento (pode aceitar ou não).. Caso seja impossível contatá-lo, seu material somente será utilizado mediante aprovação pelo Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) do Hospital ou pela Comissão Nacional de Ética em Pesquisa (CONEP) do Ministério da Saúde, em cumprimento à Resolução CNS 347/2005. Os dados desta pesquisa não serão divulgados de forma a possibilitar sua identificação. Você receberá uma cópia desse termo onde tem o nome, telefone e endereço do pesquisador responsável, para que você possa localizá-lo a qualquer tempo.

Considerando os dados acima, CONFIRMO estar sendo informado por escrito e verbalmente dos objetivos desta pesquisa.

Eu (nome da participante)..., idade:... sexo:...Naturalidade:...portadora do documento RG Nº:...declaro que entendi os objetivos, riscos e benefícios de minha participação na pesquisa e concordo em participar.

Assinatura do participante: ...

Assinatura do pesquisador principal: ...

OBS: este termo apresenta duas vias, uma destinada ao usuário ou seu representante e a outra ao pesquisador.

Prof Dr Francisco José Dutra Souto Cargo/Função: Professor Titular Instituição: UFMT – FCM

Endereço: Rua Fernando Corrêa, s/n° – Coxipó Cuiabá – MT – Fone: (65) 36158854 fsouto@ufmt.br

Prof Dr Cor Jesus Fernandes Fontes Cargo/Função: Professor

Instituição: UFMT – FCM

Endereço: Rua Fernando Corrêa, s/n° – Coxipó Cuiabá – MT – Fone: (65) 36158863